FR3075821A1 - Procede de transformation transitoire de graines germees - Google Patents
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Abstract
La présente invention a pour premier objet un procédé pour transformer de façon transitoire des graines germées de Lactuca sativa. Ledit procédé de transformation transitoire de graines germées de Lactuca sativa comprend la mise en condition de germination, à l'obscurité, de graines de Lactuca sativa, pour générer des graines germées, suivie de la mise en contact desdites graines germées avec une suspension d'Agrobacterium tumefaciens transformée par une ou plusieurs séquence(s) d'acide nucléique comprenant un gène d'intérêt, puis l'application au mélange comprenant les graines germées et la suspension d'Agrobacterium tumefaciens d'un traitement mécanique comprenant : optionnellement au moins une étape de sonication et au moins une étape de d'incubation sous vide, et de préférence suivie par une, deux ou trois étapes de mise sous vide, suivies de la mise en condition de culture des graines germées obtenues lors de ladite étape d'application d'un traitement mécanique. L'invention a pour second objet un procédé de production d'une protéine recombinante comprenant un procédé de transformation transitoire de graines germées, selon le premier objet de l'invention.
Description
PROCEDE DE TRANSFORMATION TRANSITOIRE DE GRAINES GERMEES
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne un procédé pour transformer de façon transitoire des graines germées de Lactuca sativa. L'invention a également pour objet un procédé de production de protéines recombinantes mettant en œuvre des graines germées transformées par un procédé de transformation transitoire selon l'invention.
ART ANTERIEUR
Des protéines et des peptides présentant un intérêt, notamment thérapeutique, ont été produits dans une grande variété d'hôtes. Ainsi, des systèmes d'expression hétérologue procaryotes, tels que Escherichia coliou Bacillus subtilis, ou eucaryotes, tels que les levures, les champignons, les cellules d'insectes, les cellules animales et les animaux transgéniques, ont été développés. Les cultures de cellules eucaryotes présentent un grand intérêt pour la production de protéines complexes, mais elles sont souvent associées à une longue durée de développement, un faible rendement, des modifications inappropriées des protéines produites, un risque de transmission de pathogènes et un coût de production élevé. Aussi, les plantes ont été considérées avec intérêt en tant qu'hôtes pour la production de protéines à grande échelle.
Par rapport aux méthodes de transformation végétale dite « stables » un procédé de transformation transitoire présente l'avantage de permettre la production de protéines recombinantes dans un délai très court, notamment entre 2 et 21 jours après ladite transformation transitoire, alors que la transformation végétale dite « stable » requiert des délais de plusieurs mois à années après ladite transformation. Cette rapidité de production permet une très grande flexibilité, indispensable notamment pour répondre à des problématiques aigües de production de protéines recombinantes, lors de pandémies ou d'attaques terroristes par exemple.
Plusieurs procédés de transformation transitoire d'un tissu végétal sont connus dans l'état de l'art.
Chen et al. (Biotechnology for Biofuels, 2010, 3:9 "A high-throughput transient gene expression System for switchgrass (Panicum virgatum L.) seedlings ») décrit la transformation transitoire de plantules de Panicum virgatum L par des procédés mettant en œuvre Agrobacterium tumefaciens et le gène rapporteur Gus+, un variant du gène codant la β-glucuronidase (GUS). La plantule est mise en contact avec les agrobactéries, puis soumise à un traitement mécanique comprenant l'application d'une pression de 610 mm Hg, soit 813,27 hPa. Le nombre de plantules positives pour GUS est évalué. J.F. Li et al. (Plant Methods 5 (1):6, 2009, « The FAST Technique: A Simplified Agrobacterium-Based Transformation Method for Transient Gene Expression Analysis in Seedlings of Arabidopsis and Other Plant Species ») décrit une méthode de transformation transitoire (Fast Agro-Mediated Seedling Transformation, ou FAST) de plantules de Arabidopsis thaiiana, de tabac, de riz ou de tomate, mettant en œuvre Agrobacterium tumefaciens et un tensioactif. J. Li et ai. (Scientia Horticulturae 112 (3):258-65. 2007, « Transient expression of an active human interferon-beta in lettuce ») a pour objet un procédé de transformation transitoire comprenant une étape d'infiltration sous vide à une pression de 0,1 à 1 hPa de feuilles de laitue par Agrobacterium tumefaciens. Les feuilles de laitues sont collectées après deux semaines de germination des graines pour l'infiltration et la production d'interféron-beta humain biologiquement actif est observée.
Joh et ai. (Biotechnology and Bioengineering, vol. 91, N°7, sept. 2005 « High-level transient expression of recombinant protein in lettuce ») décrit la détermination des conditions optimales de transformation transitoire de la laitue par différents procédés mettant en œuvre l'infiltration sous vide avec
Agrobacterium tumefaciens portant le gène rapporteur GUS. L'effet de différents paramètres, notamment la lumière et la présence d'une étape d'infiltration sous vide à une pression de 250 hPa pendant 20 minutes, est étudié.
Negrouk étal. {Plant Science 169 (2):433-38., 2005, « Highly efficient transient expression of functional recombinant antibodies in lettuce ») traite de la production d'anticorps monoclonaux recombinants dans la laitue. Une laitue entière est incubée sous vide à une pression de 982 hPa pendant 20 min, en présence û’Agrobacterium tumefaciens portant un gène codant pour la protéine d'intérêt, sous contrôle d'un promoteur inductible.
Sohi étal. {Iranien Journal of Biotechnology 3 (2), 2005, « Transient expression of human growth hormone in potato (Solanum tuberosum ), tobacco (Nicotiana tobacum) and lettuce (Lactuca sativa) leaves by agroinfiltration ») décrit l'expression transitoire de l'hormone de croissance humaine (hGH) dans les feuilles de pomme de terre, de tabac et de laitue, par incubation sous vide à une pression de 0,5 à 1 hPa pendant 15, 25 ou 35 min, par Agrobacterium tumefaciens. Une protéine hGH fonctionnelle est détectée dans les extraits de feuille par Western Blot et ELISA. EP 2 853 599 a pour objet un procédé de production de protéines d'intérêt pharmaceutique dans les plantes permettant de diminuer la dégradation intracellulaire des protéines lors de la récolte. Agrobacterium tumefaciens est utilisé pour la transformation. Le procédé comprend un traitement mécanique des graines, par frottement abrasif de leur surface, avant leur transformation avec Agrobacterium tumefaciens.
Les inventeurs ont maintenant mis au point un nouveau procédé de transformation transitoire de graines germées de Lactuca sativa. Ce procédé simple à mettre en œuvre et peu coûteux permet de produire en grande quantité et d'extraire du tissu végétal des protéines recombinantes dont l'activité fonctionnelle a été mise en évidence.
Un procédé selon l'invention comprend la mise en oeuvre d'au moins une, et de préférence deux ou trois étapes successives de traitement mécanique des graines germées de Lactuca sativa. Dans un procédé selon l'invention, le tissu qui est mis en contact avec les agrobactéries est la graine germée, et non, comme dans certains procédés de l'état de l'art, la plantule, les feuilles ou les racines. De plus, lesdites graines germées sont transformées à un stade précoce de leur développement, permettant ainsi de fournir un procédé dont la mise en œuvre est rapide. L'utilisation de graines germées, et non de plantes entières, en tant que matériau initial pour la production de protéines, confère une importante flexibilité au système puisque le matériel végétal est utilisable après un délai de quelques jours de germination. Au contraire, l'utilisation de plantes entières, telles que notamment Nicotiana benthamiana, l'espèce la plus utilisée pour la production de protéines recombinantes par transformation transitoire dans un système végétal, demande un délai de 5 à 6 semaines. De plus, les graines germées constituent une matière première peu onéreuse et ne nécessitant aucun apport particulier lors de la culture initiale, hormis de l'eau, puisqu'elles contiennent les ressources nécessaires à leur propre croissance. Les graines occupent également peu d'espace et peuvent par conséquent être utilisées à grande échelle en quantité importante.
Par rapport aux procédés de transformation transitoire connus dans l'état de l'art, un procédé selon l'invention permet un rendement de production de protéines recombinantes beaucoup plus élevé.
Un procédé selon l'invention permet donc de mettre en œuvre un système de production de protéines recombinantes très sûr d'un point de vue sanitaire, rapide, flexible, hautement contrôlable, permettant la production de protéines complexes, facilitant grandement la récolte de protéines, facilement adaptable à l'échelle industrielle et peu coûteux en terme de matières premières.
Selon un premier aspect, l'invention concerne un procédé de transformation transitoire de graines germées de Lactuca sativa, comprenant : a) la mise en condition de germination, à l'obscurité, de graines de Lactuca sativa, pendant une durée comprise entre 3 et 11 jours, pour générer des graines germées, b) la mise en contact desdites graines germées obtenues lors de l'étape a) avec une suspension comprenant la souche bactérienne Agrobacterium tumefaciens transformée par au moins une séquence d'acide nucléique comprenant un gène d'intérêt, pour obtenir un mélange, c) l'application au mélange obtenu lors de l'étape b) d'un traitement mécanique comprenant optionnellement au moins une étape de sonication et au moins une étape d'incubation sous vide, d) la mise en condition de culture des graines germées obtenues lors de l'étape c). L'invention concerne aussi un procédé de production d'une protéine recombinante comprenant les étapes a) à d) d'un procédé selon le premier objet de l'invention, soit : a) la mise en condition de germination, à l'obscurité, de graines de Lactuca sativa, pour générer des graines germées, b) la mise en contact des graines germées obtenues lors de l'étape a) avec une suspension comprenant la souche bactérienne Agrobacterium tumefaciens transformée par au moins une séquence en acide nucléique comprenant un gène d'intérêt codant une protéine recombinante, pour obtenir un mélange, c) l'application au mélange obtenu lors de l'étape b) d'un traitement mécanique comprenant optionnellement au moins une étape de sonication et au moins une étape d'incubation sous vide, d) la mise en condition de culture des graines germées obtenues lors de l'étape c), comprenant en outre une étape e) de récolte des tissus végétaux produits lors de l'étape d), suivie d'une étape f) d'extraction de ladite protéine recombinante à partir des tissus végétaux récoltés lors de l'étape e). D'autres caractéristiques et modes d'application des procédés selon l'invention sont présentés dans la description détaillée ci-dessous.
Dans la suite du texte, l'expression « compris entre ... et ... » signifie que les bornes sont incluses.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
La présente invention a pour premier objet un procédé de transformation transitoire de graines germées de Lactuca sativa comprenant les étapes suivantes : a) la mise en condition de germination, à l'obscurité, de graines de Lactuca sativa, pendant une durée comprise entre 3 et 11 jours, et de préférence entre 4 et 8 jours, pour générer des graines germées, b) la mise en contact des graines germées obtenues lors de l'étape a) avec une suspension comprenant la souche bactérienne Agrobacterium tumefaciens transformée par au moins une séquence en acide nucléique comprenant un gène d'intérêt, pour obtenir un mélange, c) l'application au mélange obtenu lors de l'étape b) d'un traitement mécanique comprenant : • optionnellement au moins une étape de sonication et • au moins une étape d'incubation sous vide, d) la mise en condition de culture des graines germées obtenues lors de l'étape c).
Au sens de la présente invention, on entend par « transformation » l'introduction d'acide nucléique dans une cellule, en particulier l'introduction d'acide nucléique hétérologue dans ladite cellule ; par « transformation transitoire » on entend une transformation dans laquelle ledit acide nucléique ne s'intégre pas dans le génome de l'hôte.
Par «graines germées» on entend des graines dont l'activité métabolique et le développement sont activés, lorsqu'elles sont mises dans des conditions appropriées de germination. Par « conditions appropriées de germination », on entend l'application de conditions de température, de lumière, de support et de milieu réactionnel adaptées, pendant une durée adaptée. Les conditions de germination appropriées sont connues de l'homme du métier. Typiquement les graines sont placées dans des boites en verre ou des boîtes de Pétri, et posées sur un support comprenant de l'eau stérile ou un milieu adapté, à une température comprise entre 10 et 22°C. Dans un procédé selon l'invention, les graines de laitue sont de préférence déposées dans des boîtes de Pétri sur du papier filtre stérile humidifié à l'eau distillée stérile, et à l'obscurité à une température comprise entre 10°C et 22°C.
Selon un aspect particulier d'un procédé selon l'invention, les graines sont mises en conditions de germination pendant une durée comprise entre 3 et 11 jours, de préférence pendant une durée de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11 jours, plus préférentiellement pendant une durée comprise entre 4 et 8 jours, et encore plus préférentiellement pendant une durée de 4 jours. La durée de la germination est adaptée aux conditions de température appliquées à cette étape. Cette étape génère des graines germées présentant au maximum un stade « deux cotylédons», lesdites graines germées présentent donc au plus deux cotylédons, ou feuilles cotylédonaires, qui sont les feuilles primordiales constitutives de la graine. Selon un aspect plus particulier, un procédé selon l'invention comprend donc la mise en conditions de germination, à l'obscurité, de graines de Lactuca sativa pendant une durée comprise entre 3 et 11 jours, de préférence pendant une durée de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11 jours, pour générer des graines germées présentant au maximum un stade deux cotylédons.
La surface des graines est optionnellement stérilisée par tout moyen connu de l'homme du métier, préalablement à leur mise en conditions de germination, afin d'éviter la présence de tout germe pathogène. Selon un aspect particulier, un procédé selon l'invention comprend une étape préalable de stérilisation de la surface des graines par un procédé choisi parmi les procédés bien connus de l'homme du métier, comme par exemple l'immersion des graines dans de l'eau de Javel diluée à 2,6% de chlore actif pendant 20 min, suivie de cinq rinçages à l'eau distillée stérile.
Selon un aspect particulier, dans un procédé selon l'invention ladite graine de Lactuca sativa est choisie parmi les graines des variétés suivantes ; • Lactuca sativa var. longifolia, • Lactuca sativa var. capitata et • Lactuca sativa var. crispa.
Plus particulièrement, dans un procédé selon l'invention, ladite graine de Lactuca sativa est choisie parmi les cultivars suivants ; • Lactuca sativa var. longifolia « Ballon », • Lactuca sativa var. capitata « Pierre Bénite », Lactuca sativa var. capitata « Blonde de Paris », Lactuca sativa var. capitata « Florine », Lactuca sativa var. capitata « Kamikaze », Lactuca sativa var. capitata « Grosse blonde paresseuse », Lactuca sativa var. capitata « Grosse blonde d'hiver », Lactuca sativa var. capitata « Appia», et • Lactuca sativa var. crispa « Sanguine »
Dans un procédé selon l'invention, toute souche bactérienne Agrobacterium tumefaciens choisie parmi les différentes souches connues adaptées pour une transformation par un gène d'intérêt. Pour la mise en œuvre d'un procédé selon l'invention, la souche d'Agrobacterium tumefaciens est choisie de préférence parmi les souches désignées par : EHA105, AGL1, C58C1, LBA4404, GV3101, et est plus préférentiellement la souche EHA105 (Diamos et ai. Frontiers in Plant Science, 2016, 7:200 «5' and 3' Untranslated Régions Strongly Enhance Performance of Geminiviral Replicons in Nicotiana benthamiana Leaves»).
Dans un procédé selon l'invention, la souche d'Agrobacterium tumefaciens est transformée par au moins une séquence auto-réplicative d'acide nucléique comprenant au moins un gène d'intérêt. Cette séquence auto-réplicative comprend tous les éléments nécessaires à sa réplication et sa transcription et à la production de toute protéine codée par ledit gène d'intérêt. Parmi les séquences adaptées à cet effet, l'homme du métier peut aisément choisir un plasmide connu à cet effet. Un tel plasmide comprend notamment au moins un gène de résistance à un antibiotique et est cultivé en présence dudit antibiotique. De préférence, mais non obligatoirement, ledit plasmide est un plasmide dit « binaire », capable de se répliquer dans Agrobacterium, plus préférentiellement ledit plasmide est choisi parmi: pBin, pCAMBIA (Leclercq et al. Plasmid, 2015, 81:50-4 «Development of a new pCAMBIA binary vector using Gateway® technology»), pEAQ-HT, pMW, pGWB, pMDC et pBY.
Par « gène d'intérêt », on entend une séquence d'acide nucléique codant une protéine particulière présentant un intérêt en tant que telle, et notamment un intérêt thérapeutique. De préférence, ladite protéine présentant un intérêt est choisie parmi les protéines capables d'exercer une fonction utile dans le diagnostic, la prévention ou le traitement d'une maladie.
Dans un procédé de transformation transitoire selon l'invention, les agrobactéries sont suspendues dans un tampon d'incubation approprié, et optionnellement mises en présence d'un activateur de virulence choisi parmi les activateurs de virulence connus par un homme du métier, et notamment l'acétosyringone, pour obtenir une suspension. La concentration des bactéries, la durée d'incubation, le tampon d'incubation et la concentration en activateur de virulence sont aisément choisis par un homme du métier. De préférence, dans un procédé selon l'invention, la concentration des bactéries est ajustée de façon à ce que la densité optique de la suspension bactérienne, mesurée à 600 nm, est comprise entre 0,02 et 3, et est de préférence de 0,5. De préférence, dans un procédé selon l'invention, la durée d'incubation est comprise entre 30 minutes et 6 heures, et plus particulièrement entre 3 et 5 heures. De préférence, dans un procédé selon l'invention, la concentration d'acétosyringone dans le tampon d'incubation est comprise entre 0 et 400 μΜ, et plus particulièrement est de 100 μΜ.
Dans un procédé selon l'invention, l'étape b) de mise en contact des graines et de la suspension bactérienne est réalisée par l'immersion des graines germées dans la suspension bactérienne, à une concentration comprise entre 10 et 200 graines germées par ml_ de suspension bactérienne.
On entend par « sonication » l'exposition à un traitement par ultrasons, définis comme une vibration de même nature que le son et dont la fréquence est comprise entre 10 kHz à plusieurs centaines de mégahertz. Il est connu que l'exposition des graines à un traitement par ultrasons peut notamment générer des micro-perforations au sein de la paroi des cellules végétales, facilitant ainsi l'entrée des acides nucléiques dans lesdites cellules.
Selon un aspect particulier, un procédé selon l'invention comprend la mise en oeuvre d'un traitement mécanique comprenant une étape de sonication, ladite sonication est notamment mise en œuvre en plaçant le mélange contenant les graines germées et la suspension û'Agrobacterium tumefaciens dans un bain à ultrasons ou en plongeant dans ledit mélange une sonde à ultrasons.
Selon un aspect particulier, lors de l'étape c) d'un procédé selon l'invention le mélange est soumis à l'action d'ultrasons dont la fréquence est supérieure à 10 kHz, de préférence comprise entre 20 et 80 kHz, de préférence comprise entre 20 et 60 kHz, de préférence comprise entre 50 et 60 kHz. Selon cet aspect d'un procédé selon l'invention, l'application au mélange obtenu lors de l'étape b) d'un traitement mécanique comprend une étape de sonication et au moins une étape d'incubation sous vide.
Selon un aspect plus particulier, dans un procédé selon l'invention le mélange est soumis à l'action d'ultrasons pendant une durée comprise entre 10 et 300 secondes, de préférence comprise entre 30 et 60 secondes et plus préférentiellement pendant 30 secondes.
Selon un aspect encore plus particulier, dans un procédé selon l'invention le mélange est soumis à l'action d'ultrasons d'une fréquence de 50 kHz pendant une durée de 30 secondes.
Au sens de la présente invention, on entend par « incubation sous vide » l'application pendant une durée comprise entre 5 et 30 minutes, de préférence pendant une durée comprise entre 10 et 20 minutes et plus préférentiellement pendant 10, 15 ou 20 minutes, de conditions stables de pression dans lesquelles la pression est comprise entre 10 et 750 hPa.
Lors de l'incubation sous vide dans un procédé selon l'invention, la pression comprise entre 10 et 750 hPa, de préférence entre 10 et 500 hPa, de préférence entre 15 et 100 hPa, et plus préférentiellement entre 15 et 20 hPa, est appliquée pendant une durée comprise entre 5 et 30 minutes, de préférence pendant une entre 10 et 20 minutes et plus préférentiellement pendant 10, 15 ou 20 minutes. Pour appliquer une pression sous vide au mélange, tous les moyens accessibles à un homme du métier sont utilisables, comme notamment le fait de placer ledit mélange dans une cloche à vide.
Dans un procédé selon l'invention, l'étape d'incubation sous vide est suivie d'une remise sous pression atmosphérique, pendant laquelle la pression appliquée au mélange varie entre la valeur de pression « sous vide » qui a été appliquée, qui est comprise entre 10 et 750 hPa, et la pression atmosphérique. On entend par « pression atmosphérique » ou « Patm », ou PO, l'application d'une pression égale à 1000 hPa +/- 5%. L'étape d'incubation sous vide est destinée à faciliter l'entrée des agrobactéries dans les tissus par infiltration lors de la remise sous pression atmosphérique. Le maintien du vide est destiné à permettre l'évacuation de l'air contenu dans les tissus végétaux.
Plus particulièrement, un procédé selon l'invention comprend l'application à un mélange de graines germées et d'une suspension d'Agrobacterium tumefaciens d'un traitement mécanique comprenant, ou consistant en, une incubation sous vide réalisée par l'application d'une pression comprise entre 10 et 750 hPa, de préférence entre 15 et 100 hPa, plus préférentiellement entre 15 et 20 hPa, pendant une durée comprise entre 5 et 30 minutes, de préférence entre 10 et 20 minutes, ladite incubation sous vide étant suivie par l'incubation du mélange à pression atmosphérique pendant une durée comprise entre 10 et 30 minutes.
Plus particulièrement, un procédé selon l'invention comprend l'application à un mélange de graines germées et d'une suspension d'Agrobacterium tumefaciens d'un traitement mécanique comprenant, ou consistant en, successivement : i) une étape de sonication entre 20 et 60 kHz, et de préférence à 50 kHz, ii) une étape pendant laquelle la pression varie de la pression atmosphérique PO à une pression PI comprise entre 10 et 750 hPa, de préférence entre 15 et 100 hPa, plus préférentiellement entre 15 et 20 hPa, iii) une étape d'incubation sous vide à la pression PI pendant une durée de 5 à 30 minutes, de préférence pendant une durée comprise entre 10 et 20 minutes et plus préférentiellement pendant 10, 15 ou 20 minutes, iv) une étape pendant laquelle la pression varie de la pression PI à la pression atmosphérique PO.
De préférence, dans un procédé selon l'invention, l'incubation sous vide est suivie par une incubation à pression atmosphérique PO pendant une durée comprise entre 10 et 30 minutes.
Selon un aspect particulier, dans un procédé selon l'invention l'incubation sous vide de 5 à 30 minutes, et de préférence de 10 à 20 minutes, à une pression PI comprise entre 10 et 750 hPa est suivie d'au moins une étape de mise sous vide pendant laquelle le mélange est soumis à une variation de pression, de la pression atmosphérique PO à une pression P2, comprise entre 10 et 750 hPa, de préférence entre 10 et 500 hPa, de préférence entre 15 et 100 hPa, et plus préférentiellement comprise entre 15 et 20 hPa, suivie d'un retour à la pression atmosphérique PO. La durée pendant laquelle le mélange est soumis à ladite pression P2 est inférieure ou égale à 10 secondes, et de préférence de 1 seconde, au contraire de la première étape d'incubation sous vide.
Selon un aspect particulier, un procédé selon l'invention comprend, ou consiste en, successivement : une première incubation sous vide de 5 à 30 minutes, de préférence de 10 à 20 minutes, à une pression PI comprise entre 10 et 750 hPa, de préférence entre 10 et 500 hPa, de préférence entre 15 et 100 hPa, et plus préférentiellement entre 15 et 20 hPa, un retour à la pression atmosphérique, une, deux ou trois étapes consistant chacune en : - une variation de la pression entre la pression atmosphérique PO et une pression P2 comprise entre 10 et 750 hPa, de préférence entre 10 et 500 hPa, de préférence entre 15 et 100 hPa, et plus préférentiellement comprise entre 15 et 20 hPa, ladite pression étant maintenue pendant une durée inférieure à 10 secondes, - un retour à la pression atmosphérique PO.
Au sens de la présente invention, on entend donc par « mise sous vide » l'application de conditions de pression comprises entre 10 et 750 hPa, de préférence entre 10 et 500 hPa, de préférence entre 15 et 100 hPa, et plus préférentiellement une pression comprise entre 15 et 20 hPa, pendant une durée inférieure à 10 secondes, et de préférence pendant une durée de 1 à 10 secondes.
Selon un aspect particulier, un procédé selon l'invention comprend l'application à un mélange de graines germées et d'une suspension d'Agrobacterium tumefaciens d'une incubation sous vide, à une pression PI comprise entre 10 et 750 hPa pendant 5 à 30 minutes, suivie d'au moins une mise sous vide, à une pression P2 comprise entre 10 et 750 hPa pendant 1 à 10 secondes, et de préférence une incubation sous vide suivie de une, deux ou trois mises sous vide successives.
Encore plus particulièrement, un procédé selon l'invention comprend l'application d'un traitement mécanique au mélange de graines germées et d'une suspension d'Agrobacterium tumefaciens, ledit traitement mécanique comprenant, ou consistant en : i) une étape de sonication entre 20 et 60 kHz, et de préférence à 50 kHz, pendant une durée de 30 à 60 secondes, ii) une étape pendant laquelle la pression varie de la pression atmosphérique PO à une pression PI, comprise entre 10 et 750 hPa, de préférence entre 15 et 100 hPa et préférentiellement entre 15 et 20 hPa, iii) une étape d'incubation sous vide à la pression PI pendant une durée de 5 à 30 minutes, de préférence pendant 10 à 20 minutes, iv) une étape pendant laquelle la pression varie de la pression PI à la pression atmosphérique PO, v) une étape pendant laquelle la pression varie de la pression atmosphérique PO à une pression P2, comprise entre 10 et 750 hPa, vi) une étape pendant laquelle la pression varie de la pression P2 à la pression atmosphérique PO, vii) une incubation à pression atmosphérique PO pendant 10 à 30 minutes, de préférence pendant 20 minutes.
Encore plus particulièrement, un procédé selon l'invention comprend l'application d'un traitement mécanique au mélange de graines germées et d'une suspension d'Agrobacterium tumefaciens, ledit traitement mécanique comprenant, ou consistant en : i) une étape de sonication entre 20 et 60 kHz, et de préférence à 50 kHz, pendant une durée de 30 à 60 secondes, ii) une étape pendant laquelle la pression varie de la pression atmosphérique PO à une pression PI, comprise entre 10 et 750 hPa, de préférence entre 15 et 100 hPa et préférentiellement entre 15 et 20 hPa, iii) une étape d'incubation sous vide à la pression PI pendant une durée de 5 à 30 minutes, de préférence pendant 10 à 20 minutes, iv) une étape pendant laquelle la pression varie de la pression PI à la pression atmosphérique PO, v) une étape pendant laquelle la pression varie de la pression atmosphérique PO à une pression P2, comprise entre 10 et 750 hPa, de préférence entre 15 et 100 hPa et préférentiellement entre 15 et 20 hPa, vi) une étape pendant laquelle la pression varie de la pression P2 à la pression atmosphérique PO, vii) une incubation à pression atmosphérique PO pendant 10 à 30 minutes, de préférence pendant 20 minutes, et comprenant en outre, entre les étapes vi) et vii), au moins une étape de mise sous vide, et de préférence une ou deux étapes de mise sous vide, comprenant, ou consistant successivement en: • une étape pendant laquelle la pression varie de la pression atmosphérique PO à une pression P2, comprise entre 10 et 750 hPa, de préférence entre 15 et 100 hPa, plus préférentiellement entre 15 et 20 hPa, • une étape pendant laquelle la pression varie de la pression P2 à la pression atmosphérique PO.
Dans un mode de réalisation préféré d'un procédé selon l'invention, le traitement mécanique appliqué lors de l'étape c) du procédé selon cet aspect de l'invention, comprend, ou consiste en, successivement au moins une sonication suivie par une incubation sous vide et au moins une ou deux mises sous vide, et de préférence deux mises sous vide.
Dans un mode de réalisation encore davantage préféré d'un procédé selon l'invention, le traitement mécanique appliqué lors de l'étape c) du procédé selon cet aspect de l'invention, comprend ou consiste en une sonication à 50 Hz pendant 30 secondes suivie par une incubation pendant 10 minutes à une pression de 15 hPa, puis de deux mises sous vide à 15 hPa, et d'une incubation à pression atmosphérique pendant 20 minutes.
Dans un procédé selon l'invention, la durée totale cumulée de mise sous vide du mélange est de préférence d'au plus 50 minutes, cette durée comprend la durée pendant laquelle la pression appliquée varie entre la pression atmosphérique et la dépression, et l'incubation en condition de dépression, d'une part, ainsi que la durée pendant laquelle la pression est inférieure à la pression atmosphérique lors de l'étape (ou lors des étapes) de mise sous vide qui suivent l'incubation sous vide.
Selon cet aspect du procédé, après l'application d'une pression P2 comprise entre 10 et 750 hPa, la pression est ramenée à la pression atmosphérique, et dès que celle-ci est rétablie, la mise sous vide est ré-enclenchée dans l'appareil. L'incubation à pression atmosphérique est réalisée uniquement à la fin de l'étape de traitement mécanique.
Lors de l'étape d) du procédé selon l'invention, les graines germées obtenues lors de l'étape c) sont mises en condition de culture en présence de la suspension d'Agrobacterium tumefaciens, ladite étape consiste donc en une co-culture des graines germées et dAgrobacterium tumefaciens. Selon un aspect préféré, cette étape est mise en œuvre à l'obscurité. Lors de cette étape, l'obscurité empêche le développement de la chlorophylle et facilite une éventuelle étape ultérieure de purification de protéines recombinantes produites par Lactuca sativa. Selon un mode de réalisation particulier, la mise en conditions de culture est réalisée en plaçant le mélange des graines germées et dAgrobacterium tumefaciens dans des boîtes de Pétri tapissées de papier filtre, à 22°C, ledit papier filtre étant imbibé avec un tampon adapté, tel que par exemple du tampon d'infection MES 10 mM pH 5,6, afin de favoriser le maintien des conditions optimales de transformation des cellules végétales par les agrobactéries.
La présente invention a pour second objet un procédé de production d'une protéine recombinante comprenant un procédé de transformation transitoire de graines germées de Lactuca sativa selon le premier objet de l'invention, dans lequel lors de l'étape b) la souche bactérienne Agrobacterium tumefaciens est transformée par au moins une séquence en acide nucléique comprenant au moins un gène d'intérêt codant une protéine recombinante, et dans lequel, lors de l'étape d) les graines germées sont mises en condition de culture pendant une durée suffisante pour permettre le développement des tissus végétaux, ledit procédé de transformation transitoire comprenant les étapes a) à d) mentionnées précédemment suivies des étapes suivantes : e) une étape de récolte des tissus végétaux produits lors de l'étape d), f) une étape d'extraction de ladite protéine recombinante à partir des tissus végétaux récoltés lors de l'étape e).
Selon un aspect particulier d'un procédé de production de protéines recombinantes selon le second objet de l'invention, la mise en condition de culture des graines germées obtenues lors de l'étape c), est appliquée pendant une durée comprise entre 2 et 21 jours, de préférence entre 7 et 21 jours, de préférence pendant 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 jours, au cours desquels ont lieu la croissance végétale et le développement de tissus végétaux.
Selon un mode de réalisation particulier, un procédé de production de protéines recombinantes selon l'invention comprend, ou consiste en, les étapes suivantes a) la mise en condition de germination des graines de Lactuca sativa, pendant 3 à 11 jours, de préférence pendant 4 à 8 jours, à l'obscurité, à une température comprise entre 10 et 22°C, pour générer des graines germées présentant au maximum un stade deux cotylédons ; b) la mise en contact des graines germées obtenues lors de l'étape a) avec une suspension comprenant Agrobacterium tumefaciens transformée par au moins une séquence codant au moins une protéine recombinante, pour obtenir un mélange, c) l'application au mélange obtenu lors de l'étape b) d'un traitement mécanique comprenant successivement : • une sonication à 50 kHz pendant 30 secondes, • une première étape comprenant successivement : une étape pendant laquelle la pression varie de la pression atmosphérique PO à une pression PI, comprise entre 10 et 750 hPa, de préférence entre 15 et 100 hPa, préférentiellement entre 15 et 20 hPa, une incubation à la pression PI pendant une durée de 10 à 20 minutes puis une étape pendant laquelle la pression appliquée au mélange varie de PI à la pression atmosphérique PO, • au moins une, et de préférence une, deux ou trois étapes, comprenant chacune successivement : une étape pendant laquelle la pression varie de la pression atmosphérique PO à une pression P2, comprise entre 10 et 750 hPa, de préférence entre 15 et 100 hPa, plus préférentiellement entre 15 et 20 hPa, puis une étape pendant laquelle la pression varie de la pression P2 à la pression atmosphérique PO, et • une incubation à la pression atmosphérique PO pendant 20 minutes, d) la mise en condition de culture, à l'obscurité, des graines germées obtenues lors de l'étape c) pendant 2 à 21 jours, de préférence pendant 8 à 10 jours, plus préférentiellement pendant 9 jours, permettant l'expression de ladite protéine recombinante, e) la récolte des tissus végétaux et f) l'extraction de ladite protéine recombinante à partir des tissus végétaux récoltés lors de l'étape e).
Dans un procédé selon l'invention, la récolte des tissus végétaux est mise en œuvre par tout moyen connu de l'homme du métier.
Dans un procédé selon l'invention, les protéines sont extraites des tissus végétaux partout moyen connu de l'homme du métier. Selon un aspect préféré, l'extraction des protéines produites, et notamment de la protéine recombinante d'intérêt est réalisée en mettant en œuvre les étapes suivantes : les graines germées sont broyées à froid (température inférieure ou égale à 5°C) dans un tampon adapté, comme par exemple un tampon phosphate de sodium 50 mM pH 7,0, additionné de DTT (dithiotréitol) 10 mM et de PVP (Polyvinylpyrrolidone) l,5g/L. Ce tampon sera additionné, selon les connaissances générales de l'homme du métier, d'inhibiteurs de protéases ou de tout autre composé permettant d'extraire les protéines tout en limitant l'action des protéases. La nature du tampon est choisie par l'homme du métier selon la nature des protéines à extraire.
Les exemples 1 à 4 et les figures 1 à 4 qui suivent illustrent l'invention.
La figure 1 illustre la quantité (en pg de protéine par gramme de matière fraîche) d'enzyme GUS recombinante produite par 3 espèces de graines transformées par un procédé selon l'invention, selon l'exemple 2.1. Les résultats obtenus avec L. sativa var. longifolia « Ballon », Brassica oleracea sabellica L. « Scarlet » et Trifolium pratense « Suez » sont représentés de gauche à droite. L'agrobactérie utilisée pour la transformation est EHA105 contenant un vecteur binaire avec le gène gus+ (don de l'Université de Lorraine en 2015). Les extraits protéiques sont analysés par test fluorimétrique « MUG » 9 jours après la transformation des graines germées.
La figure 2 représente l'intensité de la fluorescence de l'enzyme GUS recombinante en fonction de la variété de laitue transformée par un procédé selon l'invention par l'agrobactérie AGL1 contenant le vecteur pCAMBIA (don de l'Université de Lorraine, 2015) contenant le gène gus+, selon l'exemple 2.2. Les extraits protéiques sont analysés par test fluorimétrique « MUG » 9 jours après la transformation des graines germées. Les résultats obtenus avec L. sativa longifolia Ballon (« Ballon »), L. sativa var. capitata « Pierre Bénite » (« PB »), L. sativa var. capitata « Appia » (« Appia ») et L. sativa var. capitata « Blonde de Paris » (« BP ») sont représentés de gauche à droite.
La figure 3 illustre la quantité (en pg de protéine par gramme de matière fraîche) de protéine GUS recombinante produite par les graines germées de L. sativa var. longifolia « Ballon » transformées par différentes souches d'agrobactéries, selon l'exemple 2.3. Les résultats obtenus avec les souches d'A. tumefaciens AGL1 (don de l'Université de Strasbourg en 2015), C58Cl(don de l'INPL en 2006), LBA4404 (Achat chez Invitrogen en 2009), EHA105 (don de l'Université de Strasbourg en 2015) et GV3101 (Achat chez DSMZ en 2012) sont représentés de gauche à droite. Les extraits protéiques sont analysés par test fluorimétrique « MUG » 9 jours après la transformation des graines germées.
La figure 4 illustre la quantité (en pg de protéine par gramme de matière fraîche) de protéine GUS recombinante produite par les graines germées transformées de L. sativa var. longifolia « Ballon », selon l'intensité de la dépression appliquée aux mélanges de graines et d'agrobactéries lors du procédé de transformation, selon l'exemple 2.4. Les résultats obtenus par l'application des modalités suivantes sont représentés de gauche à droite : pas d'infiltration (= pression atmosphérique), pression de 750 hPa, pression de 250 hPa, pression de 15 hPa. Les graines germées sont transformées par l'agrobactérie EHA105 contenant un vecteur binaire avec le gène gus+. Les extraits protéiques sont analysés par test fluorimétrique « MUG » 9 jours après la transformation des graines germées. EXEMPLE 1 : Procédé de transformation transitoire de graines germées de laitue et production de protéines recombinantes 1.1 Transformation transitoire avec le gène codant la protéines GUS Des graines de Laitue Romaine 'Ballon' (L. sativa var. longifolia 'ballon') ont été achetées auprès de fournisseurs de semences français (Graines Hubert) ou anglais (Kings Quality seeds ou Mr Fothergill's seeds). Ces graines sont stérilisées par immersion pendant 20 min dans de l'eau de javel à 2,6% chlore actif, puis rincées 5 fois à l'eau distillée stérile. Ces graines sont mises en germination dans des boîtes en verre stériles dont le fond est recouvert de papier filtre stérile, à l'obscurité, pendant 4 jours à 22°C.
Préparation des agrobactéries : 24 heures avant la transformation, mise en culture ù'Agrobacterium tumefaciens souche EHA105) portant le plasmide binaire pCAMBIA codant le gène gus interrompu par un intron (« gus+ ») (Padmanablan, P. and Sahi, S. V., Plant cetI Rep, 2009,28 :31-40 « Genetic transformation and regneration of Sesbania drummondi using coyedinarynode»), dans 15 mL de milieu YEB (Yeast Extract Beef) contenant de la rifampicine et de la kanamycine, à 28°C sous agitation à 20,944rad/s. 3 heures avant la transformation, 100 μΜ d'acétosyringone sont ajoutés aux cultures d'agrobactéries pour activer leur virulence. Le temps d'incubation et la concentration en acétosyringone sont susceptibles d'être modifiés afin de déterminer les paramètres optimums d'activation de la virulence. La concentration en acétosyringone est de 100pM. Le temps d'incubation est compris entre 30 min et 6 heures, de préférence entre 3 et 5 heures. L'activation de la virulence se fait directement dans la culture ou après remise en suspension des agrobactéries dans un tampon adéquat.
Pour la transformation, les bactéries sont centrifugées et le culot bactérien est suspendu dans du tampon d'infection (MES 10 mM, pH 5,6). La DOeoonm des bactéries est ajustée à 0,5.
Les graines germées sont ensuite immergées dans la suspension bactérienne et soniquées dans un bain à ultrasons pendant 30 secondes à 50 kHz.
Le mélange graines germées/agrobactéries est placé dans une cloche à vide. Une étape de dépression est réalisée pour faciliter l'entrée des agrobactéries dans les tissus par infiltration : une incubation sous vide à une pression de 15 hPa pendant une durée de 10 min, afin de permettre l'évacuation de l'air contenu dans les tissus végétaux. La pression atmosphérique est ensuite rétablie dans la cloche, avant une nouvelle mise sous vide à 15 hPa. Enfin après une remise à la pression atmosphérique, le mélange graines germées/agrobactéries est laissé à incuber pendant une durée de 20 min à la pression atmosphérique. Les graines sont alors remises en culture dans des boîtes de Pétri tapissées de papier filtre stérile, à l'obscurité et à une température entre 18°C et 22°C, sans élimination préalable des agrobactéries, pour permettre la co-culture. Le papier filtre est imbibé avec du tampon d'infection (MES lOmM, pH 5,6) pour favoriser le maintien des conditions optimales de transformation des cellules végétales par les agrobactéries. L'ensemble des étapes de transformation est réalisé en milieu stérile pour limiter les contaminations microbiennes pouvant être sources de « faux positifs » et affecter l'état des graines germées transformées. Le procédé peut également être réalisé en milieu non stérile. 1.2 Production de protéines recombinantes
9 jours après l'infection, les graines germées transformées sont récoltées. Les protéines recombinantes sont alors analysées soit in-vivo, soit après extraction. Pour l'extraction protéique, les graines germées transformées sont broyées à froid (< 5°C) dans un tampon d'extraction (tampon phosphate de sodium 50 mM pH 7.0 ; DTT 10 mM, PVP l,5g/L). Le milieu est centrifugé, le surnageant contenant les protéines recombinantes est filtré sur un filtre à 0,2 μπι. Le filtrat est analysé et/ou stocké à -20°C dans un tampon contenant 10% de glycérol. EXEMPLE 2 : Essais comparatifs de production de l'enzyme GUS par un procédé de transformation transitoire selon l'invention 2.1 Comparaison de l'efficacité de transformation de différentes espèces végétales
La transformation de plusieurs espèces de graines germées a été testée. Pour ce faire, des agrobactéries EHA105 possédant un vecteur binaire contenant le gène gus interrompu par un intron (« gus+ ») (références: NCBI AF354045.1 ; AAK29426.1, demande internationale WO 99/13085) ont été utilisées.
La figure 1 montre la différence de production entre trois espèces végétales : L. sativa var. longifolia « Ballon », Brassica oleracea sabellica L. « Scarlet » /fournisseur La Boite à Graines, France) et Trifolium pratense «Suez» (fournisseur DLF-Trifolium, Danemark) transformées via un protocole identique. Seule L. sativa var. longifolia « Ballon », produit l'enzyme recombinante dans ces conditions. L. sativa var. longifolia « Ballon » présente donc une efficacité de transformation visiblement plus intéressante que les autres espèces testées. 2.2 Comparaison de l'efficacité de transformation de différentes variétés de L. sativa_
En plus de la variété L. sativa longifolia Ballon (« Ballon ») d'autres variétés de L. sativa (Graines de L. sativa var. capitata « Pierre Bénite » (« PB »), L. sativa var. capitata « Appia » (« Appia ») et L. sativa var. capitata « Blonde de Paris » (« BP ») achetées auprès de jardineries ou hypermarché (Cora) français en avril 2016 ont été testées. Le protocole utilisé est le suivant : - Stérilisation graines dans une solution à 2,6% de chlore actif, pendant 20 min. Rinçages à l'eau distillée stérile. - Germination pendant 4 jours à l'obscurité dans une boîte en verre stérile dont le fond est recouvert de papier filtre stérile. - Préparation des agrobactéries : 1 jour avant la transformation, mise en culture d'agrobactéries AGL1 (Chetty étal., Plant CeiiRep., 2013, 32(2):239-47, « Evaluation of four Agrobacterium tumefaciens strains for the genetic transformation of tomato (Solanum lycopersicum L.) cultivar Micro-Tom ») contenant le vecteur pCAMBIA avec le gène gus+, dans 15mL de milieu YEB supplémenté des antibiotiques adéquats. 3 heures avant la transformation, la virulence des agrobactéries est activée par l'ajout de ΙΟΟμΜ d'acétosyringone. Au moment de la transformation, les culots bactériens sont lavés puis resuspendus dans le tampon d'infection (MES lOmM pH 5,6,). La DO à 600 nm est ajustée à 0,5. - Traitement mécanique : Immersion des graines germées dans les suspensions d'agrobactéries. Traitement mécanique avec une étape de sonication pendant 30 sec à 50 kHz, une étape d'incubation sous vide par l'application d'une pression de 15 hPa pendant une durée de 10 min, qui est suivie d'une remise à la pression atmosphérique, puis d'une nouvelle mise sous vide par l'application d'une pression de 15 hPa. Dès que la mise sous vide à 15 hPa est atteinte, le mélange est remis à la pression atmosphérique. Une incubation pendant une durée de 20 min à la pression atmosphérique est réalisée. - Elimination du surplus d'agrobactéries, et remise en culture des graines germées dans des boîtes de Pétri dont le fond a été recouvert de papier filtre stérile imbibé avec du tampon d'infection, à l'obscurité, pendant 7 jours. - 9 jours après l'infection, extraction des protéines totales : Broyage de lg de tissu végétal dans 4ml_ de tampon d'extraction (Tampon phosphate de sodium 50mM pH 7, DTT lOmM). Centrifugation et filtration du surnageant contenant les protéines recombinantes sur un filtre à 0,2 pm. Le filtrat est analysé et/ou stocké à -20°C dans un tampon contenant 10% de glycérol.
La figure 2 montre une activité en enzyme GUS recombinante plus intense chez L sativa var. longifolia « Ballon », que chez les autres variétés testées. Cette variété semble donc plus apte à être transformée de façon transitoire par les agrobactéries dans les conditions étudiées. 2.3 Comparaison de l'efficacité de transformation de L. sativa var. longifolia « Ballon selon la souche d'Agrobacterium tumefaciens utilisée
Plusieurs souches d'agrobactéries ont été testées pour évaluer leur efficacité sur L. sativa var. longifolia « Ballon »: Les résultats décrits dans la figure 3 montrent que la souche EHA105 est la plus efficace pour la transformation transitoire de graines germées de L. sativa var. longifolia « Ballon ». 2.4 Comparaison de l'efficacité du procédé selon la dépression appliquée lors de la transformation
Les résultats présentés dans la figure 4 comparent la quantité de protéine recombinante après la mise en œuvre d'un protocole similaire au protocole décrit en 2.2 mais en utilisant la souche EHA105 et dans lequel la pression PI est appliquée pendant 10 minutes pour l'incubation sous vide, et la pression P2 est appliquée pendant au plus 10 secondes pour la mise sous vide, PI et P2 étant égales, respectivement à 15, 250 ou 750 hPa, selon les conditions opératoires. Les résultats montrent que l'intensité de la dépression est déterminante sur l'efficacité de la transformation. L'application d'une dépression de 15 hPa donne de meilleurs résultats que les autres intensités testées. 2.5 Conditions optimales de transformation A ce jour, les rendements obtenus selon le protocole de traitement mécanique de l'exemple 2.4 avec le choix d'une pression de 15 hPa, atteignent environ 1,5 g de protéine GUS recombinante active/kg de graines germées de L. sativa var. longifolia « Ballon » transformée avec la souche d'agrobactéries EHA105, contenant un plasmide binaire codant le gène gus interrompu par un intron (« gus+ »). EXEMPLE 3 : Production de protéines d'intérêt par un procédé selon l'invention. 3.1 Facteur intrinsèque
Le facteur intrinsèque (FI) est une glycoprotéine présente dans les sucs gastriques qui participe à l'assimilation de la vitamine B12 (aussi appelée cobalamine) par l'intestin. La séquence nucléotidique codant cette protéine (Accession: NM_005142.2, don de l'unité INSERM 954 en 2007) a été insérée dans un vecteur binaire, lui-même intégré dans l'agrobactérie EHA105. Les conditions de transformation sont celles de l'exemple 2.5. Un test d'activité a permis de détecter 12 mg de FI recombinant actif/kg de graines germées de L. sativa var. longifolia « Ballon » transformée (matière fraîche). 3.2 Anticorps monoclonal M12 L'anticorps M12 reconnaît la vitronectine, une protéine notamment impliquée dans l'hémostase et la malignité des tumeurs. Cet anticorps peut donc servir de marqueur pour la détection du cancer du sein par exemple. Deux agrobactéries (EHA105) contenant un vecteur avec soit la chaîne légère soit la chaîne lourde de l'anticorps ont été utilisées pour co-infecter des graines germées de germées de L. sativa var. longifolia « Ballon » (plasmide contenant les deux chaînes du M12 donné par le Fraunhofer IME, Aachen (Allemagne) en 2012) selon le protocole de traitement mécanique décrit à l'exemple 2.5. Un test ELISA a ensuite été réalisé pour déterminer la quantité d'anticorps M12 recombinant capable de se lier à la vitronectine. 100 pg de M12 recombinant actif/kg de graines germées de L. sativa var. longifolia « Ballon » transformées (matière fraîche) ont ainsi pu être détectés. L'invention consistant à transformer transitoirement des graines germées de L. sativa var. longifolia « Ballon »permet donc de produire des protéines humaines glycosylées (FI) ou multimériques (M12) fonctionnelles. EXEMPLE 4 : Mise en œuvre du procédé selon l'invention dans des conditions non stériles 4.1 Matériels et méthodes L'invention a également été testée en milieu non stérile. Les graines de L. sativa var. longifolia « Ballon » ont été mises en germination à l'obscurité, en aéroponie, durant 3 jours, avec une pulvérisation d'eau pendant 30 secondes toutes les 12 heures. Les graines germées ont ensuite été infectées de la même façon que pour la transformation en milieu stérile, en utilisant des agrobactéries EHA105 contenant un vecteur binaire avec le gène gus+ selon le protocole de traitement mécanique décrit à l'exemple 2.5. Les graines germées infectées ont été remises en culture dans les mêmes conditions que pour la germination, pour une période de 9 jours. 4.2 Résultats L'analyse des protéines recombinantes a été réalisée grâce à un test fluorimétrique MUG. Le rendement estimé fait état de 1,6 g de protéine GUS recombinantes produite/kg de graines germées de L. sativa var. longifolia « Ballon » transformées (matière fraîche). EXEMPLE 5 : Comparaison de l'efficacité du procédé selon l'invention et de procédés de l'état de l'art pour la transformation de graines de L. sativa var. longifolia « Ballon » 5.1 Protocole selon l'invention - Stérilisation de graines de L. sativa var. longifolia « Ballon » dans une solution à 2.6% de chlore actif, pendant 20min. Rinçages à l'eau distillée stérile. - Germination pendant 4 jours à l'obscurité à 22°C dans une boîte en verre stérile dont le fond est recouvert de papier filtre stérile. - Préparation des agrobactéries : J-l avant la transformation, mise en culture d'agrobactéries souche EHA105 contenant un vecteur binaire avec le gène gus+ dans 15ml_ de milieu YEB supplémenté des antibiotiques adéquats. 3h avant la transformation, activation de la virulence des agrobactéries par ajout de ΙΟΟμΜ d'acétosyringone. Au moment de la transformation, lavage des culots bactériens puis resuspension dans le tampon d'infection (MES lOmM pH 5,6). Ajustement de la DO à 600 nm à 1,5. - Traitement mécanique : Immersion des graines germées dans les suspensions d'agrobactéries. Sonication 30 sec à 50 kHz suivie d'une incubation sous vide par l'application d'une pression de 15 hPa pendant une durée de 10min. Remise à la pression atmosphérique. Nouvelle mise sous vide à une pression de 15 hPa. Remise à la pression atmosphérique. Répétition pour totaliser trois étapes de mise sous vide. Remise à la pression atmosphérique, puis incubation pendant une durée de 20min à pression atmosphérique. - Elimination du surplus d'agrobactéries, et remise en culture des graines germées transformées dans des boîtes de Pétri stériles dont le fond a été recouvert de papier filtre stérile, à l'obscurité, pendant 9 jours. - A J9, extraction des protéines totales : Broyage de lg de tissu végétal dans 4mL de tampon d'extraction (Tampon phosphate de sodium 50mM pH 7, DTT lOmM, PVP l,5g/L). Centrifugation et filtration du surnageant contenant les protéines recombinantes sur un filtre à 0,2pm. - A J9, extraction et analyse des protéines totales. Le rendement estimé est de 2,8 mg de protéine GUS recombinantes produite/g de graines germées de L. sativa var. longifolia « Ballon » transformées (matière fraîche). 5.2 Protocole selon Chen et al. Î201C0 - Germination de graines de L. sativa var. longifolia « Ballon » pendant 3 jours en conditions stériles dans les micro et macroéléments de MS (milieu nutritif Murashige et Skoog) additionné des vitamines Gamborg B5, 2% sucrose, pH 5,8. Culture menée à 24 ± 2°C à l'obscurité. - J-l : Agrobactéries AGL1 contenant le vecteur binaire pCAMBIA avec le gène gus+ mises en culture dans milieu YEB supplémenté avec des antibiotiques adéquats. Au moment de la transformation, lavage des culots bactériens puis resuspension dans le tampon d'infection (0,lxMS, lx vitamines B5, 3% sucrose, 1,2 g/l MES, pH 5,4 et ΙΟΟμΜ acétosyringone). Ajustement de la DO à 1. - Incubation des agrobactéries pendant 3 heures - Immersion des graines germées dans la suspension d'agrobactéries. - Sonication pendant 1 minute à 50 kHz et incubation pendant 30 minutes à température ambiante. - Centrifugation de la culture à 2400g pendant 1 minute - Les graines sont disposées dans des boîtes de Pétri stériles dont le fond a été recouvert de papier filtre stérile. Le papier est imbibé du tampon de coculture correspondant à de l'eau stérile additionnée de 100 μΜ d'acétosyringone, 400 mg/l L-cystéine and 154 mg/l DTT. Co-culture pendant 3 jours à l'obscurité à température ambiante. - A J3, extraction et analyse des protéines totales. Le rendement estimé est de 23 pg de protéine GUS recombinantes produite/g de graines germées de L. sativa var. longifolia « Ballon » transformées (matière fraîche). 5.3 Protocole selon Li et a! (2009)
Germination en conditions stériles des graines de L. sativa var. longifolia « Ballon » pendant 4 jours - J-l : Agrobactéries GV3101 contenant le vecteur binaire pCAMBIA avec le gène gus+ mises en culture dans milieu YEB supplémenté avec antibiotiques adéquats avec une DO initiale de 0,3. Les bactéries sont utilisées quand elles ont atteint une DO de 1,5. - Centrifugation à 6000g pendant 5 minutes. Un lavage avec 10 mM MgCb et 100 μΜ acétosyringone. Centrifugation des bactéries et resuspension dans 1 mL de la même solution. - Les graines germées cultivées en boite de Pétri sont inoculées avec 20 mL de la suspension bactérienne dont la DO a été ajustée à 0,5 avec le tampon de coculture (0,25x MS, 1% sucrose, 100 μΜ acétosyringone et 0,005% Silwet L-77, pH 6,0). - La co-culture se fait à l'obscurité à la même température que la mise en germination des graines pendant 36 heures ou pendant 60 heures. - A 36 heures et à 60 heures, extraction et analyse des protéines totales : pour les deux durées de co-culture, la quantité d'enzyme GUS produite à partir de graines germées de L. sativa var. longifolia « Ballon » n'est pas détectable. 5.4 Protocole selon Marion et al. (The Plant Journal 56 (1):169-79. 2008, « Systematic Analysis of Protein Subcellular Localization and Interaction Using High-Throughput Transient Transformation of Arabidopsis Seedlings ». - Germination en conditions stériles des graines de L. sativa var. longifolia « Ballon » pendant 3-4 jours - J-l : Agrobactéries C58C1 contenant le vecteur binaire pCAMBIA avec le gène gus+ mises en culture dans milieu YEB supplémenté avec des antibiotiques adéquats. Au moment de la transformation, il faut avoir une suspension d'agrobactéries saturée (DO à 5). - Centrifugation et resuspension du culot dans 2 ml de 5% sucrose, 200 pM acétosyringone. Ajustement de la DO à 2 avec un tampon d'infection composé de 5% sucrose et 0,01% Silwet. - Immersion des graines dans la suspension d'agrobactéries - Deux infiltrations (13mBars) sous vide d'une minute - Co-culture en boite de Pétri pendant 3 jours à la lumière (18°C, 60% humidité, photopériode 16/8 h). - A J3, extraction et analyse des protéines totales. Le rendement estimé est de 12 pg de protéine GUS recombinantes produite/g de graines germées de L. sativa var. longifolia « Ballon » transformées (matière fraîche). 5.5 Conclusions
La quantité d'enzyme GUS produite à partir de graines germées de L. sativa var. longifolia « Ballon », par gramme de matière fraîche, est indétectable ou très faible en mettant en œuvre les protocoles décrits dans les exemples 5.2, 5.3 et 5.4.
La mise en œuvre d'un protocole selon l'exemple 5.1 permet de produire une quantité notable de protéine.
Claims (10)
- REVENDICATIONS1. Procédé de transformation transitoire de graines germées de Lactuca sativa, comprenant les étapes suivantes : a) la mise en condition de germination, à l'obscurité, de graines de Lactuca sativa, pendant une durée comprise entre 3 et 11 jours, et de préférence entre 4 et 8 jours, pour générer des graines germées, b) la mise en contact des graines germées obtenues lors de l'étape a) avec une suspension comprenant la souche bactérienne Agrobacterium tumefaciens transformée par au moins une séquence en acide nucléique comprenant un gène d'intérêt, pour obtenir un mélange, c) l'application au mélange obtenu lors de l'étape b) d'un traitement mécanique comprenant : • optionnellement au moins une étape de sonication et • au moins une étape d'incubation sous vide, d) la mise en condition de culture des graines germées obtenues lors de l'étape c).
- 2. Procédé de production d'une protéine recombinante comprenant les étapes a) à d) selon la revendication 1, ledit procédé étant caractérisé en ce que lors de l'étape b) ledit gène d'intérêt code une protéine recombinante, et en ce que ledit procédé comprend en outre une étape e) de récolte des tissus végétaux produits lors de l'étape d), suivie d'une étape f) d'extraction de la protéine recombinante, à partir des tissus végétaux récoltés lors de l'étape e).
- 3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que ladite graine de Lactuca sativa est choisie parmi les variétés suivantes ; Lactuca sativa var. iongifoiia, Lactuca sativa var. capitata et Lactuca sativa var. crispa.
- 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ladite graine de Lactuca sativa est choisie parmi les cultivars suivants Lactuca sativa var. iongifoiia « Ballon », Lactuca sativa var. capitata « Pierre Bénite », Lactuca sativa var. capitata « Blonde de Paris », Lactuca sativa var. capitata « Florine », Lactuca sativa var. capitata « Kamikaze », Lactuca sativa var. capitata « Grosse blonde paresseuse », Lactuca sativa var. capitata « Grosse blonde d'hiver » Lactuca sativa var. capitata « Appia», et Lactuca sativa var. crispa « Sanguine ».
- 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'étape c) de traitement mécanique du mélange comprend la sonication du mélange, à une fréquence supérieure à 10 kHz, de préférence à une fréquence comprise entre 20 et 60 kHz et de façon plus préférentielle entre 50 et 60 kHz, pendant une durée comprise entre 10 et 300 secondes, de préférence comprise entre 30 et 60 secondes.
- 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'étape c) comprend une étape d'incubation sous vide du mélange, ladite incubation sous vide étant réalisée par l'application d'une pression comprise entre 10 et 750 hPa, de préférence entre 15 et 100 hPa, plus préférentiellement entre 15 et 20 hPa, pendant une durée comprise entre 5 et 30 minutes, de préférence entre 10 et 20 minutes, ladite incubation sous vide étant suivie par l'incubation du mélange à pression atmosphérique pendant une durée comprise entre 10 et 30 minutes.
- 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'étape c) comprend l'application au mélange, successivement de : i) une étape de sonication entre 20 et 60 kHz, et de préférence à 50 kHz, pendant 30 à 60 secondes, ii) une étape pendant laquelle la pression varie de la pression atmosphérique PO à une pression PI, comprise entre 10 et 750 hPa, de préférence entre 15 et 100 hPa, plus préférentiellement entre 15 et 20 hPa, iii) une étape d'incubation sous vide à la pression PI pendant une durée de 5 à 30 minutes, de préférence pendant 10 à 20 minutes, iv) une étape pendant laquelle la pression varie de la pression PI à la pression atmosphérique PO, v) une étape pendant laquelle la pression varie de la pression atmosphérique PO à une pression P2, comprise entre 10 et 750 hPa, de préférence entre 15 et 100 hPa, plus préférentiellement entre 15 et 20 hPa, vi) une étape pendant laquelle la pression varie de la pression P2 à la pression atmosphérique PO, vii) une incubation à pression atmosphérique PO pendant 10 à 30 minutes, de préférence pendant 20 minutes.
- 8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'étape c) comprend en outre, entre les étapes vi) et vii), au moins une étape de mise sous vide, comprenant successivement : • une étape pendant laquelle la pression varie de la pression atmosphérique PO à une pression P2, comprise entre 10 et 750 hPa, de préférence entre 15 et 100 hPa, plus préférentiellement entre 15 et 20 hPa, • une étape pendant laquelle la pression varie de la pression P2 à la pression atmosphérique PO.
- 9. Procédé selon la revendication 7 ou 8, caractérisé en ce que l'étape c) comprend en outre, entre les étapes vi) et vii), une ou deux étapes de mise sous vide, comprenant chacune successivement : • une étape pendant laquelle la pression varie de la pression atmosphérique PO à une pression P2, comprise entre 10 et 750 hPa, de préférence entre 15 et 100 hPa, plus préférentiellement entre 15 et 20 hPa, • une étape pendant laquelle la pression varie de la pression P2 à la pression atmosphérique PO.
- 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 9, comprenant les étapes suivantes : a) la mise en condition de germination des graines de Lactuca sativa, pendant 3 à 11 jours, de préférence pendant 4 à 8 jours, à l'obscurité, à une température comprise entre 10 et 22°C, pour générer des graines germées présentant au maximum un stade deux cotylédons ; b) la mise en contact des graines germées obtenues lors de l'étape a) avec une suspension comprenant Agrobacterium tumefaciens transformée par au moins une séquence codant au moins une protéine recombinante, pour obtenir un mélange, c) l'application au mélange obtenu lors de l'étape b) d'un traitement mécanique comprenant successivement : • une sonication à 50 kHz pendant 30 secondes, • une première étape comprenant successivement : une étape pendant laquelle la pression varie de la pression atmosphérique PO à une pression PI, comprise entre 10 et 750 hPa, de préférence entre 15 et 100 hPa, préférentiellement entre 15 et 20 hPa, une incubation à la pression PI pendant une durée de 10 à 20 minutes puis une étape pendant laquelle la pression appliquée au mélange varie de PI à la pression atmosphérique PO, • au moins une, et de préférence une, deux ou trois étapes, comprenant chacune successivement : une étape pendant laquelle la pression varie de la pression atmosphérique PO à une pression P2 comprise entre 10 et 750 hPa, de préférence entre 15 et 100 hPa, plus préférentiellement entre 15 et 20 hPa, puis une étape pendant laquelle la pression varie de la pression P2 à la pression atmosphérique PO, et • une incubation à la pression atmosphérique PO pendant 20 minutes, d) la mise en condition de culture, à l'obscurité, des graines germées obtenues lors de l'étape c) pendant 2 à 21 jours, de préférence pendant 8 à 10 jours, plus préférentiellement pendant 9 jours, permettant l'expression de ladite protéine recombinante, e) la récolte des tissus végétaux et f) l'extraction de ladite protéine recombinante à partir des tissus végétaux récoltés lors de l'étape e).
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Non-Patent Citations (3)
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|---|
| BYONG-JIN PARK ET AL: "Transformation of radish (Raphanus sativus L.) via sonication and vacuum infiltration of germinated seeds with Agrobacterium harboring a group 3 LEA gene from B. napus", PLANT CELL REPORTS, SPRINGER, BERLIN, DE, vol. 24, no. 8, 1 October 2005 (2005-10-01), pages 494 - 500, XP019335514, ISSN: 1432-203X, DOI: 10.1007/S00299-005-0973-5 * |
| CHEN XINLU ET AL: "A high-throughput transient gene expression system for switchgrass (Panicum virgatum L.) seedlings", BIOTECHNOLOGY FOR BIOFUELS, BIOMED CENTRAL LTD, GB, vol. 3, no. 1, 7 May 2010 (2010-05-07), pages 9, XP021082877, ISSN: 1754-6834, DOI: 10.1186/1754-6834-3-9 * |
| NEGROUK V ET AL: "Highly efficient transient expression of functional recombinant antibodies in lettuce", PLANT SCIENCE, ELSEVIER IRELAND LTD, IE, vol. 169, no. 2, 1 August 2005 (2005-08-01), pages 433 - 438, XP027783540, ISSN: 0168-9452, [retrieved on 20050801] * |
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