GR1009516B - Τρικαρβονυλο-συμπλοκα μεταλλων μεταπτωσεως με βενζο-ετεροκυκλικο παραγωγο του κυκλοπενταδιενυλικου ανιοντος με υψηλη διαπερατοτητα του αιματοεγκεφαλικου φραγμου για εφαρμογες στη διαγνωση και θεραπεια νοσων του κνς - Google Patents

Abstract

Η παρούσα εφεύρεση αναφέρεται σε συμπλοκές ενώσεις μετάλλων μεταπτώσεως, με έμφαση στο 99mTc και Re, που εμφανίζουν υψηλή διαπερατότητα του αιματοεγκεφαλικού φραγμού ώστε να δύνανται να χρησιμοποιηθούν ως διαγνωστικά/θεραπευτικά μέσα νόσων του ΚΝΣ. Οι ενώσεις είναι του γενικού χημικού τύπου όπου ο τρικαρβονυλο-μεταλλικός πυρήνας M(CO)3+ είναι συμπλοκοποιημένος με κυκλοπενταδιενυλικό ανιόν συνδεδεμένο με ετεροκυκλικές ενώσεις της οικογένειας των βενζοθειαζολίων, βενζιμιδαζολίων και βενζοξαζολίων. Η διέλευση του αιματοεγκεφαλικού φραγμού για τρεις ενώσεις με Μ = 99mTc είναι μεταξύ 7.04 και 3.99 %ID/gr στα 2 min. Επιπλέον, οι ενώσεις προσδένονται in vitro σε ινίδια του β-αμυλοειδούς πεπτιδίου και σε αμυλοειδείς πλάκες που χαρακτηρίζουν την νόσο Alzheimer, αναστέλλουν την τοξικότητα του β-αμυλοειδούς πεπτιδίου σε κυτταροκαλλιέργειες και την παραγωγή ROS που συνδέεται με την νόσο Alzheimer. Έχουν επομένως αποδεδειγμένη δυνατότητα για εφαρμογή στην παρασκευή διαγνωστικών/θεραπευτικών σκευασμάτων για την νόσο Alzheimer. Επιπλέον, η υψηλή διέλευση του αιματοεγκεφαλικού φραγμού, τις καθιστά υποψήφιες προς διερεύνηση για παρασκευή φαρμακευτικών σκευασμάτων για νόσους του ΚΝΣ.

Description

ΕΦΕΥΡΕΣΗ

με καταθέτες το ΕΚΕΦΕ "Δημόκριτος" και τους ερευνητές

Μ. Πελεκάνου, Μ. Σαγνού, Μ. Παπαδόπουλο, I. Πιρμεττή

και τίτλο

Τρικαρβονυλο-σύμπλοκα μετάλλων μεταπτώσεως με βενζοετερο κυκλικό παράγωγο του κυκλοπενταδιενυλικού ανιόντος με υψηλή διαπερατότητα του αιματοεγκεφαλικού φραγμού για εφαρμογές στην διάγνωση και θεραπεία νόσων του ΚΝΣ

ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ της ΕΦΕΥΡΕΣΗΣ

α. Τεχνικό πεδίο

Η παρούσα εφεύρεση αναφέρεται σε κατάλληλα σχεδιασμένα σύμπλοκα μετάλλων μεταπτώσεως που εμφανίζουν υψηλή διαπερατότητα του αιματοεγκεφαλικού φραγμού ώστε να μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως διαγνωστικά ή/και θεραπευτικά μέσα νόσων του ΚNΣ. Ειδικότερα αναφέρεχαι α) στην ραδιοδιάγνωση διαδεδομένων ασθενειών του ΚΝΣ, όπως η νόσος Alzheimer και οι εγκεφαλικοί όγκοι, με την χρήση του ραδιενεργού μετάλλου τεχνητίου-99m (<99m>Tc, γακτινοβολία) και της τομογραφίας γ-κάμερας (SPECT) και β) σε θεραπευτικές εφαρμογές των συμπλοκών αυτών κυρίως μέσω της χρήσης του ρηνίου (Re) που δίνει ανάλογα σύμπλοκα με το τεχνήτιο, αλλά και άλλων μετάλλων (σταθερών ή ραδιενεργών) με φαρμακευτική δράση.

β. Προϋ πάρχουσα γνώση

Αιματοεγκεφαλικός φραγμός και φάρμακα του ΚΝΣ

Η διέλευση του αιματοεγκεφαλικού φραγμού αποτελεί τον βασικό περιοριστικό παράγοντα στην ανάπτυξη φαρμάκων του κεντρικού νευρικού συστήματος (ΚΝΣ) και κυρίως του εγκεφάλου [1]. Ο αιματοεγκεφαλικός φραγμός δημιουργείται από την πυκνή διάταξη και στεγανή σύνδεση των ενδοθηλιακών κυττάρων των εγκεφαλικών τριχοειδών αγγείων και σκοπό έχει να διατηρήσει το περιβάλλον της κλειστής κοιλότητας του εγκεφάλου σταθερό και να αποτρέψει την είσοδο τοξικών ουσιών. Η προστασία αυτή του ΚΝΣ δημιουργεί ανυπέρβλητο εμπόδιο στην αποτελεσματική μεταφορά φαρμάκων τα οποία είναι απαραίτητα για την ανπμετώπιση παθολογικών καταστάσεων. Είναι χαρακτηριστικό ότι η ύπαρξη του αιματοεγκεφαλικού φραγμού παρεμποδίζει >98% όλων των φαρμάκων μικρού μοριακού βάρους (400 - 500 Da) και -100% των φαρμάκων μεγάλου μοριακού βάρους, καθώς και προϊόντων βιοτεχνολογίας (μονοκλωνικών αντισωμάτων, πρωτεϊνών, γονιδιακών φαρμάκων), να φτάσουν στον εγκέφαλο. Πέραν του μικρού μοριακού βάρους, σειρά φυσικοχημικών χαρακτηριστικών επηρεάζουν την διέλευση του αιματοεγκεφαλικού φραγμού, από τα οποία το σημαντικότερο είναι η λιποφιλικότητα [2]. Από τα ~7000 φάρμακα μικρού μοριακού βάρους που αναφέρονται στην συγκεντρωτική βάση δεδομένων φαρμακευτικής χημείας (Comprehensive Medicinal Chemistry database https: / / www. sciencedirect.com/ science/ referenceworks/9780080450445#, 2007) μόνο τo 5% προορίζεται για το ΚΝΣ, και για περιορισμένες παθήσεις (σχιζοφρένεια, κατάθλιψη, επιληψία, χρόνιο πόνο). Παρ' όλες τις επιτυχίες της φαρμακευτικής έρευνας για παθήσεις του ΚΝΣ, η έλλειψη λύσεων για την διέλευση του αιματεγκοεφαλικού φραγμού, δεν επιτρέπει την εφαρμογή τους στην κλινική πράξη. Έτσι, κυρίως ως αποτέλεσμα της ύπαρξης του αιματοεγκεφαλικού φραγμού, δεν υφίσταται αποτελεσματική θεραπευτική ανωνή για έναν μεγάλο αριθμό διαταραχών του ΚΝΣ όπως η νόσος Alzheimer, η νόσος του Huntington, η αμυοτροφική πλάγια σκλήρυνση (amyotrophic lateral sclerosis, A.L.S.), ο καρκίνος του εγκεφάλου, ο τραυματισμός του εγκεφάλου και του νωπαίου μυελού, βακτηριακές λοιμώξεις κλπ. Επομένως η ανάγκη για φάρμακα που διαπερνούν τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό είναι τεκμηριωμένη και μεγάλη.

Νόσος Alzheimer

Η νόσος Alzheimer αποτελεί χαρακτηριστικό παράδειγμα μιας εξαιρετικά διαδεδομένης ασθένειας του ΚΝΣ της οποίας η φαρμακευτική προσέγγιση περιορίζεται από την ύπαρξη του αιματοεγκεφαλικού φραγμού [3]. Είναι η κυριότερη μορφή άνοιας (~70% του συνόλου) και πλήττει κυρίως τα ηλικιωμένα άτομα. Περίπου 46 εκατομμύρια σε ολόκληρο τον κόσμο πάσχουν από άνοια η οποία αποτελεί την έβδομη αιτία θανάτου στον ανεπτυγμένο κόσμο και οι αριθμοί των πασχόντων αναμένεται να αυξηθούν εντυπωσιακά στο μέλλον, λόγω της αύξησης του προσδόκιμου επιβίωσης (https:/ /www.alz.co.Uk/research/statistics.http:/ / www.who.int/mediacentre /facts heets/fs310/en/).

Ένα από τα κύρια ιστοπαθολογικά χαρακτηριστικά της νόσου Alzheimer είναι η παρουσία των αμυλοειδών πλακών στον εξωκυττάριο χώρο του εγκεφάλου [4]. Το πρωτεΐνικό συστατικό των εναποθέσεων αυτών είναι το ,β-αμυλοειδές πεπτίδιο μήκους 40 ή 42 αμινοξέων. Το β-αμυλοειδές πεπτίδιο κάτω από αδιευκρίνιστες συνθήκες συσσωματώνεται σε αδιάλυτα αμυλοειδή ινίδια τα οποία προοδευτικά εναποτίθενται σχηματίζοντας τις αμυλοειδείς πλάκες με την συμμετοχή και άλλων παραγόντων. Σύμφωνα με την κρατούσα θεωρία (amyloid cascade hypothesis) η συσσωμάτωση του β-αμυλοειδούς πεπτιδίου σε τοξικά ινίδια και ο σχημαπαμός των αμυλοειδών πλακών σχετίζονται με την παθογένεια της νόσου Alzheimer [5, 6] και για τον λόγο αυτό αποτελούν στόχο διαγνωστικών και θεραπευτικών προσεγγίσεων για την ανπμετώπισή της-Μέχρι σήμερα, δεν υφίσταται μια αξιόπιστη εργαστηριακή μέθοδος για την έγκαιρη και εκλεκτική διάννωσπ της νόσου Alzheimer. Η κλινική πρακτική έχει θεσπίσει διαγνωστικά κριτήρια τα οποία περιλαμβάνουν σειρά νευροψυχολογικών, βιοχημικών και απεικονιστικών εξετάσεων που σκοπό έχουν να διακρίνουν την νόσο Alzheimer από άλλα σύνδρομα που προκαλούν παρόμοια συμπτώματα (όπως φυσιολογικό γήρας, αγγειακές άνοιες, εγκεφαλικά επεισόδια, κατάθλιψη, κλπ.)[7, 8]. Το 2012, το FDA (Food and Drug Administration, USA) ενέκρινε το florbetapir F-18 (εμπορική ονομασία Amyvid, Σχήμα ΙΑ) ως το πρώτο ραδιοδιαγνωστικό για ανίχνευση των αμυλοειδών πλακών της νόσου Alzheimer με τομογραφία εκπομπής ποζιτρονίου (Positron Emission Tomography, PET), και ακολούθησαν το 2013 το flutametamol F-18 (Visamyl, Σχήμα 1Β) και το 2014 το florbetaben F-18 (Neuraceq, Σχήμα 1C) [9]. Η εξέταση με τομογραφία ΡΕΤ δεν χρησιμοποιείται ως εξέταση ρουτίνας αλλά ως επιβεβαίωση μίας ήδη βεβαρημένης κλινικής εικόνας [10]. Η έμφαση όμως η οποία δίδεται τελευταία στην έγκαιρη διάγνωση της νόσου, πριν η πνευματική έκπτωση καταστεί εμφανής (https: / / www.nia. nih . gov / news / alzheimers-diagnosticguidelines-updated-first- time-decades), καθιστά την εφαρμογή των εξειδικευμένων απεικονιστικών τεχνικών όλο και πιό σημαντική [11].

Παράλληλα με την ανάπτυξη των ραδιοδιαγνωστικών ΡΕΤ, η αναζήτηση ραδιοδιαγνωσπκών του<99m>Tc (γ-ακτινοβολία) για ανίχνευση των αμυλοειδών πλακών με τομογραφία γ-κάμερας (Single Photon Emission Computed Tomography, SPECT) έχει αποτελέσει σημαντικό ερευνητικό στόχο διεθνώς. Το γεγονός αυτό οφείλεται στο ότι το<99m>Tc, το πλέον χρησιμοποιούμενο ραδιονουκλίδιο στην κλινική πράξη, έχει ιδανικές ιδιότητες για απεικόνιση in vivo, είναι άμεσα και ευρέως διαθέσιμο μέσω των φορητών γεννητριών<99>Mo/<99m>Tc και σε χαμηλότερο κόστος σε σχέση με τα ραδιοϊσότοπα ΡΕΤ τα οποία απαιτούν εγκατάσταση κυκλότρου για την παραγωγή τους. Πλήθος ενώσεων του<99m>Tc με ποικίλες δομές (συμπεριλαμβανομένων παραγώγων του βενζοφουρανίου , φλαβόνης, χαλκόνης, βενζοθειαζολίου, βενζοξαζολίου, κουρκουμίνης, χρυσαμίνης, Congo red) και τρόπους σύμπλεξης έχουν συντεθεί με σκοπό την δημιουργία ενώσεως με χημική συγγένεια για πς αμυλοειδείς πλάκες και κλινικά αποδεκτή διαπερατότητα του αιματοεγκεφαλικού φραγμού [9, 12]. Ανάμεσα στους μεταλλικούς πυρήνες του<99m>Tc που έχουν χρησιμοποιηθεί στην ερευνητική αυτή προσπάθεια γίνεται εδώ ειδική μνεία του κυκλοπενταδιενυλο-τρικαρβόνυλο μεταλλικού πυρήνα [Cp<99m>Tc(CO)3] [13] ο οποίος χρησιμοποιείται και στην παρούσα εφεύρεση. Ο πυρήνας διαθέτει εξαιρετικές ιδιότητες για ραδιοφάρμακο του ΚΝΣ, όπως μικρό μοριακό βάρος και μέγεθος, λιποφιλικότητα, σταθερότητα και ευελιξία στην σύζευξη με βιοδραστικά μόρια που προσδένονται σπς αμυλοειδείς πλάκες [14]. Συγκεκριμένα έχουν συντεθεί τρικαρβονυλο-σύμπλοκα με μίμηση του μοριακού σκελετού της χαλκόνης (Σχήμα 2Α) ή μέσω της σύνδεσης με εστερικό (Σχήμα 2, δομές B, C) ή αμιδικό (Σχήμα 2, δομή D) δεσμό σε διάφορες θέσεις του 2-(4'-αμινοφαινυλο) βενζοθειαζολίου [15-18].

Η αξιολόγηση των συμπλόκων του<99m>Tc που έχουν συντεθεί ως ραδιοδιαγνωστικά γίνεται μέσω του προσδιορισμού της χημικής συγγένειας για αμυλοειδείς πλάκες (in vitro και ex vivo), μέσω του υπολογισμού της σταθερός σύνδεσης στα αμυλοειδή ινίδια Κι, και μέσω του προσδιορισμού της ικανότητάς τους να εισέρχονται στον εγκέφαλο όπως αυτή προσδιορίζεται με πειράματα βιοκατανομής σε πειραματόζωα [17]. Σε πρόσφατη ανασκόπηση της σχετικής βιβλιογραφίας παρατίθενται οι σταθερές συγγένειας των ενώσεων με το αμυλοειδές πεπτίδιο και τα ποσοστά %ID/g στην περιοχή του εγκεφάλου [9]. Τα σύμπλοκα παρουσιάζουν από μεσαία έως υψηλή συγγένεια για αμυλοειδή συσσωματώματα Αβ1-42 (Κi = 12.4 -204.1 nΜ) και ισχυρή ικανότητα χρώσης των Αβ πλακών. Όμως, σε πειράματα βιοκατανομής δείχνουν περιορισμένη εγκεφαλική πρόσληψη (0.26-1.06% ID/g). Μέχρι σήμερα δεν έχει δημιουργηθεί σκεύμασμα του<99m>Tc που να συγκεντρώνει επιθυμητές ιδιότητες για να κριθεί υποψήφιο για κλινικές μελέτες.

Φάρμακο κατά της νόσου Alzheimer δεν υπάρχει. Η θεραπευτική αγωγή είναι μόνο συμπτωματική και αποβλέπει στην ύφεση των εκδηλώσεων της νόσου μέσω της τόνωσης της νευροδιαβιβαστικής λειτουργίας [19]. Παρ' όλη την τεράστια ερευνητική επένδυση μόνο πέντε φάρμακα είναι διαθέσιμα για την προσωρινή τόνωση της μνήμης και της σκέψης των ασθενών https: / / www.alz.org/research/science/ alzheimers treatment horizon .asp. Μία από τις βασικές θεραπευτικές προσεγγίσεις της νόσου στοχεύει στην παρεμπόδιση της συσσωματώσεως του β-αμυλοειδούς πεπτιδίου είτε σε διαλυτά ολιγομερή (τα οποία επίσης συνδέονται με νευροτοξική δράση [20]) είτε σε αδιάλυτα αμυλοειδή ινίδια. Πληθώρα συνθετικών ενώσεων και φυσικών προϊόντων έχουν μελετηθεί in vitro για την αλληλεπίδρασή τους με το βαμυλοειδές πεπτίδιο και την δυνατότητα να παρεμβαίνουν στην διαδικασία της συσσωμάτωσής του με θετικά αποτελέσματα στην μείωση του σχημαπσμού τοξικών συσσωματώσεων και ινιδίων [21, 22]. Η αποτίμηση της δραστικότητας των εν δυνάμει αναστολέων γίνεται με φθορισμομετρία θειοφλαβίνης Τ που ανιχνεύει ώριμα ινίδια, καθώς και με παρατήρηση του πλήθους και της μορφής των ινιδίων στο ηλεκρονικό μικροσκόπιο [23]. Γίνεται επίσης με την αποτίμηση της δυνατότητας να αναστέλλουν την τοξικότητα του ,β-αμυλοειδούς πεπτιδίου σε κυτταροκαλλιέργειες νευρικών κυττάρων [24]. Παρ' όλο που πολλές ενώσεις στην βιβλιογραφία παρεμβαίνουν στην διαδικασία συσσωμάτωσής του ,β-αμυλοειδούς πεπτιδίου και πολλές (>400) ευρίσκονται σε κλινικές δοκιμές ([25], https : / / clinical trials . gov / ) η διέλευση του αιματοεγκεφαλικού φραγμού αποτελεί το κυριώτερο αίτιο της μη εξέλιξής τους σε φαρμακευτικούς παράγοντες της νόσου Alzheimer [3].

Καρκίνος του εγκεφάλου

Ο καρκίνος του εγκεφάλου (πρωτογενής και μεταστατικός) χαρακτηρίζεται από χαμηλό προσδόκιμο επιβίωσης με μόνο το 14% των ασθενών να επιβιώνει 10 χρόνια μετά την διάγνωση στις ανεπτυγμένες χώρες (http:/ /www.cancerresearchuk.org/health-professional/cancer-statistics/) . Θα πρέπει να σημειωθεί όπ παρ' όλο που οι όγκοι του κεντρικού νευρικού συστήματος αποτελούν το 1.8% όλων των περιπτώσεων καρκίνων διεθνώς [26] η συχνότητά τους αυξάνει σημαντικά στις νεαρές ηλικίες. Σύμφωνα με σταπστική μελέτη του 2016 είναι ο πιό συχνός καρκίνος στα παιδιά (ηλικία 0-14 έτη) και ο τρίτος πιό συχνός καρκίνος στην ηλικιακή ομάδα 15-39 [26, 27],

Παρ' όλο που υπάρχουν αποτελεσματικά αντικαρκινικά φάρμακα, η εφαρμογή τους στην νευρο-ογκολογία περιορίζεται από την παρουσία του αιματοεγκεφαλικού φραγμού [28]. Κυρίως λόγω της περιορισμένης διέλευσης του αιματοεγκεφαλικού φραγμού και της χαμηλής συγκέντρωσης στην εστία του όγκου, οι επιλογές για συστηματική χημειοθεραπεία είναι περιορισμένες, και το τελικό τους αποτέλεσμα στην επιβίωση του ασθενούς είναι ακόμα αμφισβητήσιμο [29, 30]. Ως επακόλουθο, η κύρια αντιμετώπιση του καρκίνου του εγκεφάλου παραμένει η ακτινοθεραπεία και η χειρουργική επέμβαση με χαμηλές θεραπευτικές επιδόσεις. Η αποτελεσματική αντιμετώπιση των όγκων επομένως συνδέεται άρρηκτα με την διέλευση του αιματοεγκεφαλικού φραγμού η οποία αναδεικνύεται την τελευταία δεκαετία σε πρωτεύοντα στόχο της φαρμακευτικής έρευνας [31].

Η διάγνωση των εγκεφαλικών όγκων βασίζεται σε κλινικά χαρακτηριστικά συμπτώματα, νευρολογική εξέταση και νευροαπεικόνιση, κυρίως με μαγνητική τομογραφία (MRI) [32]. Η νευροαπεικόνιση με ραδιοφάρμακα (τομογραφίες ΡΕΤ, SPECT) είναι εξαιρετικά σημαντική για την παρακολούθηση της πορείας του όγκου μετά την θεραπεία ή μετά την χειρουργική επέμβαση όταν η φλεγμονή της περιοχής ή η ύπαρξη νεκρωτικού ιστού καθιστούν την διάκριση του καρκινικού ιστού δυσκολότερη με MRI. Ανάμεσα στις ραδιοεπισημασμένες ενώσεις που έχουν εφαρμοστεί κλινικά για απεικόνιση εγκεφαλικών όγκων (όπως<121>T1C1, ή<18>F-FDG), είναι και ενώσεις του<99m>Tc όπως το<99m>Tc-tetrofosmin,<99m>Tc-sestamibi,<99m>Tcglucoheptonate [33]. Τα φάρμακα αυτά δεν είναι ειδικά και η πρόσληψή τους συνδέεται κυρίως με την αυξημένη αιμάτωση του όγκου. Υπό το πρίσμα αυτό κάθε ένωση του<99m>Tc που διέρχεται τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό σε μεγάλο βαθμό - όπως οι ενώσεις που πραγματεύεται η εφεύρεση αυτή - είναι δυνατόν να οδηγήσει σε ακριβέστερη διάγνωση. Η ύπαρξη στην δομή των ενώσεων της εφεύρεσης των φαρμακοφορικών δομών του βενζοθειαζολίου, βενζιμιδαζολίου και βενζοξαζολίου, που εμφανίζουν - μεταξύ άλλων - και αντικαρκινική δράση [34-36], αυξάνει τις πιθανότητες για πρόσληψη από τον όγκο. Επίσης η δυνατότητα της χρήσης στην θέση του<99m>Tc των ραδιοϊσοτόπων του ρηνίου<186>Re και<188>Re που δίνουν σύμπλοκα ίδιας δομής με το<99m>Tc και εκπέμπουν β-ακτινοβολία κατάλληλη για θεραπεία [37] αυξάνει περαιτέρω το εύρος των εν δυνάμει εφαρμογών των ενώσεων της εφεύρεσης στον καρκίνο του εγκεφάλου.

γ. Αντικείμενο της εφεύρεσης

Αντικείμενο της παρούσας εφεύρεσης είναι η δημιουργία και η εφαρμογή συμπλοκών ενώσεων που εμφανίζουν υψηλή διαπερατότητα του αιματοεγκεφαλικού φραγμού ώστε να μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως διαγνωστικά ή /και θεραπευτικά μέσα νόσων του εγκεφάλου και του ΚΝΣ γενικότερα. Συγκεκριμένα, η εφεύρεση πραγματεύεται την χρήση του κυκλοπενταδιενυλικού ανιόντος, συνδεδεμένου με μικρού μοριακού βάρους ετεροκυκλικές ενώσεις της οικογένειας των βενζοθειαζολίων, βενζιμιδαζολίων και των βενζοξαζολίων, ως υποκαταστάτη του τρικαρβονυλομεταλλικού πυρήνα M(CO)3<+>και την δημιουργία ενώσεων του γενικού χημικού τύπου 1

Στον γενικό τύπο 1,

- Μ είναι Re, Tc ή άλλο μέταλλο μεταπτώσεως που σχηματίζει τρικαρβονυλικό πυρήνα του τύπου M(CO)3<+>

X είναι S (οικογένεια βενζοθειαζολίων), Ν (οικογένεια βενζιμιδαζολίων), Ο (οικογένεια βενζοξαζολίων)

R1, R2, R3 και R4 είναι σε όλους τους δυνατούς συνδυασμούς: υδρογόνο, αλογόνα, νίτρο-, αλκυλο-, αλογονοαλκυλο- με 0 έως 3 άτομα αλογόνου σε κάθε άτομο άνθρακα, αμινοαλκυλο-, αλκυλαμινο-, υδροξυ-, αλκοξυ-, βενζυλοξυ-, αρυλοξυ-, -SO2-C(=Ο)NR2, -C(=S)NR2, -SO2NR2, -NRC(=0)-, όπου R είναι υδρογόνο ή C1-C6αλκυλ-ομάδες

R5,R6είναι σε όλους τους δυνατούς συνδυασμούς: υδρογόνο, -N(R)2 > -NRC(=Ο) όπου R είναι υδρογόνο ή C1C6-αλκυλο- ομάδες

R7για X = Ν είναι Η, αλκυλο-, αλκενυλο-, αλογονοαλκυλο- με 0 έως 3 άτομα αλογόνου σε κάθε άτομο άνθρακα, αλκοξυαλκυλο-, κυκλοαλκυλο-, αρυλοαλκυλο-, ενώ για X = S, Ο δεν υφίσταται

Οι ενώσεις εμφανίζουν υψηλή διαπερατότητα του αιματοεγκεφαλικού φραγμού (Παράδειγμα 9). Το γεγονός αυτό σε συνδυασμό με τον ετεροκυκλικό σκελετό των βενζοθειαζολίων, βενζιμιδαζολίων και βενζοξαζολίων που απαντώνται σε φυσικά προϊόντα και βιοδραστικές ενώσεις [34-36, 38] καθιστά τις ενώσεις υποψήφιες προς διερεύνηση για πλήθος εφαρμογών ως φάρμακα του ΚΝΣ.

Πρωτεύον πεδίο εφαρμογής της εφεύρεσης είναι η νόσος Alzheimer. Ενώσεις του γενικού τύπου 1 εμφανίζουν χημική συγγένεια για τις αμυλοειδείς πλάκες που χαρακτηρίζουν την νόσο Alzheimer (Παράδειγμα 10) επομένως είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθούν ως απεικονιστικά / διαγνωστικά μέσα μέσω της χρήσης του ραδιενεργού<99m>Tc και διάγνωση με SPECT. Εμφανίζουν επίσης ισχυρή αλληλεπίδραση με τα αμυλοειδή ινίδια (Παράδειγμα 11), αναστέλλουν την τοξικότητα του β- αμυλοειδούς πεπτιδίου σε κυτταροκαλλιέργειες πρωτογενών νευρικών κυττάρων (Παράδειγμα 12) και έχουν αντιοξειδωτική δράση ένανπ ελευθέρων ριζών οξυγόνου που εμφανίζονται αυξημένες στην νόσο Alzheimer (Παράδειγμα 13). Είναι επομένως δυνατόν να χρησιμοποιηθούν ως θεραπευτικά μέσα για την νόσο Alzheimer μέσω της χρήσης σταθερών μετάλλων όπως το Re, αλλά και άλλων μετάλλων μεταπτώσεως.

Πέραν της νόσου Alzheimer, η υψηλή διέλευση του αιματοεγκεφαλικού φραγμού αποτελεί σημαντικό εύρημα για την επέκταση της εφεύρεσης και προς την κατεύθυνση της διάγνωσης και θεραπείας εγκεφαλικών όγκων μέσω της πρόσληψης των ενώσεων του γενικού τύπου 1 από το πυκνό πλέγμα των αγγείων του αναπτυσσόμενου όγκου. Η διαγνωστική εφαρμογή θα γίνεται μέσω της χρήσης του ραδιενεργού<99m>Tc ως μετάλλου και τομογραφίας SPECT, η δε θεραπευτική εφαρμογή θα γίνεται πρωτίστως μέσω της χρήσης των ραδιενεργών ισοτόπων του ρηνίου<186>Re και<188>Re που εκπέμπουν β- ακτινοβολία κατάλληλη για θεραπεία.

6. Πλεονεκτήματα της εφεύρεσης

Το μέγα πλεονέκτημα των ενώσεων που πραγματεύεται η εφεύρεση είναι η υψηλή διέλευση του αιματοεγκεφαλικού φραγμού που φτάνει στα 7.04% ID/gr για την ένωση<99m>Tc-2. Η διέλευση του αιματοεγκεφαλικού φραγμού είναι πολύ υψηλότερη από αυτήν των ενώσεων του<99m>Tc που έχουν συντεθεί ως ραδιοδιαγνωστικά της νόσου Alzheimer η καλύτερη των οποίων φτάνει τα 1.21% ID/gr στα 2 min μετά την χορήγηση [9]) και στα ίδια επίπεδα με τα εν χρήσει ραδιοφάρμακα για την αιμάτωση του εγκέφαλου, το<99m>Tc-HMPAO (5% ID/gr στα 60 min μετά την χορήγηση [39]) και το<99m>Tc-ECD (1.32% ID/organ at 2 min μετά την χορήγηση [40], περίπου 4.4% ID/gr). Με δεδομένο τον πρωτεύοντα ρόλο του εγκεφάλου για την ζωή καθώς και την δυσκολία πρόσβασης στην κραντοεγκεφαλική κοιλότητα λόγω του αιματοεγκεφαλικού φραγμού , διαφαίνεται ότι η καινοτομία και προσπθέμενη αξία της εφεύρεσης είναι μεγάλη σε σχέση με τα διαθέσιμα σκευάσματα για την αντιμετώπιση παθήσεων του εγκεφάλου. Επιπλέον, μέγα πλεονέκτημα της εφεύρεσης αποτελεί η αποδεδειγμένη δυνατότητα εφαρμογής των ενώσεων στην νόσο Alzheimer.

ε. Περιγραφή σχημάτων /απεικονίσεων

Το Σχήμα 1 παρουσιάζει τις χημικές δομές των εγκεκριμένων από το FDA ραδιοαδιαγνωστικών επισημασμένων με<18>F για ανίχνευση των αμυλοειδών πλακών της νόσου Alzheimer με τομογραφία ΡΕΤ.

Το Σχήμα 2 παρουσιάζει τις χημικές δομές κυκλοπενταδιενυλο συμπλοκών που έχουν παρουσιαστεί στην βιβλιογραφία ως ραδιοδιαγνωστικά για την νόσο Alzheimer.

Το Σχήμα 3 παρουσιάζει την εφαρμογή των μη ραδιενεργών συμπλοκών του Re σε in vitro μελέτες απεικόνισης των αμυλοειδών πλακών με την χρήση συνεστιακής μικροσκοπίας (φίλτρο DAPI, διέγερση 365 nm, εκπομπή 445 nm), Παράδειγμα 10. Συγκεκριμένα, δίδεται η χρώση τομών από κροταφικό λοβό ασθενούς με νόσο Alzheimer με τα σύμπλοκα Re -2 (A), Re-3 (Β), Re-4 (Δ) και Re-5 (Ε). Για λόγους σύγκρισης, αντίστοιχες τομές επωάστηκαν με την Θειοφλαβίνη S (Γ, ΣΤ). Η κλίμακα είναι 100 μm στις A, Β, Γ και 50 μm στις Δ, Ε, ΣΤ.

Το Σχήμα 4 παρουσιάζει: (Α) την επίδραση της παρουσίας των συμπλοκών Re-2 και Re-3 (1 και 2 μΜ) στην επαγόμενη από το Αβ42 κυτταροτοξικότητα σε καλλιέργειες πρωτογενών νευρώνων από ιππόκαμπους μυών μετά από επώαση 24 h στους 37<ο>C με την χρήση της μεθόδου ΜΤΤ (Παράδειγμα 12), (Β) την επίδραση της παρουσίας των συμπλοκών Re-2 και Re-3 (1 και 2 μΜ) στην επαγόμενη από το Αβ42 δημιουργία ROS σε πρωτογενείς καλλιέργειες νευρώνων από ιππόκαμπους μυών μετά από επώαση 24 h στους 37 °C. Τα επίπεδα ROS προσδιορίστηκαν με την φθορισμομετρική μέθοδο DCF (Παράδειγμα 13). Τα αποτελέσματα (που προέκυψαν από n = 3 ανεξάρτητα πειράματα, όπου κάθε συνθήκη επαναλήφθηκε 6 φορές) παρουσιάζονται ως μέσος όρος τιμών ± SEM. *p≤0.05, **p≤0.01, ***p≤0.001, ns (not significant) >0.05 σε συσχέτιση με το Αβ42 (1 μΜ) και #p<0.01 and ##p<0.01. ###p<0.001 σε συσχέτιση με τα κύτταρα παρουσία μόνο θρεπτικού υλικού (μάρτυρας).

στ. Πραγματοποίηση της εφεύρεσης - Παραδείγματα

Στο πλαίσιο της πραγματοποίησης της εφεύρεσης παρουσιάζονται παραδείγματα με πειραματικά αποτελέσματα:

• σύνθεσης των προδρόμων ενώσεων Fe-2 - Fe-6 (Παραδείγματα 1 - 5)

• σύνθεσης των τελικών ενώσεων με σταθερό Re (Re-2 - Re-6, Παράδειγμα 6)

• σύνθεσης των τελικών ενώσεων σε επίπεδο ραδιενεργού<99m>Tc (<99m>Tc-2 -<99m>Τc-5, Παράδειγμα 7)

• αξιολόγησης της σταθερότητας και λιποφιλικότητας των συμπλοκών<99m>Tc-2 -<99m>Tc-4 (Παράδειγμα 8)

• αξιολόγησης της διαπερατότητας του αιματοεγκεφαλικού φραγμού για τα<99m>Tc-2 -<99m>Tc-4 σε πειραματόζωα (Παράδειγμα 9)

· εφαρμογής των ενώσεων στην νόσο Alzheimer μέσω της χρώσης τομών εγκεφάλου με αμυλοειδείς πλάκες για τις ενώσεις Re-2 - Re-5 (Παράδειγμα 10), υπολογισμού της σταθεράς δέσμευσής τους σε αμυλοειδή ινίδια για τις ενώσεις<99m>Tc-2 -<99m>Tc-4, (Παράδειγμα 11), αναστολής της τοξικότητας των αμυλοειδών ινιδίων σε πρωτογενή νευρικά κύτταρα για τις Re-2, Re-3 (Παράδειγμα 12) και της αντιοξειδωτικής δράσης ένανπ ROS για τις ενώσεις Re-2, Re-3 (Παράδειγμα 13).

Θα πρέπει να σημειωθεί ότι τα μέταλλα Re και<99m>Tc έχουν παρόμοιες φυσικές και χημικές ιδιότητες και σχηματίζουν σύμπλοκα με ίδια χημική δομή και παρόμοια βιολογική συμπεριφορά. Στο πλαίσιο της παρούσας εφεύρεσης, το μη ραδιενεργό Re χρησιμοποιείται στην θέση του ραδιενεργού<99m>Tc για πς διαδικασίες σύνθεσης και χαρακτηρισμού των ενώσεων (Παράδειγμα 6) και σε πολλά πειράματα βιολογικής αξιολόγησης για πρακτικούς λόγους αποφυγής της ραδιενέργειας που απαιτεί ειδικούς χώρους και προφυλάξεις (Παραδείγματα 10, 12, 13), ενώ το<99m>Tc είναι αναντικατάστατο στα πειράματα βιοκατανομής σε πειραματόζωα (Παράδειγμα 9).

Παράδειγμα 1

Σύνθεση φερροκενυλο-βενζοθειαζολίου (Fe-2)

Μείγμα φερροκενυλο-καρβαλδεΰδης (1.1 g, 5 mmol) και 2-αμινοθειοφαινόλης (600 μL, 5.6 mol, 5 eq) σε αιθανόλη (40 mL) αναδεύτηκε σε συνθήκες επαναρροής για 16 ώρες. Η αντίδραση αφέθηκε να επιστρέφει σε θερμοκρασία περιβάλλοντος και κατέπεσε ίζημα χρώματος καφε-κόκκινου. Το καθαρό προϊόν απομονώθηκε μετά από χρωματογραφία στήλης του ιζήματος με διαλύτη έκλουσης εξάνιο:οξεικό αιθυλεστέρα από 98:2 έως 96:4. Η απόδοση της αντίδρασης ανήλθε σε 92%. NMR (DMSO-d6, ppm/. Ή (500 MHz) 8.03, 7.92, 7.47, 7.39, 5.02, 4.60, 4.16; (126 MHz) 153.43, 126.24, 124.52, 121.96, 121.80, 70.82, 70.13, 68.50. MS (ESI) m/z: [M+H]<+>υπολογισθέν για Ci H1NS<56>Fe, 320.0188; ευρεθέν, 320.0188.

Παράδειγμα 2

Σύνθεση φερροκενυλο-βενζιμιδαζολίου (Fe-3)

Μείγμα φερροκενυλο-καρβαλδεΰδης (0.76 g, 4 mmol) και μεταδιθειώδους νατρίου (1.44 g, 1.4 mmol) διαλύθηκε σε μείγμα νερού :αιθανόλης (1:1). Το μείγμα της αντίδρασης θερμάνθηκε σε θερμοκρασία επαναρροής υπό ανάδευση για 1 ώρα. Σε θερμοκρασία δωματίου, προστέθηκε 1,2-διαμινοβενζόλιο (0.4 g, 4 mmol) και το μείγμα της αντίδρασης θερμάνθηκε σε συνθήκες επαναρροής υπό ανάδευση για 1 ακόμη ώρα. Στη συνέχεια η αντίδραση αφέθηκε να επιστρέφει σε θερμοκρασία περιβάλλοντος και τέλος στους 0 °C, όπου και σχηματίστηκε ίζημα πορτοκαλί χρώματος. Το καθαρό προϊόν απομονώθηκε με χρωματογραφία στήλης του ιζήματος με διάλυμα έκλουσης διχλωρομεθάνιο : οξεικό αιθυλεστέρα 96:4. Η απόδοση της αντίδρασης ανήλθε σε 62%. NMR (DMSO-d6, ppm): Ή (500 MHz) 12.35, 7.54, 7.44, 7.13, 5.04, 4.47, 4.10;<13>C NMR (126 MHz) 152.92, 120.86, 117.50, 110.15, 69.31, 68.91, 66.90.

Παράδειγμα 3

Σύνθεση φερροκενυλο-μεθυλοβενζιμιδαζολίου (Fe-4)

Σε ένα διάλυμα NaOH (0.535 g, 13.4 mmol) σε νερό (1 mL) προστίθεται ακετόνη (7.5 mL) και φερροκενυλο-βενζιμιδαζόλιο (Fe-3) (0.54 g, 1.8 mmol), και αφού αφήνεται σε ανάδευση για 5 λεπτά, ακολουθεί η προσθήκη μεθυλοΐωδίου (145 μL, 2.3 mmol) στάγδην, στους 0 °C σε παγόλουτρο. Το μείγμα της αντίδρασης αφήνεται σε ανάδευση για 1 h σε θερμοκρασία περιβάλλοντος, οπότε και η ακετόνη εξατμίζεται υπό κενό, το μείγμα αραιώνεται με την προσθήκη νερού (50 mL) και η υδατική φάση εκχυλίζεται περαιτέρω με διχλωρομεθάνιο (3 χ 30 ml). Οι οργανικές φάσεις στην συνέχεια πλένονται με κορεσμένο διάλυμα χλωριούχου νατρίου, ακολουθεί ξήρανση με Na2SO4, συμπύκνωση υπό κενό και παραλαβή ελαιώδους προϊόντος. Το καθαρό προϊόν απομονώνεται μετά από χρωματογραφία στήλης του ελαίου με διαλύτη έκλουσης διχλωρομεθάνιο:οξεικό αιθυλεστέρα 96:4. Η απόδοση της αντίδρασης ανήλθε σε 95%. NMR (DMSO-d6, ppm): Ή (500 MHz) 7.55, 7.22, 7.17, 4.99, 4.53, 4.21, 4.03;<13>C NMR (126 MHz) 152.74, 142.57, 136.71, 121.51, 118.04, 69.80, 69.25, 68.77, 31.19.

Παράδειγμα 4

Σύνθεση φερροκενυλο-βενζοξαζολίου (Fe-5)

Διάλυμα φερροκενυλο-καρβαλδεϋδης (642 mg, 3.00 mmol) και 2-αμινοφαινόλης (330 mg, 3.00 mmol) σε οξεικό οξύ (10 ml) αναδεύεται σε θερμοκρασία περιβάλλοντος για 15 min. Ακολουθεί η αργή προσθήκη ενός καυτού διαλύματος ανύδρου οξεικού μολύβδου (1350 mg 3.03 mmol) σε οξεικό οξύ (40 ml) για 30 min, και το μείγμα της αντίδρασης χύνεται σε 50 g πάγο. Η υδατική φάση εκχυλίζεται με διχλωρομεθάνιο (3 χ 30 mL). Οι οργανικές φάσεις στη συνέχεια πλένονται με κορεσμένο διάλυμα NaCl, ακολουθεί ξήρανση με Na2SΟ4και συμπύκνωση υπό κενό που οδηγεί στον σχηματισμό στερεού υπολείμματος. Το καθαρό προϊόν απομονώνεται ως κοκκινο-καφέ σκόνη με χρωματογραφία στήλης του στερεού μείγματος με διάλυμα έκλουσης διχλωρομεθάνιο :εξάνιο 10:90. Η απόδοση της αντίδρασης ανήλθε σε 42%. NMR (DMSO-d6, ppm): Ή (500 MHz) 7.69, 7.35, 5.06, 4.62, 4.20; (126 MHz) 165.53, 150.00, 141.86, 124.46, 124.34, 118.83, 110.47, 71.10, 69.62, 68.24.

Παράδειγμα 5

Σύνθεση 2-διμεθυλαμινοφερροκενυλο-βενζοθειαζολίου (Fe-6)

Η σύνθεση γίνεται σύμφωνα με το Παράδειγμα 1 με την χρήση 2-αμινοθειοφαινόλης και 2-διμεθυλαμινοφερροκενυλο-καρβαλδεΰδης. Το καθαρό προϊόν απομονώνεται μετά από χρωματογραφία στήλης με διαλύτη έκλουσης διχλωρομεθάνιο: οξεικό αιθυλεστέρα 96:4. Η απόδοση της αντίδρασης ανήλθε σε 53%. NMR (DMSO-d6, ppm)<1>H (500 MHz) 8.04, 7.93, 7.47, 7.40, 4.97, 4.58, 4.51, 4.11, 2.16;<13>C (126 MHz) 153.02, 126.11, 124.49, 121.85, 121.71, 97.5, 73.64, 70.64, 69.81, 69.09, 44.69.

Η 2-διμεθυλαμινοφερροκενυλο-καρβαλδεΰδη συντίθεται από φερροκενυλοκαρβοξυλικό οξύ σύμφωνα με την αλληλουχία αντιδράσεων και την διαδικασία που δίδεται κατωτέρω:

Σε διάλυμα (εμπορικά διαθέσιμου) φερροκενυλο-καρβοξυλικού οξέος (2.3 g, 10 mmol) σε άνυδρο διχλωρομεθάνιο (20 mL) προστίθεται στάγδην οξαλυλοχλωρίδιο (1.8 mL, 20 mmol) σε παγόλουτρο (0 °C) και σε περιβάλλον αζώτου. Ακολουθεί η προσθήκη σταγόνας DMF. Το μείγμα της αντίδρασης φτάνει σε θερμοκρασία περιβάλλοντος με την απομάκρυνση του παγόλουτρου και μένει υπό ανάδευση για 3 ώρες. Με την παρουσία αζώτου, απομακρύνεται υπό κενό ο διαλύτης και η περίσσεια του χλωριδίου, και το κόκκινο στερεό επαναδιαλυτοποιείται σε διχλωρομεθάνιο (20 mL). Στο διάλυμα αυτό προστίθεται βρωμιούχο τετραβουτυλοαμμώνιο (12 mg, 0.03 mmol), και ακολουθεί η προσθήκη διαλύματος NaN3 (1 g, 15 mmol) σε νερό (5 mL). Το μείγμα της αντίδρασης αφήνεται σε ανάδευση σε περιβάλλον αζώτου και θερμοκρασία δωματίου για 18 h. Η αντίδραση τελειώνει με την προσθήκη επιπλέον νερού (50 mL) και η οργανική φάση διαχωρίζεται ενώ η υδατική εκχυλίζεται με διχλωρομεθάνιο (2 χ 20 mL). Η οργανική φάση στη συνέχεια πλένεται με κορεσμένο διάλυμα NaCI, ακολουθεί ξήρανση με Na2SO4και συμπύκνωση υπό κενό για την απομάκρυνση του διαλύτη. Το καθαρό αζίδιο απομονώνεται ως κόκκινο στερεό με χρωματογραφία στήλης του μείγματος με διάλυμα έκλουσης διχλωρομεθάνιο :εξάνιο 1:1. Η απόδοση της αντίδρασης ανήλθε σε 78%. NMR (CDCI3, ppm): Ή (500 MHz) 4.78, 4.55, 4.05;<13>C (126 MHz) 176.1, 89.0, 76.3, 78.0, 80.1.

Στην συνέχεια, το αζίδιο (2.3 mmol) διαλύεται σε τολουόλιο (15 mL) και το διάλυμα θερμάνεται στους 105 °C σε συνθήκες επαναρροής και παρουσία αζώτου, και προστίθεται ποσότητα 2-(τριμεθυλοσιλυλο)αιθανόλης (4.7 mmol) σε μια δόση. Το διάλυμα που προκύπτει αναδεύεται στις συνθήκες αυτές για 3 h, μέχρι που το χρώμα αλλάζει προς σκούρο πορτοκαλί. Το μείγμα αφήνεται να επιστρέφει σε θερμοκρασία περιβάλλοντος, προστίθεται NaOH (1 Μ, 50 mL) και αναδεύεται για 10 λεπτά. Η οργανική φάση διαχωρίζεται και η υδατική φάση εκχυλίζεται με διχλωρομεθάνιο (2 χ 20 mL). Οι οργανικές φάσεις στη συνέχεια εκπλένονται με κορεσμένο διάλυμα NaCl, ακολουθεί ξήρανση με Na2SO4και συμπύκνωση υπό κενό για την απομάκρυνση του διαλύτη και την δημιουργία ενός κοκκινωπού στερεού, το οποίο και καθαρίζεται με ανακρυστάλλωση από σύστημα διχλωρομεθανίου / εξανίου . Το καρβαμίδιο που σχηματίζεται (2.1 mmol) διαλύεται σε διάλυμα 1 Μ TBAF σε THF και το διάλυμα της αντίδρασης θερμαίνεται στους 50 °C για 15 min. Ο διαλύτης απομακρύνεται υπό κενό και στο μείγμα προστίθεται διχλωρομεθάνιο (50 mL) και νερό (50 mL). Μετά από ανάδευση οι δύο φάσεις διαχωρίζονται και η υδατική φάση εκχυλίζεται με διχλωρομεθάνιο (2 χ 20 mL). Οι οργανικές φάσεις στην συνέχεια εκπλένονται με κορεσμένο διάλυμα NaCl, ακολουθεί ξήρανση με Na2SO4, και συμπύκνωση υπό κενό για την απομάκρυνση του διαλύτη και την παραλαβή φερροκενυλο-αμίνης ως κόκκινης σκόνης. NMR (CDCI3, ppm): Ή (500 MHz) 4.09, 4.00, 3.85, 260;<13>C (126 MHz) 105.63, 68.85, 63.43, 58.80.

Στην συνέχεια, σε διάλυμα της φερροκενυλο-αμίνης (1.07 g, 5.32 mmol) σε οξεικό οξύ (15 mL) παρουσία αζώτου προστίθεται παραφορμαλδεΰδη (1.59 g, 53.2 mmol) και NaBH3CN (1.67 g, 26.6 mmol) και το μείγμα της αντίδρασης αφήνεται υπό ανάδευση 16 h. Ακολουθεί προσθήκη υδατικού διαλύματος NaOH 6 Μ μέχρι pH = 12 και το υδατικό μείγμα εκχυλίζεται με εξάνιο (3 x 20 mL). Η οργανική φάση στη συνέχεια εκπλένεται με κορεσμένο διάλυμα NaCl, ακολουθεί ξήρανση με Na2SO4και συμπύκνωση υπό κενό για την απομάκρυνση του διαλύτη μέχρι περίπου το 5% του αρχικού όγκου. Το υπόλειμμα υποβάλλεται σε γρήγορο φιλτράρισμα από silica-gel με εξάνιο, ο διαλύτης απομακρύνεται υπό κενό μέχρι περίπου το 5% του αρχικού όγκου. Το τελικό καθαρό προϊόν κρυστάλλωσε στην κατάψυξη (0.88 g, 73%) ως πορτοκαλί νιφάδες; mp 69-70 °C; NMR (CDCI3, ppm): Ή (500 MHz) 4.25, 3.95, 3.76, 2.59;<13>C (126 MHz) 155.80, 66.50, 63.07, 54.61, 41.50.

Σε διάλυμα (0. 1 Μ) της φερροκενυλο-διμεθυλαμίνης (0.229 g, 1 mmol) σε THF στους 0 °C και παρουσία αζώτου προστίθεται BF3'OEt2 (1.05 ισοδύναμα). Μετά από ανάδευση, το διάλυμα της αντίδρασης ψύχεται στους -78 °C σε λουτρό ακετόνης-υγρού αζώτου, ακολουθεί η προσθήκη n-BuLi (1.10 equiv., σε διάλυμα εξανίου) και η θερμοκρασία φτάνει στους -40<o>C. Μέσα σε περίπου μία ώρα παρατηρείται αλλαγή χρώματος από κίτρινο σε πορτοκαλοκόκκινο και τότε η θερμοκρασία επανέρχεται στους -78 °C, οπότε και γίνεται προσθήκη τDMF (1.20 ισοδύναμα) και η αντίδραση αφήνεται να φτάσει σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Προστίθεται επιπλέον αιθέρας και κορεσμένο διάλυμα NaHCO3. Αφού διαχωριστούν οι δύο φάσεις, η υδατική φάση εκχυλίζεται με αιθέρα. Οι οργανικές φάσεις σιη συνέχεια εκπλένονιαι με κορεσμένο διάλυμα NaCl, ακολουθεί ξήρανση με Na2SO4 και συμπύκνωση υπό κενό για την απομάκρυνση του διαλύτη. Το καθαρό προϊόν παρελήφθη μετά από χρωματογραφία στήλης του μείγματος με διάλυμα έκλουσης 94:5:1 εξάνιο / Εt2O / Et3N . NMR (CDCI3, ppm): Ή (500 MHz) 10.13, 4.63, 4.40, 4.29, 4.27, 2.70; (126 MHz) 192.81, 117.53, 71.81, 69.52, 67.71, 66.23, 60.22, 45.61

Παράδειγμα 6

Σύνθεση κυκλοπενταδιενυλιχών συμπλοκών με τρικαρβονυλτχό ρήνιο (Re-2 -Re-6)

Οι φερροκενυλο-ενώσεις Fe-2 - Fe-6 που παρασκευάστηκαν στα Παραδείγματα 1 - 5, μετατρέπονται στα αντίστοιχα τρικαρβονυλικά σύμπλοκα ρηνίου Re-2 - Re-6 που αντιπροσωπεύονται από τους τύπους

με βάση το γενικό πρωτόκολλο που περιγράφεται για την ένωση Re-2:

Σε διάλυμα χου προδρόμου μορίου [Re(CO)3Br3][NEt4]2 (30 mg, 0.047 mmol) και του φερροκενυλο παραγώγου Fe-2 (0.098 mmol) σε DMF (2.5 mL) προστίθεται διάλυμα 0.1Ν HC1 (1.8 mL) σε υάλινο αυτόκλειστο όγκου 5 mL. Μετά την παροχή αζώτου στο διάλυμα για 5 λεπτά, το μείγμα μένει υπό ανάδευση στους 160 °C για 2h. Η αντίδραση απομακρύνεται από τη θέρμανση, και αφού επιστρέφει σε θερμοκρασία δωματίου προστίθεται διχλωρομεθάνιο (10 mL). Η οργανική φάση εκπλένεται με νερό (3 x 10 mL), με κορεσμένο διάλυμα NaCl, ακολουθεί ξήρανση με Na2SO4και απομάκρυνση του διαλύτη υπό κενό. Το καθαρό προϊόν Re-2 παραλαμβάνεται μετά από χρωματογραφία στήλης του μείγματος με διαλύτη έκλουσης διχλωρομεθάνιο : οξεικό αιθυλεστέρα ή εξάνιο:οξεικό αιθυλεστέρα. NMR (DMSO-d6, ppm): Re-2 Ή (500 MHz) 8.11, 7.98, 7.53, 7.46, 6.65, 5.88;<13>C (126 MHz) 193.94, 161.06, 152.64, 134.23, 126.86, 125.83, 122.63, 122.48, 96.52, 87.09, 86.65; Re-3<1>H (500 MHz) 12.79, 7.56, 7.20, 6.50, 5.85;<13>C NMR (126 MHz) 194.31, 145.49, 143.11, 134.23, 122.81, 121.83, 118.68, 111.18, 94.96, 86.19, 85.14; Re-4 Ή (500 MHz) 7.61, 7.28, 7.23, 6.54, 5.90, 3.88;<13>C NMR (126 MHz) 194.22, 145.88, 141.80, 136.49, 122.83, 122.30, 118.88, 110.41, 93.94, 87.41, 86.37, 31.50; Re-5 Ή (500 MHz) 7.37, 7.31, 6.62, 6.60;<13>C NMR (126 MHz) 194.22, 150.1, 141.21, 137.19, 125.41, 124.23, 119.90, 110.80, 94.93, 87.35, 86.30; Re-6 NMR (DMSO-d6, ppm): Ή (500 MHz) 8.14, 7.98, 7.53, 7.48, 6.60, 6.45, 5.82, 2.32;<13>C (126 MHz) 194.22, 156.02, 128.11, 126.49, 125.83, 123.71, 93.54, 72.64, 70.64, 69.79, 44.69. MS (ESI) m/z: Re-2 [M+H]<+>υπολογισθέν για C15H9NO3S<187>Re 469.9861, ευρεθέν, 469.9852; Re-3 [M+H] υπολογισθέν για C15H10N2O3187Re 453.0169, ευρεθέν, 453.0246

Παράδειγμα 7

Σύνθεση κυκλοπενταδιενυλικών συμπλόκων με τρικαρβονυλικό<99m>Tc (<99m>Tc-2 -<99m>Tc-5)

Οι ενώσεις Fe-2 -Fe-5 που παρασκευάστηκαν στα Παραδείγματα 1 - 4, μετατρέπονται στα αντίστοιχα τρικαρβονυλικά σύμπλοκα του<99m>Tc<99m>Tc-2 -<99m>Tc-5 που αντιπροσωπεύονται από τους τύπους

με βάση τις μεθόδους που περιγράφονται για την ένωση<99m>Tc-2:

Tc-2

Α ' μέθοδος: Η πρόδρομη ένωση Fe-2 (1.0 mg) διαλύεται σε DMF (0.5 mL) και στο διάλυμα προστίθεται το σύμπλοκο fac-[<99m>Tc(H2O)3(CO)3]<+>(0.1 mL, 180 MBq). To μείγμα της αντίδρασης θερμαίνεται, υπό αδρανή ατμόσφαιρα Ν2, στους 120 °C για 3 h και παρασκευάζεται το σύμπλοκο του τεχνητίου-99m για το κάθε παραγωγό, το οποίο απομονώνεται με την τεχνική της HPLC (στήλη C-18 ανάστροφης φάσης, 1 mL/min, διαλύτης μεθανόλη με 0,1% TFA/νερό με 0,1% TFA) στους ανάλογους χρόνους έκλουσης, με το σταθερό σύμπλοκο του ρηνίου ως πρότυπο (απόδοση 50%).

Β’ μέθοδος. Η πρόδρομη ένωση Fe-2 (1.0 mg) και το σύμπλοκο Mn(CO)5Br (1.0 mg) διαλύονται σε DMF (0.5 mL) και στο διάλυμα αυτό προστίθεται το<m>TcO4(0.1 mL, 180 MBq). Το μείγμα της αντίδρασης θερμαίνεται, υπό αδρανή ατμόσφαιρα Ν2, στους 110 °C για 1 h και παρασκευάζεται το σύμπλοκο του τεχνητίου-99m για το κάθε παράγωγο, το οποίο απομονώνεται με την τεχνική της HPLC στους ανάλογους χρόνους έκλουσης, με το σταθερό σύμπλοκο του ρηνίου ως πρότυπο (απόδοση 96%).

Παράδειγμα 8

Σταθερότητα και λιποφιλικότητα των συμπλοκών του<99m>Tc

Η σταθερότητα των συμπλοκών<99m>Tc-2 -<99m>Tc-4 μελετάται παρουσία περίσσειας ανταγωνιστών, όπως τα αμινοξέα κυστεΐνη (Cys) και ιστιδίνη (His) τα οποία μπορούν να δράσουν ως τρισχιδείς υποκαταστάτες (Cys/ His challenge) σύμφωνα με μέθοδο της βιβλιογραφίας [41]. Διάλυμα (100 μL) συμπλόκου του<99m>Tc που απομονώνεται από HPLC αναμειγνύεται με 900 μL διαλύματος των ανταγωνιστών (10<3>Μ) σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (pH 7.4). Το μίγμα επωάζεται στους 37 °C και ελέγχεται με HPLC σε χρονικά διαστήματα 1 h, 3 h και 6 h. Η καταγραφή του ποσοστού του συμπλόκου που παραμένει σταθερό παρουσία των ανταγωνιστών σε κάθε ένα από τα χρονικά σημεία της μελέτης επιτρέπει την εξαγωγή συμπερασμάτων σχετικά με την σταθερότητα του επισημασμένου συμπλόκου.

Η λιποφιλικότητα των συμπλοκών<99m>Tc-2 -<99m>Tc-4 μελετάται με τον προσδιορισμό του συντελεστή κατανομής σε σύστημα οκτανόλης- νερού (PBS) [42]. Η λιποφιλικότητα εκφράζεται ποσοτικά ως logP, όπου το Ρ είναι ο λόγος:

Κρούσεις ανά mL κανονικής οκτανόλης

Κρούσεις ανά mL υδατικού διαλύματος PBS

Οι πμές σταθερότητας παρουσία ανταγωνιστών και λιποφιλικότητας για τα σύμπλοκα<99m>Tc-2 -<99m>TC-4 δίδονται στον Πίνακα 1 και αποτελούν τον μέσο όρο των τιμών από 3 πειράματα.

Πίνακας 1. Σταθερότητα των συμπλόκων<99m>Tc παρουσία περίσσειας ιστιδίνης και κυστεΐνης (ως % του αρχικού συμπλόκου) και δεδομένα λιποφιλικότητας (logPoct/ water)

Παράδειγμα 9

Έλεγχος των ενώσεων<99m>Tc-2<99m>Tc-4 για διαπερατότητα του αιματοεγκεφαλτικού φραγμού

Η αξιολόγηση έγινε μέσω πειραμάτων βιοκατανομής σε μύες τύπου Swiss Albino από το εκτροφείο πειραματόζωων του ΕΚΕΦΕ «Δημόκριτος". Στα πειράματα αυτά μελετάται η κατανομή της ραδιενέργειας στους ιστούς του πειραματόζωου μετά την χορήγηση της ραδιοεπισημασμένης ένωσης. Για την αξιοπιστία των in vivo κατανομών απαιτούνται για κάθε αξιολόγηση τρία ανεξάρτητα πειράματα όπου σε κάθε πείραμα ο πληθυσμός των πειραματόζωων κυμαίνεται από 9 - 12. Η σύνθεση της ραδιοεπισημασμένης ένωσης και τα πειράματα βιοκατανομής γίνονται στους ειδικούς χώρους της Ραδιοφαρμακευτικής του ΕΚΕΦΕ "Δημόκριτος" το οποίο διαθέτει την κατάλληλη υποδομή για την ασφαλή διεξαγωγή των πειραμάτων με χρήση ραδιενέργειας. Όλα τα πειράματα πραγματοποιούνται σύμφωνα με τους κανόνες βιοηθικής της Ευρωπαϊκής Ένωσης για τα πειραματόζωα (απόφαση του ευρωπαϊκού συμβουλίου 2010/63/EU) και με την άδεια της Νομαρχίας Αθηνών.

Για τα πειράματα βιοκατανομής, το πειραματόζωο ακινητοποιείται σε ειδική διάταξη όπου του χορηγείται διάλυμα του ραδιενεργού συμπλόκου (1 - 2 μCϊ) από την φλέβα της ουράς. Μετά την χορήγηση, το πειραματόζωο τοποθετείται σε ειδικό θάλαμο που επιτρέπει την συλλογή των απεκκρινομένων ούρων και παραμένει εκεί μέχρι την στιγμή της θανάτωσης του. Η θανάτωση γίνεται με καρδιοεκτομή και αφού το πειραματόζωο έχει αναισθητοποιηθεί σε θάλαμο κορεσμένο με ατμούς αιθέρα.

Ακολουθεί ζύγιση του πειραματόζωου, συλλογή του αίματος σε προζυγισμένο δοκιμαστικό σωλήνα και τελικά ανατομή του πειραματόζωου όπου αφαιρούνται το ήπαρ, η καρδιά, οι νεφροί, ο στόμαχος, τα έντερα, ο σπλήνας, το πάγκρεας, οι πνεύμονες, ο εγκέφαλος και τμήμα μυός και τοποθετούνται σε προζυγισμένους δοκιμαστικούς σωλήνες. Στην συνέχεια, μετράται η ραδιενέργεια κάθε δείγματος (κρούσεις/ min, cpm) σε μετρητή γ-ακτινοβολίας. Γίνεται επίσης μέτρηση της ραδιενέργειας προτύπου διαλύματος που αντιστοιχεί στο 10% της χορηγούμενης δόσης, για να αποτελέσει μέτρηση αναφοράς για τον υπολογισμό της διάσπασης του<99m>Tc, καθώς επίσης και η μέτρηση της ραδιενέργειας της ουράς (σημείο χορήγησης). Η ραδιενέργεια ανά όργανο (%ID/ organ) και ανά γραμμάριο (%ID/gr) υπολογίζεται σύμφωνα με τις ακόλουθες σχέσεις:

(cpm οργάνου)

% ενεθείσας δόσης/όργανο (%ΙD/όργανο) - - x 100

(cpm αναφοράς)

(cpm οργάνου)

% ενεθείσας δόσης/ gr (%ID/gr) - - — — — - - - x 100

(cpm αναφοράς x βάρος οργάνου)

όπου: cpm αναφοράς = (cpm 10% προτύπου x 10) - cpm ουράς.

Σημειώνεται ότι για τον υπολογισμό της ραδιενέργειας στο αίμα θεωρείται ότι αυτό αποτελεί το 7% του βάρους του σώματος του πειραματοζώου. Τα αποτελέσματα της βιοκατανομής σε μύες Swiss Albino δίδονται στους Πίνακας 2 και 3 για τα σύμπλοκα<99m>Tc-2 και<99m>Tc-3, όπου φαίνεται το εντυπωσιακό ποσοστό της ραδιενέργειας στον εγκέφαλο, 7.04 ± 0.81 %ID/gr για το<99m>Tc-2 και 3.99 ± 0.60 %ID/gr για το<99m>Τc-3. Για το<99m>Tc-4, αντίστοιχα πειράματα έδειξαν εξ' ίσου εντυπωσιακό ποσοστό 6.14 ± 1.00 %ID/gr στα 2 min.

Παράδειγμα 10

Χρώση αμυλοειδών πλακών σε τομές ιστού από εγκέφαλο με νόσο Alzheimer με τα σύμπλοκα Re-2 - Re-5

Σειριακές τομές από κροταφικό λοβό ασθενούς με νόσο Alzheimer πάχους 6 μm οι οποίες έχουν τοποθετηθεί σε αντικειμενοφόρους πλάκες υφίστανται αποπαραφίνωση με ξυλόλιο (2 x 5 min), επανυδάτωση με διαλύματα αιθανόλης- νερού (5 min σε 100%, 80%, 60%, και 0% αιθανόλης-νερού ν/ν), και κατόπιν επωάζονται για 30 min σε ρυθμιστικό διάλυμα PBS (10 mM, pH 7.3). Εν συνεχεία επωάζονται για χρονικό διάστημα 1 h με το υπό μελέτη σύμπλοκο του Re (~1 mg/mL) αλλά και με διάλυμα θειοφλαβίνης S (Th-S) για επιβεβαίωση της παρουσίας αμυλοειδών πλακών

[43]. Οι τομές εκπλένονται με PBS και διάλυμα αιθανόλης (40%) για 2 min και ακολουθεί η παρατήρηση αυτών με συνεστιακό μικροσκόπιο. Αντιπροσωπευτικές εικόνες μικροσκοπίας δίδονται στο Σχήμα 3 όπου είναι εμφανές ότι τα σύμπλοκα Re-2 - Re-5 βάφουν εκλεκτικά πς αμυλοειδείς πλάκες σε βαθμό ανάλογο με αυτό της θειοφλαβίνης S.

Πίνακας 2. Αποτελέσματα βιοκατανομής (%ID/gr) του<99m>Tc-2 σε υγιείς μύες Swiss Albino

Πίνακας 3. Αποτελέσματα βιοκατανομής (%ID/gr) του<99m>Τc-3 σε υγιείς μύες Swiss Albino

Παράδειγμα 11

Μελέτες δέσμευσης των συμπλοκών<99m>Tc-2 -<99m>Tc-4 σε αμυλοειδή ινίδια Το β-αμυλοειδές πεπτίδιο 1-42 (Αβ42) αφού πρώτα υποστεί την κατάλληλη προεπώαση των 15 ημερών (συγκέντρωση 50 μΜ) υπό συνθήκες ηρεμίας, ελέγχεται με φασματοφωτομετρικές τεχνικές και μεθόδους μικροσκοπίας για την ύπαρξη τυπικών αμυλοειδών ινιδίων. Οι ανταγωνιστικές μελέτες δέσμευσης με τη χρήση αμυλοειδών ινιδίων πραγματοποιούνται ως εξής: Σε βοριοπυριτικούς γυάλινους σωλήνες τοποθετούνται 50 nΜ ινιδίων Αβ42 (συγκέντρωση κατά προσέγγιση με βάση την αρχική ποσότητα του β- αμυλοειδούς πεπτιδίου), 0.2 μΟί ραδιενεργού συμπλόκου<99m>Tc και διαφορετικές κάθε φορά συγκεντρώσεις του αντίστοιχου μη-ραδιενεργού συμπλόκου του Re (10-<4>- 10<10>Μ). Τα ανωτέρω διαλύματα επωάζονται για 3 h σε θερμοκρασία δωματίου, διηθούνται με την χρήση φίλτρων (Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 μm ) και μετράται η ραδιενέργεια τόσο στα φίλτρα όσο και στα διηθήματα σε μετρητή γ-ακτινοβολίας. Η κάθε συνθήκη του πειράματος επαναλαμβάνεται εις τριπλούν. Ο προσδιορισμός της σταθερός αναστολής Κϊ γίνεται με την χρήση της εξίσωσης Cheng- Prousof [44]:

(1 [Radioligand] /Kd)

όπου: IC50είναι η τιμή που εκφράζει την συγκέντρωση του αναστολέα (σύμπλοκο του Re) που απαιτείται για να αναστεΐλει το 50% της δέσμευσης με το ραδιενεργό σύμπλοκο του<99m>Tc, [Radioligand] και Kdείναι η συγκέντρωση και η σταθερά διάστασης του ραδιενεργού συμπλόκου του<99m>Tc αντίστοιχα. Στην περίπτωση ομόλογου πειράματος ανταγωνιστικής δέσμευσης θεωρείται ότι το ραδιενεργό και το μη ραδιενεργό σύμπλοκο έχουν παρόμοιες συγγένειες έτσι ώστε Κd= Κi. Επομένως η ανωτέρω σχέση μετασχηματίζεται ως εξής:

Ki = IC50- [Radioligand]

Οι τιμές Ki που υπολογίστηκαν μέσω των ανταγωνιστικών μελετών αναστολής είναι 112.32 ± 12.05 nM, 7.04 ± 2.85 nΜ και 5.74 ± 2.90 nΜ για τα σύμπλοκα<99m>Tc-2,<99m>Τc-3, και<99m>Tc-4 αντίστοιχα. Οι τιμές δείχνουν υψηλή χημική συγγένεια για τα αμυλοειδή ινίδια και ευρίσκονται στην ίδια περιοχή με αυτήν του [<123>Ι]ΙΜΡΥ (12.5 ± 2.8 nΜ) που είναι η μόνη ένωση σε κλινικές δοκιμές ως πιθανό απεικονιστικό αμυλοειδών πλακών με SPECT [45].

Παράδειγμα 12

Αναστολή της τοξικότητας του β-αμυλοειδούς πεπτιδίου σε πρωτογενή νευρικά κύτταρα παρουσία των Re-2 και Re-3

Η συσσωμάτωση του β-αμυλοειδούς πεπτιδίου είτε σε διαλυτά ολιγομερή είτε σε αδιάλυτα ινίδια συνδέεται με την παθογένεια της νόσου Alzheimer και η τοξικότητα του έχει διαπιστωθεί σε συστηματικές μελέτες με καλλιέργειες νευρικών κυττάρων in vitro [46]. Η μελέτη της δυνατότητας αναστολής της τοξικότητας του Αβ42 πραγματοποιήθηκε σε πρωτογενή νευρικά κύτταρα παρουσία των συμπλοκών Re-2 και Re-3.

Για την ανάπτυξη πρωτογενών καλλιεργειών νευρικών κυττάρων χρησιμοποιήθηκαν νεογνά μυών μίας έως τριών ημερών (post natal day 0-3, ΡΟ-3), από τα οποία απομονώθηκε η περιοχή των ιπποκάμπων, σύμφωνα με δημοσιευμένα πρωτόκολλα [47]. Αναλυτικότερα, μετά την θανάτωση των ζώων, οι εγκέφαλοι απομονώνονται αφαιρώντας το δέρμα και το κρανίο με λεπτές λαβίδες και τοποθετούνται σε υγρό μέσο Hibemate-A θερμοκρασίας 4 °C, όπου και πραγματοποιείται η απομόνωση της περιοχής των ιπποκάμπων. Ο ιππόκαμπος έχει σιγμοειδή δομή και βρίσκεται στον έσω κροταφικό λοβό των εγκεφαλικών ημισφαιρίων, ένας για κάθε ημισφαίριο. Στην συνέχεια, οι απομονωμένοι ιππόκαμποι συλλέγονται σε υγρό μέσο Hibemate-A, στο οποίο προστίθεται θρυψίνη 0.25% (w/v) σε διάλυμα 0.05% (w/v) EDTA. Η θρυψίνη λειτουργεί διασπώντας τον ιστό, ούτως ώστε να απομονωθούν τα κύτταρα, ενώ το Hibemate-A είναι θρεπτικό μέσο κατάλληλο για συντήρηση απομονωμένων ζωντανών ιστών.

Ο ιστός επωάζεται στο θρεπτικό μέσο με τη θρυψίνη για 30 min στους 37 °C και κατόπιν, η θρυψίνη απενεργοποιείται με την προσθήκη 10% ορού FBS σε Hibemate-Α. Ο ιστός ξεπλένεται με Hibemate-A, άνευ ορού, μεταφέρεται στο θρεπτικό μέσο καλλιέργειας των κυττάρων Neurobasal-A, το οποίο ευνοεί την ανάπτυξη νευρικών κυττάρων, χωρίς την ανάγκη θρεπτικής υποστήριξης από αστροκύτταρα, όπου και διασπάται σε μονήρη κύτταρα. Ύστερα, το διάλυμα αφήνεται για λίγα λεπτά σε ηρεμία για να διαχωριστούν τα κύτταρα από τον μη διασπασμένο ιστό, ο οποίος καθιζάνει ως ίζημα. Τα κύτταρα καλλιεργούνται στους 37 °C σε κλίβανο επώασης με περιεκτικότητα 5% ατμόσφαιρας CO2. Το θρεπτικό υγρό μέσο καλλιέργειας Neurobasal-A ανανεώνεται κατά το ήμισυ με φρέσκο κάθε 3-4 μέρες για να επιτευχθεί η συνεχής παροχή απαραίτητων συστατικών για τη διατήρηση της καλλιέργειας, μέχρι την επαρκή διαφοροποίηση των κυττάρων.

Για τα πειράματα μελέτης της δυνατότητας αναστολής της τοξικότητας του βαμυλοειδούς πεπτιδίου, τα κύτταρα καλλιεργούνται σε πλάκες 96 φρεατίων, με πυκνότητα περίπου 2 x 10<4>ανά φρεάτιο. Μετά το πέρας των 6 ημερών και την πλήρη διαφοροποίηση των νευρώνων τοποθετήθηκαν τα προεπωασμένα διαλύματα (24 h) του Αβ42 (1 μΜ) απουσία και παρουσία διαφόρων συγκεντρώσεων των συμπλοκών Re-2 και Re-3 (1 και 2 μΜ) σε PBS για 24 h στους 37 °C στον επωαστικό θάλαμο με 5% C02. Η κυτταρική επιβίωση προσδιορίζεται με την χρωματομετρική δοκιμασία ΜΤΤ [48]. Το υπερκείμενο υγρό απομακρύνεται και αντικαθίσταται με 100 μL διαλύματος ΜΤΤ (0.5 mg/mL). Μετά από 3 ώρες επώασης, που επιτρέπουν τον μιτοχονδριακό μεταβολισμό του ΜΤΤ προς σχηματισμό των αδιάλυτων κρυστάλλων φορμαζάνης, οι κρύσταλλοι διαλύονται σε 100 μL DMSO και η απορρόφηση μετράται στα 540 και 620 nm με την βοήθεια φωτομέτρου. Για την αξιοπιστία των in vitro μελετών, απαιτούνται για κάθε αξιολόγηση τρία ανεξάρτητα πειράματα όπου σε κάθε πείραμα οι συνθήκες επαναλαμβάνονται τέσσερις φορές (n = 4). Σε όλα τα πειράματα τα αποτελέσματα αποδίδονται με τη μέση τιμή των συνθηκών, ενώ αναγράφεται και το στατιστικό λάθος της μέσης τιμής (± standard error of the mean, SEM), ενώ η στατιστική σημαντικότητα αποδίδεται με τη πιθανότητα p<0.05 μέσω της ανάλυσης ANOVA. Τα αποτελέσματα δίδονται στο Σχήμα 4Α όπου κατ' αρχάς καταγράφεται η ισχυρή τοξικότητα του Αβ42 στα πρωτογενή κύτταρα νευρώνων με την επιβίωση να φτάνει το 50%. Είναι εμφανές στο Σχήμα 4Α ότι η παρουσία των συμπλοκών Re-2 και Re-3 αναστέλλει την τοξικότητα του Αβ42 εφόσον καταγράφονται ποσοστά επιβίωσης που φτάνουν το 95% στην υψηλότερη συγκέντρωση των 2 μΜ.

Παράδειγμα 13

Αντιοξειδωτική δράση των Re-2 και Re-3 έναντι ROS

Η παθογένεια της νόσου Alzheimer συνδέεται με παραγωγή ελεύθερων ριζών (reactive oxygen species, ROS) και επαγωγή οξειδωτικού στρές [49, 50] και είναι γνωστό ότι το β-αμυλοειδές πεπτίδιο επάγει την παραγωγή ROS σε καλλιέργειες κυττάρων in vitro [51]. Για τον προσδιορισμό της ανποξειδωτικής δράσης των ενώσεων της εφεύρεσης χρησιμοποιήθηκε το παράγωγο της φλουορεσκεΐνης (DCFH-DA) που όταν διαπερνά την κυτταρική μεμβράνη και ανπδρά με ρίζες υδροξυλίου καθίσταται φθορίζον (DCF) και με αυτό τον τρόπο ανιχνεύεται η παρουσία των ROS [52].

Μελετήθηκε η ανποξειδωτική δράση των συμπλόκων Re-2 και Re-3 με πειραματική πορεία αντίστοιχη με τα πειράματα προσδιορισμού της κυτταρικής επιβίωσης που δίδεται στο Παράδειγμα 12. Και εδώ γίνεται προεπώαση των αμυλοειδών διαλυμάτων πριν την προσθήκη τους στα κύτταρα. Μετά το πέρας των 24 h επώασης, τα κύτταρα ξεπλένονται με PBS και κατόπιν επωάζονται με 10 μΜ DCFH-DA για 30 min στον επωαστικό θάλαμο στους 37 °C και 5% CO2. Η ένταση φθορισμού του DCF μετράται με την βοήθεια φωτομέτρου (διέγερση στα 485 run και εκπομπή στα 528 nm). Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στο Σχήμα 4Β όπου κατ' αρχάς καταγράφεται η δημιουργία ROS παρουσία του Αβ42 (ισχυρή ένταση φθορισμού DCF, κανονικοποιημένη σε 100%) και στην συνέχεια η αναστολή της δημιουργίας ROS (>50%) παρουσία των συμπλοκών Re-2 και Re-3.

ζ. Εφαρμογή της εφεύρεσης στην Bιομηχανια

Το αντικείμενο της εφεύρεσης αφορά σε ενώσεις που διαπερνούν τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό σε μεγάλο ποσοστό. Αυτό και μόνο το γεγονός πς καθιστά εξαιρετικά πολύτιμες στον τομέα της αντιμετώπισης παθήσεων του ΚΝΣ που στερείται φαρμακευτικών επιλογών, κυρίως λόγω του όπ η πλειονότης των φαρμάκων δεν διέρχεται τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό. Επιπλέον και με εξαιρετική σημασία, οι ενώσεις της εφεύρεσης έχουν αποδεδειγμένη δυνατότητα για εφαρμογή ως διαγνωστικά/ θεραπευτικά της νόσου Alzheimer, της μάστιγας του 21<ου>αιώνα, για την οποία το οικονομικό ενδιαφέρον είναι τεράστιο. Εμφανίζουν επίσης βάσιμη προοπτική για εφαρμογή στον καρκίνο του εγκεφάλου. Επομένως, το ενδιαφέρον της Φαρμακευτικής Βιομηχανίας για τις ενώσεις της εφεύρεσης αναμένεται να είναι καταιγιστικό, είτε για εφαρμογή στην νόσο Alzheimer, είτε για διερεύνηση πιθανών εφαρμογών τους στον καρκίνο του εγκεφάλου ή /και σε άλλες παθήσεις του ΚΝΣ. Το συμπέρασμα αυτό επικουρεί το άρθρο του Forbes https: / / www. forbes.com/ sites /matthewherper/20 15 /02/ 11 /brain-boom-the-drugcompanies-bringing-neuroscience-back-frc>m-the-brink/#4cfd35421cb7 σύμφωνα με το οποίο η Φαρμακευτική Βιομηχανία μετά από ένα διάστημα στασιμότητας, κάνει και πάλι στροφή στις Νευροεπιστήμες ωθούμενη από πς προόδους της γενετικής και βιοχημείας του εγκεφάλου αλλά και από την αναμενόμενη δραματική αύξηση των ασθενειών του εγκεφάλου λόγω της γήρανσης του πληθυσμού. Σύμφωνα με το άρθρο, 3.3 δισεκατομμύρια δολλάρια επενδύθηκαν το 2014 από τις μεγάλες φαρμακοβιομηχανίες στην ανάπτυξη φαρμάκων για εκφυλιστικές και ψυχιατρικές νόσους του εγκεφάλου, όπως Alzheimer, Πάρκινσον, σχιζοφρένεια και κατάθλιψη.

Βιβλιογραφία

I. Pardridge, W.M., The blood-brain barrier: bottleneck in brain drug development.

NeuroRx, 2005. 2(1): p. 3-14.

2. Wager, T.T., et al., Strategies to optimize the brain availability of central nervous system drug candidates. Expert Opin Drug Discov, 2011. 6(4): p. 371-81.

3. Pardridge, W.M., Alzheimer's disease drug development and the problem of the bloodbrain barrier. Alzheimers Dement, 2009. 5(5): p. 427-32.

4. Hardy, J., A hundred years of Alzheimer's disease research. Neuron, 2006. 52(1): p. 3-13.

5. Selkoe, D.J. and J. Hardy, The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years.

EMBO Mol Med, 2016. 8(6): p. 595-608.

6. Hardy, J. and D.J. Selkoe, The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science, 2002. 297(5580): p. 353-6.

7. McKhann, G.M., et al., The diagnosis of dementia due to Alzheimer's disease:

recommendations from the National Institute on Aging-Alzheimer’s Association workgroups on diagnostic guidelines for Alzheimer's disease. Alzheimers Dement, 2011. 7(3): p. 263-9.

8. Montine, T.J., et al., National Institute on Aging-Alzheimer's Association guidelines for the neuropathologic assessment of Alzheimer's disease: a practical approach. Acta Neuropathol, 2012. 123(1): p. 1-11.

9. Chen, K.H. and M.C. Cui, Recent progress in the development of metal complexes as beta-amyloid imaging probes in the brain. Medchemcomm, 2017. 8(7): p. 1393-1407.

10. Johnson, K.A., et al., Appropriate use criteria for amyloid PET: a report of the Amyloid Imaging Task Force, the Society of Nuclear Medicine and Molecular Imaging, and the Alzheimer's Association. Alzheimers Dement, 2013. 9(1): p. e-1-16.

11. Dubois, B., et al., Timely Diagnosis for Alzheimer’s Disease: A Literature Review on Benefits and Challenges. J Alzheimers Dis, 2016. 49(3): p. 617-31.

12. Ono, M. and H. Saji, Recent advances in molecular imaging probes for beta-amyloid plaques. Medchemcomm, 2015. 6(3): p. 391-402.

13. Bernard, J., et al., Aqueous synthesis of derivatized cyclopentadienyl complexes of technetium and rhenium directed toward radiopharmaceutical application. Inorganic Chemistry, 2003. 42(4): p. 1014-1022.

14. Cui, M.C., Past and Recent Progress of Molecular Imaging Probes for beta-Amyloid Plaques in the Brain. Current Medicinal Chemistry, 2014. 21(1): p. 82-112.

15. Li, Z.J., et al., Novel Cyclopentadienyl Tricarbonyl Complexes ofTc-99m Mimicking Chalcone as Potential Single-Photon Emission Computed Tomography Imaging Probes for beta-Amyloid Plaques in Brain. Journal of Medicinal Chemistry, 2013.

56(2): p. 471-482.

16. Jia, J.H., et al., 2-Phenylbenzothiazole conjugated with cyclopentadienyl tricarbonyl [CpM(CO)(3)] (Μ = Re, Tc-99m) complexes as potential imaging probes for betaamyloid plaques. Dalton Transactions, 2015. 44(14): p. 6406-6415.

17. Jia, J.H., et al., 2-Arylbenzothiazoles labeled with [CpRe/Tc-99m(CO)(3)J and evaluated as beta-amyloid imaging probes. European Journal of Medicinal Chemistry, 2016. 124: p. 763-772.

18. Kiritsis, C., et al., 2-(4’-Aminophenyl)benzothiazole Labeled with Tc-99m-Cyclopentadienyl for Imaging beta-Amyloid Plaques. Acs Medicinal Chemistry Letters, 2017. 8(10): p. 1089-1092.

19. Kim, S.H., et al., Beyond symptomatic efects: potential of donepezil as a neuroprotective agent and disease modifier in Alzheimer's disease. British Journal of Pharmacology, 2017. 174(23): p. 4224-4232.

20. Walsh, D.M. and D. J. Selkoe, A beta oligomers - a decade of discovery. J Neurochem, 2007. 101(5): p. 1172-84.

21. Belluti, F., et al., Small-molecule inhibitors/modulators of amyloid-beta peptide aggregation and toxicity for the treatment of Alzheimer's disease: a patent review (2010 - 2012). Expert Opinion on Therapeutic Patents, 2013. 23(5): p. 581-96.

22. Ansari, N. and F. Khodagholi, Natural Products as Promising Drug Candidates for the Treatment of Alzheimer's Disease: Molecular Mechanism Aspect. Current Neuropharmacology, 2013. 11(4): p. 414-429.

23. Campagna, F., et al., Synthesis and biophysical evaluation of arylhydrazono-lH-2-indolinones as beta-amyloid aggregation inhibitors. European Journal of Medicinal Chemistry, 2011. 46(1): p. 275-84.

24. Datki, Z., et al., Method for measuring neurotoxicity of aggregating polypeptides with the MTT assay on diferentiated neuroblastoma cells. Brain Res Bull, 2003. 62(3): p.

223-9.

25. Banks, W.A., Drug delivery to the brain in Alzheimer's disease: consideration of the blood-brain barrier. Adv Drug Deliv Rev, 2012. 64(7): p. 629-39.

26. Ferlay, J., et al., Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. Int J Cancer, 2015. 136(5): p. E359-86.

27. Ostrom, Q.T., et al., American Brain Tumor Association Adolescent and Young Adult Primary Brain and Central Nervous System Tumors Diagnosed in the United States in 2008-2012. Neuro Oncol, 2016. 18 Suppl 1: p. il-i50.

28. Fortin, D., The blood-brain barrier: its influence in the treatment of brain tumors metastases. Curr Cancer Drug Targets, 2012. 12(3): p. 247-59.

29. Pitz, M.W., et al., Tissue concentration of systemically administered antineoplastic agents in human brain tumors. J Neurooncol, 2011. 104(3): p. 629-38.

30. Antonadou, D., et al., Phase II randomized trial of temozolomide and concurrent radiotherapy in patients with brain metastases. J Clin Oncol, 2002. 20(17): p. 3644-50.

31. Weidle, U.H., J. Niewohner, and G. Tiefenthaler, The Blood-Brain Barrier Challenge for the Treatment of Brain Cancer, Secondary Brain Metastases, and Neurological Diseases. Cancer Genomics Proteomics, 2015. 12(4): p. 167-77.

32. Santra, A., R. Kumar, and P. Shaima, Use of 99m-technetium-glucoheptonate as a tracer for brain tumor imaging: An overview of its strengths and pitfalls. Indian J Nucl Med, 2015. 30(1): p. 1-8.

33. Gao, H. and X. Jiang, Progress on the diagnosis and evaluation of brain tumors.

Cancer Imaging, 2013. 13(4): p. 466-81.

34. Bradshaw, T.D. and A.D. Westwell, The development of the antitumour benzothiazole prodrug, Phortress, as a clinical candidate. Current Medicinal Chemistry, 2004.

11(8): p. 1009-1021.

35. Salahuddin, M. Shaharyar, and A. Mazumder, Benzimidazoles: A biologically active compounds. Arabian Journal of Chemistry, 2017. 10: p. S157-S173.

36. Kumar, D., et al., Synthesis and evaluation of anticancer benzoxazoles and benzimidazoles related to UK-1. Biοοrg Med Chem, 2002. 10(12): p. 3997-4004. 37. Deutsch, E., et al., The Chemistry of Rhenium and Technetium as Related to the Use of Isotopes of These Elements in Therapeutic and Diagnostic Nuclear-Medicine. Nuclear Medicine and Biology, 1986. 13(4): p. 465-477.

38. Sener, E., I. Yalcin, and E. Sungur, Qsar of Some Antifungal Benzoxazoles and Oxazolo(4,5-B)Pyridines against C Albicans. Quantitative Structure- Activity Relationships, 1991. 10(3): p. 223-228.

39. Nakamura, K., et al., The behavior of 99mTc-hexamethylpropyleneamineoxime (99mTc-HMPAO) in blood and brain. Eur J Nucl Med, 1989. 15(2): p. 100-7.

40. Vanbilloen, H.P., B.J. Cleynhens, and A.M. Verbruggen, Importance of the two ester functions for the brain retention of 99mTc-labelled ethylene dicysteine diethyl ester (99mTc-ECD). Nuclear Medicine and Biology, 1998. 25(6): p. 569-75.

41. Schibli, R., et al., Influence of the denticity of ligand systems on the in vitro and in vivo behavior of Tc-99m(I) -tricarbonyl complexes: A hint for the future functionalization of biomolecules. Bioconjugate Chemistry, 2000. 11(3): p. 345-351.

42. Neirinckx, R.D., et al., Tc-99m D,l-Hm-Pao - a New Radiopharmaceutical for Spect Imaging of Regional Cerebral Blood Perfusion. Journal of Nuclear Medicine, 1987.

28(2): p. 191-202.

43. Bussiere, T., et al., Morphological characterization of Thioflavin-S-positive amyloid plaques in transgenic Alzheimer mice and effect of passive Abeta immunotherapy on their clearance. Am J Pathol, 2004. 165(3): p. 987-95.

44. Klunk, W.E., et al., Uncharged thioflavin-T derivatives bind to amyloid-beta protein with high afinity and readily enter the brain. Life Sci, 2001. 69(13): p. 1471-84.

45. Jia, J., et al., 2-Phenylbenzothiazole conjugated with cyclopentadienyl tricarbonyl [CpM(CO)3] (Μ = Re, (99m)Tc) complexes as potential imaging probes for betaamyloid plaques. Dalton Trans, 2015. 44(14): p. 6406-15.

46. Hartley, D.M., et al., Protofibrillar intermediates of amyloid beta-protein induce acute electrophysiological changes and progressive neurotoxicity in cortical neurons. J Neurosci, 1999. 19(20): p. 8876-84.

47. Nunez, J., Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats. J Vis Exp, 2008(19).

48. Berridge, M.V., P.M. Herst, and A.S. Tan, Tetrazolium dyes as tools in cell biology:

new insights into their cellular reduction. Biotechnol Annu Rev, 2005. 11: p. 127-52.

49. Gella, A. and N. Durany, Oxidative stress in Alzheimer disease. Cell Adh Migr, 2009.

3(1): p. 88-93.

50. Cheignon, C., et al., Oxidative stress and the amyloid beta peptide in Alzheimer’s disease. Redox Biol, 2018. 14: p. 450-464.

51. Butterfield, D.A. and C.M. Lauderback, Lipid peroxidation and protein oxidation in Alzheimer's disease brain: potential causes and consequences involving amyloid betapeptide-associated free radical oxidative stress. Free Radic Biol Med, 2002. 32(11): p.

1050-60.

52. LeBel, C.P., H. Ischiropoulos, and S.C. Bondy, Evaluation of the probe 2', 7'-dichlorofluorescin as an indicator of reactive oxygen species formation and oxidative stress. Chem Res Toxicol, 1992. 5(2): p. 227-31.

Claims (1)

1. ΑΞΙΩΣΕΙΣ της ΕΦΕΥΡΕΣΗΣ 1. Συμπλοκές ενώσεις με υψηλή διαπερατότητα του αιματοεγκεφαλικού φραγμού που προορίζονται για την παρασκευή διαγνωστικών ή θεραπευτικών σκευασμάτων για νόσους του Κεντρικού Νευρικού Συστήματος, του γενικού τύπου 1

   όπου - Μ είναι Re, Tc ή άλλο μέταλλο μεταπτώσεως που σχηματίζει τρικαρβονυλικό πυρήνα του τύπου M(CO)3<+> - X είναι S (οικογένεια βενζοθειαζολίων), Ν (οικογένεια βενζιμιδαζολίων), Ο (οικογένεια βενζοξαζολίων) - R1, R2,R3και R4είναι σε όλους τους δυνατούς συνδυασμούς: υδρογόνο, αλογόνα, νίτρο-, αλκυλο-, αλογονοαλκυλο- με 0 έως 3 άτομα αλογόνου σε κάθε άτομο άνθρακα, αμινοαλκυλο-, αλκυλαμινο-, υδροξυ-, αλκοξυ-, βενζυλοξυ-, αρυλοξυ-, -SO2 -C(=O)NR2, -C(=S)NR2, -SO2NR2, -NRC(=O)-, όπου R είναι υδρογόνο ή C1-C6αλκυλ-ομάδες - R5, R6είναι σε όλους τους δυνατούς συνδυασμούς: υδρογόνο, -N(R)2 ■ -NRC(=O) όπου R είναι υδρογόνο ή C1- C6-αλκυλο- ομάδες - R7για X = Ν είναι Η, αλκυλο-, αλκενυλο-, αλογονοαλκυλο- με 0 έως 3 άτομα αλογόνου σε κάθε άτομο άνθρακα, αλκοξυαλκυλο-, κυκλοαλκυλο-, αρυλοαλκυλο-, ενώ για X = S, Ο δεν υφίσταται 2. Σύμπλοκες ενώσεις σύμφωνα με την Αξίωση 1 όπου κατά προτίμηση Μ = Re,<99m>Tc, R1= Η, R2= Η, R3= Η, R4= Η, Rs = Η, R6= Η, X = S, Ο, Ν, και R7= Η, CH3, δηλαδή των Re -2, Re-3, Re-4, Re-5 και<99m>Tc-2,<99m>Τc-3,<99m>Tc-4,<99m>Τc-5 που αντιπροσωπεύονται από τούς τύπους 3. Την σύνθεση των ενώσεων της Αξίωσης 2 4, Re-5, μέσω των αντιστοίχων φερροκενυ Fe-5, που αντιπροσωπεύονται από τους τύ με Μ = Re, δηλαδή των Re-2, Re-3, Reλο-προδρόμων ενώσεων Fe-2, Fe-3, Fe-4, πους: Η σύνθεση γίνεται με αντίδραση του προδρόμου μορίου [Re(CO)3Br3][NEt4]2 (30 mg) και ενός από τα Fe-2, Fe-3, Fe-4, Fe-5 φερροκενυλο-παράγωγα σε μοριακή αναλογία 1:2. Η αντίδραση γίνεται σε DMF (2.5 mL) παρουσία διαλύματος 0.1 Ν HC1 (1.8 mL) σε υάλινο αυτόκλειστο όγκου 5 mL. Μετά την παροχή αζώτου στο διάλυμα για 5 λεπτά, το μείγμα μένει υπό ανάδευση στους 160 °C για 2 h. Το καθαρό προϊόν παραλαμβάνεται με χρωματογραφία στήλης. 4. Την σύνθεση των ενώσεων της Αξίωσης 2 με Μ =<99m>Tc, δηλαδή των<99m>Tc-2,<99m>Τc-3,<99m>Tc-4,<99m>Τc-5, μέσω των αντιστοίχων φερροκενυλο- προδρόμων ενώσεων Fe-2, Fe-3, Fe-4, Fe-5. Η σύνθεση γίνεται με διάλυση ενός από τα Fe-2, Fe-3, Fe-4, Fe-5 φερροκενυλοπαράγωγα (1 mg) καθώς και του συμπλόκου Mn(CO)5Br (1.0 mg) σε DMF (0.5 mL) και, στην συνέχεια, την προσθήκη στο διάλυμα<99m>TcO4(0.1 mL, 180 MBq). To μείγμα της αντίδρασης θερμαίνεται υπό αδρανή ατμόσφαιρα Ν2, στους 110 °C για 1 h και το αντίστοιχο σύμπλοκο του<99m>Tc,<99m>Tc-2,<99m>Tc-3,<99m>Tc-4,<99m>Τc-5, απομονώνεται με HPLC. 5. Την χρήση των ενώσεων της Αξίωσης 1 για την παρασκευή διαγνωστικών ή θεραπευτικών σκευασμάτων για την νόσο Alzheimer. 6. Την χρήση των ενώσεων της Αξίωσης 1 για την παρασκευή διαγνωστικών ή θεραπευτικών σκευασμάτων για όγκους του Κεντρικού Νευρικού Συστήματος 7. Την χρήση των ενώσεων της Αξίωσης 1 για την παρασκευή διαγνωστικών ή θεραπευτικών σκευασμάτων για νόσους του Κεντρικού Νευρικού Συστήματος. 8. Την χρήση των ενώσεων της Αξίωσης 2 για την παρασκευή διαγνωστικών ή θεραπευτικών σκευασμάτων νόσων για την Νόσο Alzheimer. 9. Την χρήση των ενώσεων της Αξίωσης 2 για την παρασκευή διαγνωστικών ή θεραπευτικών σκευασμάτων νόσων για όγκους του Κεντρικού Νευρικού Συστήματος 10. Την χρήση των ενώσεων της Αξίωσης 2 για την παρασκευή διαγνωστικών ή θεραπευτικών σκευασμάτων νόσων για νόσους του Κεντρικού Νευρικού Συστήματος.