FR3132910A1 - Methodes pour le pronostic et le suivi des leucodystrophies peroxysomales - Google Patents
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Classifications
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Abstract
La présente invention concerne un procédé pour le pronostic et le suivi des leucodystrophies peroxysomales, et notamment de l’adrénoleucodystrophie liée à l’X (X-ALD). Elle permet notamment la détection précoce des formes cérébrales des leucodystrophies peroxysomales, et ainsi une meilleure prise en charge thérapeutique et un meilleur suivi des patients. Le procédé selon l’invention comprend la mesure, dans un échantillon biologique obtenu à partir d’un patient, du niveau d’expression d’au moins un gène parmi SPP1, LGALS3, CTSB, GPNMB, et GR N.
Description
La présente invention concerne un procédé pour le pronostic et le suivi des leucodystrophies peroxysomales, et notamment de l’adrénoleucodystrophie liée à l’X (X-ALD). Elle permet notamment la détection précoce des formes cérébrales des leucodystrophies peroxysomales, et ainsi une meilleure prise en charge thérapeutique et un meilleur suivi des patients.
Le peroxysome est un organite présent dans toutes les cellules sauf les cellules anucléées comme les hématies. Il a pour fonction de dégrader le peroxyde d’hydrogène et assure des fonctions métaboliques essentielles, particulièrement au niveau des tissus nerveux, avec la dégradation des acides gras à très longue chaîne (AGTLC) et la synthèse des plasmalogènes (analogues des phospholipides ou l’un des acides gras est remplacé par un alcool gras insaturé lié au glycérol par une liaison éther).
Le gèneABCD1cloné en 1993 par Mosser et al. code un transporteur ABC peroxysomal permettant l'entrée des AGTLC dans le peroxysome pour leur β-oxydation (Mosser et al.,Nature361.6414 (1993): 726-730). La mutation de ce gène est associée à la plus fréquente des maladies peroxysomales, l'adrénoleucodystrophie liée à l'X ou « X-ALD » (D. Trompier and S. Savary,Colloquium series on the genetic basis of human disease. Vol. 2. No. 1. Morgan & Claypool Life Sciences, 2013). Cette maladie neurodégénérative touche environ 1 personne sur 17000 naissances et présente une grande variabilité clinique allant de formes quasi asymptomatiques à des formes extrêmement sévères. Les deux formes cliniques principales sont la forme cérébrale infantile ou « cALD » (forme la plus sévère marquée par une démyélinisation inflammatoire progressive se déclenchant vers l'âge de 4 ans avec un pronostic létal 6 à 10 ans plus tard) et l'adrénomyéloneuropathie ou « AMN » (atteintes neurologiques démyélinisantes périphériques progressives non-inflammatoires se déclenchant autour de 28 ans).
Actuellement, la seule approche thérapeutique efficace pour lutter contre l'X-ALD est la greffe allogénique de moelle osseuse ou la transplantation de cellules souches hématopoïétiques génétiquement corrigées ou non. Elle nécessite cependant un diagnostic précoce permettant de détecter la forme de la maladie dont souffre le patient et permettant de vérifier si les atteintes neurologiques ne sont pas à un stade trop avancé. Le suivi post transplantation est également important. Outre la détection de mutations dans le gèneABCD1qui permet de confirmer l'X-ALD et de distinguer cette maladie d'autres maladies peroxysomales, le dosage des acides gras à très longue chaîne (AGTLC, C26:0 et C26:1) sous forme libre ou en association avec la carnitine ou au sein des lysophosphatidylcholines constitue le passage obligé pour un diagnostic précis de l'X-ALD. Il n'existe cependant pas de corrélation entre ces niveaux d'acides gras et la sévérité des symptômes. Le déclenchement de la maladie et le suivi de son évolution nécessitent des observations cliniques (analyses neurologiques, cognitives et fonctionnelles) qui s'accompagnent généralement d'un suivi par imagerie à résonnance magnétique.
Il existe donc un réel besoin pour l’identification de biomarqueurs et de méthodes non invasives permettant de mieux identifier le déclenchement des phases neurodégénératives et inflammatoires de l’X-ALD et des leucodystrophies peroxysomales en général, et de suivre leur évolution.
Si les oligodendrocytes, cellules cérébrales qui produisent et entretiennent la myéline, sont probablement impliqués de près dans le processus pathologique des leucodystrophies peroxysomales, plusieurs observations ont conduit à penser que le dysfonctionnement des cellules microgliales constitue l'événement déclenchant de ces pathologies neurodégénératives (Eichler et al.,Annals of Neurology: Official Journal of the American Neurological Association and the Child Neurology Society63.6 (2008): 729-742 ; Gong, Yi, et al.,Annals of Neurology82.5 (2017): 813-827). Ces cellules jouent un rôle clé dans la surveillance immunitaire du cerveau et l'homéostasie cérébrale en général. Elles contribuent notamment à l'élimination de cellules mourantes et autres débris myéliniques par phagocytose. Elles recrutent des cellules de remplacement et assurent leur différentiation et leur bon fonctionnement. Grâce à leur capacité à sécréter de nombreuses cytokines et chimiokines et à interagir avec les neurones et les autres cellules gliales, elles assurent en fait une communication indispensable au fonctionnement cérébral. Elles participent notamment à la mise en place de synapses neuronales et agissent également sur la barrière hémato-encéphalique.
L’invention est définie par les revendications.
Les présents inventeurs sont parvenus à générer des lignées cellulaires microgliales murines représentant un bon modèle d’étude des maladies peroxysomales, et notamment de l’X-ALD. Ces lignées cellulaires microgliales sont déficientes en ABCD1 (« Knock-out ABCD1 », KOD1), ABCD2 (KOD2), ABCD1 et ABCD2 (KOD1D2), et ACOX1 (KOAcox) (Raas et al.,Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids1864.4 (2019): 567-576 ; Raas et al.,Biochimica et Biophysica Acta (BBA)- Molecular and Cell Biology of Lipids1864.5 (2019): 704-714) et présentent un défaut peroxysomal conduisant à une accumulation d'AGTLC pour les cellules KOD1D2 et KOAcox, ainsi qu'à différents défauts cellulaires et métaboliques observés dans les maladies peroxysomales. Ces travaux ont également permis d’identifier une signature transcriptomique particulière qui ressemble à la signature microgliale pathologique observée dans les maladies neuroévolutives communes telles que la maladie d'Alzheimer ou la sclérose en plaques (O. Butovsky and H.L. Weiner,Nature Reviews Neuroscience19.10 (2018): 622-635). Cette étude est la première à montrer qu'un défaut peroxysomal dans une cellule microgliale conduit à un résultat proche de celui de différentes maladies neurologiques où les fonctions peroxysomales sont a priori intactes.
Les présents inventeurs ont maintenant réussi à identifier une signature de 5 gènes dont l’expression serait corrélée à l’apparition et à l’évolution de la forme cérébrale des leucodystrophies peroxysomales telles que l’X-ALD. Ces 5 gènes que sontSPP1, LGALS3, CTSB, GPNMBetGRN, ont tous des produits d'expression connus pour être sécrétés. Les inventeurs ont réussi à montrer qu’il existait une variation, et plus spécifiquement une augmentation de l’expression de ces protéines dans les lignées cellulaires modèle mentionnées ci-dessus, ainsi qu’une augmentation de leur sécrétion par ces mêmes lignées. La variation de la sécrétion de ces protéines semble donc être en lien avec le dysfonctionnement microglial induit par les déficiences peroxysomales et représente donc un marqueur précoce de l’apparition des formes cérébrales (et notamment la démyélinisation inflammatoire) des leucodystrophies peroxysomales. Ces 5 gènes représentent donc de très bons marqueurs pour le pronostic et le suivi des leucodystrophies peroxysomales.
Aussi, selon un premier aspect, la présente invention porte sur un procédé pour le pronostic et/ou le suivi d’une leucodystrophie peroxysomale, particulièrement de l’X-ALD, chez un patient, dans lequel ledit procédé comprend la mesure, dans un échantillon biologique obtenu à partir dudit patient, du niveau d’expression d’au moins un gène parmiSPP1, LGALS3, CTSB, GPNMB,etGRN. Ce niveau d’expression peut avantageusement être comparé à celui mesuré pour ce-dit au moins un gène dans un échantillon obtenu à partir d’un patient sain, ou ne souffrant pas de forme cérébrale d’une leucodystrophie peroxysomale. Dans ce cas, une variation de l’expression dudit au moins un gène, et particulièrement une surexpression de ce-dit au moins un gène, est corrélée à l’apparition/l’évolution de la forme cérébrale de la leucodystrophie peroxysomale. Dans le cadre de la présente invention, une surexpression d’au moins un gène parmiSPP1, LGALS3, CTSB, GPNMB,etGRNest donc corrélée à l’apparition ou à une fort risque d’apparition de la forme cérébrale de la leucodystrophie peroxysomale, mais aussi à une évolution défavorable de la forme cérébrale de la leucodystrophie peroxysomale.
Les 5 gènes selon la présente invention codent pour des protéines sécrétées. Aussi, il est possible d’évaluer leur niveau d’expression dans n’importe quel échantillon biologique dans lequel ces protéines peuvent être détectées, comme par exemple un échantillon de sang. Le procédé selon l’invention présente donc l’avantage de pouvoir être facilement mis en œuvre à partir d’un échantillon sanguin.
D’autres caractéristiques, détails et avantages apparaîtront à la lecture de la description détaillée ci-après, supportée par les figures suivantes :
Description des modes de réalisation
La présente invention porte donc sur un test permettant de déterminer le pronostic et de suivre l’évolution d’une leucodystrophie peroxysomale, et notamment de détecter l’apparition de la forme cérébrale de la maladie. Ce test est basé sur la mesure deSPP1, LGALS3, CTSB, GPNMBet/ouGRN. Ces 5 biomarqueurs présentent plusieurs avantages qui les rendent extrêmement intéressants en tant qu’outils de pronostic et de surveillance. Premièrement, ils sont en lien direct avec un dysfonctionnement microglial puisqu'ils correspondent à des protéines sécrétées par la microglie en cas de défaut pathologique. Ce sont donc des marqueurs précoces de l’installation de la forme cérébrale des leucodystrophies peroxysomales (dans laquelle on observe une démyélinisation inflammatoire), et ils permettent donc de détecter l’apparition de cette forme et son évolution de manière très précoce. De plus, leur dosage plasmatique a déjà été effectué dans le cadre de l'étude d’autres pathologies humaines et bénéficie donc de valeurs cibles ainsi que de connaissances associées à la variabilité interindividuelle des concentrations plasmatiques et de leur sensibilité à l'âge par exemple.
Les résultats présentés ici montrent que le test selon la présente invention permet notamment de:
- détecter l’apparition de la forme cérébrale des leucodystrophies peroxysomales : le niveau des biomarqueurs selon l’invention est corrélé à l’apparition de la forme cérébrale de la leucodystrophie peroxysomale. Ceci permet d’aider à renseigner sur les formes cliniques de la pathologie sachant qu'il n'existe pas de corrélation entre génotype et forme clinique pour ces maladies. Une même mutation du gène ABCD1 peut notamment aboutir à des formes sévères ou asymptomatiques d’X-ALD, et des patients atteints de la forme cérébrale infantile peuvent avoir des mutations différentes ;
- surveiller l’évolution de la maladie et donc fournir un pronostic : la variation des niveaux plasmatiques des marqueurs identifiés étant associée à l'apparition de symptômes neurologiques, elle permet de renseigner bien en amont sur l'évolution clinique de la leucodystrophie peroxysomale ;
- surveiller l’évolution des patients après une intervention thérapeutique : le suivi des patients nécessite, à ce jour, de l'imagerie cérébrale et des analyses cliniques. L'évolution favorable espérée après une intervention thérapeutique pourrait être observée et facilitée par l'observation et le suivi dans le temps des biomarqueurs, lesdits biomarqueurs pouvant être détectés et analysés à l'aide d'une simple prise de sang.
- détecter l’apparition de la forme cérébrale des leucodystrophies peroxysomales : le niveau des biomarqueurs selon l’invention est corrélé à l’apparition de la forme cérébrale de la leucodystrophie peroxysomale. Ceci permet d’aider à renseigner sur les formes cliniques de la pathologie sachant qu'il n'existe pas de corrélation entre génotype et forme clinique pour ces maladies. Une même mutation du gène ABCD1 peut notamment aboutir à des formes sévères ou asymptomatiques d’X-ALD, et des patients atteints de la forme cérébrale infantile peuvent avoir des mutations différentes ;
- surveiller l’évolution de la maladie et donc fournir un pronostic : la variation des niveaux plasmatiques des marqueurs identifiés étant associée à l'apparition de symptômes neurologiques, elle permet de renseigner bien en amont sur l'évolution clinique de la leucodystrophie peroxysomale ;
- surveiller l’évolution des patients après une intervention thérapeutique : le suivi des patients nécessite, à ce jour, de l'imagerie cérébrale et des analyses cliniques. L'évolution favorable espérée après une intervention thérapeutique pourrait être observée et facilitée par l'observation et le suivi dans le temps des biomarqueurs, lesdits biomarqueurs pouvant être détectés et analysés à l'aide d'une simple prise de sang.
De plus, la signature microgliale pathologique obtenue dans le mutant KOAcox étant similaire à celle obtenue dans les mutants en lien avec l’X-ALD (KOD1, KOD2, KOD1D2) il peut être établi que le test selon l’invention n’est pas seulement applicable à l’X-ALD, mais aussi à l’ensemble des leucodystrophies peroxysomales, notamment aux maladies de la beta-oxydation peroxysomale, et en particulier celles dans lesquelles une déficience en ACOX1, en D-BP, ou en thiolase est observée.
Selon un premier aspect, l’objet de la présente invention est donc un procédé pour le pronostic et/ou le suivi de l’évolution des leucodystrophies peroxysomales chez un patient, dans lequel ledit procédé comprend la mesure, dans un échantillon biologique obtenu à partir dudit patient, du niveau d’expression d’au moins un gène parmiSPP1, LGALS3, CTSB, GPNMBetGRN.
SPP1, LGALS3, CTSB, GPNMBetGRNsont tous des gènes bien connus de l’homme du métier.
Le gèneSPP1code pour l’ostéopontine qui est une cytokine pro-inflammatoire multifonctionnelle. L’ostéopontine est produite par divers types de cellules et participe à plusieurs processus physiologiques et pathologiques, notamment la minéralisation osseuse, le stress oxydatif, la remyélinisation, la cicatrisation, l’inflammation ou encore l’immunité. La séquence deSPP1est accessible sous la référence ENSG00000118785 dans la base de donnéesEnsembl Gene.
Le gèneLGALS3code pour la galectine-3. Cette protéine est une lectine, c’est-à-dire une glycoprotéine qui a la capacité de se fixer sur le beta-galactoside. Elle est sécrétée par les macrophages et la microglie. La séquence deLGALS3est accessible sous la référence ENSG00000131981 dans la base de donnéesEnsembl Gene.
Le gèneCTSBcode pour la cathepsine B qui est une protéase à cystéine lysosomale produite dans les lysosomes et a pour but de dégrader les protéines lysosomales. Elle est capable de traverser la barrière hémato-encéphalique et est associée à la neurogenèse. La séquence deCTSBest accessible sous la référence ENSG00000164733 dans la base de donnéesEnsembl Gene.
Le gèneGPNMBcode pour l’ostéoactivine qui est une glycoprotéine membranaire impliquée dans diverses fonctions en lien avec la différentiation cellulaire, le contrôle de l’inflammation, la régénérescence tissulaire et la neuroprotection. La séquence deGPNMBest accessible sous la référence ENSG00000136235 dans la base de donnéesEnsembl Gene.
Enfin, le gèneGRNcode pour la progranuline qui est une protéine lysosomale impliquée dans l’inflammation, le développement, la prolifération cellulaire et l’homéostasie des protéines. Elle est exprimée dans de nombreux types cellulaires dans le système nerveux central, en particulier par la microglie. La séquence deGRNest accessible sous la référence ENSG00000030582 dans la base de donnéesEnsembl Gene.
Dans le cadre du procédé selon la présente invention, le niveau d’expression d’un de ces 5 gènes peut être mesuré et permettre de détecter l’apparition de la forme cérébrale de la leucodystrophie peroxysomale et d’en prédire son évolution. Le procédé selon la présente invention peut comprendre la mesure du niveau d’expression de 1, 2, 3, 4 mais aussi de l’ensemble de ces 5 gènes.
Selon un mode de réalisation particulier, le procédé selon la présente invention comprend la mesure du niveau d’expression deSPP1et/ou deLGALS3, préférentiellement deSPP1.
L’homme du métier connait de nombreuses techniques qu’il utilise au quotidien afin de déterminer le niveau d’expression d’un gène. Le niveau d’expression d’un gène est typiquement déterminé en analysant le ou les ARNm transcrits à partir de ce gène. Ces molécules d’acides nucléiques peuvent typiquement être extraites de l’échantillon biologique obtenu à partir du patient et analysées par des méthodes standard. L’une de ces méthodes, communément utilisée, consiste à soumettre les ARNm isolés à une transcription inverse (« RT ») couplée à des amplifications par réaction de polymérisation en chaîne (« PCR ») en utilisant des amorces oligonucléotidiques spécifiques des gènes d’intérêt. La quantification des ARNm peut typiquement être effectuée en utilisant l’une des deux technologies de quantification en temps réelle appelées SYBR Green® ou TaqMan®.
Alternativement, le niveau d’expression du gène peut être mesuré en détectant la quantité de la protéine qu’il code. De telles méthodes comprennent typiquement la mise en contact de l’échantillon biologique à analyser avec un agent capable de lier spécifiquement la protéine cible. Cet agent est généralement un anticorps polyclonal ou monoclonal. La présence de la protéine est ensuite typiquement détectée par des méthodes standards d’immunodétection après séparation des protéines par électrophorèse (technique également appelée « Western blotting ») ou par immunodosages par méthode directe, indirecte, par compétition ou par immunocapture (techniques également appelées « ELISA »). La formation d'un complexe entre la protéine d’intérêt et le ou les anticorps la ciblant est généralement détectée et quantifiée par la mesure d’une réaction enzymatique générant un produit coloré, chimioluminescent ou fluorescent.
Dans le cadre de la présente invention, la détection de la protéine se fait préférentiellement en utilisant un test ELISA qui est une technologie utilisée quotidiennement par l’homme de l’art. De nombreux kits ELISA permettant la détection des protéines codées par les gènes selon la présente invention sont disponibles et l’homme du métier peut se les procurer facilement auprès des acteurs du domaine.
Les « leucodystrophies peroxysomales » sont un groupe de maladies génétiques associées à une anomalie du métabolisme des enzymes du peroxysome. Ces pathologies sont bien connues de l’homme du métier et font par exemple l’objet de l’article de S. Savary (La lettre du neurologue23(5):(2019) 164-170) ou de Astudillo et al. (La Presse Médicale45.3 (2016): 302-312). La « leucodystrophie peroxysomale » selon la présente invention est particulièrement une maladie de la β-oxydation peroxysomale telle que définie dans l’article de S. Savary mentionné ci-dessus. Ladite maladie de la β-oxydation peroxysomale est préférentiellement choisie dans le groupe constitué de l’adrénoleucodystrophie liée à l'X (X-ALD), de la déficience en acyl-CoA oxidase 1 (ACOX1), de la déficience en D-bifunctional protein (D-BP), de la déficience en sterol carrier protein 2 (SCP2) et de la déficience en alpha-methylacyl-CoA racemase (AMACR).
L’adrénoleucodystrophie liée à l’X (correspondant au code «Mendelian Inheritance in Man» ou « MIM » : 300100) est la maladie peroxysomale la plus fréquente (incidence de 1 cas pour 17 000 naissances). Elle est causée par une mutation dans le gène codant le transporteur ABC peroxysomal ABCD1. Ce gène se trouvant sur le chromosome X, la maladie touche principalement les hommes même s’il elle peut plus rarement se manifester chez des femmes. Elle affecte principalement le cerveau et la moelle épinière, ainsi que les glandes surrénales. L’X-ALD se présente sous deux formes principales : la forme cérébrale (cALD) et l’adrénomyéloneuropathie (AMN). La forme cérébrale se développe entre 4 et 12 ans. Les formes sévères entrainent un démyélinisation inflammatoire rapide qui provoque une invalidité totale et le décès quelques années après le diagnostic. Des formes moins graves de l’adolescent et de l’adulte ont également été observées. L’adrénomyéloneuropathie (AMN) est une forme adulte à progression plus lente non-inflammatoire et qui touche la moelle épinière et des nerfs périphériques. L’adrénoleucodystrophie liée à l’X peut également être associée à une insuffisance des glandes surrénales pouvant entrainer une maladie d’Addison.
La déficience en ACOX1 (code MIM : 264470), appelée précédemment adrénoleuco dystrophie pseudonéonatale, est associée à une accumulation d’AGTLC. Elle se révèle dès la naissance par une hypotonie et des convulsions. Les patients présentent généralement une hépatomégalie, une dysmorphie faciale, un retard psychomoteur ainsi que des troubles de l’audition et une perte de la vision. Ils décèdent généralement avant l’âge de 3 ans.
La déficience en D-BP/MFP2 (code MIM : 261515) peut être subdivisée en 3 groupes selon la sévérité. La forme la plus sévère est généralement létale avant l’âge de 2 ans. Un peu moins de la moitié des patients sont associés au type 3 et peuvent survivre au-delà de l’âge de 10 ans. La maladie est caractérisée par une hypotonie néonatale, une épilepsie et un retard psychomoteur sévère, et s’accompagne généralement de dysmorphies crâniofaciales et d’atteintes de la vision et de l’audition.
La déficience en SCP2 (code MIM : 613724) a été décrite chez un adulte qui présentait une accumulation d’acide pristanique, une dystonie cervicale et une ataxie cérébelleuse.
La déficience en AMACR (code MIM : 614307) a été diagnostiquée chez une dizaine de patients adultes. Une accumulation de précurseurs d’acides biliaires et d’acide pristanique a été observée. La maladie est associée à des atteintes neurologiques variables, touchant le système nerveux central et périphérique.
Toutes ces pathologies peuvent présenter des « formes cérébrales » c’est-à-dire dans lesquelles le système nerveux central est atteint, et dans lesquelles on peut observer un processus neurodégénératif. Typiquement, dans le cas de la forme cérébrale de l’X-ALD, on observera une atteinte microgliale et une démyélinisation inflammatoire. Ces formes sont généralement plus sévères et donc associées à un plus mauvais pronostic pour le patient. La présente invention permet de détecter l’apparition de ces formes à un stade précoce ce qui permet une meilleure prise en charge et un meilleur suivi du patient.
Typiquement, le procédé selon la présente invention est effectué après avoir diagnostiqué une leucodystrophie peroxysomale. Ce diagnostic est apporté en utilisant des techniques connues de l’homme du métier, comme par exemple le dosage des AGTLC et/ou le séquençage des gènes impliqués dans la β-oxydation peroxysomale pour y détecter la présence de mutations. Typiquement, dans le cadre de l’X-ALD, le diagnostic sera apporté après avoir effectué un dosage des AGTLC et/ou après avoir détecté une mutation dans le gèneABCD1. Dans ce cadre, le procédé selon la présente invention sera avantageusement réalisé dans un échantillon biologique obtenu à partir d’un patient identifié comme présentant une mutation dans le gèneABCD1.
L’utilisation du procédé selon la présente invention dans le cadre de l’X-ALD est particulièrement avantageuse car elle permet de détecter de manière précoce la cALD. Or, plus la cALD est détectée à des stades précoces, particulièrement avant que des troubles neurologiques majeures n’apparaissent, plus il sera possible de freiner/stopper le processus de démyélinisation inflammatoire par greffe de moelle osseuse ou transplantation de cellules souches hématopoïétiques génétiquement corrigées. Ainsi, selon un mode de réalisation préféré, la leucodystrophie peroxysomale selon la présente invention est l’adrénoleucodystrophie liée à l'X (X-ALD). Le procédé selon la présente invention permet dans ce cadre de détecter (diagnostiquer) la forme cérébrale de l’adrénoleucodystrophie liée à l'X (cALD). Une surexpression des biomarqueurs selon l’invention est corrélée à la cALD.
Selon ce mode de réalisation particulier, le procédé selon la présente invention peut avantageusement comprendre la mesure du niveau d’expression de au moinsSPP1.
Le procédé selon la présente invention permet d’apporter un diagnostic de la forme cérébrale de la leucodystrophie peroxysomale, et donc de déterminer si le patient est atteint ou est à risque de développer la forme cérébrale de la leucodystrophie peroxysomale. A l’heure actuelle, la greffe de moelle osseuse ou la transplantation de cellules souches hématopoïétiques génétiquement corrigées ne sont proposées que lorsque des lésions cérébrales apparaissent clairement lors de l’examen du cerveau par imagerie médicale (typiquement par imagerie par résonnance magnétique). De tels examens sont très coûteux et invasifs, notamment chez les enfants qui doivent préalablement être placés sous anesthésie générale. Le procédé selon la présente invention est beaucoup moins invasif et couteux à mettre en œuvre.
Le procédé selon la présente invention permet également de déterminer le pronostic d’un patient souffrant d’une leucodystrophie peroxysomale, c’est-à-dire de prédire l’évolution de la maladie. Il permet notamment de déterminer la présence ou le risque de développer une forme cérébrale, ce type de forme étant généralement associé à un mauvais pronostic pour le patient. Le procédé selon la présente invention permet notamment de grader la sévérité de la leucodystrophie peroxysomale. La concentration du au moins un gène peut en effet être positivement corrélée à la sévérité, et notamment au niveau d’atteintes neuro-axonales, de la forme cérébrale. Cette sévérité peut être évaluée sur la base d’échelles de gradation couramment utilisées par l’homme du métier dans le cas de leucodystrophie peroxysomales, comme le Loes score (Loes et al.,AJNR Am J Neuroradiol.1994 Oct;15(9):1761-6).
Enfin, le procédé de l’invention permet également le suivi/la surveillance des patients, par exemple après greffe de moelle osseuse ou transplantation de cellules souches hématopoïétiques génétiquement corrigées. Dans ce cadre, le procédé selon la présente invention peut être effectué dans le cadre du suivi « normal » du patient, mais également avant et après traitement, afin d’évaluer si le pronostic du patient après traitement a évolué favorablement. Typiquement, une diminution du niveau des biomarqueurs selon l’invention sera synonyme d’une évolution favorable, alors qu’une stagnation ou augmentation du niveau de ces biomarqueurs sera synonyme d’évolution défavorable. Le procédé selon la présente permet donc également de pouvoir alléger le suivi des patients qui ne présentent pas ou ont peu de risques de développer une forme cérébrale de la leucodystrophie cérébrale. Actuellement, tous les patients diagnostiqués avec une leucodystrophie cérébrale sont soumis à un lourd suivi. Le procédé selon la présente invention permet donc de déterminer quel type de suivi est le plus adapté à chaque patient.
Dans le cadre de la présente invention, l’« échantillon biologique » peut être n’importe quel échantillon dans lequel le niveau d’expression des gènes selon l’invention peut être détecté. Typiquement, l’échantillon est un fluide biologique. L’échantillon biologique peut par exemple être un échantillon de sang ou de liquide céphalo-rachidien.
Les inventeurs ont particulièrement réussi à démontrer que les protéines codées par les gènes selon la présente invention peuvent être détectées et analysées dans le sang. De ce fait, la méthode selon la présente invention peut être réalisée de manière très avantageuse à partir d’un simple échantillon de sang. Aussi, selon un mode de réalisation préféré, l’échantillon biologique selon la présente invention est un échantillon de sang, de sérum ou de plasma obtenu à partir du patient. Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, l’échantillon biologique est un échantillon de sang.
Le « patient » ou « sujet » est un humain ou un animal, par exemple un mammifère. Selon un mode de réalisation préféré, le patient est un humain.
Selon un mode de réalisation particulier le procédé selon la présente invention comprend une étape dans laquelle le niveau d’expression du au moins un gène selon la présente invention est comparé à une valeur de référence. Cette valeur de référence est déterminée pour chaque gène. Elle peut être déterminée de manière expérimentale, empirique ou théorique et est fixée afin d’obtenir une spécificité et sélectivité optimales. Cette valeur de référence peut être déterminée sur la base de résultats obtenus dans une population contrôle, par exemple une population de patients sains ou ne souffrant pas d’une forme cérébrale d’une leucodystrophie peroxysomale. Dans ce cas, un niveau d’expression similaire à une valeur seuil déterminée sur la base d’une population de patients ne souffrant pas d’une forme cérébrale d’une leucodystrophie peroxysomale sera associé à l’absence de forme cérébrale de la leucodystrophie peroxysomale, ou, chez un patient connu pour être atteint d’une forme cérébrale d’une leucodystrophie peroxysomale, à une évolution favorable de la maladie. Alternativement, un niveau d’expression significativement différent de la valeur seuil déterminée sur la base d’une population de patients ne souffrant pas d’une forme cérébrale d’une leucodystrophie peroxysomale sera, lui, associé à la présence de la forme cérébrale de la leucodystrophie peroxysomale ou à une évolution défavorable de la maladie.
Selon un mode de réalisation préféré, la valeur seuil est déterminée sur la base du niveau d’expression du gène selon l’invention dans un échantillon biologique obtenu à partir de patients sains ou alternativement à partir de patients ne souffrant pas d’une forme cérébrale d’une leucodystrophie peroxysomale.
Aussi, dans un mode de réalisation particulier, la présente invention porte sur un procédé pour le pronostic et/ou le suivi d’une leucodystrophie peroxysomale chez un patient, dans lequel ledit procédé comprend :
a) la mesure, dans un échantillon biologique obtenu à partir dudit patient, du niveau d’expression d’au moins un gène parmiSPP1, LGALS3, CTSB, GPNMBetGRN; et
b) la comparaison du niveau d’expression mesurée à l’étape a) au niveau d’expression dudit au moins un gène dans un échantillon biologique obtenu à partir d’un patient sain ou à partir d’un patient ne souffrant pas de la forme cérébrale de la leucodystrophie peroxysomale.
a) la mesure, dans un échantillon biologique obtenu à partir dudit patient, du niveau d’expression d’au moins un gène parmiSPP1, LGALS3, CTSB, GPNMBetGRN; et
b) la comparaison du niveau d’expression mesurée à l’étape a) au niveau d’expression dudit au moins un gène dans un échantillon biologique obtenu à partir d’un patient sain ou à partir d’un patient ne souffrant pas de la forme cérébrale de la leucodystrophie peroxysomale.
Ce procédé peut comprendre en outre une étape dans laquelle le diagnostic de la forme cérébrale d’une leucodystrophie peroxysomale et/ou pronostic de la leucodystrophie peroxysomale est évalué au vu des résultats obtenus à l’étape b).
Dans le cadre de la présente invention, une surexpression dudit au moins un gène, particulièrement une surexpression par rapport au niveau de ce gène mesuré dans une population de patients sains ou non-atteints de la forme cérébrale de la leucodystrophie peroxysomale, est corrélée à l’apparition, au risque d’apparition et/ou à une évolution défavorable de la forme cérébrale de ladite leucodystrophie peroxysomale.
La présente divulgation concerne également une méthode de traitement d’une adrénoleucodystrophie liée à l’X comprenant la greffe allogénique de moelle osseuse ou la transplantation de cellules souches hématopoïétiques comprenant le gèneABCD1non-muté chez un patient identifié comme souffrant de la forme cérébrale de l’adrénoleucodystrophie liée à l’X selon le procédé de la présente invention.
La présente invention est présentée de manière plus détaillée dans les exemples ci-dessous. Ces exemples sont fournis uniquement à des fins illustratives et ne peuvent être interprétés comme limitant la portée de la présente invention.
Exemples
Exemples
Exemple 1 : Analyse
In vitro
sur une lignée cellulaire microgliale modèle.
Des lignées cellulaires microgliales murine dont une lignée double KOAbcd1/Abcd2(nommée lignée « BV-2 » ci-après) ont été générées par édition génétique CRISPR/Cas9 comme décrit dans Raas et al (2019).
L'analyse transciptomique des cellules BV-2 mutantes par RNA-seq a été réalisée par la plateforme GenomEast de Strasbourg dans le cadre d'un projet financé par la Fondation maladies rares. L'ARN total a été extrait de 3 lots indépendants de cellules BV-2 pour chaque génotype (WT, KOD1, KOD2, KOD1D2, KOAcox) en utilisant le kit RNeasy (Qiagen). Les librairies de séquençage de l'ARN ont été préparées à l'aide du kit de préparation d'échantillons d'ARNm Stranded TruSeq et le séquençage a été effectué sur le système Illumina HiSeq 4000 Sequencing. La quantification de l'expression génétique a été réalisée à partir de lectures alignées de manière unique à l'aide de htseq-count version 0.6.1p1, avec les annotations de la version 91 d'Ensembl et en mode "union" (htseq.readthedocs.io/en/master/count.html). Les valeurs P ont été ajustées pour les tests multiples en utilisant la méthode de Benjamini et Hochberg. La comparaison des niveaux d'expression des gènes exprimés dans les cellules mutantes par rapport aux cellules contrôle a permis d'identifier un nombre important de gènes différentiellement exprimés et répondant à des critères de significativité statistique. L'analyse détaillée des gènes différentiellement exprimés (à la hausse ou à la baisse) a été réalisée au laboratoire BioPeroxIL et a permis de les regrouper en divers groupes et familles de gènes. Cette étude a permis d’observer que les gènesCtsb,Gpnmb,Grn,Lgals3etSpp1sont tous significativement différentiellement exprimés dans cette signature pathologique microgliale dans chaque génotype. Les résultats obtenus démontrent pour les 5 marqueurs un niveau d'expression relativement fort dans les cellules microgliales, une surexpression par rapport aux cellules de référence au maximum d'un facteur 4 environ (Log2 FC~2 pourSpp1dans les cellules KOD1D2) et une significativité statistique de cet effet particulièrement élevée.Ctsb,Lga l s3,Grn,GpnmbetSpp1sont significativement surexprimés (x2 - x4) dans les cellules mutantes, en particulier dans les cellules double KO Abcd1/Abcd2 (KOD1D2). Ces résultats sont montrés dans la .
La confirmation par Western blotting de l'augmentation de leur expression au niveau protéique à partir de lysats cellulaires a été effectuée au laboratoire BioPeroxIL (données non-fournies). Pour aller plus loin, les inventeurs ont souhaité vérifier si ces augmentations d'expression se retrouvaient en sécrétion en analysant le milieu extracellulaire des cellules contrôle et mutantes. Le niveau de sécrétion des protéines Ctsb, Lglas3, Grn, Gpnmb et Spp1 a été mesuré quantitativement par méthode ELISA à partir des surnageant cellulaires. Les résultats obtenus confirment une augmentation de la sécrétion pour ces cinq protéines, en particulier dans le mutant double KO Abcd1/Abcd2 (KOD1D2). Ces résultats sont présentés dans le Tableau 1 ainsi que dans la .
[Tableau 1] : Augmentation de la sécrétion de Ctsb, Gpnmb, Grn, Lgals3 et Spp1 dans les cellules microgliales BV-2 présentant un défaut peroxysomal. Les mesures de ces concentrations en ng/mL ont été effectuées par dosage ELISA. Le nombre de mesure (n), l'écart-type, l'augmentation relative par rapport à la valeur contrôle et la significativité statistique (p value<0,05, test de Mann-Whitney) sont indiqués.
Exemple
2 :
Validation sur des échantillons obtenus à partir de patients X-ALD
Dix-sept échantillons ont été inclus dans l’étude. Dix échantillons « contrôles» (sang frais) en provenance de l’Établissement Français du Sang (EFS), 4 échantillons de patients AMN (plasma congelé) et 3 échantillons de patients cALD (plasma congelé) provenant du Centre de Ressources Biologiques du CHU de Dijon. Pour les échantillons « contrôles », le plasma a été obtenu en prélevant le surnageant après une centrifugation à 1300 g pendant 10 min sur la centrifugeuse Heraeus Megafuge 16R (Thermo Fisher).
Les échantillons ont été analysés par test ELISA sandwich.
Une augmentation significative de la concentration plasmatique de SPP1 (x1.8, p=0,04*) a été observée chez les patients cALD. Il n’y a en revanche pas de variation significative chez les patients AMN. SPP1 représenterait donc un biomarqueur d’intérêt dans la forme cérébrale de l’X-ALD en permettant notamment de distinguer les formes de la maladie et une évolution des atteintes cérébrales. Les résultats sont présentés dans le Tableau 2 et la .
[Tableau 2] : Augmentation de la concentration plasmatique de SPP1 chez les patients adultes cALD. Le tableau présente la valeur moyenne de la concentration plasmatique en ng/mL de SPP1 obtenue à partir de 10 individus sains adultes, 3 patients AMN et 3 patients cALD. L'écart-type, l'augmentation relative par rapport à la valeur contrôle et la significativité statistique (p value<0,05, test de Mann-Whitney) sont indiquées.
Claims (9)
- Un procédé pour le pronostic et/ou le suivi de l’évolution des leucodystrophies peroxysomales chez un patient, dans lequel ledit procédé comprend la mesure, dans un échantillon biologique obtenu à partir dudit patient, du niveau d’expression d’au moins un gène parmiSPP1, LGALS3, CTSB, GPNMBetGRN.
- Procédé selon la revendication 1, dans lequel ledit échantillon biologique est un échantillon de sang.
- Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel ladite leucodystrophie peroxysomale est une maladie de la β-oxydation peroxysomale choisie dans le groupe constitué de l’adrénoleucodystrophie liée à l'X (X-ALD), de la déficience en acyl-CoA oxidase 1 (ACOX1), de la déficience en D-bifunctional protein (D-BP), de la déficience en sterol carrier protein 2 (SCP2) et de la déficience en alpha-methylacyl-CoA racemase (AMACR).
- Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel ledit procédé comprend en outre une étape dans laquelle ledit niveau d’expression est comparé au niveau d’expression dudit au moins un gène dans un échantillon biologique obtenu à partir d’un patient sain ou à partir d’un patient ne souffrant pas de la forme cérébrale de la leucodystrophie peroxysomale.
- Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel ledit au moins un gène estSPP1.
- Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel une surexpression dudit au moins un gène est corrélée à l’apparition, au risque d’apparition et/ou à une évolution défavorable de la forme cérébrale de ladite leucodystrophie peroxysomale.
- Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel ladite leucodystrophie peroxysomale est l’X-ALD.
- Procédé selon la revendication 7, dans lequel une surexpression dudit au moins un gène est corrélée à la forme cérébrale de l’adrénoleucodystrophie liée à l’X (cALD).
- Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel ledit patient a été identifié comme présentant une mutation dans le gèneABCD1.
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