FR3066916A1 - Complexe vegetal a base de seve de bouleau et d'un extrait aqueux de chaga et applications en cosmetique - Google Patents

Abstract

La présente invention est relative à un complexe végétal comprenant au moins de la sève de bouleau (ou eau de bouleau) et au moins un extrait de chaga (Inonotus obliquus), ainsi qu'à une composition cosmétique à application topique comprenant un tel complexe végétal à titre d'ingrédient actif. Elle se rapporte également à un procédé cosmétique non thérapeutique pour les soins de la peau mettant en œuvre une telle composition, ainsi qu'à l'utilisation cosmétique et non thérapeutique d'une telle composition cosmétique pour les soins de la peau, et notamment pour protéger la peau des agressions extérieures, notamment des effets néfastes des rayons ultraviolets (UV), et calmer la peau tout en renforçant ses défenses naturelles.

Description

® COMPLEXE VEGETAL A BASE DE SEVE DE BOULEAU ET D'UN EXTRAIT AQUEUX DE CHAGA ET APPLICATIONS EN COSMETIQUE.

(57) La présente invention est relative à un complexe végétal comprenant au moins de la sève de bouleau (ou eau de bouleau) et au moins un extrait de chaga (Inonotus obliquus), ainsi qu'à une composition cosmétique à application topique comprenant un tel complexe végétal à titre d'ingrédient actif.

Elle se rapporte également à un procédé cosmétique non thérapeutique pour les soins de la peau mettant en oeuvre une telle composition, ainsi qu'à l'utilisation cosmétique et non thérapeutique d'une telle composition cosmétique pour les soins de la peau, et notamment pour protéger la peau des agressions extérieures, notamment des effets néfastes des rayons ultraviolets (UV), et calmer la peau tout en renforçant ses défenses naturelles.

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La présente invention se rapporte au domaine technique général des produits cosmétiques de soin, à usage topique, utilisables notamment sur la peau.

Plus précisément, la présente invention est relative à un complexe végétal comprenant au moins de la sève de bouleau (ou eau de bouleau) et au moins un extrait de chaga (Inonotus obliquus'), ainsi qu'à une composition cosmétique à application topique comprenant un tel complexe végétal à titre d'ingrédient actif. Elle se rapporte également à un procédé cosmétique non thérapeutique pour les soins de la peau mettant en œuvre une telle composition, ainsi qu'à l'utilisation non thérapeutique d'une telle composition cosmétique pour les soins de la peau, et notamment pour protéger la peau des agressions extérieures, notamment des effets néfastes des rayons ultraviolets (UV), et calmer la peau tout en renforçant ses défenses naturelles.

La peau est le principal organe du corps humain avec une surface totale d'environ 2 m². La peau comprend plusieurs couches intégrées, allant de la couche superficielle, l'épiderme, jusqu'aux couches plus profondes, le derme et l'hypoderme, et chacune de ces couches possède des propriétés spécifiques permettant à l'ensemble de réagir et de s'adapter aux conditions de son environnement.

L'épiderme, principalement composé de kératinocytes, de mélanocytes et de cellules de Langerhans, joue un rôle fondamental pour assurer la protection et le maintien d'une bonne trophicité. Les kératinocytes sont des cellules extrêmement dynamiques qui subissent une prolifération et une différenciation permanentes aux termes desquelles elles se transforment en cellules mortes (cornéocytes), s'éliminant régulièrement par desquamation.

Le derme se compose principalement de collagène, d'élastine et de protéoglycanes, molécules synthétisées par les fibroblastes dermiques. Les fibres de collagène assurent la résistance mécanique et la texture de la peau, l'élastine est responsable de l'élasticité, et les protéoglycanes, combinant protéines et glycosaminoglycane, jouent un rôle majeur de structure et d'hydratation de la peau. Les glycosaminoglycanes, tels que l'acide hyaluronique, sont des molécules très hygroscopiques qui sont capables de retenir des quantités importantes d'eau. D'autres cellules, comme les macrophages et les leucocytes, sont également présentes dans la couche du derme.

L'hypoderme, qui est la couche la plus profonde de la peau, contient les adipocytes qui produisent des lipides pour que le tissu sous-cutané fabrique une couche lipidique protégeant les muscles, les os et les organes internes contre les chocs.

La peau protège l'organisme des agressions extérieures, contribue à la respiration et est le principal organe jouant sur l'immunité.

Les agressions de l'environnement, y compris les agressions climatiques telle que l’exposition au soleil, les variations de températures, la pollution, jouent un rôle néfaste sur la peau en générant des radicaux libres qui sont des espèces réactives de l'oxygène (ou R.OS, de l'expression anglophone « Reactive oxygéné species ») telles que l'anion superoxyde (Ο₂“)· L’attaque par voie radicalaire initie des réactions en chaîne qui ne s'arrêtent que lorsque deux radicaux libres s'inactivent mutuellement. En particulier, les radicaux libres génèrent un stress oxydant altérant les lipides membranaires des cellules de la peau et les cellules elles-mêmes, non seulement au niveau de l'ADN mitochondrial et des mitochondries, qui sont le centre énergétique des cellules et « l'atelier » de réparation cellulaire, provoquant un vieillissement prématuré et/ou accéléré de la peau, mais également au niveau de l'ADN cellulaire, c'est-à-dire de l'ADN contenu dans le noyau des cellules.

Il est donc important de protéger les cellules de la peau des effets néfastes des agressions de l'environnement, et en particulier du stress oxydatif généré notamment par les rayonnements UV afin de prévenir et/ou retarder l'apparition de signes de vieillissement cutanés tels que rides et ridules.

Des compositions cosmétiques ayant des propriétés antiradicalaires ont déjà été proposées, notamment des compositions comprenant de la superoxyde dismutase qui est une métalloprotéine possédant une activité enzymatique catalysant la dismutation des anions superoxyde en dioxygène et peroxyde d’hydrogène. Pour cette raison, cette enzyme est une composante essentielle du mécanisme d'élimination des radicaux libres (voir par exemple la demande de brevet FR.2287899.

Par ailleurs, au regard de certains composés synthétiques, incorporés dans les compositions cosmétiques, les produits d'origine naturelle ou contenant des composés naturels sont de plus en plus appréciés par les consommateurs(trices) et ont amené l'industrie cosmétique à proposer des produits contenant des substances naturelles ou d'origine naturelle présentant des propriétés anti-radicalaires. C'est ainsi que l'on connaît déjà des compositions cosmétiques contenant des substances d'origine végétale, telles que par exemple des polyphénols, capables de piéger les radicaux libres produits en excès par l'organisme lors d'agressions externes.

A titre d'exemple, la demande de brevet EP 0 629 397 décrit une composition cosmétique ou pharmaceutique pour application topique ayant une action antiradicalaire et anti-infllammatoire, comprenant un extrait hydroglycolique de microalgues Chlorella, Scenedesmus et Spiruline en association avec un extrait de café vert.

Un autre exemple est donné par la demande de brevet EP 1 787 970 qui décrit une composition cosmétique à application topique ayant des propriétés anti-radicalaires comprenant des polyphénols extraits de fèves de cacao.

Par ailleurs, la demande de brevet FR. 2 829 695 décrit des compositions cosmétiques renfermant de la sève de bouleau en association avec un jus d'argousier. Il est mentionné que cette association a des propriétés hydratantes, permet de calmer les sensations d’inconfort produites par l’irritation mécanique, notamment par le rasage quotidien bien connu pour déclencher le feu du rasoir, procure une sensation anti-fatigue et permet de vitaliser les tissus.

Compte tenu de la demande toujours croissante pour de nouveaux produits et de l'attrait des consommateurs et consommatrices pour les produits d'origine naturelle, il existe toujours un besoin pour des compositions cosmétiques alternatives ayant notamment des propriétés antiradicalaires et pouvant avantageusement être utilisées pour prévenir et/ou traiter les signes du vieillissement cutané.

Les travaux réalisés par la Demanderesse ont montré que l'association de la sève de bouleau et d'au moins un extrait de chaga présente des propriétés anti-radicalaires synergiques, mais également qu'un tel extrait permet de stimuler l'immunomodulation (renforcement des défenses naturelles), a un effet positif sur la production intrinsèque de superoxyde dismutase et de catalase par les cellules de la peau ayant subi un stress oxydatif enfin a une action protectrice et réparatrice de l'ADN mitochondrial et également une action protectrice de l'ADN cellulaire. Cette association présente de plus un effet apaisant permettant de calmer les peaux irritées.

De plus, les essais effectués ont montré qu'un tel complexe végétal de ne présentait aucune cytotoxicité.

La sève de bouleau est également appelée eau de bouleau en raison de sa transparence. Il ne faut pas la confondre avec le jus de bouleau qui est une décoction de feuilles de bouleau. La récolte de la sève de bouleau a lieu généralement à la fin de l'hiver et au début du printemps, au moment où l'arbre se gorge de toute la sève dont il a besoin, et ce pendant 3 ou 4 semaines. Pendant cette période la sève monte alors dans l'arbre, c'est donc la sève montante qui est récoltée par incision de l'écorce du bouleau ou pincement de celle-ci. C'est à cette période très précise que l'on peut récolter l'eau de bouleau, juste avant que les bourgeons n'apparaissent, parfois dès la fin du mois de février. La sève peut notamment être extraite du bouleau blanc (Betula alba), du bouleau verruqueux (Betula pendula), du bouleau flexible (Betula lenta), du bouleau papyfera (Betula papyfera) et du bouleau fontinal (Betula /0111103115). La sève de bouleau est riche en oligoéléments, en sels minéraux, en oligosaccharides, en acides aminés et en acides organiques. Elle est connue pour ses bienfaits de drainage et de régénération de l'organisme. Elle peut être consommée à l'état naturel ou après incorporation dans des boissons fermentées en y ajoutant du miel par exemple. Les propriétés anti-radicalaires de la sève de bouleau n'avaient cependant pas encore été décrites.

Le chaga (Inonotus obliquus) est un champignon du genre Inonotus de la famille des Hymenochaetaceae. Il a une apparence de sclérote avec une surface de couleur allant de l'orange au noir. Il est un parasite du bouleau dont il digère lentement le tronc. On le trouve dans les forêts de bouleau de Russie, de Corée, dans l’Est de l’Europe du Nord ainsi qu’en Auvergne et dans les régions du Nord des États-Unis, dans les montagnes en Caroline du Nord et au Canada. Le chaga est considéré comme un champignon médicinal qui a sa place en médecine populaire en Russie et en Europe de l’Est. Plusieurs études ont démontré que le chaga aide à combattre le cancer et à détoxifier l’organisme des matières radioactives émises lors d’une chimiothérapie. Il renforcerait le système immunitaire en plus de prévenir l’asthme et les allergies. Il serait également un régénérateur du foie et du système digestif (WOLFE, David (2012). Chaga: King of the Médicinal Mushrooms. Berkeley, California : North Atlantic Books).

Il n'était cependant pas connu que l'association de la sève de bouleau et d'un extrait de chaga aurait notamment des propriétés synergiques antiradicalaires ainsi qu'un effet immunomodulateur permettant de renforcer les défenses naturelles pouvant avantageusement être mises à profit dans des compositions cosmétiques à application topique pour prévenir et/ou traiter les signes du vieillissement cutané.

Ainsi, la présente invention a pour premier objet un complexe végétal comprenant au moins de la sève de bouleau et au moins un extrait aqueux de chaga (Inonotus obliquus').

Un second objet de l'invention est l'utilisation cosmétique et non thérapeutique d'un complexe végétal tel que défini selon le premier objet de l'invention, à titre d'ingrédient actif ayant des propriétés antiradicalaires et d'immunomodulation, dans une composition cosmétique destinée à prévenir et/ou traiter les signes du vieillissement cutané.

Un troisième objet de l'invention est une composition cosmétique à application topique comprenant, dans un support cosmétiquement acceptable, au moins un complexe végétal tel que défini selon le premier objet de l'invention, c'est-à-dire comprenant au moins de la sève de bouleau et au moins un extrait aqueux de chaga.

Enfin, un quatrième objet de l'invention est un procédé de traitement cosmétique non thérapeutique pour prévenir et/ou traiter les signes du vieillissement cutané comprenant au moins une étape d'application sur la peau d'une composition cosmétique à application topique telle que définie selon le troisième objet de l'invention, c'est-à-dire comprenant au moins un complexe végétal tel que défini selon le premier objet de l'invention.

Comme indiqué précédemment la sève de bouleau peut être récoltée par légère excision de l'arbre lorsque printemps lorsque la sève est montante et avant formation des bourgeons. Une fois récoltée, la sève est éventuellement additionnée d'un conservateur et décontaminée par filtration. La sève de bouleau est également disponible commercialement auprès de la société Greentech sous la dénomination commerciale BOULEAU SEVE BIO SB.

La sève de bouleau comprend des minéraux, notamment des chlorures, du calcium, du magnésium, du sodium, du potassium, du cuivre, du fer, du manganèse, de la silice et du zinc, ainsi que des oligosaccharides tels que le fructose, le galactose, le saccharose et le glucose, des acides aminés et des protéines tels que l'asparagine, l'acide aspartique, la glutamine, l'acide glutamique, l'isoleucine, la valine et la citruline, ainsi que des acides organiques tels que l'acide malique et l'acide citrique. Elle se présente sous la forme d'un liquide incolore ayant les caractéristiques suivantes :

- indice de réfraction 1,325 à 1,345 ;

- pH (direct) : 3,4 à 4,0 ;

- densité : 0,980 à 1,020.

L'extrait de chaga peut être obtenu par cryobroyage du champignon entier après congélation à très basse température, puis extraction aqueuse du cryobroyat par macération dans l'eau, de préférence à une température de 35 à 40°C. L'extrait aqueux est ensuite clarifié puis éventuellement additionné d'un conservateur avant d'être enfin décontaminé par filtration (diamètre 0,2 pm). Un tel extrait aqueux de chaga est également disponible dans le commerce auprès de la société Greentech, sous la dénomination commerciale INONOTUS OBLIQUUS CRYOEXTRAIT CONCENTRATE AQUEUX BIO SB.

L'extrait aqueux de chaga comprend, entre autres ingrédients, des oligo- et polysaccharides tels que du rhamnose, de l'arabinose, du xylose, du mannose, du glucose, du galactose, du fucose, de la glucosamine, de la galactosamine, de l'amidon, de l'acide uronique, des exo-polysaccharides (EPS), des endo-polysaccharides, des alpha-fucoglucomannanes, des betaglucanes ; des composés phénoliques tels que des tannins, des polyphénols, des acides phénoliques (acide vanillique, acide protocatéchique, acide syringique, acide caféique) et des acides aminés et des protéines tels que le tryptophane, la glycine, la cystéine et la mélanine. Il se présente sous la forme d'un liquide ambré à brun foncé ayant les caractéristiques suivantes :

- taux de matières sèches : 1,0 à 4,0 % en masse ;

- pH (direct) : 3,4 à 4,0 ;

- indice de réfraction : 0,950 à 1,050.

- polysaccharides : 0,5 à 5 g/L ;

- polyphénols (dont catéchine) : 0,30 à 0,60 g/L.

Le complexe végétal conforme à l'invention peut par exemple se présenter sous la forme d'un kit à plusieurs compartiments dans lequel un premier compartiment contient ladite sève de bouleau et un deuxième compartiment contient ledit extrait aqueux de chaga.

La quantité de sève de bouleau à utiliser selon l'invention peut varier par exemple de 0,1 à 50 % en masse, et de préférence de 1 à 5 % en masse par rapport à la masse totale de la composition cosmétique.

La quantité d'extrait aqueux de chaga à utiliser selon l'invention peut varier par exemple de 0,1 à 15 % en masse, et de préférence de 0,1 à 2 % en masse par rapport à la masse totale de la composition cosmétique.

Selon une forme de réalisation préférée de l'invention, la composition cosmétique comprend de 2,5 à 5 % en masse de sève de bouleau et de 0,5 à 2 % en masse d'extrait aqueux de chaga, et encore plus préférentiellement 5 % en masse de sève de bouleau et 2 % en masse d'extrait aqueux de chaga, par rapport à la masse totale de la composition cosmétique.

Au sens de la présente invention, on entend par « support cosmétiquement acceptable », les supports et excipients habituellement utilisés dans les compositions cosmétiques et/ou dermatologiques et qui sont compatibles avec la peau et/ou ses phanères, qui présentent une couleur, une odeur et un toucher agréables et qui ne génèrent pas d’inconforts inacceptables (picotements, tiraillements, rougeurs pour les utilisatrices et utilisateurs de ces compositions). A titre d'exemple, de tels supports comprennent généralement de l'eau, un mélange d'eau et d'un ou plusieurs solvants organiques, ou un solvant ou un mélange de solvants organiques cosmétiquement et/ou dermatologiquement acceptables.

Suivant une forme avantageuse de réalisation, la composition cométique conforme à la présente invention peut contenir, outre le complexe végétal décrit ci-dessus, c'est-à-dire outre la sève de bouleau et l'extrait aqueux de chaga, un ou plusieurs actifs supplémentaires renforçant ou complétant avantageusement leur activité, et compatibles, c'est-à-dire non susceptibles de réagir les uns avec les autres ou de masquer ou limiter leurs effets. De tels ingrédients actifs peuvent par exemple être choisis parmi tout type de composés habituellement utilisés dans les compositions cosmétiques et tels que des émollients, des agents hydratants des couches supérieures de l'épiderme, des correcteurs de teint, des vitamines, des agents kératolytiques, des alpha-hydroxyacides, des agents stimulants de la circulation tels que par exemple des extraits de marron d'inde, de vigne rouge, de cyprès, etc...

La composition cosmétique conforme à la présente invention peut se présenter sous les formes galéniques classiquement utilisées pour une application par voie topique, notamment sous forme de gel, d'émulsion (en particulier crème ou lait), d'émulsion biphasique huile-dans-eau ou eau-danshuile, de masque, de pommade, lesdites formes galéniques contenant en outre des excipients et supports usuels et acceptables sur le plan cosmétologique. La composition cosmétique conforme à l'invention est de préférence utilisée sous forme de crème, de sérum, de lotion ou de gel.

Ces formes d'application par voie topique sont préparées par les techniques usuelles, et par exemple, dans le cas d'une crème, par dispersion d'une phase grasse dans une phase aqueuse pour obtenir une émulsion huile-dans-eau, ou inversement pour préparer une émulsion eau-danshuile dans les cas de crèmes.

La composition cosmétique conforme à l'invention peut en outre renfermer un ou plusieurs excipients acceptables sur le plan cosmétologique. Ces excipients appropriés pour la formulation sont bien connus de l'homme du métier et comprennent en particulier les agents de pénétration tels que le phytantriol, l'octyl dodécanol et l'escine ; les épaississants tels que les gommes naturelles et les polymères de synthèse ; les tensioactifs ; les émulsionnants tels que des dérivés de polyglycérol ; les conservateurs tels que le phénoxyéthanol et l'acide déhydroacétique ; les colorants ; les parfums ; etc...

On peut également ajouter à la composition cosmétique des agents de protection contre les rayons ultraviolets, et par exemple des filtres solaires UV-A et UV-B hydrophiles ou lipophiles, ou des pigments formant écran antiultraviolet.

L'utilisation non thérapeutique de la composition cosmétique conforme à l'invention comprend tous les soins du corps et de la peau y compris les produits solaires, protecteurs et bronzants, les produits anti-âges, antiséborrhéiques, toniques, les produits assurant l'amélioration de l'aspect de la peau y compris le traitement acnéique et les rougeurs cutanées, les agents dépigmentants et/ou de blanchiment de la peau, etc..

La composition cosmétique conforme à la présente invention est parfaitement tolérée par la peau, elle ne présente aucune phototoxicité et son utilisation sur des périodes, même prolongées, ne génère aucun effet systémique.

De préférence, le procédé de traitement cosmétique non thérapeutique pour prévenir et/ou traiter les signes du vieillissement cutané comprend une à deux applications par jour de la composition cosmétique conforme à l'invention sur les zones à traiter, principalement sur le visage et le cou.

Les exemples suivants illustrent l'invention sans pour autant en limiter la portée.

EXEMPLES

EXEMPLE 1 : Préparation d’une crème de jour comprenant de la sève de bouleau et un extrait aqueux de chaga

Par les techniques usuelles, on a préparé une crème de jour pour le soin des peaux normales à mixtes ayant la composition massique indiquée ciaprès (quantités indiquées en % en masse) :

- Polyacrylate Crosspolymer vendu sous la dénomination commerciale SEPIMAX ZEN ® par la société SEPPIC0,90

- Chlorphenesin vendu sous la dénomination commerciale

ELESTAB CPN ® par la société AMI0,27

- Sorbate de potassium vendu sous la dénomination commerciale SORBATE DE POTASSIUM GRANULAR ® par la société UNIVAR0,20

- EDTA disodique vendu sous la dénomination commerciale

DISSOLVINE NA2P par la société BRENNTAG0,10

- Mélange de polygluceryl-6-distearate, d'esters de jojoba de polyglyceryl-3 Beeswax et d'alcool cétylique vendu sous la dénomination commerciale EMULIUM MELLIFERA ® par la société GATTEFOSSE3,50

- Triglycéride caprylique/caprique vendu sous la dénomination commerciale MYRITOL ® 318 par la société BASF/AMI3,00

- Alcool cétylique vendu sous la dénomination commerciale

LANETTE 16 ® par la société BASF/AMI0,50

- Squalane vendu sous la dénomination commerciale

PHYTOSQUALAN par la société SOPHIM1,50

- Alcool béhénylique vendu sous la dénomination commerciale

LANETTE 22 ® par la société BASF/AMI0,20

- Triglycérides en Ci₀-Ci₈ vendus sous la dénomination commerciale LIPOCIRE A SG ® par la société GATTEFOSSE 2,00

- Insaponifiables d'éthylhexyl olivate hydrogéné et d'huile d'olive hydrogénée vendus sous la dénomination commerciale

SOFT OLIVE ® par la société SOLIANCE 3,00

- Stearoyl glutamate de sodium/chlrorure de sodium vendu ίο sous la dénomination commerciale EUMULGIN SG ® par la société BASF/AMI0,80

- Huile de graines de Corylus avellana vendue sous la dénomination commerciale HV-REFINED HAZELNUT OIL ® par la société SOPHIM1,00

- Huile hybride de tocophérol et d’Helianthus annuus vendu sous la dénomination commerciale BIOXAN SF T50 ® par la société QUIMASSO0,50

- Pentylène glycol vendu sous la dénomination commerciale

HYDROLITE 5 ® par la société SAFIC-ALCAN1,00

- Glycérine vendue par la société UNIVAR3,00

- Extrait aqueux de chaga vendu sous la dénomination commerciale INONOTUS OBLIQUUS CRYOEXTRACT

CONCENTRATE AQUEUX SB ® par la société GREENTECH 0,50

- Sève de bouleau vendue sous la dénomination commerciale

BOULEAU SEVE BIO SB ® par la société GREENTECH2,50

- Parfum0,10

- Acide citrique monohydraté (AMI)0,20

- Eau déminéralisée qsp 100,00

Cette crème de jour peut être utilisée une à deux fois par jour par application sur les zones de la peau à traiter. Elle permet de lutter contre les effets du vieillissement cutané.

EXEMPLE 2 : Préparation d’un sérum aqueux visage comprenant de la sève de bouleau et un extrait aqueux de chaga

Par les techniques usuelles, on a préparé un sérum aqueux pour les soins du visage ayant la composition massique indiquée ci-après (quantités indiquées en % en masse).

- Mélange de gomme Sclerotium, de lysolécithine, de Pullulan de gomme de xanthane et de silice vendu sous la dénomination commerciale ECOGEL ® par la société UNIPEX 1,30

- EDTA disodique vendu sous la dénomination commerciale

DISSOLVINE NA2P par la société BRENNTAG0,10

- Butylène glycol-1,3 vendu par la société UNIVAR2,00

- Sorbate de potassium vendu sous la dénomination commerciale SORBATE DE POTASSIUM GRANULAR ® par la société UNIVAR0,25

- Chlorphenesin vendu sous la dénomination commerciale

ELESTAB CPN ® par la société AMI0,27

- Mélange aqueux d'acide lévulinique, de glycérine et de lévulinate de sodium vendu sous la dénomination commerciale

DERMOSOFT 700 B ® par la société UNIPEX0,50

- Sève de bouleau vendue sous la dénomination commerciale

BOULEAU SEVE BIO SB ® par la société GREENTECH5,00

- Extrait aqueux de chaga vendu sous la dénomination commerciale INONOTUS OBLIQUUS CRYOEXTRACT

CONCENTRATE AQUEUX SB ® par la société GREENTECH 1,00

- Polysorbate 20 vendu sous la dénomination commerciale

MONTANOX 20 DF ® par la société SEPPIC 0,40

- Parfum 0,10

- Eau déminéralisée qsp 100,00

Ce sérum peut être utilisé une à deux fois par jour par application sur les zones de la peau à traiter. Il permet de lutter contre les effets du vieillissement cutané.

EXEMPLE 3 : Préparation d’un sérum aqueux émulsionné pour le visage comprenant de la sève de bouleau et un extrait aqueux de chaga

Par les techniques usuelles, on a préparé un sérum aqueux émulsionné pour les soins du visage ayant la composition massique indiquée ci-après (quantités indiquées en % en masse).

- Butylène glycol-1,3 vendu par la société UNIVAR2,00

- Acrylates/C10-C30 alkyl acrylate crosspolymère vendu sous la dénomination commerciale PEMULEN TR2 ® par la société GATTEFOSSE0,27

- Méthylpropanediol vendu sous la dénomination commerciale

DUB DIO ® par la société STEARINE DUBOIS1,00

- Gomme de xanthane vendue sous la dénomination commerciale RHODICARE T par la société SACI-CFPA0,05

- Chlorphenesin vendu sous la dénomination commerciale

ELESTAB CPN ® par la société AMI0,27

- Sorbate de potassium vendu sous la dénomination commerciale SORBATE DE POTASSIUM GRANULAR ® par la société UNIVAR0,20

- EDTA disodique vendu sous la dénomination commerciale

DISSOLVINE NA2P par la société BRENNTAG0,10

- Mélange de carbonate dicaprylyl et de tocophérol vendu sous la dénomination commerciale CETIOL CC ® par la société BASF/AMI1,00

- Squalane vendu sous la dénomination commerciale

PHYTOSQUALAN par la société SOPHIM6,00

- Ceteareth-20 vendu sous la dénomination commerciale

EUMULGIN B2 ® par la société BASF/AMI1,00

- Stéarate de glycéryl vendu sous la dénomination commerciale CUTINA GMS SE par la société BASF/AMI0,60

- Huile hybride de tocophérol et d’Hélianthus annuus vendu sous la dénomination commerciale BIOXAN SF T50 ® par la société QUIMASSO0,50

- Extrait aqueux de chaga vendu sous la dénomination commerciale INONOTUS OBLIQUUS CRYOEXTRACT CONCENTRATE AQUEUX SB ® par la société GREENTECH 1,00

- Sève de bouleau vendue sous la dénomination commerciale

BOULEAU SEVE BIO SB ® par la société GREENTECH5,00

- Parfum0,10

- Hydroxyde de sodium (Merck)0,092

- Eau déminéralisée qsp 100,00

Ce sérum émulsionné peut être utilisé une à deux fois par jour par application sur les zones de la peau à traiter. Il permet de lutter contre les effets du vieillissement cutané.

EXEMPLE 4 : Vérification de l’absence cytotoxicité et étude de l’effet du complexe végétal sur l’ADN mitochondrial

La cytotoxicité du complexe végétal suivant l'invention, ainsi que son effet sur l'ADN mitochondrial ont été étudiés vis-à-vis de kératinocytes humains en culture.

4.1 Culture des kératinocytes

Des cultures de kératinocytes ont été établies à partir de prépuce néonatal d'un sujet mâle âgé de 2 ans, d'origine caucasienne, prélevé sous acte chirurgical. L'étude a été réalisée sur des cellules cultivées en plaque 6 puits à raison de 2.10⁶ cellules par puits dans du milieu de culture pour kératinocytes supplémenté en extrait de glandes pituitaires bovines (0,4% V/V), EGF recombinant humain (0,125 ng/ml), insuline (5 pg/ml), hydrocortisone (0,33 pg/ml), transférine humaine (10 pg/ml), épinéphrine (0,39 pg/ml) et chlorure de calcium (0,15 mM).

4.2 Etude de la cytotoxicité

Quatre lots ont été constitués :

Lot n° 1 : témoin ne recevant aucun produit.

Lot n° 2 : traité par le Complexe végétal 1

Lot n° 3 : traité par le Complexe végétal 2

Lot n° 4 : par le Complexe végétal 3

Complexe 1 : sève de bouleau : 2,5 % en masse / Extrait aqueux de chaga : 0,5 % en masse

Complexe 2 : sève de bouleau : 5 % en masse / Extrait aqueux de chaga : 1 % en masse

Complexe 3 : sève de bouleau : 5 % en masse / Extrait aqueux de chaga : 2 % en masse

Chaque lot a été maintenu au contact des kératinocytes humains en culture pendant 24 heures. Chaque lot a été testé en triplicate.

La viabilité cellulaire est déterminée par le test de réduction au bleu de Formazan (test MTT) après 24 heures d'incubation avec les kératinocytes.

Après incubation des cellules avec chacun des lots de produit à l'étude, les puits contenant les cellules sont vidés par retournement doux et le tapis cellulaire est rincé avec le milieu de culture. On distribue dans tous les puits 200 pl d'une solution de MTT (bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5diphényltétrazolium) diluée au moment de l'emploi (5 mg/ml), puis les plaques sont incubées à 37°C pendant 3 heures.

Il y a alors formation de cristaux bleu de Formazan, en quantité inversement proportionnelle à l'atteinte des succinates déshydrogénases.

Les puits sont à nouveau vidés par retournement doux et les cellules sont ensuite lysées et les cristaux de bleu de Formazan sont dissous par addition de 200 pl de diméthylsulfoxyde (DMSO). Après homogénéisation de la coloration par agitation, la densité optique (DO) des plaques est lue, au moyen d'un spectrophotomètre à 570 nm, ce qui permet de connaître la quantité relative de cellules vivantes et actives métaboliquement.

Les valeurs de la densité optique (DO) après 24 heures de contact sont regroupées dans le tableau 1 ci-dessous.

TABLEAU 1

LOTS	Densité optique DO 570 nm	%
Lot n°l (témoin)	0,752 ± 0,07	-
Lot n°2 (complexe 1)	0,810 ± 0,04	ns
Lot n°3 (complexe 2)	0,790 ± 0,08	ns
Lot n°4 (complexe 3)	0,778 ± 0,09	ns

n.s. : non significatif par rapport au témoin

Ces résultats montrent que le complexe végétal utilisé dans l'invention ne présente aucune cytotoxicité vis-à-vis des kératinocytes humains en culture aux concentrations étudiées.

4.4 Etude de l'effet du complexe végétal sur l'ADN mitochondrial

Trois types d'effets ont été étudiés :

aj_. Etude, de. J/effet..du..çompJexe. .yégétaJ..sur..l.'ADN.. mitochondrial, dans les conditions.physjologi.q.ues

Quatre lots ont été constitués :

Lot n° 1 : témoin ne recevant aucun produit.

Lot n° 2 : traité par le Complexe végétal 1

Lot n° 3 : traité par le Complexe végétal 2

Lot n° 4 : par le Complexe végétal 3

L'essai a été conduit en triplicate pendant 24 heures. Les cellules ont été traitées par les complexes 1, 2 ou 3. Elles ont été récupérées après 24 heures d'incubation avant l'extraction de l'ADN.

L'ADN total a été extrait à l'aide d'un kit d'extraction Invisorb® Spin DNA Extraction Kit (Eurobio, Les Ulis, France).

Brièvement, les cellules ont été lysées à l'aide d'un tampon de lyse et les acides nucléiques ont été précipités en présence d'éthanol à 70%. Après précipitation, l'ADN total a été fixé directement sur la membrane d'une colonne dédiée à l'extraction des ADN. Après lavage de cette membrane, l'ADN a été élué à l'aide d'un tampon en faible teneur en sel.

L'ADN a ensuite été amplifié à l'aide d'un kit REPLI-g Mitochondrial DNA (Qiagen, Courtaboeuf, France) contenant de la DNA polymérase, ainsi que les tampons et les réactifs nécessaires pour l'amplification du génome mitochondrial humain à partir du génome entier avec un rendement approximatif de 3 à 5 pg d'ADN mitochondrial amplifié par réaction (correspondant approximativement à 2 X 10⁹ copies de génomes mitochondriaux par microlitre).

Brièvement, l'ADN total a été dénaturé à 75 °C pendant 5 minutes par un tampon spécifique. Après arrêt de la dénaturation par refroidissement de la solution à température ambiante, la DNA polymérase a été ajoutée. L'amplification isothermique a lieu pendant 8 heures à 33°C, puis l'ADN mitochondrial a été congelé à -20°C.

La quantification des éventuels dommages causés à l'ADN mitochondrial a ensuite été déterminée de la façon suivante. Les sites Apuriniques/apyrimidiniques (AP) sont une des lésions principales de l'ADN formées durant l'excision et la réparation des bases oxydées, désaminées, ou alkylées. On estime qu'environ 2xl0⁵ lésions de base sont générées par cellules et par jour. Le niveau des sites AP dans les cellules peut être un bon indicateur des lésions de l'ADN et du taux de réparation contre les dommages chimiques ou causés par l'âge des cellules. Le DNA Damage quantification Kit (Biovision, Mountain View, USA) utilise les réactifs ARP (« Aldéhyde Reactive Probe ») qui réagissent spécifiquement avec les groupements aldéhydes qui se trouvent dans les fenêtres ouvertes formées par les sites AP. Après traitement de l'ADN contenant les sites AP avec les réactifs ARP, les sites AP sont marqués avec des résidus biotines, qui peuvent être quantifiés en utilisant des réactions avidine-biotine suivies par une détection colorimétrique.

Brièvement, 0,5 pg d'ADN mitochondrial ont été incubés avec les réactifs ARP pendant lh à 37°C pour marquer les sites AP de l'ADN. Ce dernier a été ensuite précipité par l'éthanol pur puis centrifugé et lavé 3 fois par l'éthanol 70%. Le culot d'ADN a été séché à l'air libre puis repris dans 1 ml de tampon TE. L'ADN marqué a été coaté sur une plaque 96 puits (parallèlement à une gamme standart d'ADN-ARP) sur la nuit. Le lendemain, après 5 lavages, une solution HRP-streptavidine a été ajoutée dans les puits pendant lh à température ambiante. Après 5 lavages, le développement de la couleur a été révélé par un tampon spécifique pendant lh à 37°C, puis stoppé par de l'acide sulfurique 2N. La densité optique a été lue sur un spectrophotomètre à 450 nm.

Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 2 ci-dessous.

TABLEAU 2

LOTS	Nombres de site AP/105 paires de bases	%
Lot n°l (témoin)	0,78 ± 0,05	-
Lot n°2 (complexe 1)	0,75 ± 0,08	ns
Lot n°3 (complexe 2)	0,73 ± 0,06	ns
Lot n°4 (complexe 3)	0,71 ± 0,07	ns

n.s. : non significatif par rapport au témoin

Ces résultats montrent que le complexe végétal utilisé dans l'invention n'a induit aucune lésion de l'ADN mitochondrial dans les conditions physiologiques.

b).... Etude... de... J/effet..^rotecteur...du...çompJexe...végétal...sur...l.'ADN rn ! tochondria.l. dans. .les. çon d i tion s. d.'.i.nd u et ig ns. pa r .les. UVB

Cinq lots ont été constitués :

Lot n° 1 : témoin négatif ne recevant aucun produit.

Lot n° 2 : témoin positif (UVB 100 mJ/cm²)

Lot n° 3 : traité par le Complexe végétal 1 + (UVB 100 mJ/cm²)

Lot n° 4 : traité par le Complexe végétal 2 + (UVB 100 mJ/cm²)

Lot 5 : par le Complexe végétal 3 + (UVB 100 mJ/cm²)

L'essai a été conduit en triplicate pendant 24 heures. Les cellules ont été traitées par les complexes 1, 2 ou 3 pendant 2h30 puis irradiées aux UVB. Les cellules ont été récupérées après 24 heures d'incubation.

L'effet protecteur du complexe végétal conforme à l'invention aux concentrations testées vis-à-vis du rayonnement UVB a ensuite été évalué par la détermination du nombre de site AP/10⁵ paires de base selon le même protocole que celui détaillé ci-dessus au point 4.4 a).

Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 3 ci-dessous.

TABLEAU 3

LOTS	Nombres de site AP/105 paires de bases	%
Lot n°l (témoin négatif)	0,78 ± 0,05	-
Lot n°2 (témoin positif UVB)	1,45 ± 0,11 *	+86
Lot n°3 (complexe 1 + UVB)	1,06 ± 0,13 **	-27
Lot n°4 (complexe 2 + UVB)	0,97 ± 0,09 **	-33
Lot n° 5 (complexe 3 + UVB)	0,85 ± 0,15 **	-41

n.s. : non significatif par rapport au témoin * ; significativement différent par rapport au témoin négatif (p<0,05) : significativement différent par rapport au témoin positif (p<0,05)

Les résultats obtenus montrent que le nombre de sites AP est stimulé en réaction aux rayons ultraviolets B (+86%) en comparaison au témoin négatif. Le traitement des kératinocytes par le complexe végétal conforme à l'invention aux concentrations étudiées a réduit significativement les lésions de l'ADN mitochondrial respectivement de 27%, 33% et 41% par rapport au témoin positif.

çl..Et.ude...de....L'effet...réparateur....d.u....ço.mpJ.exe....yégétal....su.r....l.'AD.N rn ! toçh ο ndri al. dans. .les. çon.d i tion s. d.'.i.n d uct i.o ns. pa r .les. U V B

Cinq lots ont été constitués :

Lot n° 1 : témoin négatif ne recevant aucun produit.

Lot n° 2 : témoin positif (UVB 100 mJ/cm²)

Lot n° 3 : Exposition aux UVB (100 mJ/cm²) puis traité par le Complexe végétal 1

Lot n° 4 : Exposition aux UVB (100 mJ/cm²) puis traité par le Complexe végétal 2

Lot 5 : Exposition aux UVB (100 mJ/cm²) puis traité par le Complexe végétal 3

L'essai a été conduit en triplicate pendant 24 heures. Les cellules ont été irradiées par les UVB puis incubées pendant 3 heures. Le complexe végétal conforme à l'invention aux concentrations testées a ensuite été ajouté aux cultures cellulaires irradiées. Les cellules ont été récupérées après 24 heures d'incubation.

L'effet réparateur du complexe végétal conforme à l'invention aux concentrations testées vis-à-vis du rayonnement UVB a ensuite été évalué par la détermination du nombre de site AP/10⁵ paires de base selon le même protocole que celui détaillé ci-dessus au point 4.4 a).

Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 4 ci-dessous.

TABLEAU 4

LOTS	Nombres de site AP/105 paires de bases	%
Lot n°l (témoin négatif)	0,78 ± 0,05	-
Lot n°2 (témoin positif UVB)	1,45 ± 0,11*	+86
Lot n°3 (UVB + complexe 1)	1,18 ± 0,07**	-19
Lot n°4 (UVB + complexe 2)	1,13 ± 0,14**	-22
Lot n° 5 (UVB + complexe 3)	1,06 ± 0,10*	-41

n.s. : non significatif par rapport au témoin * ; significativement différent par rapport au témoin négatif (p<0,05) : significativement différent par rapport au témoin positif (p<0,05)

Les résultats obtenus montrent que le nombre de sites AP est stimulé en réaction aux rayons ultraviolets B (+86%) en comparaison au témoin négatif. Le traitement des kératinocytes par complexe végétal conforme à l'invention aux concentrations étudiées après exposition aux UVB a réduit significativement les lésions de l'ADN mitochondrial respectivement de 19%, 22% et 27%.

EXEMPLE 5 : Etude des propriétés antiradicalaires du complexe végétal selon l’invention à différentes concentrations

DEROULEMENT DE L'ETUDE

5.1. Système cellulaire .5 _: .1,1. kéra t in oçyte s. .humains.. en. .cul tu re

Les kératinocytes ont été isolés à partir de prépuce néonatal d'un sujet mâle âgé de 2 ans et d'origine caucasienne, sous acte chirurgical. La viabilité cellulaire a été estimée à 96% approximativement. Le temps de doublement de la population cellulaire est de 28 heures.

.5_:.1,2.-..Mise en..culture

Les kératinocytes ont été cultivés dans des boîtes de 25 cm² puis de 75 cm² jusqu'à l'obtention du nombre de cellules nécessaires à l'étude. L'étude a été réalisée sur des cellules cultivées en plaque 6 puits à raison de 2.10⁶ cellules par puits dans du milieu de culture pour kératinocytes supplémenté en extrait de glandes pituitaires bovines (0,4% V/V), EGF recombinant humain (0,125 ng/ml), insuline (5 pg/ml), hydrocortisone (0,33 pg/ml), transférine humaine (10 pg/ml), épinéphrine (0,39 pg/ml) et chlorure de calcium (0,15 mM).

5.2. Constitution des lots

L'essai a été conduit en triplicate après contact des produits avec les cellules en culture.

- Lot 1 : témoins ne recevant aucun produit.

- Lot 2 : traité par le complexe 1, tel que préparé à l'exemple4

- Lot 3 : traité par le complexe 2, tel que préparé à l'exemple4

- Lot 4 : traité par le complexe 3, tel que préparé à l'exemple4

- Lot 5 : témoin positif irradié aux UVA (5J/cm²) et aux UVB (100mJ/cm²)

- Lot 6 : traité par le complexe 1 + [UVA (5J/cm²) + UVB 100mJ/cm²]

- Lot 7 : traité par le complexe 2 + [UVA (5J/cm²) + UVB 100mJ/cm²]

- Lot 8 : traité par complexe 3 + [UVA (5J/cm²) + UVB 100mJ/cm²]

5.3. Dosage des ROS mitochondriales

Selon une cinétique de 0 min, 30 min et 3 h après irradiation aux UV, les cellules sont détachées des puits de culture par un traitement à la trypsine-EDTA, lavées puis incubées avec une sonde fluorescente spécifique des ROS mitochondriales (MitoSOX ® Red) pendant 15 minutes, à 37°C et dans l'obscurité. Immédiatement après cette incubation, les cellules sont lavées 2 fois avec du tampon PBS puis analysées par cytométrie en flux. lxlO⁴ cellules sont collectées et analysées par test.

Le réactif MitoSOX ® Red est un colorant fluorogénique, qui cible particulièrement les mitochondries dans les cellules vivantes. L'oxydation du réactif MitoSOX ® Red par l'anion superoxyde produit une fluorescence rouge. Le réactif MitoSOX ® Red pénètre dans les cellules vivantes ou il cible les mitochondries de manière sélective. Il est oxydé rapidement par l'anion superoxyde et non par d'autres dérivés réactifs de l'oxygène et dérivés réactifs d'azote. Le produit oxydé est extrêmement fluorescent en cas de liaison avec l'acide nucléique et est détecté par cytométrie en flux.

5.4. Dosage des ROS cytoplasmiques

Parallèlement à l'incubation avec le réactif MitoSOX ® Red, les cellules sont également incubées avec une sonde spécifique des ROS cytoplasmiques (CM-H₂DCFDA) pendant 15 minutes, à 37°C et dans l'obscurité. Comme précédemment, après cette incubation, les cellules sont lavées 2 fois avec un tampon PBS puis analysées par cytométrie en flux. 1 X 104 cellules sont collectées et analysées par test.

Le CM-H₂DCFDA est un dérivé de chlorométhyle de H₂DCFDA (2’,7’dichlorodihydrofluorescéine diacétate). Il permet d'indiquer les dérivés réactifs de l'oxygène (DRO) dans les cellules. Cet indicateur présente une rétention bien meilleure dans les cellules vivantes que le H₂DCFDA. Le CMH₂DCFDA se diffuse passivement dans les cellules, où ses groupes acétates sont catalysés par des estérases intracellulaires et son groupe chlorométhyle réactif aux thiols réagit avec le glutathion intracellulaire et avec d'autres thiols. L'oxydation qui en résulte produit un adduit fluorescent, qui est piégé à l'intérieur de la cellule, ce qui facilite les études à long terme. Le CMH₂DCFDA permet de doser les ROS cytoplasmiques par cytométrie en flux.

5.5. Dosage des ROS totales

Parallèlement à l'incubation avec les réactifs MitoSOX ® Red et CMH₂DCFDA, les cellules sont également incubées avec une sonde spécifique des ROS totales (CelIROX® Deep Red) pendant 15 minutes, à 37°C et dans l'obscurité. Comme précédemment, après cette incubation, les cellules sont lavées 2 fois avec un tampon PBS puis analysées par cytométrie en flux. lxlO⁴ cellules sont collectées et analysées par test.

Le réactif CelIROX ® Deep Red est un colorant cellulaire perméant, dont les valeurs maximales d'absorption/émission s'élèvent à environ 644/665 nm. Le réactif CelIROX ® Deep Red n'est pas fluorescent à l'état réduit. Il devient fluorescent en cas d'oxydation par les dérivés réactifs de l'oxygène avec des valeurs maximales d'émission d'environ 665 nm mesurables par cytométrie en flux. Le réactif CelIROX ® Deep Red permet de doser les ROS totales intracellulaires.

5.6. Dosage des activités SOD et catalase

Les cellules sont traitées par ultrasons dans 0,1 M de Tris-CI (pH 7,5) pendant deux salves de 30s. Après 10 min de centrifugation à 12000g, les aliquotes du surnageant obtenus sont stockés à -80°C.

La concentration totale en protéine est mesurée par le réactif du kit BCA (Pierce-ThermoFisher Scientific). L'activité SOD est analysée en utilisant un kit de dosage SOD-WST (Dojindo Molecular Technologies). L'activité catalase est mesurée par un kit Amplex Red Assay Kit catalase (Molecular Probes). Des courbes d’étalonnage pour les activités enzymatiques de la SOD et de la catalase sont établies en utilisant des préparations d’enzymes purifiées. Les activités spécifiques des enzymes sont exprimées en unités/mg de protéine. Une unité d’activité de la catalase est définie comme 1 pmole de H₂O₂ consommée par minute. Une unité d’activité de la SOD est définie comme la quantité d’enzyme qui inhibe 50% de la WST-1 Formazan par minute.

5.7 Analyse statistique

L’analyse statistique est réalisée par un test de Wilcoxon Rank-Sum Test avec (p<0,05).

RESULTATS

Les résultats du dosage des ROS totales dans les conditions physiologiques sont rassemblés dans le tableau 5 ci-après :

TABLEAU 5

LOTS	Intensité moyenne de fluorescence émise par les ROS totales
T= 0	T = 30 min	T = 3 heures
Lot 1 Témoin négatif	1035 ± 25	1052 ± 58	1011 ± 75
Lot 2 Complexe 1	1014 ± 67 ns	998 ± 40 ns	1005 ± 66 ns
Lot 3 Complexe 2	1023 ± 70 ns	1046 ± 38 ns	1020 ± 45 ns
Lot 4 Complexe 3	1011 ± 69 ns	1059 ± 51 ns	1025 ± 43 ns

n.s. : non significatif par rapport au témoin

Ces résultats montrent que le complexe végétal conforme à l'invention, aux concentrations testées, n'entraine aucune augmentation des ROS totales dans les conditions physiologiques. Les complexes 1, 2 et 3 ne présentent donc aucune activité pro-radicalaire.

Les résultats du dosage des ROS totales dans les conditions d'induction par les UVA et les UVB sont présentés dans le tableau 6 ci-après :

TABLEAU 6

LOTS	Intensité moyenne de fluorescence émise par les ROS totales
T= 0	T = 30 min	T = 3 heures
Lot 1 Témoin négatif	1035 ± 25	1052 ± 58	1011 ± 75
Lot 5 Témoin positif	1085 ± 37	1369 ± 49* (+30%)	1476 ± 41 (+46%)
Lot 6 Complexe 1 + UVA et UVB	1011 ± 24 ns	1128 ± 60 “ (-18 %)	1230 ± 33 ” (-17 %)
Lot 7 Complexe 2+ UVA et UVB	1031 ± 42 ns	1086 ± 27 “ (-21 %)	1188 ± 50 ” (-20 %)
Lot 8 Complexe 3+ UVA et UVB	985 ± 38 ns	974 ± 44 “ (-29 %)	923 ± 62 “ (-37 %)

n.s. : non significatif par rapport au témoin * ; significativement différent par rapport au témoin négatif (p<0,05) : significativement différent par rapport au témoin positif (p<0,05)

Dans les conditions d'induction par les rayons ultraviolets A et B, l'irradiation des kératinocytes humains en culture entraine une augmentation des ROS totales. Ce résultat est très net après 30 min et 3h d'incubation. Le 10 traitement préalable des kératinocytes par le complexe avant l'irradiation aux rayons ultraviolets A et B entraine une nette diminution des ROS totales. Le complexe 3 entraine une diminution des ROS totales supérieure à celle des complexes 1 et 2.

Les résultats du dosage des ROS cytoplasmiques dans les conditions 15 physiologiques sont rassemblés dans le tableau 7 ci-après :

TABLEAU 7

LOTS	Intensité moyenne de fluorescence émise par les ROS cytoplasmiques
T= 0	T = 30 min	T = 3 heures
Lot 1 Témoin négatif	821 ± 32	841 ± 56	802 ± 49
Lot 2 Complexe 1	805 ± 28 ns	883 ± 50 ns	801 ± 35 ns
Lot 3 Complexe 2	811 ± 47 ns	836 ± 34 ns	811 ± 24 ns
Lot 4 Complexe 3	802 ± 39 ns	859 ± 68 ns	815 ± 50 ns

n.s. : non significatif par rapport au témoin

Ces résultats montrent que le complexe végétal conforme à l'invention, aux concentrations testées, n'entraine aucune augmentation des ROS 5 cytoplasmiques dans les conditions physiologiques. Les complexes 1, 2 et 3 ne présentent donc aucune activité pro-radicalaire.

Les résultats du dosage des ROS cytoplasmiques dans les conditions d'induction par les UVA et les UVB sont présentés dans le tableau 8 ci-après :

TABLEAU 8

LOTS	Intensité moyenne de fluorescence émise par les ROS cytoplasmigues
T= 0	T = 30 min	T = 3 heures
Lot 1 Témoin négatif	821 ± 32	841 ± 56	802 ± 49
Lot 5 Témoin positif	885 ± 60	1158 ± 38* (+38%)	1260 ± 68 (+57%)
Lot 6 Complexe 1 + UVA et UVB	802 ± 58 ns	916 ± 41 ” (-21 %)	1017 ± 52 ” (-19 %)
Lot 7 Complexe 2+ UVA et UVB	821 ± 67 ns	874 ± 30 ” (-24 %)	975 ± 40 “ (-23 %)
Lot 8 Complexe 3+ UVA et UVB	780 ± 44 ns	760 ± 27 ” (-34 %)	718 ± 37 “ (-43 %)

n.s. : non significatif par rapport au témoin * ; significativement différent par rapport au témoin négatif (p<0,05) : significativement différent par rapport au témoin positif (p<0,05)

Dans les conditions d'induction par les rayons ultraviolets A et B, l'irradiation des kératinocytes humains en culture entraine une augmentation 15 des ROS cytoplasmiques. Ce résultat est très net après 30 min et 3h d'incubation. Le traitement préalable des kératinocytes par le complexe avant l'irradiation aux rayons ultraviolets A et B entraine une nette diminution des

ROS cytoplasmiques. Le complexe 3 entraîne une diminution des ROS totales supérieure à celle des complexes 1 et 2.

Les résultats du dosage des ROS mitochondriales dans les conditions physiologiques sont rassemblés dans le tableau 9 ci-après :

TABLEAU 9

LOTS	Intensité moyenne de fluorescence émise par les ROS mitochondriales
T= 0	T = 30 min	T = 3 heures
Lot 1 Témoin négatif	1372 ± 82	1345 ± 101	1324 ± 91
Lot 2 Complexe 1	1326 ± 65 ns	1271 ± 95 ns	1313 ± 84 ns
Lot 3 Complexe 2	1334 ± 73 ns	1325 ± 66 ns	1357 ± 80 ns
Lot 4 Complexe 3	1331 ± 58 ns	1354 ± 74 ns	1358 ± 69 ns

n.s. : non significatif par rapport au témoin

Ces résultats montrent que le complexe végétal conforme à l'invention, aux concentrations testées, n'entraine aucune augmentation des ROS mitochondriales dans les conditions physiologiques. Les complexes 1, 2 et 3 10 ne présentent donc aucune activité pro-radicalaire.

Les résultats du dosage des ROS mitochondriales dans les conditions d'induction par les UVA et les UVB sont présentés dans le tableau 10 ciaprès :

TABLEAU 1 0

LOTS	Intensité moyenne de fluorescence émise par les ROS mitochondriales
T= 0	T = 30 min	T = 3 heures
Lot 1 Témoin négatif	1372 ± 82	1345 ± 101	1324 ± 91
Lot 5 Témoin positif	1445 ± 112	1712 ± 100* (+38%)	1812 ± 114 (+77%)
Lot 6 Complexe 1 + UVA et UVB	1435 ± 95 ns	1590 ± 60 ns	1601 ± 54 ” (-12 %)
Lot 7 Complexe 2+ UVA et UVB	1426 ± 78 ns	1432 ± 113 ” (-16 %)	1549 ± 89 ” (-15 %)
Lot 8 Complexe 3+ UVA et UVB	1353 ± 84 ns	1344 ± 90 “ (-21 %)	1302 ± 70 ” (-28 %)

n.s. : non significatif par rapport au témoin * ; significativement différent par rapport au témoin négatif (p<0,05) : significativement différent par rapport au témoin positif (p<0,05)

Dans les conditions d'induction par les rayons ultraviolets A et B, l'irradiation des kératinocytes humains en culture entraîne une augmentation des ROS mitochondriales. Ce résultat est très net après 30 min et 3h d'incubation. Le traitement préalable des kératinocytes par le complexe avant 5 l'irradiation aux rayons ultraviolets A et B entraîne une nette diminution des ROS mitochondriales. Le complexe 3 entraîne une diminution des ROS totales supérieure à celle des complexes 1 et 2.

Les résultats du dosage de la SOD dans les conditions physiologiques sont présentés dans le tableau 11 ci-après :

TABLEAU 1 1

LOTS	Activité de la SOD (mU/mg de protéines)
T= 0	T = 30 min	T = 3 heures
Lot 1 Témoin négatif	385 ± 22	398 ± 29	378 ± 18
Lot 2 Complexe 1	397 ± 25 ns	405 ± 17 ns	374 ± 15 ns
Lot 3 Complexe 2	372 ± 20 ns	401 ± 23 ns	377 ± 27 ns
Lot 4 Complexe 3	380 ± 30 ns	411 ± 24 ns	365 ± 21 ns

n.s. : non significatif par rapport au témoin

Ces résultats montrent que le complexe végétal conforme à l'invention n'entraîne aucune diminution de l'activité SOD dans les conditions physiologiques. Les complexes 1, 2 et 3 ne présentent donc aucune activité 15 pro-radicalaire.

Les résultats de l'activité de la SOD dans les conditions d'induction par les UVA et les UVB sont présentés dans le tableau 12 ci-après :

TABLEAU 1 2

LOTS	Activité de la SOD (mU/mg de protéines)
T= 0	T = 30 min	T = 3 heures
Lot 1 Témoin négatif	385 ± 22	398 ± 29	378 ± 18
Lot 5 Témoin positif	195 ± 12* (-49%)	255 ± 18* (-36%)	271 ± 21 * (-28%)
Lot 6 Complexe 1 +	221 ± 10**	291 ± 15**	285 ± 20 ns
UVA et UVB	(+13 %)	(+14 %)	(+5%)
Lot 7 Complexe 2+	235 ± 11 **	307 ± 23 **	299 ± 25 ns
UVA et UVB	(+21 %)	(+20 %)	( + 10 %)
Lot 8 Complexe 3+	283 ± 25 **	334 ± 22 **	330 ± 27 **
UVA et UVB	(+45 %)	(+31 %)	( + 22 %)

n.s. : non significatif par rapport au témoin * ; significativement différent par rapport au témoin négatif (p<0,05) : significativement différent par rapport au témoin positif (p<0,05)

Dans les conditions d'induction par les rayons ultraviolets A et B, l'irradiation des kératinocytes humains en culture entraîne une diminution de l'activité SOD. Ce résultat est très net à T0 et T30 min d'incubation. Le traitement préalable des kératinocytes par le complexe végétal selon l'invention avant l'irradiation aux rayons ultraviolets A et B entraîne une nette 10 augmentation de l'activité SOD, notamment à T = 30 min. Le complexe 3 entraîne une augmentation de l'activité SOD qui semble supérieure à celle des complexes 1 et 2 à T = 3 heures.

Les résultats du dosage de la catalase dans les conditions physiologiques sont présentés dans le tableau 13 ci-après :

TABLEAU 1 3

LOTS	Activité de la catalase (mU/mg de protéines)
T= 0	T = 30 min	T = 3 heures
Lot 1 Témoin négatif	175 ± 10	188 ± 16	158 ± 14
Lot 2 Complexe 1	187 ± 13 ns	205 ± 15 ns	174 ± 10 ns
Lot 3 Complexe 2	162 ± 9 ns	191 ± 13 ns	167 ± 11 ns
Lot 4 Complexe 3	170 ± 11 ns	201 ± 17 ns	155 ± 8 ns

n.s. : non significatif par rapport au témoin

Ces résultats montrent que le complexe végétal conforme à l'invention n'entraîne aucune diminution de l'activité de la catalase dans les conditions physiologiques. Les complexes 1, 2 et 3 ne présentent donc aucune activité pro-radicalaire.

Les résultats de l'activité de la catalase dans les conditions d'induction par les UVA et les UVB sont présentés dans le tableau 14 ci-après :

TABLEAU 1 4

LOTS	Activité de la catalase (mU/mg de protéines)
T= 0	T = 30 min	T = 3 heures
Lot 1 Témoin négatif	175 ± 10	188 ± 16	158 ± 14
Lot 5 Témoin positif	94 ± 7 * (-46%)	154 ± 11*	163 ± 9 ns
(-18%)	(+3%)
Lot 6 Complexe 1 +	119 ± 10**	185 ± 14 **	182 ± 11 ns
UVA et UVB	(+27 %)	(+20 %)	(+12%)
Lot 7 Complexe 2+	124 ± 10 **	197 ± 16 **	165 ± 12 ns
UVA et UVB	(+32 %)	(+28 %)	( + 1 %)
Lot 8 Complexe 3+	145 ± 15 **	217 ± 13**	210 ± 17**
UVA et UVB	(+54 %)	(+41 %)	(+29 %)

n.s. : non significatif par rapport au témoin * ; significativement différent par rapport au témoin négatif (p<0,05) : significativement différent par rapport au témoin positif (p<0,05)

Dans les conditions d'induction par les rayons ultraviolets A et B, l'irradiation des kératinocytes humains en culture entraîne une diminution de l'activité de la catalase. Ce résultat est très net à T0 et T30 min d'incubation. Le traitement préalable des kératinocytes par le complexe végétal selon l'invention avant l'irradiation aux rayons ultraviolets A et B entraîne une nette augmentation de l'activité catalase à T = 30 min. Le complexe 3 entraîne une augmentation de l'activité SOD qui semble supérieure à celle des complexes 1 et 2 à T = 3 heures.

EXEMPLE 6 : Etude des propriétés immunomodulatrices du complexe végétal selon l’invention à différentes concentrations

L'effet immunomodulateur du complexe végétal selon l'invention a été évalué à différentes concentrations par le dosage des cytokines TH1 et TH2. Le terme de cytokines TH1 et de cytokines TH2 fait référence au motif de cytokines sécrétées par 2 types de sous-populations de cellules T CD4 qui déterminent le devenir d'une réponse antigénique humorale versus une immunité cellulaire. Nombres de cellules autres que les cellules T exprimant le CD4 sont capables de produire des cytokines TH1 et TH2. Ces cellules peuvent être des cellules T CD8, des monocytes/macrophages, des cellules natural killer, des cellules B, des éosinophiles, des cellules mastocytaires, des basophiles, des kératinocytes et d'autres types cellulaires.

MATERIELS ET METHODES

6.1. Fibroblastes humains en culture

Les cultures de fibroblastes ont été établies à partir de peau de prépuces humains récoltés lors de circoncisions et ont été amplifiées en milieu de culture RPMI 1640 supplémenté par du sérum de veau fœtal, de la L-glutamine et de la gentamicine.

Les essais ont été réalisés sur des fibroblastes, entre le 2^eme et le 4^eme passage, afin d’assurer une reproductibilité entre les différentes expérimentations. Les fibroblastes sont ensemencés dans des boîtes de 25 cm² à raison de 10⁶ cellules par mL. Ils ont été ensuite incubés pendant 24 heures.

6.2. Kératinocytes humains en culture

Les kératinocytes ont été isolés à partir de prépuce néonatal d'un sujet mâle âgé de 2 ans et d'origine caucasienne, sous acte chirurgical. La viabilité cellulaire a été estimée à 96% approximativement. Le temps de doublement de la population cellulaire est de 28 heures.

6.3. Co-culture kératinocvtes/fibroblastes

Dans ce système de culture, les cellules sont mises en co-culture à raison de 200000 cellules/ml pour les kératinocytes et 400000 cellules/ml pour les fibroblastes. Le milieu de culture permettant une croissance normale des deux types cellulaires est le milieu défini Clonetics ® KGM2.

6.4. Etude de la cytotoxicité

6.4.1-.Çppsritutipn.des.Jpts

L’essai a été conduit en triplicate après contact des produits avec les cellules en culture.

- Lot 1 : témoin ne recevant aucun produit.

- Lot 2 : traité par le complexe 1, tel que préparé à l'exemple4

- Lot 3 : traité par le complexe 2, tel que préparé à l'exemple4

- Lot 4 : traité par le complexe 3, tel que préparé à l'exemple4 .6_:4.2r...EyaJ.uatjon..de.Ja..yiabJJJté.çeJJuJaire..au.nJveau..de ..la. co-culture ké rat i nocytes/fi b.r o.bl.ast es. .h u ma ί n s. en. .culture

Cette étape a été réalisée par le Test de réduction au bleu de Formazan (MTT). Après 24 heures d'incubation des cellules avec les complexes à l'étude à différentes concentrations, les puits contenant les cellules ont été vidés par retournement doux, puis le tapis cellulaire a été rincé avec le milieu de culture. 200 pl d'une solution de MTT diluée ont été distribués dans tous les puits. Les plaques ont été ensuite incubées à 37°C pendant 3 heures. Il y a, alors, formation de cristaux de bleu de Formazan, en quantité inversement proportionnelle à l'atteinte des succinates déshydrogénases. Les puits ont été, de nouveau, vidés par retournement doux, les cellules ont été ensuite lysées et les cristaux de bleu de Formazan dissous, par ajout de 200 μΙ de diméthyl sulfoxyde (DMSO). Après homogénéisation de la coloration, par agitation, les plaques ont été lues à 570 nm à l'aide d'un spectrophotomètre.

6.5- Dosage des médiateurs de l'inflammation

6.:5....1...-. Constitution. des.Jots

L’essai a été conduit en triplicate après contact des complexes avec les cellules en culture.

- Lot 1 : témoin ne recevant aucun produit.

- Lot 2 : traité par le complexe 1, tel que préparé à l'exemple 4

- Lot 3 : traité par le complexe 2, tel que préparé à l'exemple 4

- Lot 4 : traité par le complexe 3, tel que préparé à l'exemple 4

- Lot 5 : témoin positif irradié aux [UVA (5J/cm²) + UVB (100mJ/cm²)]

- Lot 6 : traité par le complexe 1 + [UVA (5J/cm²) + UVB 100mJ/cm²]

- Lot 7 : traité par le complexe 2 + [UVA (5J/cm²) + UVB 100mJ/cm²]

- Lot 8 : traité par complexe 3 + [UVA (5J/cm²) + UVB 100mJ/cm²]

:.5...2..-. Dosage .des. cytokines heures avant l'essai, le milieu de culture des cellules a été changé par le même milieu originel sans SVF. Les complexes à l'étude ont été additionnés aux cultures cellulaires 2h avant l'activation des cellules. Afin d'induire une activation des cellules et une production de cytokines de l'inflammation, celles-ci ont été exposés aux UVA et aux UVB puis remises en culture durant 48h à 37°C sous 5% de CO₂.

heures après l'activation par les UVA et les UVB, 25 pl de surnageant cellulaire ont été prélevés et immédiatement testés pour le dosage des cytokines pro- et anti-inflammatoires par la technique du FlowCytomix ®.

Dosage en cytométrie de flux

Brièvement, le FlowCytomix ® humain est un système d'immuno essai par billes fluorescentes pour la détection quantitative par cytométrie en flux de l'Interféron-γ, l'Interleukine-Ιβ, l'Interleukine-2, l'Interleukine-4, l'Interleukine-5, l'Interleukine-6, l'Interleukine-8, l'Interleukine-10, l'Interleukine-12p70 et le Tumor Necrosis Factor a et β, etc... dans les surnageants de culture.

Des microsphères ont été revêtues avec des anticorps dirigés spécialement envers chaque cytokine détectée par le système multiplex. Les billes peuvent être différenciées par leur taille et par leur émission spectrale.

Un mélange de chaque bille revêtue pour chaque cytokine a été incubé avec l'échantillon ou la gamme du standard. Les cytokines présentes dans l'échantillon se lient à l'anticorps fixés à la bille fluorescente. Un second anticorps couplé à la biotine a été ajouté au mélange, cet anticorps spécifique se lie aux cytokines capturées par le premier anticorps. La streptavidinephycoérythrine a été ajoutée, elle se lie au conjugué biotine et émet un signal fluorescent.

6.6-Analvse statistique

L’analyse statistique a été réalisée par un test de Wilcoxon Rank-Sum Test avec (p<0,05).

RESULTATS

Les résultats de l'évaluation de la cytotoxicité en fonction des différentes concentrations des complexes à l'étude après 24 heures de contact (Test de MTT) sont présentés dans le tableau 15 ci-après :

TABLEAU 1 5

LOTS	Densité optique DO 570 nm	%
Lot n°l (témoin)	0,875 ± 0,06	-
Lot n°2 (complexe 1)	0,884 ± 0,09	ns
Lot n°3 (complexe 2)	0,887 ± 0,06	ns
Lot n°4 (complexe 3)	0,872 ± 0,05	ns

n.s. : non significatif par rapport au témoin

Les résultats obtenus montrent que les complexes végétaux selon l'invention n'entraînent aucune cytotoxicité aux concentrations étudiées au niveau des kératinocytes en co-culture avec des fibroblastes humains

Les résultats du dosage de l'Interleukine-Ιβ (IL-Ιβ) dans les conditions physiologiques sont présentés dans le tableau 16 ci-après :

TABLEAU 1 6

LOTS	IL-Ιβ (pg/ml)	%
Lot n°l (témoin négatif)	1037 ± 52	-
Lot n°2 (complexe 1)	978 ± 54	ns
Lot n°3 (complexe 2)	970 ± 45	ns
Lot n°4 (complexe 3)	953 ± 70	ns

n.s. : non significatif par rapport au témoin

Les résultats du dosage de l'Interleukine-Ιβ (IL-Ιβ) après induction aux UVA et aux UVB sont présentés dans le tableau 17 ci-après :

TABLEAU 1 7

LOTS	IL-Ιβ (pg/ml)	%
Lot n°l (témoin négatif)	1037 ± 52	-
Lot n° 5 (témoin positif)	1811± 145 *	+75
Lot n°2 (complexe 1 + UVA + UVB)	1254 ± 75 **	-31
Lot n°3 (complexe 2+ UVA + UVB)	1140 ± 57 **	-37
Lot n°4 (complexe 3+ UVA + UVB)	946 ± 68 **	-48

n.s. : non significatif par rapport au témoin * ; significativement différent par rapport au témoin négatif (p<0,05) : significativement différent par rapport au témoin positif (p<0,05)

Les résultats du dosage de l'Interleukine-6 (IL-6) dans les conditions 15 physiologiques sont présentés dans le tableau 18 ci-après :

TABLEAU 1 8

LOTS	IL-6 (pg/ml)	%
Lot n°l (témoin négatif)	799 ± 34	-
Lot n°2 (complexe 1)	770 ± 33	ns
Lot n°3 (complexe 2)	768 ± 51	ns
Lot n°4 (complexe 3)	750 ± 30	ns

n.s. : non significatif par rapport au témoin

Les résultats du dosage de l'Interleukine-6 (IL-6) après induction aux

UVA et aux UVB sont présentés dans le tableau 19 ci-après :

TABLEAU 1 9

LOTS	IL-6 (pg/ml)	%
Lot n°l (témoin négatif)	799 ± 34	-
Lot n° 5 (témoin positif)	1466 ± 102 *	+83
Lot n°2 (complexe 1 + UVA + UVB)	970 ± 62 **	-34
Lot n°3 (complexe 2+ UVA + UVB)	841 ± 48 **	-43
Lot n°4 (complexe 3+ UVA + UVB)	743 ± 56 **	-49

n.s. : non significatif par rapport au témoin * ; significativement différent par rapport au témoin négatif (p<0,05) : significativement différent par rapport au témoin positif (p<0,05)

Les résultats du dosage de l'Interleukine-8 (IL-8) dans les conditions physiologiques sont présentés dans le tableau 20 ci-après :

TABLEAU 20

LOTS	IL-8 (pg/ml)	%
Lot n°l (témoin négatif)	4351 ± 294	-
Lot n°2 (complexe 1)	4260 ± 311	ns
Lot n°3 (complexe 2)	4080 ± 290	ns
Lot n°4 (complexe 3)	4012 ± 248	ns

n.s. : non significatif par rapport au témoin

Les résultats du dosage de l'Interleukine-8 (IL-8) après induction aux

UVA et aux UVB sont présentés dans le tableau 21 ci-après :

TABLEAU 21

LOTS	IL-8 (pg/ml)	%
Lot n°l (témoin négatif)	4351 ± 294	-
Lot n° 5 (témoin positif)	7304 ± 653 *	+68
Lot n°2 (complexe 1 + UVA + UVB)	5108 ± 400 **	-30
Lot n°3 (complexe 2+ UVA + UVB)	4750 ± 390 **	-35
Lot n°4 (complexe 3+ UVA + UVB)	4513 ± 427 **	-38

n.s. : non significatif par rapport au témoin * ; significativement différent par rapport au témoin négatif (p<0,05) : significativement différent par rapport au témoin positif (p<0,05)

Les résultats du dosage de l'Interleukine-10 (IL-10) dans les conditions physiologiques sont présentés dans le tableau 22 ci-après :

TABLEAU 22

LOTS	IL-10 (pg/ml)	%
Lot n°l (témoin négatif)	135 ± 10	-
Lot n°2 (complexe 1)	126 ± 7	ns
Lot n°3 (complexe 2)	125 ± 5	ns
Lot n°4 (complexe 3)	126 ± 8	ns

n.s. : non significatif par rapport au témoin

Les résultats du dosage de l'Interleukine-10 (IL-10) après induction aux UVA et aux UVB sont présentés dans le tableau 23 ci-après :

TABLEAU 23

LOTS	IL-10 (pg/ml)	%
Lot n°l (témoin négatif)	135 ± 10	-
Lot n° 5 (témoin positif)	300 ± 24 *	+ 122
Lot n°2 (complexe 1 + UVA + UVB)	214 ± 11 **	-29
Lot n°3 (complexe 2+ UVA + UVB)	190 ± 15 **	-37
Lot n°4 (complexe 3+ UVA + UVB)	181 ± 12**	-40

n.s. : non significatif par rapport au témoin * ; significativement différent par rapport au témoin négatif (p<0,05) : significativement différent par rapport au témoin positif (p<0,05)

Les résultats du dosage du TNF-α dans les conditions physiologiques 10 sont présentés dans le tableau 24 ci-après :

TABLEAU 24

LOTS	TNF-α (pg/ml)	%
Lot n°l (témoin négatif)	435 ± 38	-
Lot n°2 (complexe 1)	418 ± 23	ns
Lot n°3 (complexe 2)	422 ± 18	ns
Lot n°4 (complexe 3)	410 ± 25	ns

n.s. : non significatif par rapport au témoin

Les résultats du dosage du TNF-α après induction aux UVA et aux UVB sont présentés dans le tableau 25 ci-après :

TABLEAU 25

LOTS	TNF-α (pg/ml)	%
Lot n°l (témoin négatif)	435 ± 38	-
Lot n° 5 (témoin positif)	834 ± 64 *	+92

Lot n°2 (complexe 1 + UVA + UVB)	536 ± 33 “	-36
Lot n°3 (complexe 2+ UVA + UVB)	470 ± 27 “	-44
Lot n°4 (complexe 3+ UVA + UVB)	430 ± 36 “	-48

n.s. : non significatif par rapport au témoin * ; significativement différent par rapport au témoin négatif (p<0,05) : significativement différent par rapport au témoin positif (p<0,05)

Les résultats du dosage de l'IFN-γ dans les conditions physiologiques sont présentés dans le tableau 26 ci-après :

TABLEAU 26

LOTS	IFN- γ (pg/ml)	%
Lot n°l (témoin négatif)	312 ± 17	-
Lot n°2 (complexe 1)	299 ± 16	ns
Lot n°3 (complexe 2)	295 ± 12	ns
Lot n°4 (complexe 3)	297 ± 18	ns

n.s. : non significatif par rapport au témoin

Les résultats du dosage de l'IFN- γ après induction aux UVA et aux UVB sont présentés dans le tableau 27 ci-après :

TABLEAU 27

LOTS	IFN- γ (pg/ml)	%
Lot n°l (témoin négatif)	312 ± 17	-
Lot n° 5 (témoin positif)	560 ± 35 *	+79
Lot n°2 (complexe 1 + UVA + UVB)	400 ± 36 **	-29
Lot n°3 (complexe 2+ UVA + UVB)	376 ± 32 **	-33
Lot n°4 (complexe 3+ UVA + UVB)	350 ± 21 **	-38

n.s. : non significatif par rapport au témoin * ; significativement différent par rapport au témoin négatif (p<0,05) : significativement différent par rapport au témoin

Les résultats du dosage de l'IL-2 dans les conditions physiologiques 15 sont présentés dans le tableau 28 ci-après :

TABLEAU 28

LOTS	IL-2 (pg/ml)	%
Lot n°l (témoin négatif)	36,0 ± 3,2	-
Lot n°2 (complexe 1)	33,4 ± 2,0	ns
Lot n°3 (complexe 2)	32,0 ± 2,7	ns
Lot n°4 (complexe 3)	32,8 ± 3,0	ns

n.s. : non significatif par rapport au témoin

Les résultats du dosage de l'IL-2 après induction aux UVA et aux UVB sont présentés dans le tableau 29 ci-après :

TABLEAU 29

LOTS	IL-2 (pg/ml)	%
Lot n°l (témoin négatif)	36,0 ± 3,2	-
Lot n° 5 (témoin positif)	39,3 ± 3,7	ns
Lot n°2 (complexe 1 + UVA + UVB)	35,4 ± 3,0	ns
Lot n°3 (complexe 2+ UVA + UVB)	36,8 ± 2,9	ns
Lot n°4 (complexe 3+ UVA + UVB)	38,8 ± 2,1	ns

n.s. : non significatif par rapport au témoin

Les résultats du dosage de l'interleukine 12-p70 (IL12-p70) dans les conditions physiologiques sont présentés dans le tableau 30 ci-après :

TABLEAU 30

LOTS	IL12-p70 (pg/ml)	%
Lot n°l (témoin négatif)	48,5 ± 4,1	-
Lot n°2 (complexe 1)	47,7 ± 2,8	ns
Lot n°3 (complexe 2)	45,6 ± 3,4	ns
Lot n°4 (complexe 3)	45,0 ± 4,2	ns

n.s. : non significatif par rapport au témoin

Les résultats du dosage de l'interleukine 12-p70 (IL12-p70) après induction aux UVA et aux UVB sont présentés dans le tableau 31 ci-après :

TABLEAU 31

LOTS	IL12-p70 (pg/ml)	%
Lot n°l (témoin négatif)	48,5 ± 4,1	-
Lot n° 5 (témoin positif)	75,8 ± 6,1 *	+56
Lot n°2 (complexe 1 + UVA + UVB)	74,8 ± 4,0	ns
Lot n°3 (complexe 2+ UVA + UVB)	72,3 ± 6,2	ns
Lot n°4 (complexe 3+ UVA + UVB)	70,1 ± 5,6	ns

n.s. : non significatif par rapport au témoin * ; significativement différent par rapport au témoin négatif (p<0,05)

CONCLUSION

Les cytokines sont de véritables messagers chimiques permettant aux cellules de communiquer entres elles à distance afin d'effectuer les différentes fonctions physiologiques auxquelles elles sont rattachées. Cette communication indirecte se fait via des récepteurs spécifiques aux cytokines.

Les cellules immunes communiquent ainsi entre elles via ce réseau de cytokines.

La réponse à une inflammation locale se fait via les macrophages et les monocytes qui initient la l^ere phase de réponse aigue. Cette phase de réponse aigue s'initie grâce à trois principales cytokines : l'IL-l, l'IL-6 et le TNF-a.

Ces trois cytokines activent une seconde phase de production de cytokines nécessaires à la mise en place de la chronicité de l'inflammation notamment : l'IFN- γ.

Le contrôle spécifique de la séquence des étapes activatrices et suppressives dans le système immunitaire est médié par les cellules immunes à travers la production simultanée de cytokines pro-inflammatoires et antiinflammatoires. Le ratio entre cellules Thl (pro-inflammatoires) et Th2 (antiinflammatoires) et leurs cytokines est cliniquement important. Elles s'autobalancent en activant ou en inhibant leur propre réponse.

Ainsi, lorsque l'on observe une production de cytokines proinflammatoires, simultanément, pour contrebalancer ce phénomène, on assiste à l'apparition de cytokines anti-inflammatoires notamment l'IL-10.

Enfin, l'IL-8 n'est pas à proprement parlé une cytokine pro- ou antiinflammatoire. Cette cytokine agit comme potentialisateur de l'inflammation. C'est un puissant agent chemo-attractant qui va favoriser l'entrée sur le site inflammatoire de cellules immunes qui vont « entretenir » l'inflammation.

Ces cytokines peuvent aussi être subdivisées en fonction de leur enjeu dans l'inflammation aigue et/ou chronique. Ainsi sont responsables de :

- l'inflammation aigue : le TNF-a, l'IL-Ιβ, l'IL-6 et l'IL-8 ;

- l'inflammation chronique : l'IL-4, l'IL5 et l'IL6 médiant une réponse humorale ; l'IL-l, l'IL-2, l'IL-4, l'IL-10, l'IL-12p70, le TNF-α, et l’IFN- γ médiant une réponse cellulaire.

Il ressort des résultats présentés dans cet exemple, que les complexes végétaux conformes à la présente invention peuvent être considérés comme montrant une activité anti-inflammatoire et régulatrice du système immunitaire car ils diminuent de manière dose-dépendante la production des trois principales cytokines fortement impliquées à la fois dans les inflammations aigues et chroniques et l'activation du système immunitaire. Ce sont le TNF-a, l'IL-Ιβ et l'IL-6.

Au niveau immunitaire, la diminution de la production de ces 3 cytokines va permettre de réguler le système immunitaire. Ces cytokines sont connues pour stimuler la prolifération des cellules T, et notamment induire la différenciation des lymphocytes en lymphocytes «killer».

Les complexes végétaux conformes à la présente invention, en diminuant la production de l'IL-Ιβ, de l'IL-6 et du TNF-α, peuvent maintenir les cellules T dans un état naïf et empêcher ou limiter leur différenciation.

L'IFN- γ favorise la différenciation des cellules ThO en cellules Thl (proinflammatoires) au détriment des cellules Th2 (anti-inflammatoires). Ainsi, cette cytokine participe à l'inflammation chronique en intervenant en tant que second acteur puisqu'elle « entretient » l'inflammation favorisant la présence des cellules Thl productrices de cytokines pro-inflammatoires. Comme pour les cytokines pro-inflammatoires citées ci-dessus, complexes végétaux conformes à la présente invention diminuent de manière dose dépendante la production de l’IFN-γ. Les complexes végétaux conformes à la présente invention peuvent donc ainsi être considérés comme étant à nouveau antiinflammatoire sur les inflammations chroniques.

La production d'IL-10 (cytokine anti-inflammatoire) est elle aussi diminuée par les complexes végétaux conformes à la présente invention. Cette cytokine est présente pour réguler et diminuer l'inflammation induite par le TNF-α, l'IL-1 β et l'IL-6. La production de ces dernières cytokines étant diminuée par les complexes selon l'invention, il est logique d'observer également une diminution de production de l'IL-10.

Enfin, en ce qui concerne l'IL-12p70 et l'IL2 : les taux libérés dans le milieu de culture sont inférieurs à lOOpg/ml « bruit de fond ». Ce résultat montre que les complexes selon l'invention peuvent être considérés comme immunomodulateur car ces cytokines sont liées directement à l'expansion clonale des lymphocytes T et B et donc sont des facteurs importants dans le processus de l'immunosuppression due aux UVB.

En conclusion : Les complexes végétaux conformes à la présente invention peuvent être considérés comme ayant des propriétés antiinflammatoires et immunomodulatrices.

EXEMPLE 7 : Autre étude des propriétés antiradicalaires du complexe végétal selon l’invention à différentes concentrations

PROTOCOLE EXPERIMENTAL

7.1. Matériel

L'étude a été réalisée sur des épidermes reconstruits, modèle CellSystem®. Chaque essai a été réalisé en triplicate.

7.2. Principe de la culture

Des kératinocytes d’origine humaine sont ensemencés sur des filtres en polycarbonate de 0,5 cm² dans un milieu MCDB 153 modifié vendu par la société SIGMA-ALDRICH et supplémenté en facteurs de croissance. Les cellules sont cultivées pendant 14 jours à l’interface air/liquide, le milieu de culture étant changé tous les deux jours.

Les épidermes ainsi formés ont été utilisés pour la réalisation de l’étude à partir du I7^eme jour de la culture.

7.3. Evaluation de l'activité antiradicalaire _: 3... 1.... E s s a i. p.ré.l.i.m i n.ai.re

Un essai préliminaire a été effectué pour chaque produit étudié afin de déterminer les temps de contact produit/épiderme n’entraînant pas de cytotoxicité.

7.3.1.1 - Répartition des épidermes reconstitués

L’essai a été conduit en triplicate à chaque temps expérimental : 24 heures. Lots d’épidermes reconstitués pour chaque temps de contact :

- Lot 1 : témoin négatif ne recevant aucun produit.

- Lot 2 : traité par le complexe 1, tel que préparé à l'exemple 4

- Lot 3 : traité par le complexe 2, tel que préparé à l'exemple 4

- Lot 4 : traité par le complexe 3, tel que préparé à l'exemple 4

7.3.1.2- Evaluation de la viabilité cellulaire * Par réaction colorim étriqué au sel de tétrazolium (MTT)

0,15 ml de milieu de culture contenant 10% vol/vol de solution de bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényl tétrazolium (MTT) est pipetté sous chacun des filtres/support de culture. Après une incubation de 30 minutes à température ambiante, la couleur des différentes cultures a été observée et notée : les cultures doivent être de couleur bleue/pourpre intense, preuve de la viabilité des cellules de l'épiderme.

* Par examen histologique

Les épidermes fixés dans une solution à 10% de formaldéhyde ont été inclus dans des blocs en paraffine. Les coupes verticales de 4 microns ont été colorées à l'hématoxyline/éosine et photographiées sous un microscope optique.

.7._:3.2.-..Essai.prpp.rement.dJt

7.3.2.1 - Répartition des épidermes

L'essai a été conduit en triplicate après 24 heures de contact des produits avec les épidermes. - Constitution des lots :

- Lot 1 : témoins ne recevant aucun produit.

- Lot 2 : traité par le complexe 1, tel que préparé à l'exemple 4

- Lot 3 : traité par le complexe 2, tel que préparé à l'exemple 4

- Lot 4 : traité par le complexe 3, tel que préparé à l'exemple 4

- Lot 5 : : témoin traité par la vitamine C (10'⁶M)

- Lot 6 : témoin positif irradié aux [UVA (5J/cm²) + UVB (150mJ/cm²)]

- Lot 7 : témoin positif irradié aux [UVA (5J/cm²) + UVB (150mJ/cm²)] + vitamine C (10'⁶M)

- Lot 8 : traité par le complexe 1 + [UVA (5J/cm²) + UVB 150mJ/cm²]

- Lot 9 : traité par le complexe 2 + [UVA (5J/cm²) + UVB 150mJ/cm²]

- Lot 10 : traité par complexe 3 + [UVA (5J/cm²) + UVB 150mJ/cm²]

7.3.2.2 - Dosage du malondialdéhyde (MDA) : indice de lipopéroxydation

7.3.2.2.1 - Extraction du malondialdéhyde (MDA)

Après 24h de traitement des épidermes reconstitués, les homogénats cellulaires ont été remis en suspension dans :

- 250 pl de tampon Tris 50 mM, pH 8 contenant NaCI 0,lM ; EDTA 20 mM

- 25 μΙ de SDS à 7%

- 300 μΙ de HCl (0,1 N)

- 38 μΙ d'acide phosphotungstique à 1% dans l'eau

- 300 μΙ d'acide thiobarbiturique à 0,67% dans l'eau

Après 1 heure d'incubation dans l'obscurité à 50°C et un refroidissement dans l'eau glacée, 300 μΙ de n-butanol ont été ajoutés dans chaque tube. Ceux-ci ont été centrifugés à 10000 g à 0°C pendant 10 minutes. La phase supérieure a été récupérée pour le dosage du MDA.

7.3.2.2.2- Dosage du malondialdéhyde (MDA)

Le MDA a été dosé par mesure de la fluorescence après séparation du complexe MDA-TBA par chromatographie liquide haute performante (HPLC).

- Pompe Bischoff Model 2.200

- Injecteur automatique Alcoot Model 788 autosampler

- Colonne Ultrasep ® C18 (30 cm x 0,18 cm) 6 mm de porosité

- Détecteur de fluorescence, Jasco 821-FI

La détection de la fluorescence a été effectuée avec une excitation à 515 nm et une émission à 553 nm. L'éluant utilisé est composé de méthanol : eau, 40:60 (v/v) dont le pH 8,3 a été ajusté avec du KOH IM.

La quantification a été faite par rapport à des standards traités comme les échantillons (0,125; 0,25 ; 0,5 et 1 μΜ) à l'aide d'un logiciel informatique ICS (Pic 3) (Instrumentation Consommable Service).

7.3.2.2.3- Dosage des protéines

Le dosage des protéines a été réalisé selon la méthode de BRADFORD. L'augmentation de l'absorbance à 595 nm est proportionnelle à la concentration des protéines déterminées à l'aide d'un spectrophotomètre UNICAM ® 8625.

7.3.2.3- Dosage des protéines oxydées

Des standards d'albumine (10 pg/mL) ou des échantillons de protéine ont été adsorbés sur une plaque de 96 puits pendant 2 heures à 37°C. Les protéines oxydées présentes dans l’échantillon ou dans les standards ont été dérivatisées au DNP-Hydrazone et évaluées à l'aide d'un anticorps anti-DNP suivi d’un anticorps secondaire couplé au HRP. Le taux de protéines oxydées dans l’échantillon a été déterminé à partir d'une courbe étalon selon le protocole du kit « OxiSelect® Protein Carbonyl ELISA Kit ».

7.4- Analyse statistique

L'analyse statistique a été réalisée par un test de Wilcoxon Rank-Sum Test avec (p<0.05).

RESULTATS

7.5. Etude de la viabilité cellulaire

7_:5...1_?..Ρ3Γ.Γέ3ρυοη..ρο]ρΓίηΊέυΓί9υθ.3.υ..ΜΤΤ.

Les résultats sont présentés dans le tableau 32 ci-après :

TABLEAU 32

LOTS	Test colorimétrique (MTT)	Densité optique
Lot n°l (témoin négatif)	Bleu	-
Lot n°2 (complexe 1)	Bleu	ns
Lot n°3 (complexe 2)	Bleu	ns
Lot n°4 (complexe 3)	Bleu	ns

n.s. : non significatif par rapport au témoin

Les produits déposés à raison de ΙΟμΙ sur des épidermes reconstitués pendant 24 heures, n'ont induit aucune toxicité comparativement à des épidermes témoins après révélation au MTT. Les cultures ont été de couleur bleue/pourpre intense, preuve de la viabilité des cellules de l'épiderme.

7.5.,2.-..Par examen.h.istoIogi.que

Les produits déposés à raison de ΙΟμΙ sur des épidermes reconstitués pendant 24 heures n'ont induit aucune toxicité comparativement à des épidermes témoins. Les images histologiques (non représentées), après coloration HES, d'épidermes traités sont comparables à celles des épidermes témoins.

7.6 - Dosage du malondialdéhvde (MPA) dans l'homooénat cellulaire

7_:6..1.-..Lipopéroxydation.ph.ysJologj.que

Les résultats sont présentés dans le tableau 33 ci-après :

TABLEAU 33

LOTS	MDA (μΜ/mg de protéines)	%
Lot n°l (témoin négatif)	756 ± 31	-
Lot n° 5 (Vitamine C)	429 ± 33 *	-43
Lot n°2 (complexe 1)	580 ± 22 *	-23
Lot n°3 (complexe 2)	528 ± 27 *	-30
Lot n°4 (complexe 3)	517 ± 30 *	-32

n.s. : non significatif par rapport au témoin * ; significativement différent par rapport au témoin négatif (p<0,05)

Les résultats montrent que le traitement des épidermes par les produits à l'étude entraine une diminution significative du taux de MDA dans les conditions physiologiques.

7._:6-.2.-..Lipopéroxydation. provoquée

Les résultats sont présentés dans le tableau 34 ci-après :

TABLEAU 34

LOTS	MDA (μΜ/mg de protéines)	%
Lot n°l : témoin négatif	756 ± 31	-
Lot n° 6 : témoin positif irradié aux [UVA (5J/cm2) + UVB (150mJ/cm2)]	1311 ± 82 *	+73
Lot n° 7 : témoin positif irradié aux vitamine C (10‘6M) + [UVA (5J/cm2) + UVB (150mJ/cm2)]	540 ± 37 *	-59
Lot n°8 : traité par le complexe 1 + [UVA (5J/cm2) + UVB 150mJ/cm2]	952 ± 70 **	-27
Lot n°9 : traité par le complexe 2 + [UVA (5J/cm2) + UVB 150mJ/cm2]	810 ± 66 **	-38
Lot n°10 : traité par le complexe 3 + [UVA (5J/cm2) + UVB 150mJ/cm2]	780 ± 54 **	-41

n.s. : non significatif par rapport au témoin * ; significativement différent par rapport au témoin négatif (p<0,05) ; significativement différent par rapport au témoin UVA+UVB (p<0,05)

Les résultats montrent que l'irradiation des épidermes reconstitués par les rayons ultraviolets A et B entraîne une augmentation du taux de MDA (+73%). Le traitement des épidermes par les complexes selon l'invention préalablement à l'irradiation aux rayons ultraviolets entraîne une diminution significative du taux de MDA. Cet effet protecteur vis-à-vis des rayons ultraviolets, des différents complexes est nettement supérieur à celui obtenu 5 dans les conditions physiologiques.

7.7 - Dosage des protéines oxydées

7_:7,l-.ÇondjtiQns..phYSjoJogi.ques

Les résultats sont présentés dans le tableau 35 ci-après :

TABLEAU 35

LOTS	Protéines oxydées (nmol/mg de protéines)	%
Lot n°l : témoin négatif	3,95 ± 0,15	-
Lot n° 5 (Vitamine C)	1,95 ± 0,10 *	-51
Lot n°2 (complexe 1)	2,91 ± 0,20 *	-26
Lot n°3 (complexe 2)	2,51 ± 0,14 *	-36
Lot n°4 (complexe 3)	2,4 ± 0,17 *	-39

n.s. : non significatif par rapport au témoin * ; significativement différent par rapport au témoin négatif (p<0,05)

Les résultats montrent que le traitement des épidermes par les complexes selon l'invention entraîne une diminution significative du taux des protéines oxydées dans les conditions physiologiques.

.7.:7.,2-.Conditions, d'inductjon.par J.es.U.VA et .les. UVB

Les résultats sont présentés dans le tableau 36 ci-après :

TABLEAU 36

LOTS	Protéines oxydées (nmol/mg de protéines)	%
Lot n°l : témoin négatif	3,95 ± 0,15	-
Lot n° 6 : témoin positif irradié aux [UVA (5J/cm2) + UVB (150mJ/cm2)]	6,37 ± 0,51 *	+61
Lot n° 7 : témoin positif irradié aux vitamine C + (10‘6M) [UVA (5J/cm2) + UVB (150mJ/cm2)]	1,80 ± 0,17 **	-72
Lot n°8 : traité par le complexe 1 + [UVA (5J/cm2) + UVB 150mJ/cm2]	4,22 ± 0,31 **	-34

Lot n°9 : traité par le complexe 2 + lOVA (5J/cm2) + UVB 150mJ/cm2]	3,50 ± 0,25 “	-45
Lot n°10 : traité par le complexe 3 + lOVA (5J/cm2) + UVB 150mJ/cm2]	3,22 ± 0,31 “	-49

n.s. : non significatif par rapport au témoin * ; significativement différent par rapport au témoin négatif (p<0,05) ; significativement différent par rapport au témoin UVA+UVB (p<0,05)

Les résultats montrent que l'irradiation des épidermes reconstitués par les rayons ultraviolets A et B entraîne une augmentation du taux des protéines oxydées (+61%). Le traitement des épidermes par les complexes selon l'invention préalablement à l'irradiation aux rayons ultraviolets entraîne une diminution significative du taux des protéines oxydées. Cet effet protecteur vis-à-vis des rayons ultraviolets, des différents complexes est nettement supérieur à celui obtenu dans les conditions physiologiques.

EXEMPLE 8 : Etude de l’effet protecteur cellulaire du complexe végétal conformes à l’invention vis-à-vis des agressions dues aux rayons ultra-violets A et B

Dans cet exemple, on a évalué l'effet protecteur du complexe végétal conforme à l'invention à différentes concentrations, vis-à-vis des agressions dues aux rayonnements UVA et UVB par le test des Comètes.

PROTOCOLE EXPERIMENTAL

8.1. Principe de l'étude

Le principe de l’étude est d’évaluer les dommages causés à l’ADN en mesurant la proportion de l’ADN dans la queue des comètes après une irradiation aux UVA et UVB. Cette quantité d’ADN est fonction de la dose d’irradiation.

8.2- Protocole expérimental

8.2.1-.Système.ceJJuJaire

8.1.1.1 -kératinocytes humains en culture

Les kératinocytes sont isolés à partir de prépuce néonatal d'un sujet mâle âgé de 2 ans et d'origine caucasienne, sous acte chirurgical. La viabilité cellulaire est estimée à 96% approximativement. Le temps de doublement de la population cellulaire est estimé à 28 heures.

8.1.1.2- Mise en culture

Les kératinocytes sont cultivés dans des boîtes 25cm² puis 75cm² jusqu'à l'obtention du nombre de cellules nécessaires à l'étude. L'étude est réalisée sur des cellules cultivées en plaque 6 puits à raison de 2.10⁶ cellules par puits dans du milieu de culture pour kératinocytes supplémenté en extrait de glandes pituitaires bovines (0,4% V/V), EGF recombinant humain (0,125 ng/ml), insuline (5 pg/ml), hydrocortisone (0,33 pg/ml), transférine humaine (10 pg/ml), épinéphrine (0,39 pg/ml) et chlorure de calcium (0,15 mM).

8.2.2.-.Etude.de .la. cytotoxicité.

L'essai est conduit en triplicate après 24 heures de contact du produit à l'étude avec les kératinocytes humains en culture.

8.2.2.1 - Constitution des lots

- Lot 1 : témoins non traités.

- Lot 2 : traités par le complexe 1 tel que préparé à l'exemple 4,

- Lot 3 : traités par le complexe 2 tel que préparé à l'exemple 4,

- Lot 4 : traités par le complexe 3 tel que préparé à l'exemple 4.

8.2.2.2- Evaluation de la viabilité cellulaire au niveau des kératinocytes humains en culture

Cette étape a été réalisée par le Test de réduction au bleu de Formazan (MTT). Après 24 heures d'incubation des cellules avec le produit à l'étude, les puits contenant les cellules ont été vidés par retournement doux, puis le tapis cellulaire a été rincé avec le milieu de culture. 200 pi d'une solution de MTT diluée ont été distribués dans tous les puits. Les plaques ont été ensuite incubées à 37°C pendant 3 heures. Il y a, alors, formation de cristaux de bleu de Formazan, en quantité inversement proportionnelle à l'atteinte des succinates déshydrogénases. Les puits ont été, de nouveau, vidés par retournement doux, les cellules ont été ensuite lysées et les cristaux de bleu de Formazan dissous, par ajout de 200 μΙ de DMSO. Après homogénéisation de la coloration, par agitation, les plaques ont été lues à 570 nm à l'aide d'un spectrophotomètre.

8_:23-..Κυ.ίθ..όθ.ΓθίΓθί..ρΓ0ίθείθ^Γ .des..pxoduits.à.J/éUu.de..yiS7.à7yJ.s. de

l.'a.g rassi on. du e aux. ray on s. u.l t ray i ο I ets A. et _B

8.2.3.1 - Principe

Le test des comètes (ou selon l'expression anglophone « Single Cell Gel Electrophoresis » (SCGE)) est une technique d’électrophorèse sur microgel d’agarose. Il permet de mesurer les cassures induites directement par un agent génotoxique et indirectement lors des processus enzymatiques de réparation des dommages ou lors de processus secondaires de fragmentation de l’ADN tel que l’apoptose.

Les cellules, après un contact avec un agent altérant la structure de l’ADN (isotopes, agents oxydants, UV ou autres molécules toxiques) pendant un temps donné, sont décollées de leur boîte de pétri pour être englobées dans un gel d’agarose et déposées sur une lame de microscope. Elles sont ensuite soumises à l’action d’un agent alcalin (pH 10) qui a pour effet de lyser les cellules (destruction des membranes, des protéines et des ARNs) et de libérer les noyaux. Ces derniers sont ensuite incubés dans un tampon d’électrophorèse basique (pH 13) pour faciliter la dénaturation, la détorsion de l’hélice et l’exposition des sites sensibles aux agents alcalins. L’ADN ainsi relâché, est soumis à une électrophorèse (de faible voltage et ampérage) puis révélé par addition d’un intercalant fluorescent : le bromure d’éthidium (Yoyo).

Si l’ADN n’a pas été endommagé, il sera révélé sous forme d’une sphère compacte. Si l’ADN a été endommagé, celui-ci présentera en plus des fragments simples et doubles brins qui migreront en dehors de cette sphère formant un halo d’ADN qui s'étirent en direction de l'anode et décrivent la queue de la comète.

8.2.3.2- Constitution des lots

L'essai a été conduit en triplicate après 24 heures de traitement des cellules avec les produits à l'étude

- Lot 1 : témoins non traités.

- Lot 2 : traités par le complexe 1 tel que préparé à l'exemple4,

- Lot 3 : traités par le complexe 2 tel que préparé à l'exemple4,

- Lot 4 : traités par le complexe 3 tel que préparé à l'exemple4,

- Lot 5 : témoin positif irradié aux [UVB 100mJ/cm² + UVA (5J/cm²)],

- Lot 6 : traité par le complexe 1 puis irradié aux [UVB 100mJ/cm² + UVA (5J/cm²)],

- Lot 7 : traité par le complexe 2 puis irradié aux [UVB 100mJ/cm² + UVA (5J/cm²)],

- Lot 8 : traité par le complexe 3 puis irradié aux [UVB 100mJ/cm² + UVA (5J/cm²)]

8.2.3.3 - Evaluation des dommages de l'ADN heures après l'irradiation, les cellules ont été individualisées puis incorporées dans un gel d’agarose et placées sur une lame de microscope. Les cellules ont été ensuite lysées. La fraction nucléaire obtenue a été soumise à une électrophorèse. La quantification de la quantité d’ADN présente dans la queue des comètes a été évaluée par un microscope muni d’une caméra et couplé à un analyseur d’images. Le moment de la queue de la comète (ou « Tait Moment » selon l'expression anglophone) est calculé grâce à l'équation suivante :

% ADN queue x longueur de la queue de la comète

8.3- Analyse statistique

L’analyse statistique est réalisée par un test de Wilcoxon Rank-Sum Test avec (p<0.05)

RESULTATS

8.1- Etude de la cytotoxicité

Les résultats sont présentés dans le tableau 37 ci-après :

TABLEAU 37

LOTS	Densité optique (DO)	%
Lot n°l : témoin négatif	0,752 ± 0,07	-
Lot n°2 (complexe 1)	0,810 ± 0,04	ns
Lot n°3 (complexe 2)	0,790 ± 0,08	ns
Lot n°4 (complexe 3)	0,788 ± 0,09	ns

n.s. : non significatif par rapport au témoin

Ces résultats montrent que le complexe végétal selon l'invention, testé à différentes concentrations, n'entraine aucune toxicité au niveau des kératinocytes humains en culture.

8.2- Evaluation de l'effet protecteur du complexe d'actifs en absence d'irradiaticn aux UVA et B

Les résultats exprimant le mcment de la queue de la ccmète sent présentés dans le tableau 38 ci-après :

TABLEAU 38

LOTS	% de cellules présentant un mcment de la queue de la ccmète
Grades de mcment de la queue de la ccmète	10-20	20-30	30-40	40-50	>50
Lct n°l : témein négatif	75 %	25 %	-	-	-
Lct n°2 (ccmplexe 1)	79 %*	21 %*	-	-	-
Lct n°3 (ccmplexe 2)	83 %*	17 %*	-	-	-
Lct n°4 (ccmplexe 3)	89 %*	11 %*	-	-	-

; significativement différent par rapport au témoin négatif (p<0,05)

Ces résultats révèlent que la majerité des cellules témeins (75%) ent un mcment de queue de la ccmète entre 10 et 20. Ce résultat signifie que l'ADN n'est quasiment pas fragmenté. Seul 25% de cellules présentent un mcment de queue de la comète entre 20 et 30 ce qui traduit une faible fragmentation physiologique de l'ADN des cellules. Le traitement des cellules par le complexe végétal selon l'invention, aux différentes concentrations, ne montre aucune fragmentation supérieure à celle des cellules témoins non traitées. En effet la majorité des cellules ont un moment de queue de la comète se situant entre 10 et 30, et les complexes végétaux selon l'invention montrent une diminution de la fragmentation physiologique en comparaison avec le témoin négatif.

En conclusion, dans les conditions physiologiques, le complexe végétal selon l'invention, aux différentes concentrations testées, n'entraîne aucune fragmentation de l'ADN comparativement au témoin. Il semble cependant, montrer un faible, mais néanmoins significatif, effet protecteur de l'ADN comparativement au témoin négatif.

8.3- Evaluation de l'effet protecteur du complexe d'actifs après irradiatipn aux UVA et UVB

Les résultats exprimant le mement de la queue de la cemète sent présentés dans le tableau 39 ci-après :

TABLEAU 39

LOTS	% de cellules présentant un moment de la queue de la comète
Grades de moment de la queue de la comète	10-20	20-30	30-40	40-50	>50
Lot n°l : témoin négatif	75 %	25 %	-	-	-
Lot n°5 témoin positif [UVB 100mJ/cm2 + UVA (5J/cm2)]	2%*	6 %*	9 %*	16 %*	67 %*
Lot n°6 (complexe 1 + [UVB 100mJ/cm2 + UVA (5J/cm2)])	45 %**	28 %**	20 %**	7 %**	-
Lot n°7 (complexe 2+ [UVB 100mJ/cm2 + UVA (5J/cm2)])	51 %**	22 %**	25 %**	2 %**	-
Lot n°8 (complexe 3+ [UVB 100mJ/cm2 + UVA (5J/cm2)])	53 %**	32 %**	15 %**	-	-

n.s. : non significatif par rapport au témoin * ; significativement différent par rapport au témoin négatif (p<0,05) : significativement différent par rapport au témoin UVA et UVB (p<0,05)

Ces résultats montrent que la majorité des cellules irradiées (92%) ont un moment de queue de la comète supérieur ou égal à 30 et que 67% des cellules ont un moment de queue de la comète supérieur à 50. Ce résultat signifie que l'ADN des cellules est très fragmenté par les rayons ultraviolets A 10 et B (lot 5). Seul 8% de cellules présentent un moment de queue de la comète inférieur à 30. Le traitement des cellules par le complexe végétal selon l'invention montre une nette diminution de la fragmentation de l'ADN. En effet aucune fragmentation supérieure à 50 n'est observée.

En conclusion, dans les conditions d'irradiation le complexe végétal 15 selon l'invention, aux différentes concentrations, entraîne une nette diminution de la fragmentation de l'ADN due aux rayons ultraviolets A et B. Cette diminution de la fragmentation est plus importante après traitement des cellules par le complexe 3 comparativement aux complexes 1 et 2.

Claims (11)

1. REVENDI CATI ONS

   1. Complexe végétal comprenant au moins de la sève de bouleau et au moins un extrait aqueux de chaga (Inonotus obliquus).
2. 2. Complexe selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il se présente sous la forme d'un kit à plusieurs compartiments dans lequel un premier compartiment contient ladite sève de bouleau et un deuxième compartiment contient ledit extrait aqueux de chaga.
3. 3. Utilisation cosmétique et non thérapeutique d'un complexe végétal tel que défini selon la revendication 1 ou 2, à titre d'ingrédient actif ayant des propriétés antiradicalaires et d'immunomodulation, dans une composition cosmétique destinée à prévenir et/ou traiter les signes du vieillissement cutané.
4. 4. Composition cosmétique à application topique comprenant, dans un support cosmétiquement acceptable, au moins un complexe végétal comprenant au moins de la sève de bouleau et au moins un extrait aqueux de chaga.
5. 5. Composition selon la revendication 4, caractérisée en ce que la quantité de sève de bouleau varie de 0,1 à 50 % en masse par rapport à la masse totale de ladite composition cosmétique.
6. 6. Composition selon la revendication 4 ou 5, caractérisée en ce que la quantité de sève de bouleau varie de 1 à 5 % en masse par rapport à la masse totale de ladite composition cosmétique.
7. 7. Composition selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, caractérisée en ce que la quantité d'extrait aqueux de chaga varie de 0,1 à 15 % en masse par rapport à la masse totale de la composition cosmétique.
8. 8. Composition selon l'une quelconque des revendications 4 à 7, caractérisée en ce que la quantité d'extrait aqueux de chaga varie de 0,1 à 2 % en masse par rapport à la masse totale de la composition cosmétique.
9. 9. Composition selon l'une quelconque des revendications 4 à 8, caractérisée en ce qu'elle comprend de 2,5 à 5 % en masse de sève de bouleau et de 0,5 à 2 % en masse d'extrait aqueux de chaga par rapport à la masse totale de la composition cosmétique.
10. 10. Composition selon l'une quelconque des revendications 4 à 8, caractérisée en ce qu'elle comprend 5 % en masse de sève de bouleau et

    2 % en masse d'extrait aqueux de chaga, par rapport à la masse totale de la composition cosmétique.
11. 11. Procédé cosmétique non thérapeutique pour prévenir et/ou traiter les signes du vieillissement cutané comprenant au moins une étape 5 d'application sur la peau d'une composition cosmétique à application topique telle que définie telle que définie à l'une quelconque des revendications 4 à

    10.

    RÉPUBLIQUE FRANÇAISE

    N° d'enregistrement national

    FA 838703

    FR 1754772 irai — I INSTITUT NATIONAL

    DE LA PROPRIÉTÉ

    INDUSTRIELLE

    RAPPORT DE RECHERCHE PRÉLIMINAIRE établi sur la base des dernières revendications déposées avant le commencement de la recherche

    DOCUMENTS CONSIDÉRÉS COMME PERTINENTS

    Revend ication(s) concernée(s)

    Classement attribué à l'invention par ΙΊΝΡΙ

    Catégorie

    Citation du document avec indication, en cas de besoin, des parties pertinentes

    JP 2007 320921 A (NITTA GELATIN KK) 13 décembre 2007 (2007-12-13) * abrégé * * colonnes 1,2,10-1 *

    DATABASE WPI

    Week 201682

    Thomson Scientific, London, GB; AN 2016-68271E

    XP002773110, & KR 2016 0123158 A (Y00 G C)

    25 octobre 2016 (2016-10-25) * abrégé *

    KR 2016 0123158 A (Y00 GI CHUN [KR])

    25 octobre 2016 (2016-10-25) * abrégé * * alinéas [0001] - [0004], [0014];

    exemples *

    KR 2004 0102558 A (YOU & I COSMETICS 00 LTD) 8 décembre 2004 (2004-12-08) * abrégé * * le document en entier *