FR3094378A1 - Traitement des maladies respiratoires avec la bacterie lactobacillus animalis - Google Patents

Abstract

La présente invention a pour objet l’utilisation de la bactérie Lactobacillus animalis dans le traitement des maladies respiratoires chez les humains tout comme chez les animaux. Il est notamment décrit une souche particulière de cette bactérie et des compositions pharmaceutiques la comprenant.

Description

TRAITEMENT DES MALADIES RESPIRATOIRES AVEC LA BACTERIE LACTOBACILLUS ANIMALIS

Le microbiote, composé de bactéries mais aussi de virus, parasites et champignons présents au-niveau de toutes les muqueuses, telles que l’intestin ou les poumons, est une composante majeure des interactions hôte-pathogène. Le microbiote intestinal, par exemple, exerce un effet protecteur, tant pour le maintien de l’homéostasie (mécanisme de tolérance), que pour la protection contre des pathogènes [1]. Notamment, l’orientation du système immunitaire vers un profil anti-inflammatoire, permettant de limiter l’inflammation, dépend largement du microbiote [2]. Son étude a ainsi permis l’identification parmi les bactéries du microbiote intestinal, de souches dites probiotiques, possédant des propriétés spécifiques permettant la prévention ou le traitement de différentes maladies (notamment les infections pulmonaires) [3, 4].

Bien que longtemps considérés comme stériles, les poumons possèdent eux aussi un microbiote. Les données disponibles dans la littérature proviennent majoritairement d’étude de métagénomique [5,6, 7]. En effet, la charge bactérienne dans les poumons en bonne santé est au moins d’un ordre de grandeur plus faible que celle de l'intestin. Il a pu être montré que le microbiote du poumon se compose d'une relativement grande diversité d'espèces bactériennes.

La colonisation par le microbiote a un impact très important sur l’immunité et la santé. Les présents inventeurs ont ainsi mis en évidence l’effet protecteur d’une souche d’Enterococcus faecaliscontre l’asthme allergique [8]. En outre, un candidat probiotique issu du microbiote pulmonaire,Corynebacterium pseudodiphtheriticum, améliore la réponse immunitaire pulmonaire contre l'infection par le virus respiratoire syncytial (VRS) et la pneumonie résultant de l’infection secondaire parStreptococcus pneumoniae[9]. Ces questions sont plus largement développées dans [10, 11].

La tuberculose est l’une des 10 premières causes de mortalité dans le monde. Grâce aux traitements actuels (vaccin BCG (Bacillus Calmette–Guérin) et quadrithérapie antibiotique), l’incidence de la maladie diminue en moyenne de 1,5 % par an. Cependant, l’apparition de formes de tuberculose résistante aux antibiotiques souligne le besoin d’identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques [12].

La tuberculose est une maladie infectieuse causée par une bactérie (Mycobacterium tuberculosis) et touchant le plus souvent les poumons [13]. La multiplication du pathogène et l’expression de certains composés moléculaires induisent une hypersensibilité immunologique conduisant à une inflammation incontrôlée [14].

Une fois que le bacille tuberculeux inhalé a atteint les alvéoles, il est phagocyté par différentes cellules immunitaires, dont notamment des macrophages alvéolaires. Cette défense cellulaire est complétée par une défense immune, impliquant les lymphocytes T par l’intermédiaire de leurs récepteurs avec les antigènes deM. tuberculosis. Ces cellules après s’être multipliées localement vont migrer dans l’organisme et gagner le foyer infectieux primaire où elles vont déclencher une réaction inflammatoire.

Les facteurs toxiques sécrétés par les cellules immunitaires, délétères pour les bactéries, mais aussi pour les cellules de l’hôte, conduisent à des dommages tissulaires importants au niveau des poumons [15]. Ainsi, pour lutter efficacement contre la tuberculose, il est nécessaire de développer de nouveaux antibiotiques, mais aussi d’identifier des outils permettant de maintenir une inflammation suffisante pour contrôler la bactérie mais sans être délétère pour l’hôte. Ce type de thérapeutique est important également en dehors de la tuberculose puisque de nombreuses maladies respiratoires sont liées à une inflammation trop importante, comme par exemple les infections parFrancisella tularensisouPseudomonas aeruginosa.

La présente invention a pour objet de nouveaux traitements de l’inflammation liée à une maladie respiratoire, notamment la tuberculose. La présente invention a notamment pour objet leur prévention.

Plus particulièrement, les présents inventeurs ont montré que la bactérieLactobacillus animalispossède des propriétés tout à fait avantageuses dans le traitement et/ou la prévention de maladies respiratoires liées à l’inflammation telles que la tuberculose.

En effet, l’administration de cette bactérie confère une forte protection contre l’infiltration leucocytaire des poumons, un marqueur clinique important de l’inflammation. En outre, elle entraîne une forte diminution de la population de leucocytes produisant des cytokines pro-inflammatoires dans les poumons. Dans le même temps, les lymphocytes T régulateurs produisant des cytokines anti-inflammatoires sont fortement stimulés. En particulier, les lymphocytes iTregs sont induits. Encore plus particulièrement, les lymphocytes iTregs qui sont induits sont des lymphocytes T régulateurs bifonctionnels.

Dans un premier aspect, l’invention a pour objet la bactérieL. animalispour son utilisation dans le traitement et/ou la prévention de l’inflammation liée à une maladie respiratoire, notamment la tuberculose. Elle a aussi pour objet l’utilisation de la bactérieL. animalispour la préparation d’un médicament pour traiter et/ou prévenir l’inflammation liée à une maladie respiratoire, notamment la tuberculose. Préférentiellement, le sujet affecté par ladite maladie respiratoire est un mammifère, y compris l'homme, le chien, le chat, les équidés, les bovins, les caprins, les porcs, les ovins et les primates non-humains. De façon plus préférée, ledit sujet est un sujet humain. Alternativement, le sujet peut être un mammifère non-humain, tel qu’un chien, un chat ou un équidé.

L’invention a notamment pour objet une souche particulière deL. animalispour son utilisation dans le traitement et/ou la prévention de l’inflammation liée à une maladie respiratoire, notamment la tuberculose. Plus spécifiquement, l’invention a pour objet la souche deL. animalisdéposée sous le numéro I-5314 le 16 avril 2018 à la Collection Nationale des Cultures de Microorganismes (CNCM), 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France, pour son utilisation dans le traitement et/ou la prévention de l’inflammation liée à une maladie respiratoire, notamment la tuberculose.

L’invention a aussi pour objet une souche particulière deL. animalispossédant des propriétés de prévention et/ou de traitement des maladies respiratoires liées à l’inflammation. Plus spécifiquement, l’invention a pour objet la souche deL. animalisdéposée sous le numéro I-5314 le 16 avril 2018 à la Collection Nationale des Cultures de Microorganismes (CNCM), 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France.

La souche I-5314 est produite par culture, par exemple, dans un milieu de croissance connu de l’homme du métier (par exemple, un milieu liquide MRS : « Man, Rogosa et Sharpe ») pendant 1 à 2 jours en conditions aérobie, à une température de 30-37°C, avec ou sans ajustement du pH. Le bouillon de fermentation contenant les cellules bactériennes est recueilli. Le bouillon peut être utilisé tel quel, concentré ou lyophilisé. Avantageusement, les bactéries seront recueillies, par exemple par centrifugation puis remises en suspension dans un tampon approprié, par exemple du PBS (« phoshate-buffered saline »). La concentration bactérienne peut être établie en utilisant un cytomètre de flux ou un autre procédé équivalent.

La souche de l’invention est particulièrement avantageuse en ce qu’elle entraîne une forte augmentation des populations aussi bien de lymphocytes Th17 que de lymphocytes Tregs. L’induction des lymphocytes Treg est notamment importante car ce sont avant tout des Tregs bifonctionnels qui ont à la fois des propriétés pro- et anti-inflammatoires. Ainsi, en fonction du contexte, les biTregs peuvent réguler de manière positive ou négative la réponse inflammatoire intervenant au cours de la maladie infectieuse [16, 17, 18].

Selon un mode préféré de réalisation, l’invention a donc pour objet la bactérieL. animalispour son utilisation dans le traitement et/ou la prévention de l’inflammation liée à une maladie respiratoire, notamment la tuberculose, ledit traitement et/ou prévention comprenant une diminution de l’infiltration leucocytaire et une augmentation des populations pulmonaires lymphocytes Th17 que de lymphocytes Tregs.

Selon un autre mode préféré de réalisation, l’invention a pour objet l’utilisation de la bactérieL. animalispour la préparation d’un médicament pour traiter et/ou prévenir l’inflammation liée à une maladie respiratoire, notamment la tuberculose, ledit traitement et/ou prévention comprenant une diminution de l’infiltration leucocytaire et une augmentation des populations pulmonaires lymphocytes Th17 que de lymphocytes Tregs.

Selon un mode de réalisation encore plus préféré, les lymphocytes Tregs sont des lymphocytes iTregs. Encore plus préférentiellement, les lymphocytes iTregs sont des lymphocytes iTregs bifonctionnels.

Les « lymphocytes T » ou « cellules T » sont un type de lymphocytes (globules blancs) jouant un rôle central dans l'immunité à médiation cellulaire. Ils peuvent être distingués d'autres lymphocytes, tels que les cellules B et les cellules tueuses naturelles (cellules NK), par la présence d'un récepteur de cellules T (TCR) à la surface de la cellule. Tel qu'utilisé ici, le terme « récepteur de cellules T » ou « TCR » représente un récepteur présent à la surface des cellules T qui est responsable de la reconnaissance des antigènes liés aux molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (MHC). Les cellules T ne présentent pas d'antigènes et dépendent d'autres lymphocytes (cellules tueuses naturelles, cellules B, macrophages, cellules dendritiques) pour faciliter la présentation de l'antigène. Les types de cellules T incluent notamment les cellules T auxiliaires (cellules Th), les cellules T mémoire (Tcm, Tern ou Temra), les cellules T régulatrices (Treg), les cellules T cytotoxiques (CTL), les cellules T tueuses naturelles (cellules NKT), les cellules T gamma delta et les cellules T invariantes associées à la muqueuse (MAIT).

Parmi les lymphocytes T, les « lymphocytes T CD4⁺», appelés également « T auxiliaires » et aussi « T helper (Th) », ont pour fonction principale de réguler positivement ou négativement d’autres cellules immunitaires. Ces cellules expriment la glycoprotéine CD4 à leur surface. Le terme « CD4 », tel qu'utilisé ici, désigne une glycoprotéine membranaire de lymphocytes T qui interagit avec les antigènes du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de classe II et est également un récepteur du virus de l'immunodéficience humaine. La protéine fonctionne pour initier ou augmenter la phase précoce d'activation des cellules T. De préférence, la molécule CD4 de l'invention est un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés représentée par NP_038516.

Les lymphocytes T CD4⁺peuvent être classifiés selon le type de cytokines qu’ils produisent. On peut ainsi notamment identifier des lymphocytes T CD4⁺Th1, des lymphocytes T CD4⁺Th2, des lymphocytes T CD4⁺Th17 ou encore des lymphocytes T CD4⁺régulateurs.

On appelle « lymphocytes T CD4⁺Th1 » ou « lymphocytes Th1 » ou « Th1 » une population de lymphocytes T CD4⁺activés qui orientent la réponse immunitaire vers la réponse cellulaire et la cytotoxicité. Les Th1 produisent principalement les cytokines IL-2, TNFα et IFNγ et expriment le facteur de transcription T-bet. Le terme « T-bet » ou « TBX21 », tel qu’utilisé ici, représente un facteur de transcription de la famille des facteurs de transcription à T-box, qui est nécessaire à la différenciation des lymphocytes T Th1 et des lymphocytes T cytotoxiques Tc1 (c’est-à-dire un lymphocyte T cytotoxique présentant à sa surface des récepteurs pouvant se lier à des complexes formés par un peptide présenté par une molécule CMH de classe I), deux populations lymphocytaires capables de sécréter l'IFNγ. Dans un mode préféré de réalisation, la protéine T-bet possède la séquence d’acides aminés représentée par NP_037483.1.

Les lymphocytes Th1 sont induits par la cytokine IL-12 en réponse aux infections par des pathogènes viraux ou bactériens (commeM. tuberculosispar exemple). Les cytokines alors produites par les Th1 activent les macrophages qui détruisent les pathogènes. Cependant, cette réponse anti-infectieuse Th1 peut aussi être à l’origine des lésions immunopathologiques tissulaires, notamment en présence d’une infection chronique.

Par « lymphocytes T CD4⁺Th17 » ou « lymphocyte Th17 » ou « cellules Th17 » ou « Th17 », on entend ici une population de lymphocytes T CD4⁺auxiliaires exprimant le facteur de transcription RAR-related orphan receptor-γt (ROR-γt) et produisant la cytokine IL-17A, une cytokine fortement pro-inflammatoire. Avantageusement, les cellules Th17 sont également caractérisées par la libération d’IL‐17F, d’IL‐21 et d’IL‐22 et la co‐expression des marqueurs membranaires CCR6, ICOS et CCR4. Les cellules Th17 sont impliquées dans le contrôle des infections bactériennes extracellulaires et fongiques.

Tel qu'utilisé ici, le terme « cellules T régulatrices » ou « cellules Tregs » ou « Tregs » ou « cellules T suppresseurs » désigne une population de cellules T qui expriment le facteur de transcription FOXP3 et qui maintiennent la tolérance immunologique. Les cellules Tregs sont importantes pour maintenir l'homéostasie, contrôler l'ampleur et la durée de la réponse inflammatoire et prévenir les réponses auto-immunes et allergiques. Au cours d'une réponse immunitaire, les Tregs suppriment ainsi les réactions immunitaires médiées par les cellules T effectrices, telles que les cellules T effectrices CD4⁺ou CD8⁺.

Les cellules T régulatrices peuvent être des cellules Tregs naturelles ou des cellules Tregs induites. Par « cellules Tregs naturelles » ou « Tregs naturels », on entend ici des cellules T d’origine thymique qui expriment des marqueurs particuliers de la surface des cellules, à savoir les marqueurs CD4 et CD25. Lesdites cellules sont donc de préférence de phénotype CD4⁺CD25^highFOXP3^high. En outre, les Tregs naturels expriment le facteur de transcription Helios.

Les « lymphocytes Tregs induits » ou « cellules Tregs induites » ou « cellules iTregs », tel qu’on les entend ici, sont des cellules T d’origine périphérique dont la différenciation est induite à la suite d’une interaction antigénique en présence de cytokines telles que TGF-β et IL-2. Les iTregs sont caractérisées par la présence de la chaîne α du récepteur de l’IL‐2 (CD25) et de CCR4 à leur surface et la production de cytokines suppressives comme par exemple IL-10, en sus de l’expression de FOXP3. En outre, les cellules iTregs n’expriment pas le facteur de transcription Helios.

Le terme « CD25 », tel qu'utilisé ici, désigne la chaîne alpha du récepteur de l'IL-2. Cette protéine est une protéine transmembranaire de type I présente sur les cellules T activées, les cellules B activées, certains thymocytes, les précurseurs myéloïdes et les oligodendrocytes qui s'associent à CD122 pour former un hétérodimère pouvant servir de récepteur à haute affinité pour IL-2. Les Tregs en particulier expriment CD25 en plus des CD4 et FOXP3. De préférence, la molécule CD25 de l'invention est un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés représentée par NP_032393.

Par « Helios », on entend ici un facteur de transcription à doigt de zinc codé par le gène IKZF2. Le facteur de transcription Helios forme des homodimères, voire des hétérodimères avec les facteurs de transcription Iskaros et Aiolos. Helios est exprimé notamment dans les cellules Tregs. Plus spécifiquement, Helios est exprimé exclusivement dans les Tregs naturels, mais pas dans les Tregs induits. Préférentiellement, la protéine Hélios telle qu’on l’entend ici correspond à deux isoformes, dont les séquences en acides aminés sont représentées par NP_057344.2 et NP_001072994.1, respectivement.

Dans un mode de réalisation préférentiel, les cellules iTregs sont des cellules possédant une double fonctionnalité et sont appelées « lymphocytes iTregs bifonctionnels » ou « lymphocytes bi-Tregs » ou « cellules iTregs bifonctionnelles » ou « cellules bi-Tregs » ou « biTregs ». Selon ce mode de réalisation, les cellules biTregs sont des cellules qui expriment à la fois ROR-γt et FOXP3. Préférentiellement, les cellules biTregs produisent à la fois la cytokine pro-inflammatoire Il-17 et la cytokine anti-inflammatoire IL-10. De façon encore plus préférée, les cellules biTregs produisent en outre les cytokines TGF-β et IL-35.

Par « RAR-related orphan receptor-γt » ou « ROR-γt », on entend ici un facteur de transcription de la famille des récepteurs nucléaires des hormones stéroïdiennes, exclusivement exprimé dans les cellules du système immunitaire. Le facteur de transcription ROR-γt joue ainsi un rôle clé dans la régulation de la différenciation des cellules Th17. De préférence, le facteur de transcription ROR-γt est un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés représentée par NP_001001523.1.

Tel qu'utilisé ici, le terme « FOXP3 » désigne un facteur de transcription appartenant à la famille des régulateurs de transcription « forkhead / winged helix ». Le facteur de transcription FOXP3 est le régulateur principal du développement et de la fonction des lymphocytes Tregs. En outre, FOXP3 est un marqueur des lymphocytes Tregs, l’expression de ce facteur de transcription dans un lymphocyte T CD4⁺suffisant à caractériser un lymphocyte Treg. De préférence, le facteur de transcription FOXP3 est un polypeptide ayant la séquence d'acides aminés représentée par NP_001186276.

Les présents inventeurs ont ainsi montré que l’administration de la bactérieL. animalisconduit à une augmentation de la population pulmonaire de cellules iTregs. Cette augmentation n’est pas causée par un accroissement de la prolifération cellulaire, mais par une induction de la différenciation de ces cellules. De préférence, l’administration deL. animalisconduit à une induction dans le poumon de lymphocytes iTregs sécrétant aussi bien des cytokines pro-inflammatoires (par exemple, Il-17A) que des cytokines anti-inflammatoires (par exemple IL-10).

Le terme « cytokine », tel qu’on l’entend ici, se rapporte à une famille de petites protéines sécrétées régulatrices ayant un rôle crucial dans les réponses immunitaires. Les cytokines sont impliquées dans la communication entre cellules et régulent de nombreuses fonctions cellulaires, comme par exemple la survie et la croissance des cellules, ainsi que l'induction de l’expression de nombreux gènes. Les cytokines peuvent être produites par de nombreux types cellulaires. Comme expliqué plus haut, le type cellulaire d’un lymphocyte donné est notamment déterminé par son profil cytokinique. Ainsi, les « cytokines Th1 », telles qu’on les entend ici, sont les cytokines produites par les lymphocytes T CD4 Th1 (notamment IL-2, IFNγ et TFNα).

Par « cytokine pro-inflammatoire », on entend ici les cytokines qui conduisent à une augmentation de l’inflammation. Elles comprennent notamment des cytokines telles que, par exemple, IL-1β, TNFα, IL-6, IL-15, IL-17, IFN-γ et IL-18. Selon un mode de réalisation préféré, les cytokines pro-inflammatoires sont TNFα, IL-6, IFN-γ et IL-17, plus préférentiellement IL-17. Les « cytokines anti-inflammatoires » sont celles qui contrôlent la réponse des cytokines pro-inflammatoires. Les cytokines anti-inflammatoires agissent de concert avec des inhibiteurs de cytokines spécifiques et des récepteurs de cytokines solubles pour réguler la réponse immunitaire humaine. Les cytokines anti-inflammatoires majeures comprennent l'antagoniste au récepteur d’IL-1, IL-10 et TGF-β. Préférentiellement, les cytokines anti-inflammatoires sont IL-10 et TGF-β.

Selon un mode de réalisation plus particulièrement préféré, l’administration deL. animalisentraîne l’induction dans le poumon de lymphocytes iTreg produisant de l’Il-10, du TGF-β et de l’IL-17. Les inventeurs ont d’ailleurs montré que le nombre de cellules produisant ces cytokines est augmenté après administration deL. animalis. En revanche, la concentration de cytokines pro-inflammatoires telles que TNFα, IL-6 et IFN-γ n’est pas affectée.

Le terme «'interleukine 17 » ou « IL-17 » ou « IL-17A », tel qu’on l’entend ici, représente une glycoprotéine homodimérique de 20-30 kDa. Le gène de l'IL-17 humaine code une protéine constituée de 155 acides aminés, dont une séquence signal de 19 acides aminés et un segment mature de 136 acides aminés. Il-17 est une cytokine pro-inflammatoire qui participe aux défenses contre les infections bactériennes extra-cellulaires et fongiques. Une fois sécrétée, cette cytokine agit sur les cellules épithéliales, les cellules endothéliales, les fibroblastes ainsi que sur d’autres cellules du système immunitaire, en les activant pour qu’elles produisent des cytokines pro-inflammatoires comme l’IL-1, l’IL-6, le TNF-α, des chimiokines, du GM-CFS, etc.

Par « interleukine 10 » ou « IL-10 », on entend ici une protéine homodimérique composées de deux sous-unités en hélice α liées par des interactions non covalentes. De façon préférée, chaque monomère d’IL-10 est exprimé sous la forme d’un précurseur dont la séquence en acides aminés est représentée par NP_000563.1. L'IL-10 est une cytokine anti-inflammatoire clé produite par des cellules immunitaires activées qui joue un rôle critique dans le contrôle des réponses immunitaires. En particulier, elle réduit l'expression des cytokines Th1, des antigènes du CMH de classe II et des molécules co-stimulatrices sur les macrophages. Elle améliore également la survie, la prolifération et la production d'anticorps des cellules B. L'IL-10 peut bloquer l'activité de NF-KB et est impliquée dans la régulation de la voie de signalisation JAK-STAT.

On entend ici par « TGF-β » ou « transforming growth factor-β” ou « facteur de croissance transformant-β » une cytokine multifonctionnelle appartenant à la superfamille des facteurs de croissance transformants et comprenant quatre isoformes différentes (TGF-β1 à 4). De façon préféré, TGF-β1, 2, 3 et 4 ont des séquences en acides aminés représentées par NP_000651, NP_001129071 ou NP_003229, NP_001316867 ou NP_001316868 ou NP_003230, et Q64280.1. Le TGF-β est impliqué dans de multiples processus. Notamment, il joue un rôle immunosuppresseur et anti-inflammatoire en favorisant la résolution de l’inflammation et le retour à l’homéostasie. Il supprime ainsi la production de cytokines en inhibant l'activité des macrophages et des cellules Th1. En particulier, il neutralise l'IL-1, l'IL-2, l'IL-6 et le TNFα, et induit IL-1RA.

Le terme « augmenté », tel qu'il est utilisé ici dans certains modes de réalisation, signifie une plus grande quantité, par exemple, une quantité légèrement supérieure à la quantité d'origine ou par exemple une quantité en grand excès par rapport à la quantité d'origine, et notamment toutes les quantités dans l'intervalle. En variante, « augmentation » peut faire référence à une quantité ou une activité qui est au moins 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% ou 20% de plus que la quantité ou de l'activité pour laquelle la quantité ou de l'activité accrue est comparé. Les termes « augmenté », « plus grand que », et « accru » sont utilisés ici de manière interchangeable. Une « population de lymphocytes augmentée » signifie ainsi une population desdits lymphocytes, par exemple des lymphocytes Th17 ou iTregs, notamment des biTregs, accrue par rapport à un contrôle de référence, tel que, par exemple, un contrôle n’ayant pas été traité avec la présente bactérieL. animalis. En d’autres termes, une « population de lymphocytes augmentée » dans les poumons, par exemple des lymphocytes Th17 ou iTregs, notamment des biTregs, signifie que le nombre desdits lymphocytes dans les poumons est augmenté par rapport à un contrôle de référence, tel que, par exemple, un contrôle n’ayant pas été traité avec la présente bactérieL. animalis. Cette augmentation peut résulter notamment d’une augmentation de la différenciation des lymphocytes T dans le type de lymphocytes d’intérêt (par exemple des lymphocytes Th17 ou iTregs, notamment des biTregs) et/ou d’une augmentation de la prolifération cellulaire. Préférentiellement, cette augmentation de la population de lymphocytes d’intérêt (par exemple des lymphocytes Th17 ou iTregs, notamment des biTregs) ne résulte pas d’une augmentation de la prolifération cellulaire.

Le terme « diminution », tel qu'il est utilisé ici dans certains modes de réalisation, signifie une plus petite quantité, par exemple, une quantité légèrement inférieure à la quantité d'origine, ou par exemple une quantité beaucoup plus petite que la quantité d'origine, et notamment toutes les quantités dans l'intervalle. En variante, « diminution » peut faire référence à une quantité ou une activité qui est au moins 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% ou 20% de moins que la quantité ou de l'activité pour laquelle la quantité ou de l'activité diminuée est comparé. Les termes « diminué », « plus petit que », « moindre » et « décru » sont utilisés ici de manière interchangeable. Une « population de lymphocytes diminuée » signifie ainsi une population desdits lymphocyte réduite par rapport à un contrôle de référence, tel que, par exemple, un contrôle n’ayant pas été traité avec la présente bactérieL. animalis. En d’autres termes, une « population de lymphocytes diminuée » dans les poumons signifie que le nombre desdits lymphocytes dans les poumons est réduit par rapport à un contrôle de référence, tel que, par exemple, un contrôle n’ayant pas été traité avec la présente bactérieL. animalis.

Ledit « contrôle » tel qu’utilisé ici peut être un patient, un modèle animal ou encore un modèle cellulaire in vitro. De préférence, le « contrôle » est un patient. Par « patient », on entend ici un sujet humain souffrant d’une inflammation liée à une maladie respiratoire, notamment la tuberculose. Selon un autre mode de réalisation préféré, le sujet est un animal, notamment un chien, un chat ou un cheval.

Dans un autre aspect, la présente invention a aussi pour objet une composition pharmaceutique comprenant la souche I-5314 et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.

La bactérie inactivée induit les mêmes effets que la souche vivante et possède donc elle aussi des propriétés de prévention et/ou de traitement des maladies respiratoires.

Selon un mode de réalisation particulier de l’invention, la souche I-5314 présente dans la composition pharmaceutique est une souche inactivée. Par « souche inactivée », on entend ici une souche bactérienne qui est incapable de croître et/ou de se diviser. Préférentiellement, une souche inactivée n’a plus d’activité métabolique. Toutefois, les bactéries inactivées selon l’invention sont toujours capables de modérer l’inflammation, c’est-à-dire que l’administration de la bactérie inactivée entraîne une diminution de l’infiltration leucocytaire et une augmentation des populations pulmonaires de lymphocytes Tregs.

Les techniques d’inactivation des bactéries sont bien connues de l’homme du métier. On citera par exemple l’inactivation par la chaleur, l’irradiation par les UV ou les rayons gamma, le traitement par les acides, le traitement par le peroxyde d’hydrogène, etc. Les bactériesL. animalisseront préférentiellement inactivées par traitement à la chaleur.

Il est particulièrement avantageux d’utiliser des extraits de la souche I-5314 dans les présentes compositions pharmaceutiques. Un « extrait », tel qu’on l’entend ici, désigne tout matériel cellulaire obtenu suite à la lyse d'une ou plusieurs souches bactériennes. Avantageusement, un extrait a subi une ou plusieurs étapes supplémentaires d’extraction et/ou de purification. Préférentiellement, l'extrait est obtenu à partir d’une seule souche ; plus préférentiellement, ladite souche est la présente souche I-5314.

La lyse peut être réalisée par tous les moyens connus de l’homme du métier : lyse alcaline, lyse par sonication, lyse par haute pression (presse de French), etc. L’extrait obtenu par la lyse cellulaire peut ensuite être soumis à des étapes d’extraction et/ou de purification supplémentaires. Celles-ci peuvent comprendre n’importe quel traitement usuel de tels extraits et connu de l’homme du métier : on mentionnera entre autres les centrifugations (par exemple pour séparer la membrane plasmique du cytoplasme), les filtrations, les précipitations et les séparations des différents constituants cellulaires (par exemple en utilisant l’un des nombreux types de chromatographie), etc. Chacun des différents extraits obtenus à chacune de ces étapes peut être utilisé dans la méthode de l’invention pour autant qu’il soit toujours capable de modérer l’inflammation, c’est-à-dire que l’administration dudit extrait entraîne une diminution de l’infiltration leucocytaire et une augmentation des populations pulmonaires de lymphocytes Th17 et de lymphocytes Tregs.

Les présentes compositions sont utiles pour le traitement de l’inflammation liée aux maladies respiratoires.

Par « maladie respiratoire », on entend ici les maladies de l'appareil respiratoire, notamment des poumons ou des bronches, ou provoquant des troubles de la respiration. Parmi ces maladies respiratoires, un grand nombre sont liées à une inflammation de l'appareil respiratoire, notamment des poumons ou des bronches. On citera ainsi, et de manière non exhaustive, l'asthme (légère, modérée ou sévère), par exemple, bronchique, allergique, intrinsèque, extrinsèque, induite par l'exercice, d'origine médicamenteuse (y compris l'aspirine et aux AINS) et l'asthme induit par la poussière, l'asthme résistant aux stéroïdes, la bronchite, y compris la bronchite infectieuse et à éosinophiles, d'une maladie pulmonaire obstructive chronique (COPD), comme la BPCO (broncho-pneumopathie chronique obstructive), la fibrose cystique, la fibrose pulmonaire, y compris cryptogénique alvéolite fibrosante, la fibrose pulmonaire idiopathique, prieumonias interstitielles idiopathiques, la fibrose compliquant une thérapie anti-néoplasique et chronique, l'infection, y compris la tuberculose, la tularémie (causée parF. tularensis), l'aspergillose et d'autres infections bactériennes (par exemple parFrancisella Novicidaou parP . aeruginosa) ou fongiques (par exemple parCandida albicansou parAspergillus fumigatus) ; complications de la transplantation pulmonaire; vascularite et troubles thrombotiques du système vasculaire pulmonaire et hypertension artérielle pulmonaire (y compris l'hypertension artérielle pulmonaire); activité antitussive comprenant le traitement de la toux chronique associée à des affections inflammatoires et sécrétoires des voies respiratoires et la toux iatrogène; rhinite aiguë et chronique, y compris la rhinite médicamenteuse, et la rhinite vasomotrice; perannuelle et saisonnière rhinite allergique y compris la rhinite nerveuse (rhume des foins); polypose nasale; infection aiguë virale, y compris le rhume, et l'infection due au virus respiratoire syncytial, la grippe, coronavirus (SRAS notamment) et l'adénovirus, un œdème pulmonaire, embolie pulmonaire, pneumonie, sarcoïdose pulmonaire, la silicose, poumon de fermier et les maladies apparentées; pneumopathie d'hypersensibilité, insuffisance respiratoire, syndrome de détresse respiratoire aiguë, l'emphysème, la bronchite chronique, la tuberculose et le cancer du poumon, etc. Les maladies respiratoires telles qu’on l’entend ici comprennent aussi les maladies respiratoires affectant spécifiquement les animaux, notamment les chats, les chiens ou les chevaux. Elles comprennent notamment la toux du chenil, causée en particulier par les infections au virusParainfluenzaet la bactérieBordetella bronchiseptica. Selon un mode de réalisation préféré, ladite maladie respiratoire est la tuberculose.

Par « tuberculose », on entend ici une maladie infectieuse causée par la bactérieMycobacterium tuberculosis. Dans la grande majorité des cas, la tuberculose est une tuberculose pulmonaire, ce qui signifie que l’infection touche les poumons. Lorsqu’elle se déclare, la tuberculose pulmonaire se manifeste par une toux, parfois productive ou sanglante, des douleurs thoraciques, une asthénie, une perte de poids et des sueurs nocturnes. En outre, la tuberculose peut être responsable d'une inflammation d'évolution prolongée, dont l'aspect anatomopathologique est caractéristique.

Par « inflammation », on entend ici l’ensemble des mécanismes réactionnels de défense par lesquels l’organisme reconnaît, détruit et élimine toutes les substances qui lui sont étrangères. La réaction inflammatoire est la réponse à une agression d'origine exogène (cause infectieuse, traumatique) ou endogène (cause immunologique, par exemple une réaction d'hypersensibilité ou une autre cause, par exemple le syndrome d'ischémie- reperfusion). La réponse inflammatoire est habituellement composée d’une phase d'initiation qui fait suite à un signal de danger d'origine exogène ou endogène et qui met en jeu des effecteurs primaires, d’une phase d'amplification avec la mobilisation et l'activation d'effecteurs secondaires et d’une phase de résolution et de réparation qui tend à restaurer l'intégrité du tissu agressé. La réaction inflammatoire est ainsi, le plus souvent, une réponse adaptée strictement contrôlée par de multiples systèmes régulateurs, dont, par exemple, les cellules Tregs. Toutefois, si la réponse inflammatoire est inadaptée ou mal contrôlée ; elle peut devenir agressive. Dans certains cas, l’inflammation peut devenir chronique : par exemple, la tuberculose entraîne une inflammation chronique.

Les termes « traiter », « traité », « traitement », ainsi que les termes analogues, tels qu'ils sont utilisés ici, se réfèrent à la réduction ou l'amélioration des symptômes d'un trouble (par exemple, l’inflammation liée à une maladie respiratoire, notamment la tuberculose) et/ou les symptômes associés avec celui-ci chez un sujet. On notera que, bien que ce ne soit pas exclu, le traitement d'un trouble ou un état ne nécessite pas que la pathologie, la condition ou les symptômes qui lui sont associés soient complètement éliminés.

Les termes « prévenir », « prévention », ainsi que les termes analogues, tels qu'ils sont utilisés ici, se réfèrent à la suppression du risque d’apparition d'un trouble (par exemple, l’inflammation liée à une maladie respiratoire, notamment la tuberculose) et/ou les symptômes associés avec celui-ci chez un sujet.

On entend ici par « sujet » n’importe quel mammifère pouvant bénéficier du traitement décrit ici, y compris l'homme, le chien, le chat, les équidés, les bovins, les caprins, les porcs, les ovins et les primates non-humains. Plus spécifiquement, on appelle ici « patient » un sujet humain. Ledit patient peut appartenir à n’importe quelle classe d’âge, c’est-à-dire le patient peut être un enfant, un adolescent ou un adulte. Alternativement, le sujet peut être un mammifère non-humain, tel qu’un chien, un chat ou un équidé.

Les présentes compositions pharmaceutiques comprennent outre la souche I-5314, un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables.

Par « excipient pharmaceutiquement acceptable », on entend ici un excipient dont l'administration à un individu ne s'accompagne pas d'effets délétères significatifs. Les excipients pharmaceutiquement acceptables sont bien connus de l’homme du métier.

Tel qu'il est utilisé ici, l’expression « excipient pharmaceutiquement acceptable » comprend tous les solvants, tampons, solutions salines, milieux de dispersion, revêtements, agents antibactériens et antifongiques, agents isotoniques et retardant d'absorption, et analogues qui sont physiologiquement compatibles. Les excipients sont choisis selon la forme pharmaceutique et le mode d'administration souhaité, parmi les excipients habituels qui sont connus de l'homme du métier. Le type de support sera ainsi choisi en fonction de la voie d'administration prévue. Dans divers modes de réalisation, le support est approprié pour une administration intraveineuse, intrapéritonéale, sous-cutanée, intramusculaire, topique, transdermique, orale, ou par aérosol. Ainsi, dans des modes particuliers de réalisation, la présente souche est formulée dans des véhicule pharmaceutiquement acceptables, tels que des solutions, suspensions, comprimés, comprimés dispersibles, pilules, gélules, poudres, formulations à libération prolongée ou élixirs, pour administration orale ou dans des solutions ou suspensions stériles pour administration parentérale, ainsi que des patchs transdermiques et des inhalateurs de poudre sèche. Les véhicules pharmaceutiquement acceptables comprennent les solutions ou dispersions aqueuses stériles et des poudres stériles pour la préparation extemporanée de solutions ou dispersions injectables stériles. L'utilisation de milieux et agents pour des substances pharmaceutiquement actives est bien connue dans la technique. Les techniques et les méthodes bien connues de la personne du métier seront ainsi utilisées pour préparer des compositions pharmaceutiques contenant la souche I-5314 ou les extraits de celle-ci (voir par exemple, Ansel (1985)Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms ,4^thEd., p. 126). Les procédés pour préparer des compositions pharmaceutiques, notamment des compositions pharmaceutiques administrables par voie orale ou par inhalation, seront connus ou évidents pour l'homme du métier et sont décrits plus en détail dans, par exemple, «Remington's Pharmaceutical Science, 17th ed ., Mack Publishing Company , Easton, Pa. (1985)», et le 18e et 19e éditions de ce manuel.

Les présentes compositions sont administrées au patient à une dose thérapeutiquement efficace. Le terme « dose thérapeutiquement efficace » tel qu'utilisé ici se réfère à la quantité nécessaire pour observer une activité thérapeutique ou préventive sur l’inflammation liée à la maladie respiratoire, notamment la tuberculose, en particulier la quantité nécessaire pour observer une amélioration des symptômes. La quantité de bactérie I-5314 à administrer ainsi que la durée du traitement sont évaluées par l'homme du métier selon l'état physiologique du sujet à traiter, ainsi que la voie d'administration utilisée. La souche bactérienne utilisée peut être administrée sous la forme d'une dose unique ou de doses multiples.

L’homme du métier saura ainsi choisir au mieux les voies et modes d’administration de la composition, ainsi que les posologies et formes galéniques optimales, selon les critères généralement pris en compte dans la fabrication d’un médicament ou l’établissement d’un traitement pharmaceutique ou vétérinaire. De préférence, ces composés seront administrés par voie systémique, en particulier par voie intraveineuse, par voie intramusculaire, intradermique, intra-péritonéale ou sous-cutanée, par voie orale, ou par voie topique (au moyen de gel, aérosols, gouttes, etc.). Les formes unitaires d'administration appropriées comprennent les formes par voie orale telles que les comprimés, les gélules molles ou dures, les poudres, les granules et les solutions ou suspensions orales, les formes d'administration sublinguale, buccale, intra-trachéale, intraoculaire, intranasale, par inhalation, les formes d'administration topique, transdermique, sous-cutanée, intramusculaire ou intraveineuse, les formes d'administration rectale et les implants. Pour l'application topique, on peut utiliser les composés selon l'invention dans des crèmes, gels, pommades ou lotions.

Il sera particulièrement avantageux d’administrer la composition par voie entérale, orale, parentérale (par exemple sous-cutanée, intradermique, ou intramusculaire) ou mucosale (par exemple intranasale, sublinguale, intravaginale, transcutanée). De manière plus préférée, la composition pharmaceutique sera administrée à plusieurs reprises, de manière étalée dans le temps. Son mode d’administration, sa posologie et sa forme galénique optimale peuvent être déterminés selon les critères généralement pris en compte dans l’établissement d’un traitement adapté à un patient comme par exemple l’âge ou le poids corporel du patient, la gravité de son état général, la tolérance au traitement et les effets secondaires constatés.

Dans les présentes compositions pharmaceutiques, le principe actif ou les principes actifs sont généralement formulés en unités de dosage. Par exemple, quand la bactérie I-5314 vivante est administrée, l'unité de dosage contient au moins 10²ufc, préférentiellement au moins 10³ufc, préférentiellement au moins 10⁴ufc, préférentiellement au moins 10⁵ufc, préférentiellement au moins 10⁶ufc, plus préférentiellement au moins 10⁷ufc, encore plus préférentiellement au moins 10⁸ufc, le plus préférentiellement au moins 10⁹ufc, par unité de dosage. Selon un autre mode de réalisation, l'unité de dosage contient entre 10²et 10⁹ufc, avantageusement entre 10⁵et 10⁹ufc, de préférence de 10⁷à 10⁹ufc par unité de dosage, pour les administrations quotidiennes, une ou plusieurs fois par jour. Par ailleurs, quand des extraits bactériens sont administrés au patient, l'unité de dosage contient 2,5 à 500 mg, avantageusement de 10 à 250 mg, de préférence de 10 à 150 mg par unité de dosage, pour les administrations quotidiennes, une ou plusieurs fois par jour. Bien que ces dosages soient des exemples de situations moyennes, il peut y avoir des cas particuliers où des dosages plus élevés ou plus faibles sont appropriés, de tels dosages appartiennent également à l'invention. Selon la pratique habituelle, le dosage approprié à chaque patient est déterminé par le médecin selon le mode d'administration, l'âge, le poids et la réponse dudit patient.

L’invention sera décrite plus précisément au moyen des exemples ci-dessous.

LEGENDES DES FIGURES

[Figure 1 : Protocole expérimental utilisé pour étudier l’effet de l’administration de bactéries isolées du microbiote pulmonaire sur l’infection par M ycobacterium t u b erculosis ( Mtb ) .Des souris C57BL/6 femelles âgées de 6 semaines reçoivent par voie intranasale (i.n.) 10⁷bactéries (L. salivariusCNCM I 4968, ouL. animalisCNCM I ouL. rhamnosusCNCM I 4967 ou du PBS) dans 25µL de PBS 3 fois par semaine pendant 2 semaines. Selon les expériences elles sont ensuite sacrifiées (Figure 2.) ou infectées par 10³UFC de Mtb (autres figures). Pour les souris infectées, l’administration de lactobacilles est poursuivie jusqu’au sacrifice à raison de 2 fois par semaine (groupes traités avant et après infection, noté « av/ap »). Alternativement les lactobacilles peuvent n’être administrés qu’après infection (groupe CNCM I 5314 ap) et non avant. Après sacrifice, les poumons sont utilisés soit entiers pour une analyse en histologie de l’immunopathologie soit homogénéisés pour déterminer la charge bactérienne et caractériser la réponse immunitaire locale par cytométrie en flux.

Figure 2 : Modification du système immunitaire pulmonaire de souris non infectées par des bactéries isolées du microbiote pulmonaire.Des souris C57BL/6 reçoivent par voie intranasale 10⁷bactéries (L. salivariusCNCM I 4968 ouL. animalisCNCM I 5314 ouL. rhamnosusCNCM I 4967 ou PBS) dans 25 µL de PBS 3 fois par semaine pendant 2 semaines. Après sacrifice, une suspension cellulaire est obtenue par dissociation enzymatique et mécanique des poumons. Les proportions de sous-populations de lymphocytes T CD4+ sont déterminés par cytométrie en flux.A.Stratégie d’analyse: Après exclusion des doublets et des cellules mortes, les lymphocytes T CD4+ sont sélectionnés. La proportion de différentes sous-population est déterminée en sélectionnant les cellules exprimant un facteur intracellulaire spécifique d’intérêt (panel du bas) et pas son isotype contrôle (panel du haut).B.Proportion de lymphocytes T CD4+ exprimant le facteur Foxp3 (appelés Treg), produisant du TNF-α (cellules de type Th1) ou de l’IL-17 (Th17). Les graphiques représentent la médiane obtenue en groupant 3 expériences ayant chacune 4-7 souris. Statistique : test de Kruskal-Wallis : * p<0,05 ; ** p<0,01 ; *** p<0,001 ; **** p<0,0001

Figure 3 : Impact de l’administration de bactéries isolées du microbiote pulmonaire sur l’infection par Mtb .Des souris C57BL/6 reçoivent par voie intranasale 10⁷bactéries
(L. salivariusCNCM I 4968 ouL. animalisCNCM I 5314 ouL. rhamnosusCNCM I 4967 ou PBS) dans 25 µL de PBS 3 fois par semaine pendant 2 semaines. Elles sont ensuite infectées par 1000 bactéries de la souche H37Rv de Mtb par voie intranasale. Après infection les souris reçoivent les bactéries pulmonaires comme précédemment 2 fois par semaine pendant 30 jours. Après sacrifice les poumons sont dissociés pour estimer la charge bactérienne ou fixés pour évaluer les dommages tissulaires.A.Estimation de la charge bactérienne mesurée par étalement sur milieu gélosé d’un broyat de poumon. Chaque graphique représente une expérience indépendante comparant 2 groupes de souris traitées avec un groupe contrôle, n=3-7 souris par groupe.B. Dommages tissulaires estimés par observation de colorations Hematoxylin-Eosine (HE) réalisées sur des coupes histologiques de poumons fixés en formol 10% et inclus en paraffine. Images représentatives de 2 expériences indépendante n=3 souris par groupe.

Figure 4 : Caractérisation de l’impact de l’administration de L. animalis sur l’infection par Mtb .Des souris C57BL/6 reçoivent du PBS (barres blanches) ou 10⁷deL. animalispar voie intranasale avant et après infection (groupe CNCM I 5314 av/ap, barres grises) par 1000 UFC de la souche H37Rv de Mtb par voie intranasale, ou uniquement après infection (groupe CNCM I 5314 ap, barres hachurées).A.Estimation de la charge bactérienne 42 jours après infection, mesurée par étalement sur milieu gélosé d’un broyat de poumon. Le graphique montre une expérience représentative de 2 expériences indépendantes, n=6 souris par groupe.B.Dommages tissulaires estimés par observation (panel de gauche) et quantification des infiltrats leucocytaires (panel de droite) sur colorations Hematoxylin-Eosine réalisées sur des coupes histologiques de poumons fixés en formol 10 % et inclus en paraffine 42 jours après infection. Le pourcentage d’infiltration correspond au ratio de l’aire occupée par des infiltrats leucocytaires par rapport à l’aire totale des poumons. 2-5 expériences comprenant chacune 4-5 souris par groupe sont représentées.C .D.Caractérisation des lymphocytes T CD4⁺pulmonaires présents 42 jours après infection par cytométrie en flux. Les proportions de LT CD4+ exprimant différents facteurs de transcription(C.)(T-bet, caractéristique des Th1, RORγt pour les Th17 et Foxp3 pour les Treg) ou produisant des cytokines (D.)après stimulation avec phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) et Ionomicine en présence de Monensin et Brefeldin A (IFN-γ et TNF-α pour les Th1, IL-17 pour les Th17, IL-10 et TGF-β pour les Treg) sont représentées.E .F.G.Caractérisation des lymphocytes Treg exprimant Foxp3. L’origine des Tregs, naturels (nTreg, exprimant le facteur Helios, haut) ou induits (iTreg, qui ne l’expriment pas, bas)(E.), leur prolifération (caractérisée par l’expression de l’antigène Ki67)(F.)et production de cytokines(G.)est détectée par cytométrie en flux comme en C et D. Statistiques : graphiques correspondants à 1-4 expériences indépendantes poolées avec 4-7 souris par groupe pour les panels C et D. La médiane de chaque groupe est représentée et un test de Kruskal-Wallis compare les souris traitées aux souris contrôles : * p<0,05 ; ** p<0,01 ; **** p<0,0001.

EXEMPLES

Matériels et Méthodes

Souches bactériennes, milieux, conditions de croissance

Les souches bactériennes pulmonaires ont été isolées d’homogénats de poumons de souris avec un homogénéiseur (Ultraturax (IKA) ou Tissu Lyser (Qiagen)). Elles ont ensuite été cultivées sur milieu yhBHI, M17, MRS, ou Mannitol Sel Agar (BD biosciences) pendant 24 à 48h à 37°C sous conditions aérobie ou 5 jours à 37°C dans une chambre Freter sous conditions anaérobie. Les souches isolées ont été congelées à -80°C dans 16% de glycérol. L’identité de chaque souche a été confirmée par spectrophotométrie de masse et séquençage par PCR de l’ARN 16S. Les souches sélectionnées ont été déposées à la Collection Nationale des Cultures de Microorganismes (CNCM). Les trois souches utilisées ici sont unLactobacillus animalis(souche de l’invention) déposée sous la référence CNCM I 5314, unLactobacillus rhamnosus(CNCM I 4967) et unLactobacillus salivarius(CNCM I 4968). Ces bactéries sont cultivées en milieu liquide MRS 24h à 30°C (pré-culture) ou 3-4h à 37°C (pour les instillations) sans agitation.

Modèle murin d’infection par la tuberculose et traitement probiotique

Toutes les expériences réalisées sur des animaux ont été approuvées par le Ministère de l'enseignement supérieur et de la recherche après examen par le Comité d’Ethique Régional (Agréments APAFIS 5704). Les souris utilisées sont des femelles C57BL/6 âgées de 6 à 8 semaines provenant des élevages de Charles River Laboratories.

Pour chaque administrationin vivod’un des lactobacilles, une suspension bactérienne contenant 4.0 x 10⁸CFU/mL a été préparée en tampon phosphate salin (PBS) à partir de cultures fraiches en phase exponentielle. Les souris reçoivent 25 µL de PBS contenant 1.0 x 10⁷CFU ou 25 µL de PBS (groupe contrôle) par voie intranasale (i.n.) sous anesthésie gazeuse (isoflurane 4%, Virbac Danmark). Cette opération est répétée 3 fois par semaine pendant 2 semaines puis les souris sont soit sacrifiées (expériences sur les souris non infectées) soit infectées (procédures décrites ci-après), et reçoivent à nouveau l’administration des bactéries commensales 2 fois par semaine jusqu’au sacrifice. Dans certaines expériences, l’administration des lactobacilles est réalisée uniquement après infection et non pas avant et après infection (voir Figure 1).

Une culture fraîche de la souche H37Rv de Mtb (cultivée en milieu liquide 7H9 (Difco) supplémenté en glycérol 0,5%, ADC (Middlebrook) 10% et tyloxapol 0.05%) est utilisée pour infecter les souris. Chaque souris reçoit par voie i.n. 1.0 x 10³CFU de Mtb dans 25 µL de PBS sous anesthésie isoflurane. Les souris sont sacrifiées par dislocation cervicale (sous anesthésie isoflurane) après 42 jours d’infection.

Analyses histologiques

Les poumons entiers de souris dédiées aux analyses histologiques sont utilisés. Ils sont gonflés puis fixés pendant 5 jours à 4°C avec une solution contenant 10% de formol (Formalin solution, Sigma-Aldrich) et inclus en paraffine. Des colorations hématoxyline-éosine (HE) sont réalisées pour visualiser les infiltrats leucocytaires qui sont quantifiés, après numérisation, sur le logiciel CaseViewer (3DHISTECH).

Préparation des homogénats pulmonaires et détermination de la charge bactérienne

Les poumons entiers des souris ont été prélevés de manière stérile, homogénéisés avec un gentleMACS dissociator avant (tubes C, cycle m_lung_01, Miltenyi) et après (cycle m_lung_02) 30 min d’incubation à 37°C avec de la collagénase D (2 mg/mL, Roche) et de la DNAse I (0,1mg/mL, Roche). Une part de cet homogénat est diluée en série en PBS puis étalée sur milieu gélosé 7H10 (Difco) supplémenté en peptone et OADC (Middlebrook). Après 2-3 semaines, le dénombrement des colonies de Mtb obtenues permet d’estimer la charge bactérienne pulmonaire. Le reste des homogénats est passé au travers de filtre 70 µm pour détruire les agrégats, et centrifugé à 329 x g pendant 5 min. Les surnageants sont passés 2 fois au travers de filtres 0,2 µm et stockés à -80°C pour l’analyse des cytokines présentes dans les poumons. Les globules rouges présents dans le culot sont lysés pendant 5 min avec une solution contenant 150 mM NH₄Cl, 10 mM KHCO₃, 0.1 mM EDTA (pH 7.2), neutralisée par ajout de milieu RPMI contenant 10% du sérum de veau fœtal (SVF). La suspension cellulaire ainsi obtenue est filtrée au travers d’un filtre 40 µm (élimination des agrégats de globules rouges lysés) pour les analyses de cytométrie en flux.

Cytométrie en flux

L’analyse des différentes populations de lymphocytes T auxiliaires CD4⁺est réalisée grâce à la détection par cytométrie en flux de facteurs de transcription et de cytokines caractéristiques de ces sous population par marquages des cellules présentes dans la suspension cellulaire obtenue comme décrit dans la section précédente. Une partie de la suspension cellulaire est incubée dans du RPMI contenant 50 ng/mL de Phorbol Myristate Acetate (PMA, (Sigma Aldrich) et 500 ng/mL d’ionomycine (Sigma-Aldrich) pour induire la production de cytokines par les lymphocytes ainsi que de la Brefeldin A (Golgi plug 1/1000, BD Biosciences) et du Monensin (Golgi Stop 1/2000, BD Biosciences) pour ségréger ces cytokines dans l’appareil de Golgi pendant 4h à 37°C et 5% CO₂. Le reste de la suspension cellulaire, utilisée pour le marquage de facteurs de transcription, est conservée dans du Cell Staining Buffer (CSB, Biolegend) 4 h à 4°C. Le marquage extracellulaire de ces deux fractions est réalisé en CSB 30 min à 4°C dans le noir en utilisant un anticorps anti-Cluster Differentiation 16 /32 (CD16/CD32, Biolegend) pour limiter les marquages aspécifiques, un marqueur de viabilité (live/dead fixable blue dead cell stain kit, Invitrogen), un anti-CD45.2 BV711 (clone 104, BD Biosciences), un anti-CD3 FITC (17A2, Biolegend) ou anti-T cell Receptor beta (TCRb) Alexa 700 (H57-597, Biolegend) et un anti-CD4 BV786 (Sk3, BD Biosciences). Pour le marquage intracellulaire les cellules sont ensuite fixées 30 min à température ambiante (TA), perméabilisées 15 min à TA (Foxp3 / transcription factor staining buffer set, eBioscience) et incubées 45 min à TA avec un panel d’anticorps comprenant un anti-RORgt PE-CF594 (Q31-378, BD Biosciences), un anti-T-bet PE-Cy7 (eBio4BIO, eBiosciences), un anti-Foxp3 APC (FJK-16s, eBioscience), un anti-Helios APC-eFluor 780 (22F6, eBiosciences), un anti-Ki67 Alexa 700 (SolA15, eBioscience) ou un anti-interleukin 10 (IL-10) FITC (JES5-16E3, BD Biosciences), un anti-IL-17 PE (TC11-18H10, BD Biosciences), un anti-IFNγ PE-Dazzle (XMG1.2, Biolegend), un anti-TNFα PE Cy7 (MP6-XT22, BD Biosciences), l’anti-Foxp3 APC et un anti-TGF-β BV421 (TW7-16B4, BD Biosciences). Pour les expériences réalisées sur des souris infectées par Mtb, les cellules sont fixées 2h en paraformaldéhyde (PFA) 4% à TA. Les données sont acquises avec un FACS LSRII ou Fortessa (BD Biosciences) et analysées sur le logiciel FlowJo V10. Les doublets (FSH-H vs. FSC-W et SSC-H vs. SSC-W) et les cellules mortes (live/dead positives) sont exclues au début de chaque analyse.

Analyse statistique

L’analyse statistique des résultats a été réalisée avec le logiciel GraphPad Prism 7. Sur les graphiques, chaque point représente une souris différente. La médiane de chaque groupe est représentée par les barres. Un test de Mann-Whitney (comparaison de 2 groupes) ou de Kruskall-Wallis (comparaison de 3 groupes) a été utilisé pour comparer les valeurs. La significativité est représentée par : * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001; and **** p<0.0001.

Résultats

L’identification de bactéries du microbiote pulmonaire capables de modifier la réponse immunitaire au cours de l’infection par Mtb s’appuie sur une banque de bactéries primo-colonisatrices du poumon de souriceaux isolées et identifiées par l’équipe du Dr Langella (Probihôte – MICALIS – INRA), et notamment par Aude Remot et Muriel Thomas. L’une de ces bactéries, une souche d’Enterococcus sp. déposée à la CNCM sous le numéro I-4969 est capable de moduler la susceptibilité des souris à l’asthme allergique (voir WO 2017/12987 et [8]). Parmi ces bactéries, 3 sont des lactobacilles (L. salivarius,L. animalisetL. rhamnosus) qui possèdent un statut d’organismes GRAS (Generally Recognised As Safe) et ont été déposés à la CNCM sous les numéros : CNCM I 4968, CNCM I 5314 et CNCM I 4967, respectivement.

Pour déterminer le potentiel probiotique de ces 3 lactobacilles pour la prévention et le traitement de la tuberculose, différents protocoles résumés en Figure 1 ont été employés dans un modèle murin. L’administration de 10⁷bactéries est réalisée par voie intranasale pendant deux semaines avant sacrifice des souris (Figure 2) ou infection parMycobacterium tuberculosis(Mtb) (autres figures). Dans ces expériences les bactéries sont administrées avant et après infection (groupes av/ap) ou seulement après infection (groupe ap, Figure 4).

Dans un premier temps, la capacité des bactéries à modifier le système immunitaire local de souris non-infectées a été évaluée par l’analyse en cytométrie en flux de l’expression de marqueurs intracellulaires caractéristiques de différentes sous-populations de lymphocytes T auxiliaires CD4⁺(stratégie d’analyse en Figure 2A), orchestrateurs clés de la réponse immunitaire anti-Mtb: les lymphocytes Th1 (produisant du TNF-α), Th17 (produisant l’IL-17A) et T régulateurs (Treg exprimant Foxp3) [16, 17, 18]. Nos résultats montrent que les trois lactobacilles isolés du microbiote pulmonaire ont des capacités immunomodulatrices fortes, avec un profil anti-inflammatoire (même en dehors d’un contexte infectieux). La souche CNCM I 5314 deL. animalisest celle qui induit la plus forte diminution des Th1, augmentation des Th17 et des Treg pulmonaires (Figure 2B), alors que ces trois espèces appartiennent au même genre bactérien.

Pour déterminer si ces bactéries (et notamment la souche deL. animalis) induisent une réponse anti-inflammatoire suffisante pour diminuer l’immunopathologie associée à la tuberculose, les bactéries ont été administrées comme précédemment par voie intranasale, 15 jours avant infection par Mtb puis tout au long de l’infection (Figure 1). Dans ce modèle, les trois bactéries ne modifient pas la charge bactérienne de Mtb (Figure 3A). En revanche,L. animalisCNCM I 5314 semble conférer une protection importante contre l’infiltration leucocytaire des poumons (moins de surface pulmonaire occupée par des cellules immunitaires) menant à l’immuno-pathologie à des stades tardifs de l’infection (et pas les deux autres bactéries) (Figure 3B).

Pour mieux caractériser l’effet protecteur de la souche CNCM I 5314, la même expérience a été répétée (groupe CNCM I 5314 av/ap) en incluant des analyses permettant de déterminer la composition de l’infiltrat immunitaire des poumons. De plus, la capacité de cette bactérie à exercer son effet protecteur dans une stratégie de traitement (par opposition à l’approche prophylactique décrite précédemment) a été évaluée en ajoutant un groupe pour lequel l’administration de la bactérie ne commence qu’après l’infection (groupe CNCMI 5314 ap) (détail des différents groupes dans la Figure 1). Ces expériences confirment que l’effet anti-inflammatoire induit par cette bactérie ne permet pas à Mtb de se multiplier de manière incontrôlée (Figure 4A) alors qu’il accorde une protection significative (pour le groupe ayant reçu la bactérie en pré-traitement, CNCM I 5314 av/ap) contre l’immuno-pathologie induite par l’infection avec une réduction des infiltrats leucocytaires (Figure 4B). Bien que l’infiltration pulmonaire de lymphocytes Th1 pro-inflammatoires (exprimant T-bet et produisant du TNF-α ou de l’IFN-γ) varie peu entre les groupes, la souche CNCM I 5314 induit une augmentation à la fois des lymphocytes Th17 (exprimant RORγt et produisant de l’IL-17A) et des Treg (exprimant Foxp3, produisant de l’IL-10 et du TGF-β) 42 jours après infection (Figure 4C). Cependant une analyse plus poussée révèle que l’augmentation des Treg observée avec l’administration deL. animalis(que ce soit avec une approche prophylactique ou de traitement) n’est pas liée à une augmentation de Treg conventionnels (Foxp3 ⁺ RORγt ^- ), mais à celle d’une population récemment décrite, double positive Foxp3 ⁺ RORγt ⁺ appelée bi-Treg. Ces cellules possèdent à la fois des fonctions pro-inflammatoires et anti-inflammatoires et produisent de l’IL-17 mais aussi de l’IL-10, du TGF-β et de l’IL-35 (non analysée ici) qui en font des régulateurs clés de l’inflammation [17, 18]. Elles pourraient donc être responsables de la diminution des infiltrats leucocytaires (observés en 4B) et donc de l’effet prometteur de cette bactérie pour la prévention et le traitement de la tuberculose. La proportion de Th17 (Foxp3 ^- RORγt ⁺ ) semble également augmentée. Dans le cas d’un environnement riche en IL-10 et TGF-β (comme c’est le cas ici), l’activité des Th17/IL-17 est biaisée et ces cellules exercent des fonctions anti-inflammatoires et protectives vis-à-vis des dommages tissulaires, principalement via la production d’IL-22 (production non mesurée dans nos expériences), suggérant un rôle bénéfique de ces cellules dans notre contexte [16, 17]. Les Treg augmentés parL. animalis, et en particulier les biTreg n’expriment pas le facteur de transcription Helios, indiquant qu’ils sont induits au niveau des muqueuses (iTreg) par opposition aux Treg d'origine naturelle (nTreg) c’est-à-dire générés dans le thymus, suggérant que cet effet est spécifique et lié à la tolérance périphérique (Figure 4E). L’augmentation de ces cellules ne semble pas liée à une plus forte prolifération puisque l’expression de l’antigène Ki67 est diminuée (Figure 4F). Elles semblent pouvoir avoir les effets pro- et anti-inflammatoires décrits dans la littérature puisque les Tregs observés produisent de l’IL-17, de l’IL-10 mais surtout du TGF-β (dont la production est également plus forte dans les deux groupes de souris ayant reçus l’administration deL. animalis) (Figure 4G).

Nous montrons ici pour la première fois qu’une souche bactérienne du microbiote pulmonaire (L. animalisCNCM I 5314) est capable de modifier la réponse immunitaire à Mtb notamment par une induction de biTreg qui pourraient mieux contrôler la balance immunitaire (pro-/anti- inflammatoire) et ainsi réduire l’immunopathologie induite par l’infection. Ces résultats présentent ainsi la soucheL. animalis(CNCM I-5314) isolée du microbiote pulmonaire comme un probiotique prometteur pour la tuberculose. Les résultats préliminaires obtenus avec le groupe « CNCM I 5314 ap » suggèrent également des applications pour le traitement de cette maladie. D’autres maladies respiratoires étant liées à une inflammation, nous supposons que son rôle bénéfique ne se limiterait pas à la tuberculose.

1 :Belkaid Y, Hand TW. Role of the microbiota in immunity and inflammation. Cell. 2014; 157; 121-41.

2 :Atarashi K et al. Induction of colonic regulatory T cells by indigenous Clostridium species. Science (2011) 331(6015):337-41

3 :Patel R, DuPont HL. New approaches for bacteriotherapy: prebiotics, new-generation probiotics, and synbiotics. Clin Infect Dis. 2015; 60; S108-21.

4 :Vieira AT, et al. Control of Klebsiella pneumoniae pulmonary infection and immunomodulation by oral treatment with the commensal probiotic Bifidobacterium

5:Sibley CD, Grinwis ME, Field TR, Eshaghurshan CS, Faria MM, et al. (2011) Culture Enriched Molecular Profiling of the Cystic Fibrosis Airway Microbiome. PLoSONE 6: e22702.

6:Gollwitzer E, Saglani S, Trompette A, Yadava K, Sherburn R, et al. (2014) Lung microbiota promotes tolerance to allergens in neonates via PD-L1. Nature medicine 20: 642-647.

7:Erb-Downward JR, Thompson DL, Han MK, Freeman CM, McCloskey L, et al. (2011) Analysis of the Lung Microbiome in the ‘‘Healthy’’ Smoker and in COPD. PloSONE 6.

8 :Remot A, et al. Bacteria isolated from lung modulate asthma susceptibility in mice. ISME J. 2017; 11; 1061-1074.

9 :Kanmani P, et al. Respiratory Commensal Bacteria Corynebacterium pseudodiphtheriticum Improves Resistance of Infant Mice to Respiratory Syncytial Virus and Streptococcus pneumoniae Superinfection. Front Microbiol. 2017; 8; 1613.

10 :Dumas A, et al. The role of the lung microbiota and the gut–lung axis in respiratory infectious diseases. Cell Microbiol. 2018; e12966.

11 :Mathieu E, et al. Paradigms of lung microbiota functions in health and disease, particularly, in asthma. Frontiers in Physiology 2018; 9; 1168.

12: OMS 2016

13 :Pai M, Behr MA, et al. Tuberculosis. Nat Rev Dis Primers. 2016; 2; 16076.

14 :Nunes-Alves C, Booty MG, Carpenter SM, Jayaraman P, Rothchild AC, Behar SM. In search of a new paradigm for protective immunity to TB. Nat Rev Microbiol. 2014; 12 ; 289-99.

15 :Malherbe ST, et al. Persisting positron emission tomography lesion activity and Mycobacterium tuberculosis mRNA after tuberculosis cure. Nat Med. 2016; 22; 1094-1100.

16 :Sehrawat S, et al. Interplay of Regulatory T Cell and Th17 Cells during Infectious Diseases in Humans and Animals. Front Immunol. 2017; doi: 10.3389/fimmu.2017.00341

17 :Kluger MA, et al. RORγt(+)Foxp3(+) Cells are an Independent Bifunctional Regulatory T Cell Lineage and Mediate Crescentic GN. J Am Soc Nephrol. 2016; doi: 10.1681/ASN.2014090880. Epub 2015 Jun 8.

18:Krebs CF, Steinmetz OM. CD4⁺T Cell Fate in Glomerulonephritis: A Tale of Th1, Th17, and Novel Treg Subtypes. Mediators Inflamm. 2016; 2016:5393894. Epub 2016 Nov 15.

Claims (12)

1. Bactérie L. animalis pour son utilisation dans le traitement et/ou la prévention de l’inflammation liée à une maladie respiratoire.
2. BactérieL. animalispour son utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite bactérie est inactivée.
3. BactérieL. animalispour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que ledit traitement et/ou prévention comprend une diminution de l’infiltration leucocytaire et une augmentation des populations pulmonaires de lymphocytes Th17 et de lymphocytes Tregs.
4. BactérieL. animalispour son utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que les lymphocytes Tregs sont des lymphocytes iTregs.
5. BactérieL. animalispour son utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que les lymphocytes iTregs sont des lymphocytes biTregs.
6. BactérieL. animalispour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que la maladie respiratoire est la tuberculose.
7. BactérieL. animalispour son utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que ladite bactérie est la souche deL. animalisdéposée à la Collection nationale des cultures de microorganismes (CNCM, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France) sous le numéro I-5314.
8. Souche deL. animalisdéposée à la Collection nationale des cultures de microorganismes (CNCM, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France) sous le numéro I-5314.
9. Composition pharmaceutique comprenant la souche de la revendication 8 et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.
10. La composition de la revendication 9 caractérisée en ce que la souche est inactivée.
11. La composition de la revendication 10 caractérisée en ce que la souche est inactivée par la chaleur.
12. La composition de la revendication 10 caractérisée en ce que la souche est présente sous forme d’extraits.