FR3127395A1

FR3127395A1 - Composition orale antioxidante à base de plantes

Info

Publication number: FR3127395A1
Application number: FR2110157A
Authority: FR
Inventors: Damien Guillemet
Original assignee: Nexira
Current assignee: Nexira
Priority date: 2021-09-27
Filing date: 2021-09-27
Publication date: 2023-03-31
Also published as: WO2023047063A2; WO2023047063A3

Abstract

L’invention vise une composition orale antioxydante comprenant une combinaison d’au moins deux extraits comestibles de plantes, lesdits extraits étant choisies parmi le groupe constitué d’un extrait de raisin, un extrait de hamamélis, un extrait de giroflier et un extrait d’immortelle. Figure d’abrégé : Figure 5

Description

COMPOSITION ORALE ANTIOXIDANTE À BASE DE PLANTES

L’invention se rapporte à une composition orale antioxydante comprenant une combinaison d’au moins deux extraits comestibles de plantes. L’invention se rapporte aussi à l’utilisation de cette composition dans la protection cellulaire des radicaux libres et processus d’inflammations. Ainsi, l’invention vise en particulier une utilisation de la composition dans le traitement et/ou la prévention d’une affection choisie parmi les affections liées aux activités pro-oxydatives et/ou inflammatoires..

Il est connu qu’une alimentation riche en antioxydants peut réduire le risque de nombreuses maladies, y compris les maladies cardiaques ou certains cancers. Les antioxydants éliminent en particulier les radicaux libres des cellules du corps et préviennent ou, du moins réduisent les dommages causés par l'oxydation. Ces processus antiradicalaires sont directement impliqués dans les activités de modulation de l’inflammation chronique. Pour palier des carences éventuelles en antioxydants, l’état de la technique propose des compléments alimentaires qui en contiennent. Ces compléments peuvent trouver une application dans la santé sportive (performance et/ou récupération), la santé de l’œil et de la vision, la santé de la peau (parfois appelée nutri-cosmétique), la santé de l’audition, la santé du foie, etc.

Une partie au moins des antioxydants proposés dans l’art sont d’origine synthétique, c’est-à-dire provenant par exemple d’une synthèse chimique. La présente invention s’écarte de ce type d’antioxydants et se rapporte à des antioxydants provenant de plantes.

Les antioxydants provenant de plantes sont généralement identifiés et/ou testés dans des modèles utilisant des tests biochimiques, ditsin tuboqui ne font intervenir que des espèces chimiques, sans la présence de cellules vivantes qui ne tiennent ni compte du passage intestinal et de la pénétration dans l’organisme, ni de la pénétration de l’antioxydant au sein de la cellule. Dans une approchein vivo, en particulier dans un contexte d’application biologique, les tests biochimiques ne sont pas satisfaisants.

Tout cela fait que les antioxydants, et en particulier leur effet thérapeutique, protecteur et préventif, continuent à être étudiés largement dans le monde entier.

La présente invention vient améliorer la situation.

Ainsi, l’invention vise une composition orale antioxydante comprenant une combinaison d’au moins deux extraits comestibles de plantes, lesdits extraits étant choisies parmi le groupe constitué d’un extrait de raisin, un extrait de hamamélis, un extrait de giroflier et un extrait d’immortelle.

L’extrait de raisin est un extrait provenant du fruit de la plante, préférentiellement du pépin, et plus préférentiellement duVinOseed ^TM . Plus généralement, on utilise de préférence un extrait purifié, c’est-à-dire un extrait de raisin (notamment du pépin) ayant une teneur supérieure ou égal à 90% de polyphénols totaux. L’extrait de hamamélis est un extrait obtenu à partir de la partie aérienne de la plante. L’extrait de giroflier est un extrait obtenu à partir du bouton floral de la plante, et préférentiellement un extrait de clou de girofle. L’extrait d’immortelle est un extrait obtenu à partir de la partie aérienne de la plante. Les résultats pour ces provenances d’extraits sont particulièrement satisfaisants.

Dans un mode de réalisation préféré la composition comprend seulement deux extraits comestibles de plantes. D’une part, les effets synergique observés dans ce mode de réalisation sont très satisfaisant, et d’autre part cela permet d’économiser la matière première en extraits. Dit autrement, dans un mode de réalisation particulier, la composition de l’invention est constituée d’une combinaison de deux extraits comestibles de plantes, lesdits extraits étant choisies parmi le groupe constitué d’un extrait de raisin, un extrait de hamamélis, un extrait de giroflier et un extrait d’immortelle.

Dans ce mode de réalisation la proportion en poids de chaque extrait est compris entre 20% et 80%.

Préférentiellement, la combinaison des extraits de plantes est choisie parmi : - une combinaison d’un extrait de clou de girofle et d’un extrait d’immortelle; - une combinaison d’un extrait de clou de girofle et d’un extrait un extrait de pépin de raisin, préférentiellement duVinOseed ^TM ; - une combinaison d’un extrait de clou de girofle et d’un extrait de hamamélis ; - une combinaison d’un extrait de pépin de raisin, préférentiellement duVinOseed ^TM et d’un extrait de hamamélis. Dans ce cas, la combinaison d’un extrait de clou de girofle et d’un extrait d’immortelle comprend de préférence 50% en poids d’extrait de clou de girofle et 50%en poids d’extrait d’immortelle ; la combinaison d’un extrait de clou de girofle et d’un extrait un extrait de pépin de raison, préférentiellement duVinOseed ^TM comprend de préférence 50% en poids d’extrait de clou de girofle et 50% en poids d’extrait de pépin de raisin; la combinaison d’un extrait de clou de girofle et d’un extrait de hamamélis comprend de préférence 50% en poids d’extrait de clou de girofle et 50% en poids d’extrait de hamamélis ; et la combinaison d’un extrait de pépin de raisin, préférentiellement duVinOseed ^TM et d’un extrait de hamamélis comprend 60% en poids d’extrait de pépin de raisin et 40% en poids d’extrait de hamamélis.

L’invention vise également la composition décrite ci-dessus, pour l’utilisation dans le traitement et/ou la prévention d’une affection chez un humain ou un animal choisie parmi les affections liées aux activités pro-oxydatives et/ou inflammatoires. Lesdites affections peuvent être notamment les affections du système cardiovasculaire, les affections du système tissulaire et les affections du système articulaire. Parmi les affections du système cardiovasculaire on peut citer les affections du type maladie chronique inflammatoire comme par exemple la rigidification des vaisseaux, le diabète, etc. Parmi les affections du système tissulaire on peut citer les affections du tissu hépatique (du type hépatite d’origine non bactérienne, stéatose et dérives inflammatoires, etc.), du tissu adipeux (hypertrophie et statut inflammatoire chronique), du tissu intestinal (atteintes inflammatoires chroniques du type Syndrome de l’intestin irritable, hyper-perméabilité intestinale, etc.), des tissus cutanés (lésions cellulaires dues à l’exposition aux UV ou polluants, atteintes tissulaires liées à l’âge et l’inflammation, etc.), des tissus auditifs (du type par exemple acouphènes, perte d’acuité liée à l’âge, etc.) et des tissus oculaires (du type par exemple dégénérescence maculaire liée à l’âge), des tissus de fibres musculaires (effets délétères de la génération de radicaux libres sur la fibre musculaire, vitesse de récupération de capacité musculaire, etc. Parmi les affections du système articulaire on peut citer en particulier l’ostéoarthrite).

La composition peut se présenter sous une forme choisie parmi un comprimé, un cachet, une capsule, un granule, une gélule, une dragée, une gomme à mâcher, une pâte, une boisson, un sirop et une poudre. Ceci favorise la prise par voie orale.

L’invention vise aussi un produit alimentaire, ou complément alimentaire, ou complément diététique, ou substitut de repas, ou boisson, ou supplément de boisson, ou produit pharmaceutique, comprenant la composition décrite ci-dessus.

D’autres avantages et caractéristiques de l’invention apparaîtront à la lecture de la description détaillée ci-après et sur les dessins annexés sur lesquels :

montre les résultats de concentrations d'efficacité antioxydante à 10% (EC10) de l’AOP1 de 26 échantillons d’extraits de plantes ;

montre les résultats de concentrations d'efficacité antioxydante à 50% (EC50) de l’AOP1 de 26 échantillons d’extraits de plantes ;

montre les résultats de concentrations d'efficacité antioxydante à 90% (EC90) de l’AOP1 de 26 échantillons d’extraits de plantes ;

montre les résultats des figures 1 à 3 dans un même graphique ;

montre la moyenne de luminescences relatives de séries de tests de Transwell représentative pour de l’AOP2;

montre l’effet antioxydant direct (AOP1) de combinaisons d’échantillons de l’invention sur cellules épithéliales ; et

montre l’effet antioxydant indirect (AOP2) de combinaisons d’échantillons de l’invention sur cellules épithéliales.

Les figures, tableaux et la description ci-après contiennent, pour l’essentiel, des éléments de caractère certain. Les figures et tableaux font partie intégrante de la description, et pourront donc non seulement servir à mieux faire comprendre la présente invention, mais aussi contribuer à sa définition, le cas échéant.

Le terme "partie comestible" de plante désigne une partie de plantes pouvant être ingérée par un humain per os, c’est-à-dire par voie orale ou plus généralement par voie gastro-intestinale. Une telle "partie comestible" peut en outre être ingérée par un animal. La composition de l’invention comprend des extraits de parties comestibles de plantes.

De manière générale, une plante présente deux parties principales : une partie souterraine qui comprend en particulier la racine (ou le tubercule ou le rhizome), et une partie aérienne qui est en particulier composée de la tige, des feuilles, des bourgeons, des fruits et/ou des fleurs.

Une partie comestible d’une plante peut se présenter sous forme solide ou liquide. Il peut donc notamment s’agir de feuilles, d’une racine, d’une tige, d’un fruit, de fleurs ou encore de l’exsudat ou de sève d’une plante, transformé(e)(s) ou non. Il peut s’agir de tout ou seulement d’une ou plusieurs parties de ces éléments.

On désigne par "extrait", la ou les parties comestibles de la plante, transformées ou non par un processus d’extraction, présentes dans la composition de l’invention. D’une manière plus générale, l’extrait peut être brut ou modifié par un processus d’extraction utilisé de manière habituelle dans le domaine des compléments alimentaires et qui conserve les propriétés biologiques souhaitées.

Un processus d’extraction peut notamment comprendre une déshydratation ou un séchage à froid de sorte que la partie comestible soit transformée en format adapté pour la consommation par un humain. D’autres processus peuvent comprendre le broyage ou le découpage de certaines parties des plantes, ou encore un complément par extraction solide/liquide sur la base d’un solvant comme par exemple l’eau et/ou l’éthanol. D’autres étapes complémentaires peuvent être relatives à la purification par passage sur membrane filtrante ou résine d’absorption ou encore échangeuses d’ions. Des extraits de plantes peuvent ainsi se retrouver sous forme de poudre ou de granulés notamment. Des processus peuvent en outre comprendre le lavage, la désinfection, la décoloration, le séchage et/ou la cuisson de parties de plantes. Les extraits peuvent donc également se retrouver par exemple sous forme de suspension, de solution aqueuse ou de dispersion. Par ailleurs, des extraits peuvent se présenter sous forme de "totum de plante", c’est-à-dire une plante entière ou une partie de celle-ci, déshydratée par séchage puis broyée.

La composition de l’invention peut se présenter sous différentes formes adaptées à l’ingestion par voie orale. En particulier la composition peut se présenter sous forme de comprimés, de gélules, de capsules, de poudre, de liquide ou encore sous forme de sirop. Ainsi, la composition de l’invention peut comprendre des substances véhicule ou de support (carrier en anglais) pharmaceutiquement acceptable et/ou compatible avec le marché agroalimentaire. La composition peut comprendre en outre des ingrédients de type diluant, adjuvant, excipient, agent de conservation, charge, agent de désintégration, agent mouillant, émulsifiant, agent antimottant, agent de suspension, agent d’intensifiant de goût, agent aromatique, agent odorant, agent antibactérien, agents anti levure, agent lubrifiant et agent de dispersion. Des techniques de formulation sont notamment décrits dans l’ouvrage Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, ISBN-13: 978-0912734040 ou dans l’ouvrage Conception des compléments alimentaires : Marché, développement, réglementation et efficacité, ISBN-13: 978-2743022211.

La composition antioxydante de l’invention est principalement destinée au marché des compléments alimentaires. On vise notamment un produit alimentaire (foodstuffen anglais), un complément alimentaire (food supplementen anglais), un complément diététique (dietary supplementen anglais), une boisson (beverageen anglais), un supplément de boisson (beverage supplementen anglais). Mais l’invention vise également le marché pharmaceutique. Ainsi, on vise un produit pharmaceutique (pharmaceutical producten anglais) sous forme usuelle.

Dans un contexte d’application biologique, les tests in tubo / biochimiques ne sont pas les plus représentatifs, et il convient d’utiliser des modèles cellulaires afin d’anticiper au mieux les résultats potentiels chez l’humain. La Demanderesse a utilisé pour se faire un système qui mesure l’activité antioxydante à l’intérieure de la cellule, afin de tenir compte de la capacité de l’ingrédient à pénétrer cette dernière et la protéger des processus délétères pro-oxydants et leurs conséquences inflammatoires.

Ainsi, pour étudier l’effet antioxydant d’un extrait et/ou la combinaison d’extraits, la Demanderesse a utilisé une technologie connue sous le nom de LUCS (de l’anglais Light-Up Cell System). Cette technologie est décrite notamment dans EP2235505 ou les articles Gironde, C., Rigal, M., Dufour, C., & Furger, C. (2020). AOP1, a new live cell assay for the direct and quantitative measure of intracellular antioxidant effects.Antioxidants,9(6), 471. ; et Derick S. et al. (2017), LUCS (Light-Up Cell System), a universal high throughput assay for homeostasis evaluation in live cells, Scientific Reports - Nature, 7, p. art. 18069 [11 p.]. ISSN 2045-2322.

La technologie LUCS se base sur un test de fluorescence et mesure l’effet des antioxydants sur des modèles de cellules vivantes. Plus particulièrement, la technologie utilise les variations d’intensité de fluorescence du thiazole orange (TO), un biocapteur nucléaire de la famille des cyanines asymétriques, pour établir l’état d’homéostasie de la cellule. Cela rend possible de qualifier les effets antioxydants cellulaires.

D’une manière générale, le biocapteur (TO) est ajouté dans le milieu de culture cellulaire, s’associe aux acides nucléiques des cellules et devient fluorescent. Le TO s’active par une lumière incidente de longueur d’onde 480 nm, puis se relaxe en transférant une partie de son énergie à l’oxygène intracellulaire. Cela génère de l’oxygène singulet intracellulaire. Il s’ensuit la production d’espèces oxygénées réactives (ROS, de l’anglais Reactive Oxygen Species) comportant en particulier l’anion superoxyde (O2.–) et le radical hydroxyle (OH.). L’effet antioxydant est mesuré par la capacité de l’échantillon testé à neutraliser cette production de ROS intracellulaire. Plus précisément, l’effet antioxydant intracellulaire se traduit par un retard dans le temps de l’augmentation de fluorescence induite par la photo-activation du biocapteur sous l’effet de flashs lumineux successifs.

La Demanderesse a suivi un protocole plus complexe pour identifier l’activité antioxydante des extraits ou combinaisons d’extraits de l’invention. Ce protocole prévoit l’étude de la biodisponibilité des extraits de plantes, c’est-à-dire avant et après le passage intestinal. De plus, ce protocole distingue une activité antioxydante dite directe (AOP1, de l’anglais Anti-Oxydant-Power 1) et une activité antioxydante dite naturelle (AOP2, de l’anglais Anti-Oxydant-Power 2). L’AOP1 correspond à la capacité des extraits de piéger directement des ROS intracellulaires, tandis que l’AOP2 correspond à la capacité des extraits de stimuler la voie de défense antioxydante naturelle de la cellule par activation du gêne ARE / Nrf2.

La technologie AOP2 est décrite notamment dans l’article Furger, C. (2021). Live Cell Assays for the Assessment of Antioxidant Activities of Plant Extracts. Antioxidants, 10(6), 944.

Plus particulièrement, la première activité testée a été réalisé sur un modèle utilisant des lignées cellulaires représentatives de la barrière intestinale, qui est la première traversée par un ingrédient ingéré oralement (AOP1). Dans le but d’améliorer encore la représentativité biologique dans un contexte d’ingrédient à ingérer oralement, la Demanderesse a utilisé un modèle innovant afin de simuler le passage de l’ingrédient au travers d’une barrière intestinale, puis de tester les produits passants sur des cellules hépatiques, représentatives du premier organe traversé une fois que l’ingrédient à atteint le sang (ce modèle est utilisé dans le cas de résultats AOP2).

Ainsi, la Demanderesse a étudié dans un premier temps l’AOP1 d’un grand nombre d’extraits de plantes, avant et après le passage intestinal, pour identifier des candidats d’extraits présentant une activité antioxydante accrue. Puis, dans un deuxième temps, la Ella a étudié l’AOP2 des candidats retenus. La Demanderesse a ensuite découvert non sans surprise que des compositions comportant une combinaison d’extraits sélectionnées parmi ceux retenus, résulte en des propriétés antioxydants largement supérieurs aux compositions de l’état de la technique. Il semblerait qu’un effet synergique est à l’origine de l’activité antioxydante drastiquement accrue. Les composition selon l’invention présentent ainsi des propriétés inédits.

Partie Expérimentale 1

l’AOP1 de 28 extraits de plantes est étudié sur des cellules épithéliales.

Les extraits sont présentés dans le tableau 1 ci-dessous :

Code	Nom latin	Nom vernaculaire	Partie de plante
AA	Helichrysum italicum	Immortelle	partie aerienne
AB	Vitis vinifera	VinOseed 40%	pépin
AC	Vitis vinifera	VinOseed So free	pépin
AD	Vitis vinifera	VinOgrape Plus	divers parties fruit
AE	Vitis vinifera	VinOgrape Prestige	divers parties fruit
AG	Olea europaea	Oli Ola 3% clear Bio	fruit
AI	Vaccinium macrocarpon	Canneberge - Jus	fruit
AJ	Malpighia emarginata	Acérola vert Bio - Jus	fruit
AK	Ribes nigrum	Cassis	feuille
AL	Cinnamomum verum	Cannelle	écorce
AM	Syzygium aromaticum	Clou de girofle	fleur
AN	Vitis vinifera	Raisin	feuille
AO	Vitis vinifera	Raisin	pépin
AP	Sambucus nigra	Sureau - Jus	fruit
AQ	Glycyrrhiza glabra	Réglisse	Racine
AR	Rosmarinus officinale	Romarin	Feuilles
AS	Thymus vulgaris	Thym	Feuilles
AU	Ocimum tenuiflorum	Holy basil	feuille
AV	Andrographis paniculata	Chirette verte	parties aériennes
AW	Undaria pinnatifida	Wakamé	algue
AX	Hamamelis virginiana	Hamamélis	parties aériennes
AY	Ilex paraguariensis	Yerba mate	Feuille
AZ	Melissa officinalis	Melisse	Feuille
BA	Salvia officinalis	Sauge )	Feuille
BB	Vaccinuim myrtillus	Myrtille - Jus	Fruit
BD	Ficus Carica	Figuier	Feuille
BE	Morus Nigra	Mûrier	Feuille
BF	Lonicera Caerulea	Camerise - Jus	Fruit

Tableau 1 : Extraits

L’effet antioxydant AOP1 (effet direct) avant le passage intestinal est réalisé sur un modèle de cellules épithéliales intestinales humaines. Les cellules utilisés ici sont des cellules Caco-2 qui constituent une lignée cellulaire tumorale (cellules immortalisées) humaine d'origine intestinale isolée d'un adénocarcinome colique.

Les extraits se présentent sous forme de poudre. Ils sont pesés (250 mg), puis mis en solution dans 5 ml de milieu de culture cellulaire DMEM sans sérum de veau fœtal (FCS). Des échantillons (50 mg/ml) de la solution sont vortexées, puis centrifugés à 8700 rpm pendant 10 min. Les surnageants sont aliquotés et conservés à -20 °C. Tous les échantillons sont conservés à 4 °C jusqu'au jour de l'analyse AOP1 et dilués dans une culture de cellules DMEM moyen sans FCS.

L'échantillon BF a été préparé à partir d'un échantillon brut selon le protocole suivant: broyage par blender pendant 5 min, agitation magnétique pendant 30 min, centrifugation à 5000 g pendant 10 min, puis collecte du surnageant. La matière sèche de AI et de BF a été pesée : AI = 463 mg/ml; BF = 145 mg/ml.

Pour l'étude sur les cellules CaCo2 humaines, ces dernières sont inoculés dans des plaques à 96 puits à une densité de 30000 cellules / puit en milieu DMEM avec un supplément de sérum de veau fœtal (FCS). Les plaques sont conservés dans un incubateur pendant 24 h à 37 °C / 5% CO₂.

Les cellules sont ensuite incubées en présence d'échantillons (6 concentrations obtenues par une série de 16 dilutions log(3) pendant 4 h à 37 °C / 5% CO₂. Les expériences sont réalisées en milieu DMEM sans FCS. Au moins deux expériences indépendantes sont réalisées, chacune sur des puits en triple.

Après l'incubation de 4 h, les cellules sont traitées avec le biocapteur fluorescent pendant 1 h et la fluorescence est mesurée (RFU à 535 nm) selon une procédure d'application répétitive de lumière LED d’un longeure d’onde de 480 nm (20 itérations) de l'ensemble de la plaque à 96 puits. Les profils cinétiques sont enregistrés. Chaque échantillon de monographie présente les valeurs RFU brutes enregistrées pendant la cinétique pour chaque concentration testée avant et après soustraction des valeurs de blanc (fluorescence non spécifique). Des données normalisées (% d'âge des valeurs de contrôle) et les courbes dose-réponse sont également étudiés. L'indice cellulaire antioxydant (indice AOP) est calculé à partir de profils cinétiques normalisés selon la formule:

Les courbes dose-réponse, obtenues en compilant des indices AOP selon le log(10) de la concentration de l'échantillon, sont soumis à un ajustement sigmoïde selon la formule:

où SC est égal à la concentration de l'échantillon et HS est égal à la pente de Hill. Les EC50 (concentration d'efficacité de 50%), EC10 (concentration d'efficacité de 10%) et EC90 (concentration d'efficacité de 90%) sont ensuite évaluées en fonction de l'ajustement.

Les résultats sont étudiés dans des monographies. Chaque série de données correspond à un représentant d’expérience. Dans l’ensemble des cas, les deux expériences indépendants donnent des résultats similaires.

Tous les échantillons à l'exception de deux (AJ et AW) montrent des valeurs EC.

La montre les résultats des 26 échantillons, classés en fonction des EC10 calculés.

Analyse du quartile EC10:

- Q1 (valeur EC10 la plus basse) = (AC; AB; AX; AE; AD; AA; AL)

- Q2 (valeur EC10 la plus basse) = (AM; AK; AN; BB; AY)

La montre les résultats des 26 échantillons, classés en fonction des EC50 calculés.

Analyse du quartile EC50:

- Q1 (valeur EC50 la plus basse) = (AC; AX; AB; AE; AD; AM; AA)

- Q2 (valeur EC50 la plus basse) = (AN; BB; AY; AK; AL)

La montre les résultats des 26 échantillons, classés en fonction des EC90 calculés.

Analyse du quartile EC90:

- Q1 (valeur EC90 la plus basse) = (AC; AX; AB; AE; AM; AD; AN)

- Q2 (valeur EC90 la plus basse) = (BB; AY; AK; AA; AO; BD)

La montre les résultats EC10, EC50 et EC90 des 26 échantillons dans un même graphique.

Partie Expérimentale 2

À partir des résultats obtenus dans la première partie expérimentale, 12 échantillons sont sélectionnés : AA, AB, AC, AK, AL, AM, AN, AR, AX, AY, AZ, et BB.

Le tableau 2 montre les 12 échantillons sélectionnés.

Code échantillon	Nom vernaculaire	Partie de plante

AC	VinOseed So free	pépin
AX	Hamamelis	partie aérienne
AB	VinOseed 40%	pépin
AM	Clou de girofle	fleur
AA	Immortelle	partie aerienne
AN	Raisin F	feuille
BB	Myrtille	Fruit
AY	Yerba mate	Feuille
AK	Cassis	feuille
AL	Cannelle	écorce
AR	Romarin	Feuilles
AZ	Melisse	Feuille

Tableau 2 : 12 échantillons sélectionnés

L'objectif de la deuxième partie expérimentale est de soumettre tous les échantillons sélectionnés à un test de barrière intestinale afin de collecter les compartiments basolatéraux et d'évaluer les activités antioxydantes résiduelles des technologies AOP1 et AOP2. Des cellules hépatiques (modèle HepG2 humain) sont choisis pour évaluer ces activités car le foie représente le premier organe ciblé après le transfert des ingrédients ou des métabolites dans le sang (veine porte).

A titre comparatifavec la partie expérimentale 1, l’activité AOP1 a aussi été mesurée pour chaque échantillon en contact direct avec les même cellules hépatiques (HepG2).

Ainsi, la deuxième partie expérimentale est divisée en deux tâches principales:

Tâche 1: conditionner les 12 échantillons grâce à un test de transport intestinal réalisé sur le même humain modèle de cellule épithéliale déjà utilisé pour la première partie (mais en version monocouche confluente différenciée de sorte à refaire la barrière physiologique telle que présente dans l’intestin et qui permet de filtrer / absorber les nutriments vers l’organisme).

Tâche 2: tester les 12 compartiments basolatéraux collectés par les technologies AOP 1 et AOP 2 sur les cellules hépatiques humaines HepG2 afin de déterminer leurs profils antioxydants complets.

Pour étudier l’effet antioxydant AOP1 après le passage intestinal, une étude de biodisponibilité des extraits sur des cellules Caco-2 peut-être réalisée. Cette étude permet d’isoler la fraction du produit (ou la partie moléculaire) qui est assimilée par l’organisme humain après une administration per os. Par exemple, lorsqu’un produit comporte un principe actif il peut s’agir de la fraction intacte de ce principe actif qui atteint la circulation sanguine générale. Dans d’autres cas, cette fraction peut consister en l’association de molécules issues du produit, ou peut être constituée de molécules ayant subi une transformation biochimique ou métabolisation cellulaire.

Les cellules Caco-2 constituent une lignée cellulaire tumorale (cellules immortalisées) humaine d'origine intestinale isolée d'un adénocarcinome colique.

Dans certaines conditions de culture, ces cellules ont la capacité de se différencier spontanément en cellules intestinales organisées en monocouche contigu et polarisées pour former un épithélium mimant une barrière intestinale fonctionnelle. L’épithélium peut notamment présenter des microvillosités, des jonctions serrées, des transporteurs spécifiques au système intestinal, et des enzymes du processus de métabolisation, cf. Pinto M. et al., Enterocyte-like differentiation and polarization of the human colon carcinoma cell line CACO-2 in culture, Biol Cell, 1983, 47:323-30, et Hidalgo IJ. et al., Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability, Gastroenterology, 1989, 96(3):736-49.

Des essais sur cellules Caco-2 permettent ainsi d’appliquer la perméabilité intestinale à un produit. Autrement dit, des essais sur Caco-2 renseignent sur la sa capacité d’un composé à traverser la paroi intestinale et, le cas échéant sur sa transformation biochimique, avant de rejoindre la circulation sanguine et lymphatique et se distribuer dans l'organisme.

Ici un test Caco-2, dit essai de perméabilité, est utilisé pour obtenir les fractions biodisponibles des extraits de l’invention. Il s’agit d’une mise œuvre sur insert de monocouche à compartiment isolé.

Pour cela, des cellules Caco-2 sont cultivées sur une membrane microporeuse placée dans des chambres de culture individuelles. Après une période de culture d’environ 20 à 25 jours, les cellules forment une monocouche différenciée isolant les compartiments supérieurs et inférieurs de la chambre de culture.

Une fois que la fraction biodisponible est isolée, une étude de l’effet antioxydant AOP1 de cette fraction peut être menée. En effet, l’utilisation de la fraction biodisponible rend l’évaluation significative sur le plan biologique. En particulier, elle augmente drastiquement la représentativité in vivo.

Ensuite l’effet antioxydant AOP2 des extraits et de leurs combinaisons peut être étudié sur les cellules hépatiques humaines HepG2 afin de déterminer le profil antioxydant complet (cf. ci-dessous après l’étude AOP1).

Des fractions congelées des échantillons utilisés pour la première phase sont décongelées et utilisées pour la tâche 1.

Comme évoqué plus haut, l'approche LUCS est basée sur la production d'espèces radicalaires cellulaires suite à l'ajout dans le milieu de culture d'un biocapteur d'acide nucléique fluorescent photo-inductible. Sous l'effet de la lumière, le biocapteur cellulaire déclenche la production d'oxygène singulet qui à son tour provoque la production de ROS (Reactive Oxygen Species) dans une cascade biochimique liée à une augmentation de fluorescence émise.

Pour déterminer l’AOP2, on utilise le protocole dénommé ARE / Nrf2 live cell assay. Il s’agit d’une approche génique qui mesure la capacité de l'échantillon à activer la séquence du promoteur d'ADN ARE (Antioxidant Response Element) après la sécrétion du noyau du facteur de transcription Nrf2 du complexe cytosolique Keap1 / Nrf2. Cette voie génomique (à laquelle il est souvent fait référence en tant que « Défense cellulaire antioxydante naturelle ») est connue pour augmenter la capacité des cellules à s'adapter au stress oxydant ou autre stress. Davantage de détails sont décrits dans la publication Ma (2013), Role of Nfr2 in oxidative stress and toxicity, Annual Review of Pharmacology & Toxicology, 53: 401. Dans les cellules HepG2-Nrf2, la séquence du promoteur ARE est couplée à l'expression de l'enzyme luciférase qui, en présence de luciférine, catalyse la production du composé oxyluciférine luminescent.

Le protocole concernant la barrière intestinale (en anglais : Intestinal Barrier Assay) correspond à un système de test de perméabilité. Le système comporte généralement un insert de Transwell® disponible auprès de la société Merck. L' insert comprend une membrane microporeuse sur laquelle des cellules Caco-2 sont cultivées en monocouche. L'ensemble membrane microporeuse / cellules Caco-2 sépare un compartiment apical et un compartiment basolatéral. La membrane microporeuse est généralement agencée en une pluralité de puits. Chaque puit présente un certain diamètre (par exemple 24 mm) et un fond à membrane microporeuse présentant des pores ( par exemple de 0,4 pm). Chaque puit est inoculé avec une densité cellulaire définie (par exemple 100000 cellules / puit . Le milieu de culture est changé régulièrement pour obtenir une monocouche cellulaire, cf. Reboul et al., Lutein transport by Caco-2 TC- 7 cells occurs partly by a facilitated process involving the scavenger receptor class B type I (SR- BI), Biochem J, 2005, 387 (Pt 2):455-61.

Les compartiments apical et basolatéral sont emplis respectivement de milieu de culture. Une exposition des cellules aux extraits de plantes peut alors être réalisée pendant une durée définie. Les cellules et les milieux de culture respectifs des compartiments apical et basolatéral sont récoltés et analysés. Optionnellement, les cellules et les milieux de culture respectifs des compartiments apical (milieu apical) et basolatéral (milieu basolatéral) sont congelés à -80°C pour des expériences ultérieures. L'utilisation d'un tel système permet d'avoir un accès au côté apical (côté supérieur aux cellules, mimant la lumière intestinale) et au côté basal (côté inférieur aux cellules, mimant le milieu intérieur) de l'épithélium intestinal. Cela permet l'évaluation des échanges de produits entre les deux côtés (apical/basal) . Ainsi, l'essai de perméabilité sur cellules Caco-2 permet d'investiguer notamment la perméabilité de l'épithélium intestinal vis-à-vis d'un produit d'intérêt, la biodisponibilité attendue chez l'humain, le criblage (screening en anglais) et la sélection de produits d'intérêts, la cinétique d'absorption du système intestinal, ou l'étude biologique des mécanismes d'absorption.

Après exposition des cellules Caco-2 à des extraits ou des combinaisons d'extraits de plantes introduits dans le milieu apical, il est alors possible de récolter le milieu basolatéral comprenant la fraction biodisponible, des extraits ou de leurs combinaisons. On notera que le milieu basolatéral peut en outre contenir des métabolites résultants de l'exposition spécifique des cellules Caco-2 aux extraits de plantes. Le milieu basolatéral est généralement récolté et stabilisé par congélation -80°C.

La Demanderesse a ainsi évalué la biodisponibilité des extraits sélectionnés de plantes afin d'évaluer ensuite l'effet antioxydant des fractions biodisponibles.

Ici on utilise des cellules CaCo2 humaines dosés dans des plaques (pore = 3 µm) de culture Transwell type 12-polycarbonate de Corning dans un milieu de culture DMEM complété par 20% FCS (Fetal Calf Serum) à une densité de 760000 cellules par puit (500 µl). Les cellules sont cultivées pendant 21 jours à 37 °C / CO2 5%. Le milieu de culture est remplacé tous les jours (sauf les week-ends). La valeur TEER (Trans Epithelial Electrical Resistance) est mesuré régulièrement avec un ohmmètre dédié afin d’évaluer l'intégrité et la stabilité de la barrière cellulaire. Au jour 21, la valeur TEER est mesuré et les plaques Transwell sont traités avec les échantillons à 10 mg / ml (à l'exception de l'échantillon AA qui a été préparé à 1 mg / ml) pendant 4 heures. Le compartiment apical (500 µl) et le compartiment basolatéral (1500 µl) sont collectés à la fin du temps d'incubation, puis aliquotés et conservés à -20 °C pour d'autres expériences. Deux expériences indépendants sont menées pour chacun des échantillons.

L'étude AOP1 et AOP2 est réalisée sur les cellules HepG2 humaines. Les cellules ont été inoculés dans des plaques 96 puits à une densité de 75000 cellules/puit en milieu DMEM supplémenté en sérum de veau fœtal (FCS). Les plaques sont incubés pendant 24h à 37 °C / 5% CO2.

Les cellules sont ensuite incubées en présence des échantillons (6 concentrations obtenues par série de dilutions log2) pendant 4 h (AOP 1) ou 17 h (AOP 2) à 37 °C / 5% CO2. Les expériences sont réalisées en milieu DMEM sans FCS. Une expérience sur des puits en triple (AOP 1) et deux expériences indépendantes en des puits dupliqués (AOP 2) sont réalisés.

Pour le test AOP1, les cellules sont traitées après les 4 h d'incubation avec le biocapteur fluorescent pendant 1 h et la fluorescence est mesurée (RFU à 535 nm) après exposition LED répétitive à 480 nm (20 itérations) de l'ensemble de la plaque de 96 puits. Les profils cinétiques sont enregistrés. Des monographies présentant les valeurs brutes de RFU enregistrées lors de la cinétique pour chaque concentration testée sont étudiées. Des courbes dose-réponse sont également étudiés. L'indice cellulaire antioxydant (indice AOP) est calculé à partir de profils cinétiques normalisés selon la formule :

Les courbes dose-réponse, obtenues en compilant des indices AOP selon le logarithme(10) de la concentration de l’échantillon, sont soumis à un ajustement sigmoïde selon la formule:

où SC est égal à la concentration de l'échantillon et HS est égal à la pente de Hill. Les valeurs EC50, EC10 et EC90 sont ensuite calculés.

En raison de la faible disponibilité de l'échantillon pour le compartiment basolatéral, une seule expérience AOP1 est réalisée en triple.

Pour le test AOP2, les cellules sont traitées après 17 h d'incubation avec un mélange (BPS Bioscience, USA) comprenant une solution de lyse cellulaire et de la luciférine (substrat de la luciférase) pendant 40 min. La luminescence est lue sur un équipement appelé Varioskan (disponible auprès de la société Fischer). Les valeurs de luminescence (RLU) révèlent l'expression du gène de la luciférase suite à l’expression du gène ARE. Les résultats sont présentés sous forme d'augmentation FI (FI, de l’anglais Fold Increase) des valeurs de contrôle à t = 30 min selon la formule suivante:

Des monographies présentant le FI et, en supposant que les asymptotes min et max ont été considéré par ajustement sigmoïde, la courbe dose-réponse est étudiée. Les valeurs EC10, EC50, EC90 et les pentes de Hill (en anglais Hill slopes) sont calculées de l'ajustement sigmoïde selon la formule suivante:

où SC est égal à la concentration de l'échantillon et HS est égal à la pente de Hill. Dans le cas où l'ajustement sigmoïde ne fonctionne pas, des EC10 et EC50 extrapolés sont évalués.

Ensuite, la résistance épithéliale TEER (Trans Epithelial Electrical Resistance) est analysée. Le tableau 3, montre la TEER mesurée entre le compartiment apical et le compartiment basolatéral avant et après l’incubation de chaque échantillon sélectionné.

Échantillon	TEER avant l'ajout de l'échantillon	TEER après l'ajout de l'échantillon
AA	669	520
AB	931	628
AC	839	570
AK	720	500
AL	1021	870
AM	942	592
AN	1040	925
AR	921	884
AX	981	940
AY	931	845
AZ	1033	800
BB	937	780
Contrôle négatif	24

Tableau 3 : Test de résistance épithéliale TEER
Ensuite l’AOP1 et l’AOP2 sur les compartiments pré-apical et basolatéral des cellules HepG2 est mesurée.

À l’exception de l’échantillon AA, chacun des 12 échantillons a donné un résultat pour EC50. Le tableau 4 montre une comparaison entre les résultats obtenus sur cellules CaCo2 (cf. première phase expérimentale) et les résultats obtenus sur cellules HepG2 (seconde phase expérimentale) :

Échantillon	EC50 AOP1 CACO2 (µg/ml)	EC50 AOP1 HEPG2 (µg/ml)
AA	76.25	ND
AB	20.96	16.76
AC	11.62	15.74
AK	97.77	143.30
AL	102.10	52.09
AM	57.78	46.73
AN	76.75	59.78
AR	169.90	174.70
AX	18.58	23.00
AY	95.43	131.40
AZ	200.50	248.20
BB	80.70	308.20

Tableau 4 : Comparaison EC50 CaCo vs. HEPG2

AOP1 : Aucun des échantillons basolatéraux n'a montré d'effets antioxydants classiques AOP1 (effet direct par neutralisation des radicaux libres). Il est envisageable que l'incubation de 4h n'était pas suffisante. Toutefois, une augmentation du temps d’incubation à 17h n’a pas changé la situation. On remarquera que les profils cinétiques des échantillons basolatéraux ont montré un léger décalage vers la gauche en comparaison à la courbe de contrôle. Ce phénomène est observé particulièrement sur les échantillons AC, AK, AL, AR, AZ,.

AOP2 : La montre les données regroupées de 2 expériences Transwell indépendantes (séries 1 et 2). Les barres d’erreur sont indiquées et proviennent mesures quadruplâtes). Les compartiments basolatéraux provenaient d’une incubation de 4 h avec des échantillons à 10 mg / ml à l'exception de l'échantillon AA (1 mg / ml).

Le récapitulatif des données à disposition sur les 12 ingrédients après la partie expérimentale 2 est résumé dans le tableau 5 ci-après.

Activités antioxydantes	Fraction biodisponible	Origine cellulaire
AOP 1 (direct, phase I)	Non	Barrière intestin
AOP 1 (direct)	Non	Foie
AOP 2 (activation défenses)	Oui	Foie

Tableau 5 : Données disponibles

Partie expérimentale 3

Parmi la démarche de la Demanderesse elle a considéré que les extraits de plantes peuvent avoir des activités très différentes y compris au sein d’un même modèle et qu’il convient de les sélectionner pour leur potentiel. En outre, l’opportunité de les coupler peut aboutir à des optimisations importantes du potentiel antioxydant biologique. La Demanderesse a ainsi identifié des combinaisons spécifiques d’extraits de plantes assemblés de telle sorte qu’elles conduisent à des activités de protection antioxydantes biologiques synergiques (c’est-à-dire supérieures aux ingrédients testés séparément). Ces combinaisons peuvent être utilisées en tant que complément alimentaire à administration orale et pour des applications de protection cellulaires (des radicaux libres et processus d’inflammation) pour des bénéfices tels que la santé du sportif (performance et récupération), la santé de l’œil et la vision, la santé de la peau aussi appelée nutricosmétique, la santé de l’audition, la santé du foie, etc. Par ailleurs les combinaisons sélectionnées peuvent être utilisées seul ou en association avec d’autres ingrédients fonctionnels ou techniques. La population cible peut être tant humaine qu’animale.

Dans un premier les une partie des échantillons sont triés par activité. Le tableau 6 montre le trie :

Nom	AOP2 Biodispo	Ecart type	AOP2 Direct	AOP 1	AOP 1
				Epith.	Hepat.
Clou de girofle	292,4	30,3	**	57,8	46,7
Hamamelis	182,4	25		18,6	23
Immortelle	157,4 (x5)	16,9		76,3	ND
Romarin	149,3	38,3	**	169,9	174,7
Cassis	121,9	29,8	**	97,8	143,3
Raisin F	116	9,5	*	76,8	59,8
VinOseed 40%	106,3	14,2		21	16,8
Cannelle	90,3	14,5	*	102,1	52,1

Tableau 6 : Classement sur activité

Des combinaisons d’échantillons ont ensuite été étudiés.

La montre l’effet antioxydant direct (AOP1) de combinaisons d’échantillons sur cellules épithéliales.

Une synergie considérable est observé pour les combinaisons Clou de Girofle/Immortelle 50/50, Clou de Girofle /Vinoseed 50/50, Clou de Girofle /Hamamélis 50/50 et Vinoseed/Hamamelis 60/40.

La montre l’effet antioxydant indirect (AOP2) de combinaisons d’échantillons sur cellules épithéliales.

Une synergie considérable est observé pour la combinaison Clou de Girofle /Vinoseed 50/50. Clou de Girofle/Immortelle 50/50 montre un effet synergie partiel. Un effet plutôt linéaire est observé pour Clou de Girofle/Hamamélis 50/50.

Il apparait que ce sont les combinaisons à base de Clou de girofle, Hamamélis, Immortelle et Pépin de raisin extrait (VinOseed) qui sont les plus probants et à synergie importante.

Afin d’étudier davantage l’effet synergique entre les extraits, la Demanderesse a calculé les synergies des combinaisons. Les résultats sont montrés dans les tableaux 7 et 8, ci-après.

Combinaison d’extrait	%/%	EC₅₀Théorique (µg/ml)	EC₅₀Observé (µg/ml)	Var. (%)
S. aromaticum/H. italicum	50/50	76.20	39.64	-47.98
	35/65	81.55	104.20	27.78
	20/80	86.90	133.10	53.17
S. aromaticum/H. virginiana	50/50	38.47	14.62	-61.99
	35/65	32.49	31.60	-2.75
	20/80	26.52	29.30	10.47
S. aromaticum/V. vitifera 5	50/50	40.76	12.74	-68.74
	35/65	35.48	31.30	-11.77
	20/80	30.19	31.70	4.99
H. virginiana/V. vitifera 5	50/50	20.86	20.07	-3.76
	40/60	21.31	3.30	-84.52

Tableau 7 : Effet synergique de combinaisons d’extraits sur l’activité AOP1

Le tableau 7 montre une comparaison de AOP1 EC₅₀calculé à partir de courbes dose-réponse obtenues avec différentes combinaisons d'extraits sur des cellules CaCo2.EC ₅₀ Théoriquea été calculé en tenant compte de la contribution proportionnelle des activités individuelles de chaque extrait.Var. (%)est la variation en pourcentage des deux valeursEC ₅₀ ThéoriqueetEC ₅₀ Observé.Les variations à valeur négatives montrent un effet synergique marqué.

Combinaison d’extrait	%/%	FI observé	FI théorique	Var. (%)
S. aromaticum/H. italicum	50/50	1.77	1.82	-2.43
	35/65	1.61	1.38	16.75
	20/80	1.52	1.33	14.32
S. aromaticum/H. virginiana	50/50	1.76	1.66	6.32
	35/65	1.28	1.18	8.31
	20/80	1.13	1.00	12.93
S. aromaticum/V. vitifera 5	50/50	2.00	1.52	31.41
	35/65	1.50	1.18	27.13
	20/80	1.17	0.86	35.31
H. virginiana/V. vitifera 5	50/50	1.02	1.05	-2.63
	40/60	0.94	0.90	4.37

Tableau 8 : Effet synergique de combinaisons d’extraits sur l’activité AOP2

Le tableau 8 montre en particulier les effets synergiques sur l'expression du gène ARE/Nrf2 des hépatocytes par les combinaisons au niveau de compartiments de barrière post-intestinale.FI observécorrespond à la mesure de l'augmentation du facteur d'expression génique (FI) pour chaque combinaison ;FI théoriquecorrespond à la somme des mesures d'augmentation du facteur d'expression génique (FI) de chacun des deux extraits prises indépendamment ;Var. (%)est la variation en pourcentage des deux valeursFI observéetFI théoriqueLes variations à valeur positive montrent un effet synergique marqué.

Les combinaisons particulièrement remarquables sont :

- Clou de girofle / Pépins de raisin – 50/50 ;

- Clou de girofle / Hamamélis – 50/50 ;

- Clou de girofle / Immortelle – 50/50 ; et

- Pépins de raisins / Hamamélis – 60/40.

Bien évidemment des ratios légèrement différents pourront être mis en œuvre pour l’invention.

En outre il est envisageable de combiner les combinaisons préférés ci-dessus avec d’autres échantillons, et particulièrement ceux figurants dans le tableau 7 tels que la sauge ou le cassis.

Claims

Composition orale antioxydante comprenant une combinaison d’au moins deux extraits comestibles de plantes, lesdits extraits étant choisies parmi le groupe constitué d’un extrait de raisin, un extrait de hamamélis, un extrait de giroflier et un extrait d’immortelle.
Composition selon la revendication 1, dans laquelle l’extrait de raisin est un extrait provenant du fruit de la plante, préférentiellement du pépin, et plus préférentiellement duVinOseed ^TM .
Composition selon l’une des revendications précédentes, dans laquelle l’extrait de hamamélis est un extrait obtenu à partir de la partie aérienne de la plante.
Composition selon l’une des revendications précédentes, dans laquelle l’extrait de giroflier est un extrait obtenu à partir du bouton floral de la plante, et préférentiellement un extrait de clou de girofle.
Composition selon l’une des revendications précédentes, dans laquelle l’extrait d’immortelle est un extrait obtenu à partir de la partie aérienne de la plante.
Composition selon l’une des revendications précédentes, comprenant seulement deux extraits comestibles de plantes.
Composition selon la revendication 6, dans laquelle la proportion en poids de chaque extrait est compris entre 20% et 80%.
Composition selon l’une des revendications précédentes, dans laquelle la combinaison des extraits de plantes est choisie parmi : - une combinaison d’un extrait de clou de girofle et d’un extrait d’immortelle; - une combinaison d’un extrait de clou de girofle et d’un extrait un extrait de pépin de raisin, préférentiellement duVinOseed ^TM ; - une combinaison d’un extrait de clou de girofle et d’un extrait de hamamélis ; - une combinaison d’un extrait de pépin de raisin, préférentiellement duVinOseed ^TM et d’un extrait de hamamélis.
Composition selon la revendication 8, dans laquelle la combinaison d’un extrait de clou de girofle et d’un extrait d’immortelle comprend 50% en poids d’extrait de clou de girofle et 50% en poids d’extrait d’immortelle ; la combinaison d’un extrait de clou de girofle et d’un extrait un extrait de pépin de raisin, préférentiellement duVinOseed ^TM comprend 50% en poids d’extrait de clou de girofle et 50% en poids d’extrait de pépin de raisin; la combinaison d’un extrait de clou de girofle et d’un extrait de hamamélis comprend 50% en poids d’extrait de clou de girofle et 50% en poids d’extrait de hamamélis ; et la combinaison d’un extrait de pépin de raisin, préférentiellement duVinOseed ^TM et d’un extrait de hamamélis comprend 60% en poids d’extrait de pépin de raisin et 40% en poids d’extrait de hamamélis.
Composition selon l’une des revendications précédentes, pour l’utilisation dans le traitement et/ou la prévention d’une affection choisie parmi une affection liée à des activités pro-oxydatives et/ou inflammatoire chez un humain ou un animal.
Composition selon l’une des revendications précédentes, sous une forme choisie parmi un comprimé, un cachet, une capsule, un granule, une gélule, une dragée, une gomme à mâcher, une pâte, une boisson, un sirop et une poudre.