FR3030575A1 - Procede de synthese d'acides gras - Google Patents

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Julien Cescut
Jean-Louis Uribelarrea
Stephane Guillouet
Carole Molina-Jouve
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National des Sciences Appliquees de Toulouse
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National des Sciences Appliquees de Toulouse
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
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Abstract

L'invention concerne un procédé de synthèse d'acides gras par culture d'un microorganisme eucaryote du règne des Fungi, naturellement oléagineux ou rendu oléagineux, caractérisé en ce que la culture est réalisée en présence d'un inhibiteur de l'acide gras synthase dans le milieu de culture.

Description

PROCEDE DE SYNTHESE D'ACIDES GRAS La présente invention concerne un procédé de synthèse d'acides gras, en particulier d'acide gras à courtes ou moyennes chaines carbonées, à partir de microorganismes eucaryotes oléagineux. Elle a également pour objet les acides gras tels qu'obtenus par le procédé de l'invention et leurs utilisations dans les domaines de l'énergie, de la chimie, de la santé, de l'agro-alimentaire et de la nutrition. Par « acide gras » on désigne les molécules d'acide carboxylique contenant une chaine carbonée hydrophobe. Par « acides gras » on peut désigner les acides gras stockés sous forme libre ou sous forme de triglycérides. Ils se distinguent essentiellement en fonction de la longueur de leur chaîne carbonée et du nombre de liaisons éthyléniques (degré d'insaturation), c'est-à-dire selon l'existence éventuelle d'une ou de plusieurs doubles liaisons entre deux atomes de carbone voisins. Cela conduit à différencier les acides gras saturés (qui ne possèdent aucune double liaison) des acides gras mono- et poly-insaturés (comprenant respectivement une et plusieurs doubles liaisons). L'identification de la position de la ou des liaisons éthyléniques permet de différencier les acides gras ayant le même degré d'insaturation. Généralement les acides gras ont une chaine carbonée variant de 4 à 36 atomes de carbone. Ceux possédant 2, 3 ou 4 atomes de carbone sont appelés acides gras volatils ; ceux dont la chaine carbonée varie de 6 à 10 atomes de carbone sont appelés acides gras à courte chaine. Les acides gras à chaine moyenne ont un nombre d'atomes de carbone qui varie entre 12 et 14. Ceux dont la chaine carbonée varie de 16 à 18 atomes de carbone sont appelés acides gras à chaine longue et ceux dont la chaine carbonée dépasse 18 atomes de carbone sont appelés acides gras à très longue chaine. Les plus fréquents possèdent un nombre pair d'atomes de carbone. Parmi les acides gras saturés les plus courants figurent l'acide hexadécanoïque (C16:0), l'acide octodécanoïque (C18:0), l'acide icosanoïque (C20:0). L'acide cis-9-tétradécénoïque (C14:1(9)), l'acide cis-9-hexadécénoïque (C16:1(9)) et l'acide cis-9-octadécénoïque (C18:1(9)) appartiennent au groupe des acides gras monoinsaturés. L' acide cis, cis-9-octadécadiénoïque (C18:2(9,12)) et l'acide cis,cis,cis, cis-5 . 8.11.14- icosatétranoïque (C20:4(5,8,11,14)) sont des exemples d'acides gras polyinsaturés. Les acides gras préférés de l'invention sont l'acide héxanoïque (C6:0), l'acide heptanoïque (C7:0), l'acide octanoïque (C8:0), l'acide nonanoïque (C9:0), l'acide décanoïque (C10:0), l'acide dodécanoïque (C12:0), l'acide tétradécanoïque (C14:0).
Par « microorganisme eucaryote du règne des Fungi » on désigne les organismes vivants unicellulaires ou pluricellulaires qui comprennent dans leur cytoplasme plusieurs organelles, et notamment un noyau, un appareil de Golgi et des mitochondries. La reproduction de ces organismes s'effectue soit de manière asexuée par mitose soit de manière sexuée par méiose lorsque les conditions de culture sont défavorables. A titre d'exemple, et sans que cela ne restreigne la portée de la présente invention, les microorganismes eucaryotes du règne des Fungi selon la présente invention appartiennent notamment aux genres Yarrowia, Saccharomyces, Rhodotorula ou Rhosporidium. On qualifie les microorganismes eucaryotes de « naturellement oléagineux » les microorganismes du règne des Fungi dont le métabolisme permet la synthèse d'acides gras dans des quantités variant de 15% à 80% de masse sèche de microorganisme (cellules). Le stockage des acides gras peut éventuellement se faire sous forme de triacylglycerides stockés dans des corps lipidiques. Par « rendu oléagineux », on désigne les microorganismes eucaryotes du règne des Fungi dont le génome a été modifié afin d'accroitre la production en acide gras (rendement, vitesse, quantité...) ou de moduler la composition en acides gras accumulés. Cette modification génique peut porter sur au moins l'un des gènes codant pour les enzymes impliquées dans la biosynthèse ou le stockage des acides gras, en particulier l'acide gras synthase. La modification génique peut résulter d'une suppression, insertion, délétion, substitution ou duplication de gène. Par « inhibiteur de l'acide gras synthase » on désigne les composés capables d'interagir avec le site actif de l'acide gras synthase, ou capables d'interagir avec un autre site de l'acide gras synthase, de manière antérieure et/ou postérieure à la fixation dudit substrat sur ladite enzyme au niveau de son site actif, l'ensemble de ces interactions pouvant être réversibles ou irréversibles. Cette fixation entraine une modulation de toute ou partie de l'activité enzymatique de l'acide gras synthase. Parmi les inhibiteurs bien connus de l'Homme du métier, le triclosan (5-chloro-2-(2,4-dichlorophenoxy) phenol), le TOFA (5 - (tétradécyloxy)- 2-20 furannecarboxylique), le C75 (tétrahydro-4-méthylène-2R-octy1-5-0x0- 3Sfurannecarboxylique) et la cérulénine (2,3-époxy-4-oxo-7,10-hexadecadienoylamide) sont utilisés comme des inhibiteurs de l'acide gras synthase. La cérulénine se fixe irréversiblement à la B cétoacyl-ACP synthase et par conséquent inhibe l'acide gras synthase (Funabashi et al., 1989 Journal of Biochemistry 105, 751-55). Chez les levures et les eucaryotes supérieurs, les réactions de synthèse des acides gras sont réalisées par un homodimère protéique qui possède l'ensemble des activités enzymatiques requises pour produire des acides gras et qu'on appelle acide gras synthase I (FAS I). Il existe des microorganismes eucaryotes capables d'accumuler plus de 30 % de leur masse sèche en lipides intracellulaires en présence de substrat carboné. C'est notamment le cas de Yarrowia lipolytica. La demande FR 2 940 315 Al divulgue un procédé de culture basé sur une gestion contrôlée des apports en carbone et en azote dans le milieu de culture et qui permet la synthèse de 0,35 glipide.g-1 masse sèche de levure ; les acides gras synthétisés sont des acides gras ayant majoritairement des longueurs de chaine carbonées comprises en C16:0 et C24:0. Dans un autre procédé de culture de Yarrowia lipolytica (FR 2 981 363 Al), l'apport contrôlé de phosphore même en présence d'un excès de substrat carboné permet l'accumulation de polysaccharides et de lipides à raison de 50 % en carbone de la masse sèche de biomasse. De tels procédés ne permettent toutefois pas de moduler le profil des acides gras en fonction de l'utilisation envisagée, en particulier en fonction des spécificités du domaine d'application. Un certain nombre d'inhibiteurs spécifiques de la voie de biosynthèse des acides gras est bien connu de l'Homme du métier. Il s'agit notamment du triclosan (5-chloro-2-(2,4- dichlorophenoxy)phenol), du TOFA (5 - (tétradécyloxy)-2-20 furannecarboxylique), du C75 (tétrahydro-4-méthylène-2R-octy1-5-oxo-3Sfurannecarboxylique) ou de la cérulénine (2,3 - époxy-4-oxo-7,10-hexadecadienoylamide). La cérulénine (2, 3-époxy-4-oxo-7,10-hexadecadienoylamide) est une mycotoxine développée à l'origine comme un antibiotique antifongique ; elle exerce un effet inhibiteur sur l'activité de l'acide gras synthétase (en anglais FAS - Fatty Acid Synthase) [Nomura et al., 1972, J Antibiot (Tokyo) 25: 365-368]. La cérulénine se lie de manière covalente à un résidu cystéine dans le site actif de la B-cétoacyl-synthétase, enzyme de condensation requise pour la synthèse des acides gras [Price et al., 2001, J Biol Chem 276: 6551-6559].
Plusieurs études ont permis d'analyser les effets de la cérulénine sur la croissance des microorganismes. En particulier, Tanaka et al., ont montré que la cérulénine bloque totalement la croissance d'une souche sauvage de Candida lypolytica lorsque celle-ci croît sur un substrat contenant du n-undecane ou du n-dodecane mais demeure sans effet lorsque le substrat contient des alkanes de plus grande taille (n-tetradecane à n-octadecane) [Tanaka et al., European J.Appl.Microbiol., 1976, 3(2), 115-124]. Plus récemment, Torella et al. ont montré que l'ajout de cérulénine dans le milieu de culture permet d'augmenter le rendement de synthèse de certains acides gras dont les courtes chaines chez des souches d'Escherichia colt Toutefois, ces résultats ont été obtenus sur des souches génétiquement modifiées pour l'une au moins des enzymes de la voie de biosynthèse des acides gras [Torella et al., 2013, PNAS, 110(28), 11290-11295]. Il est établi que les acides gras libres à courtes chaines sont toxiques pour les microorganismes [Neal et al., 1965, J Bacteriol, 90(1), 126-131]; ils sont donc produits en faible quantité par les souches sauvages selon les voies naturellement présentes dans le 15 métabolisme. Dans la recherche de la modulation du potentiel de biosynthèse des acides gras induite par une limitation nutritionnelle et avec l'ajout des doses non létales de cérulénine, les inventeurs ont constaté de manière surprenante que l'ajout de cérulénine dans le milieu de culture d'un microorganisme eucaryote du règne des Fungi, naturellement oléagineux ou rendu 20 oléagineux, provoque une augmentation de l'accumulation d'acides gras à courtes ou moyennes chaines dans la levure. Le but de la présente invention est de proposer un procédé pour produire des acides gras à courte ou moyenne chaine carbonée. Un autre but de la présente invention est de fournir des acides gras à courte ou moyenne 25 chaine carbonée en grande quantité et avec un degré de pureté élevé. Un but supplémentaire de la présente invention est de fournir des acides gras à courtes ou moyennes chaines carbonées utilisables pour des usages de biocarburant. Enfin, un autre but de la présente invention est de fournir des acides gras à courtes ou moyennes chaines carbonées utilisables dans le domaine de l'oléochimie et/ou la production de molécules bioénergétiques et/ou la préparation d'agent cosmétique et/ou pharmaceutique et/ou nutritionnel. L'oléochimie concerne les transformations physico-chimiques appliquées aux huiles et aux graisses animales et végétales. Elle est ainsi présente dans une multitude de domaines d'application tels que la chimie, les matériaux, la santé, l'énergie (les lubrifiants, les plastiques, les polymères, les additifs, les biodiesels...). La présente invention concerne un procédé de synthèse d'acides gras à courtes ou moyennes chaines carbonées, de préférence comprise entre 4 et 15 atomes de carbones, par culture d'un microorganisme eucaryote du règne des Fungi, naturellement oléagineux ou rendu oléagineux, caractérisé en ce que la culture est réalisée en présence d'un inhibiteur de l'acide gras synthase dans le milieu de culture. L'ajout du susdit inhibiteur de l'acide gras synthase dans le milieu de culture a pour effet de moduler la cinétique d'élongation des acides gras. Par « cinétique d'élongation des acides gras » on désigne les différentes étapes réactionnelles du cycle de synthèse de novo des acides gras réalisées par la FAS, en particulier, la transacétylation, la transmalonysation, l'étape de condensation, les deux étapes de réductions successives de l'étape de déshydratation. Le processus d'élongation de la chaine d'acyl gras est réalisé par des cycles successifs utilisant les mêmes étapes de condensation du malonyl-CoA et de l'acyl-ACP suivies des étapes de décarboxylation, de réduction et de déshydratation La FAS libère des palmityl-coA (16 atomes de carbone) dans le cytoplasme. Pour synthétiser des acides gras à plus de 16 atomes de carbone, des enzymes cytoplasmiques distinctes de la FAS catalysent successivement les mêmes réactions que la FAS. La présente invention concerne également un procédé de synthèse d'acides gras à courtes ou moyennes chaines, de préférence comprise entre 4 et 15 atomes de carbone, par culture d'un microorganisme eucaryote du règne des Fungi, naturellement oléagineux ou rendu oléagineux, dans lequel l'inhibiteur de l'acide gras synthase est choisi de préférence parmi la cérulénine et ses analogues, le triclosan (5-chloro-2-(2,4-dichlorophenoxy)phenol), le TOFA (5 - (tétradécyloxy)-2-20 furannecarboxylique), le bischloroanthrabenzoxocinone, la thiolactomycine, la platensimycine ainsi que les analogues de ces molécules de préférence, le C75 (acide 4-methylène-2-octy1-5-oxo-tétrahydro-furan-3-carboxylique), le C93 (ou FAS93), et le FAS31.
Il est à noter que le composé C75 peut être référencé dans la littérature notamment sous les formules suivantes : acide 4-méthylène-2-octy1-5-oxo-tétrahydro-furan-3-carboxylique, tétrahydro-4-méthylène-2R-octy1-5-oxo-3Sfurannecarboxylique ou trans-4-carboxy-5-octy1-3- méthylène butyrolactone.
Dans le présent procédé, peuvent également être utilisés tous les composés qui sont capables d'inhiber l'acide gras synthase tels que l'orlistat (N-Formyl-L-leucine (1S)-1-[[(2S,3S)-3- hexy1-4-oxo-2-oxetanyl]methyl]dodecyl ester), le GSK837149A (Dibenzènesulfonamide urée), l'isoniazide, le platencine, le pyrazinamide, l'éthionamide, le diazoborine, l'hexachlorophène, le diclofénac, l'épigallocatechin-3-gallate (EGCG), la lutéoline, la taxifoline, le kaempférol, la quercetine, l'apigénine, l'anthécotulide, l'anthécularine, la 4- hydroxyanthécotulide et la 4-acétoxyanthécotulide. Il est à noter que le composé orlistat peut être référencé dans la littérature notamment sous les formules suivantes : N-Formyl-L-leucine (1 S)-1-[ [(2 S,3 S)-3-hexy1-4-oxo-2-ox etanyl]methyl]dodecyl ester et (S)-((S)-14(2S,3S)-3-hexy1-4-oxooxetan-2-yl)tridecan-2-y1)2- 15 formamido-4-méthylpentanoate. Peuvent également être utilisés les inhibiteurs de l'acide gras synthase listés dans la demande internationale WO 2013/022 927, notamment le C247 et les molécules portant une fonction 3- ary1-4-hydroxyquinolin-2(1H)-one telles que celles décrites dans la demande WO 2007/089 634 déposée par Merk, ou celles portant une fonction bisamide telles que celles décrites dans 20 la demande WO 2008/059 214 déposée par AstraZeneca. La présente invention concerne également un procédé de synthèse d'acides gras à courtes ou moyennes chaines, de préférence comprise entre 4 et 15 atomes de carbone, par culture d'un microorganisme eucaryote du règne des Fungi, naturellement oléagineux ou rendu oléagineux, dans lequel l'inhibiteur de l'acide gras synthase est choisi de préférence parmi la 25 cérulénine et ses analogues, le triclosan (5-chloro-2-(2,4-dichlorophenoxy)phenol), le TOFA (5 - (tétradécyloxy)-2-20 furannecarboxylique), le bischloroanthrabenzoxocinone, la thiolactomycine, la platensimycine ainsi que les analogues de ces molécules de préférence, le C75 (acide 4-méthylène-2-octy1-5-oxo-tétrahydro-furan-3-carboxylique), le C93 (ou FA593), le FAS31, 1' orlistat (N-Formyl-L-leucine (1 S)-1- [ [(2 S,3 S)-3-hexy1-4-oxo-2-ox 30 etanyl]methyl]dodecyl ester), le G5K837149A (dibenzènesulfonamide urée), l'isoniazide, le platencine, le pyrazinamide, l'éthionamide, le diazoborine, l'hexachlorophène, le diclofénac, l'épigallocatechin-3-gallate (EGCG), la lutéoline, la taxifoline, le kaempférol, la quercetine, l'apigénine, l'anthécotulide, l'anthécularine, la 4-hydroxyanthécotulide, la 4- acétoxyanthécotulide, le C247, et plus préférentiellement l'inhibiteur de l'acide gras synthase est la cérulénine.
La présente invention concerne également un procédé de synthèse d'acides gras à courtes ou moyennes chaines, de préférence comprise entre 4 et 15 atomes de carbone, par culture d'un microorganisme eucaryote du règne des Fungi, naturellement oléagineux ou rendu oléagineux, dans lequel ledit microorganisme est du genre Yarrowia, Saccharomyces, Rhodotorula, ou Rhodosporidium. Dans un mode particulier de réalisation du procédé selon l'invention, ledit microorganisme est la levure Yarrowia hpolytica ou Rhodotorula glutinis. Dans un mode plus particulier de réalisation du procédé selon l'invention, ledit microorganisme est la levure Yarrowia hpolytica.
Dans un autre mode particulier de réalisation du procédé selon l'invention, ledit l'inhibiteur de l'acide gras synthase est la cérulénine. Dans un autre mode particulier de réalisation du procédé selon l'invention, la cérulénine est introduite par ajout pulsé, unique ou multiples et successifs, dans le milieu de culture. L'ajout pulsé correspond à l'addition dans le milieu de culture d'une quantité précise de cérulénine. Cette quantité précise est proportionnelle à la quantité de microorganisme présente dans le milieu de culture. L'addition est réalisée dans un très court temps (quelques secondes), ce qui correspond à la définition du pulse. L'effet de la cérulénine pouvant disparaitre dans le temps, un ou plusieurs ajouts pulsés peuvent être réalisés. Le temps entre deux ajouts pulsés dépend de la dynamique de la réduction de l'effet de la cérulénine.
Dans un autre mode plus particulier de réalisation du procédé selon l'invention, la cérulénine est introduite par ajout en continu dans le milieu de culture. Ce débit dépend de la concentration de microorganismes présents, concentration qui évolue en permanence, la fourchette de débit est donc large : 0.4 mgcé,,,.11-1 à 20 mgcé,,,.11-1.
Dans un autre mode encore plus particulier de réalisation du procédé selon l'invention, la concentration de cérulénine varie de 1 à 25 mg/g de levure sèche, et de préférence de 1 à 14 mg/g de levure sèche. Dans le procédé selon l'invention, il est également envisageable de contrôler d'autres paramètres que celui de l'apport en inhibiteur de la FAS. En particulier, il pourrait être intéressant de maintenir le rapport entre la vitesse de consommation du carbone et la vitesse de consommation d'azote (rc/rN) à une valeur comprise entre 12 et 16 (moles de carbone consommé par mole d'azote consommé). Par ailleurs, dans le procédé selon l'invention, l'apport de phosphore dans le milieu de culture pourra être ajusté de manière à maintenir la teneur en phosphore intracellulaire de la levure à une valeur variant de 4 à 27 mg/g de biomasse. Par ailleurs, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que les acides gras à courtes ou moyennes chaines carbonées, de préférence comprises entre 4 et 15 atomes de carbones sont obtenus sous forme d'un mélange d'acides gras libres et de triglycérides.
L'invention a également pour objet les acides gras à courtes ou moyennes chaines carbonées susceptibles d'être obtenus par le procédé précédemment décrit tels que l'acide pentanoïque (C5 :0), l'acide héxanoïque (C6:0), l'acide heptanoïque (C7:0), l'acide octanoïque (C8:0), l'acide nonanoïque (C9:0), l'acide décanoïque (C10:0), l'acide dodécanoïque (C12:0), l'acide tétradécanoïque (C14:0), l'acide pentadécanoïque (C15 :0). L'utilisation des d'acides gras à courtes ou moyennes chaines carbonées, de préférence comprise entre 4 et 15 atomes de carbones, obtenus par le procédé de l'invention peut intervenir dans plusieurs domaines techniques distincts. Les acides gras à courtes ou moyennes chaines carbonées, de préférence compris entre 4 et 15 atomes de carbone tels qu'obtenus par le procédé selon l'invention pourront être utilisés dans le domaine de l'oléochimie tel que pour la production de lubrifiants, d'agents tensio-actifs, de solvants, de plastifiants, de polymères pour des applications d'adhésifs, de peinture, de colles, d'emballages, de mousses ou d'enrobage.
En particulier, les acides gras à courtes ou moyennes chaines carbonées, de préférence compris entre 4 et 15 atomes de carbone tels qu'obtenus par le procédé selon l'invention pourront être utilisés pour la production de molécules énergétiques, en particulier pour la production de biocarburants.
Les carburants pour l'aéronautique ont une longueur de chaine carbonée centrée sur C12 et C14; il est donc préférable d'obtenir des huiles de longueurs de chaines carbonées comprises entre C8 et C16 et préférentiellement proches de C12 et C14 afin de réduire le coût énergétique du post-traitement des huiles permettant d'obtenir les alcanes. Plus particulièrement, les acides gras à courtes ou moyennes chaines carbonées de préférence comprise entre 4 et 15 atomes de carbone tels qu'obtenus par le procédé selon l'invention pourront être utilisés pour le traitement cosmétique de la peau ou des cheveux. Les acides gras tels qu'obtenus par le procédé de l'invention pourront entrer dans la composition de shampoings, crèmes, gels et masques. Encore plus particulièrement, les acides gras à courtes ou moyennes chaines carbonées de préférence comprise entre 4 et 15 atomes de carbone tels qu'obtenus par le procédé selon l'invention pourront être utilisés dans le domaine de la santé et de la nutrition, tel que pour une utilisation en tant que médicaments. Les triglycérides à chaînes moyennes (TCM) sont préconisés dans certains cas pour rééquilibrer l'alimentation des personnes souffrant de troubles de l'absorption des graisses.
Ces TCM facilitent la co-absorption de nutriments liposolubles tels que vitamines A, D, E et K ou caroténoïdes. Les figures et les exemples suivants visent à illustrer davantage la présente invention et ne sauraient en aucun cas en restreindre la portée.
Figure 1 : Détail de l'anabolisme central des acides gras chez Yarrowia lipolytica. Figure 2: Evolution de la concentration en biomasse (g.1-') en fonction du temps (heure, h) lors de la culture en mode fed-batch de Y. lipolytica avec la mise en place d'une limitation en azote (symbole +) et l'injection d'un pulse de DMSO (10 mL) (symbole X) (Culture A).
Figure 3: Evolution du profil en acides gras pendant la phase d'accumulation de lipide avant (-2h), pendant (Oh) et après (15 mn, 1h, 3h) un pulse de DMSO (10 mL) pendant une culture fed-batch de Y. /ipo/ytica (Culture A). Figure 4: Evolution de la concentration en biomasse (g.1-') en fonction du temps (h) lors de la culture en mode fed-batch de Y. /ipo/ytica avec la mise en place d'une limitation en azote (symbole +) et l'injection de pulses de cérulénine de 7 mgcen1eninsx-1 (symbole X) (Culture B). Figure 5: Evolution du taux de croissance calculé à partir des données de la sonde de capacitance [h-1] en fonction du temps [h] lors de la culture en mode fed-batch de Y. lipo/ytica avec la mise en place d'une limitation en azote (symbole +) et l'injection de pulses de cérulénine de 7 mgcendeninsx 1 (symbole X). (Culture B) Figure 6: Evolution du profil en acides gras pendant la phase d'accumulation de lipide avant (-2h), pendant (Oh) et après (15 mn, 1h, 3h) un pulse de 7 mgcendeninsx 1 pendant une culture fed-batch de Y. lipo/ytica. (Culture B) Figure 7: Evolution de la teneur massique [gAG .gx-1] des différents acides gras majoritaires présents chez Y. lipo/ytica pendant la phase d'accumulation de lipide avant (- 2 h) et après (3h) un pulse de 7 mgcenden n.gx-ipendant une culture fed-batch. (Culture B) Figure 8: Profil des acides gras accumulés par Y. Lipolytica 2 h après un pulse de cérulénine de 7 mgcendenm.gx 'pendant une culture fed-batch en limitation d'azote (Culture B). Figure 9: Comparaison des profils en acide gras pendant la phase d'accumulation de lipide après 3h des pulses 1 et 2 pendant une culture fed-batch de Y. lipo/ytica. (Culture B). 1 - Matériels et méthodes 1.1 - Souche et milieux de culture La souche de Yarrowia hpolytica est une souche sauvage (Yarrowia hpolytica W29).
Des stocks de souche ont été réalisés à partir de précultures axéniques réalisées dans des fioles Erlenmeyer bafflées placées sur une table d'agitation rotative, avec un milieu riche ayant une concentration initiale en glucose de 10 g/L. En milieu de phase exponentielle, des échantillons de 1 mL ont été prélevés et additionnés de glycérol stérile (30 % en volume/volume). Puis ces stocks ont été conservés dans des flacons stériles à -80°C. Ces cultures concentrées congelées ont été utilisées pour ensemencer les différentes précultures à des fins de culture en mode alimentation discontinue. Les précultures de levure ont été effectuées dans deux fioles d'Erlenmeyer de 100 mL contenant 8 mL de milieu riche LB à 30°C pendant 16 h sur une table d'agitation rotative (100 tr/min). Les cultures ont été transférées dans deux fioles d'Erlenmeyer de 250 mL contenant 72 mL de milieu minéral (pH 5,6) ayant une concentration initiale en glucose de 10 g/L. Après 12 h à 30°C, les cultures d'un volume de 80 mL ont été utilisées pour ensemencer deux fioles d'Erlenmeyer de 5 L contenant 710 mL de milieu minéral avec des vitamines. Ces fioles ont été placées à incuber à 30°C pendant 12 h, avec une concentration initiale en glucose de 10 g/L. Le contenu d'une des fioles de la dernière culture a été utilisé pour ensemencer 8 L de milieu minéral dans un bioréacteur de 20 L. La série de précultures réalisées en parallèle est utilisée pour vérifier la reproductibilité des précultures. La composition du milieu de type LB est la suivante : peptone de caséine 10 g/L ; NaC1 9 g/L extrait autolytique de levure 5 g/L avec du glucose en concentration de 10 g/L.
La composition du milieu minéral est la suivante : K2HPO4 : 3 g/L ; (NH4)2SO4 : 3g/L ; NaH2PO4,H20 : 3 g/L ; MgSO4,7H20 : 1 g/L ; ZnSO4,7H20 : 0,04 g/L ; FeSO4,7H20 : 0,0163 g/L ; MnSO4,H20 : 0,0038 g/L ; CoC12,6H20 : 0,0005 g/L ; CuSO4,5H20 : 0,0009 g/L ; Na2MoSO4,2H20 : 0,00006 g/L ; CaC12,2H20 : 0,23 g/L ; H3B03 : 0,03 g/L ; et 10 mL de solution de vitamines. La solution de vitamines a été préparée à une concentration d'un facteur 1000 : d-biotine : 0,05 g/L, chlorhydrate de thiamine : 1 g/L, acide panthoténique : 1 g/L ; chlorhydrate de pyridoxol : 1 g/L ; acidenicotinique : 1 g/L, acide p-aminobenzoïque : 0,2 g/L, myo-inositol : 25 g/L. Avant stérilisation, le pH de ce milieu a été ajusté à 4,5 avec une solution de H3PO4 et à pH de travail (5,5) avec une solution d'ammoniaque. 1.2 - Cultures Des cultures en mode alimentation discontinue, également appelé Fed-batch, (8 L) sont effectuées dans un bioréacteur de 20 L (volume total) en utilisant le système de culture Braun Biostat E (Braun, Melsungen, Allemagne) sans limitation d'oxygène. La température est régulée à 28°C et le pH à 5,5 par addition d'une solution à 10 mol/L de NEI3 (phase de croissance) ou d'une solution de KOH (phase d'accumulation de lipides).
Un logiciel, élaboré dans le laboratoire des inventeurs, permet l'acquisition et le contrôle des valeurs des paramètres opératoires tels que vitesse d'agitation, pH, température, pression partielle d'oxygène dissous (DO), volumes et débits d'alimentation des bases et de l'agent antimousse. La pression dans le bioréacteur est régulée à 0,3 bar (pression relative). La quantité maximale d'agent antimousse (Struktol) ajoutée est égale à 0,5 mL par culture. Le bioréacteur est équipé de trois systèmes d'alimentations stériles (source de carbone, avantageusement du glucose seul, sel, ammoniaque ou hydroxyde de potassium) utilisant des pompes péristaltiques (Masterflex et Gilson). La concentration d'alimentation en source de carbone, avantageusement du glucose seul, est égale à 730 g/L. Les masses de la solution de source de carbone et de la solution d'ammoniac (ou d'hydroxyde de potassium) introduites dans le bioréacteur sont mesurées de manière continue par le suivi des masses des flacons stock des solutions (balances de marque Sartorius). Les concentrations en source de carbone et en azote dans le fermenteur sont estimées d'après l'équation des bilans de carbone et redox. Le débit d'évaporation est estimé à partir de la température de culture, de l'efficacité du condenseur du fermenteur et du débit d'aération. Le volume de culture est calculé d'après un bilan de matière réalisé à partir des apports en substrat, sel, ammoniaque, base, vitamines et agent antimousse et des sorties par évaporation, échantillonnage avec et sans biomasse. 1.3 - Agents chimiques Les produits chimiques (glycérol, sels, oligoéléments, acide ortho phosphorique et 20 NH3) sont fournis par Prolabo (France), et les vitamines par Sigma (E.U.A.). Tous ces produits sont de la plus haute qualité analytique disponible. Le cérélose pour les cultures en mode fed-batch est fourni par Roquette (France). 1.4 - Stratégie d'alimentation en glucose Au cours de la phase de croissance, un profil exponentiel du débit de la pompe 25 d'alimentation en source de carbone permet le maintien d'un taux de croissance constant. Au cours de la phase d'accumulation, un taux de croissance constant est maintenu de façon la plus stable possible par un débit exponentiel de la source en carbone. 1.5 - Stratégie d'alimentation en sels concentrés Le bioréacteur est alimenté par un débit de solution de sels concentrés correspondant à 30 1/10 du débit d'alimentation en substrat. La composition de la solution de sels concentrés est la suivante : KC1 : 20 g/L, Cu504,5H20 : 0,6 g/L, NaC1 : 20 g/L, Na2Mo04,2H20 : 0,094 g/L, MgSO4,7H20 : 27 g/L, CaC12,2H20 : 6,4 g/L, ZnSO4,7H20 : 7,7 g/L, FeSO4,7H20 : 3,97 g/L, MnSO4,H20 : 0,47 g/L, H3B03 : 0,3 g/L, CoC12,6H20 : 0,3 g/L, H3PO4 : 46,7 g/L. 1.6 - Stratégie d'alimentation en vitamines Toutes les cultures sont effectuées avec une alimentation séquencée en vitamines en fonction du taux de croissance : des quantités de 0,1 % (vol/vol) de solution de vitamines sont ajoutées lors de production de 10 g/L de biomasse. 1.7 - Stratégie d'alimentation en ammonium Au cours de la phase de croissance, l'azote est ajouté à l'aide de la pompe de base pour la régulation de pH à la valeur constante égale à 5,5. Au cours de la phase de production de lipides, l'apport en azote est contrôlé par une pompe péristaltique avec un débit exponentiel, variant de 0.00014 L.11-1 à 0.004 L.11-1, de solution de NEI3 (5 mol/L) afin de maintenir une vitesse de croissance spécifique constante ; le pH est régulé par apport d'une solution de KOH (10 mol/L). 2. Méthodes analytiques 2.1 - Quantification et qualification de la biomasse La concentration en levure est déterminée par des mesures spectrophotométriques à 600 nm dans un spectrophotomètre HITACHI U-1100 dans une cellule en quartz ayant un trajet optique de 0,2 cm. Des dilutions de l'échantillon sont effectuées de telle sorte que la densité optique soit comprise dans la plage de 0,1 à 0,6 UA. Pour chaque échantillon, la moyenne de trois mesures est calculée. Pour la détermination de la masse sèche des cellules, des échantillons de culture (5 à 10 ml) sont recueillis par filtration sur une membrane de 0,45 mm (Sartorius) et sont séchés à 200 mm d'Hg et 60°C pendant 48 h jusqu'à obtention d'une masse constante. Une estimation en ligne de la concentration de cellules actives est réalisée grâce à l'utilisation d'une sonde à capacitance (Fogale). Cette technologie est basée sur la corrélation entre le volume de la biomasse catalytique viable et la variation de la permittivité diélectrique du milieu dans lequel les cellules sont dispersées. Toutes les concentrations cellulaires seront exprimées en gms/L soit la masse sèche de levure par unité de volume de culture. La quantité de cendre est déterminée après deux combustions totales des filtres de masse sèche avec biomasse en présence de 200 mL de solution à 20 g/L de NH4NO3 dans un four à moufle à 550°C pendant 12 h à chaque fois. La formule de la biomasse a été déterminée à l'ENSIACET (Toulouse, France) par analyse élémentaire de C, H, 0 et N et des cendres. En raison d'une accumulation importante de lipides, la formule de la biomasse varie au cours de la culture de CF11,8600,52N0,13 (phase de croissance) à CH2,0000,59N0,07(phase d'accumulation). 2.2 - Echantillonnage Toutes les 20 min, un échantillon de surnageant est recueilli par un système de filtration tangentielle associé à un collecteur automatique de fractions. Un échantillon de milieu de culture est recueilli chaque heure directement à travers un septum. Tous les échantillons sont stockés à -20°C. 2.3 - Analyse des gaz de sortie de réacteur L'analyse du gaz à la sortie du fermenteur est effectuée, toutes les 20 secondes, par spectroscopie de masse en sortie du condenseur de gaz du fermenteur. Le spectromètre de masse (PRIMA 600s ; VG Gas, Manchester, Royaume-Uni) est utilisé en raison de sa précision pour mesurer les compositions en CO2, 02, N2 et Ar.
La vitesse de consommation d'02 et la vitesse de production de CO2 sont calculées d'après les bilans de matière, combinant le volume du gaz dans le réacteur, le débit d'air entrant (mesuré par un débitmètre massique), la température, l'humidité et la pression et la composition des gaz d'entrée et de sortie. 2.4 - Extraction et quantification des lipides L'extraction des lipides cellulaires totaux est effectuée selon la technique de Cescut Jet al. (PloS one ; 6 (11) : e27966, 2011) qui est une automatisation du mode opératoire de Bligh et Dyer, comme suit : l'extraction au gradient de solvant se réalise dans un extracteur liquide sous pression (SPE). 500 mg de lyophilisats sont placés dans des cellules d'extraction. 3 différents mélanges de solvants sont injectés sous pression à chaud dans la cellule (100°C, 100 bars). Les mélanges de solvants successifs sont : méthanol/chloroforme (2:1, vol/vol), (1:1, vol/vol) et enfin (1:2, vol/vol). Les trois phases organiques sont mélangées et lavées deux fois avec une solution à 25 % (vol/vol) de solution à 0,88 % de KC1 (masse/volume) pendant 15 min sous agitation douce. Par séparation liquide/liquide après centrifugation (5000 x g, 10 min) la phase organique est récupérée. Finalement, les lipides sont recueillis après l'évaporation des solvants dans un évaporateur centrifugeuse (45°C ; 500 g) de marque Genevac. La teneur totale en lipides est quantifiée par une méthode gravimétrique. L'extrait de lipides est maintenu dans un mélange chloroforme/méthanol à -20°C. 2.5 - Evaluation des profils acides gras Les acides gras libres ou liés sont méthylés en ester méthylique d'acides gras (FAME) en utilisant de l'hydroxyde de triméthylsulfonium (TMSH, 0,2 M dans le méthanol, Macherey-Nagel, Allemagne). L'analyse est effectuée avec un appareil de chromatographie en phase gazeuse Hewlett-Packard 5890 équipé d'une colonne en silice fondue WCOT de 50 m x 250 mm x 25 mm (VARIAN, E.U.A.) et d'un FID, dans les conditions suivantes : phase mobile : N2, débit 50 mL.min-1, température du four : 50-75°C à 9°C.min-1, puis 75-140°C à 13°C.min-1, puis 140-180°C.min-1 à 1,5°C.min-1, puis 180-240°C à 4,5°C.min-1, température d'injecteur 140°C, température du détecteur 250°C. 3. Résultats D'après des études préliminaires où la masse de cérulénine (antibiotique) par unité de masse de biomasse (x) varie entre 1 mgcen1eninsx-1 et 25 mgcen1enin.gx-1, il a été établi qu'une dose de 15 mgcen1eninsx-1 inhibe totalement la croissance. Il est donc retenu une dose de 7 ligcen1enin.mgx-1 pour une inhibition partielle de la croissance et la quantification de la modulation de la vitesse d'élongation des acides gras de Y.lipolytica. Deux cultures sont réalisées. La culture A, appelée culture de contrôle, permet d'identifier l'influence du DMSO, solvant de l'antibiotique, sur la physiologie de la levure. Le DMSO est un solvant indispensable pour dissoudre l'antibiotique qui est ajouté lors d'un pulse dans la culture B. Toutes les conditions opératoires sont identiques lors de ces deux cultures.
Culture A Les résultats de la culture A sont illustrés par les Figure 2 et Figure 3 ; ils montrent l'évolution de la croissance et des profils acides gras en fonction du temps de culture. Il apparait que la dynamique de la croissance n'est pas influencée par l'injection de DMSO. La stabilité du profil en acide gras pendant la période comprise entre + 15 min et +3 h par rapport au pulse de DMSO complète l'analyse en révélant que le DMSO n'affecte pas le métabolisme d'accumulation de lipides.
En conclusion : Dans la culture A de contrôle, le pulse de DMSO n'influence pas le taux de croissance de la levure ni le profil en acide gras. Culture B Un pulse de cérulénine est réalisé dans la culture B à 28,2h (Figure 4) soit 11h après le début de la phase de la limitation en azote, ce pulse déclenche l'induction de la biosynthèse lipidique avec un taux de croissance maintenu à 0,045 fil (variation maximale de 5 %), - lorsqu'une concentration cellulaire de 6,9 gx.L1 est atteinte. Au niveau de l'évolution de la concentration cellulaire en fonction du temps, la dynamique de croissance n'est pas influencée par le pulse de cérulénine pendant les 10 h de culture suivant l'injection. Comme reporté sur la figure 5, la variation du taux de croissance pendant les 10 h suivant la première injection de cérulénine est inférieure à 5%. Il est montré que l'apport d'une dose de cérulénine de 7 jagcenden n.Mgx-1 lors d'une culture de Y. lipolytica en condition de limitation d'azote n'a pas d'effet sur la dynamique de croissance de la levure.
Durant toute la phase de limitation azotée, à partir du débit du substrat imposé, il est quantifié une accumulation d'acide gras totaux conformément aux travaux antérieurs (Cescut et al., PloS one ; 6 (11) : e27966, 2011) avec une absence de sécrétion d'acide citrique : 20 % d'acides gras totaux sont accumulés durant la totalité de la phase de limitation azote (50 h) dont 3 % durant les 10 h suivant le pulse de cérulénine. Du point de vue du comportement cinétique, il est observé, suite à l'apport de cérulénine, une diminution de la vitesse spécifique de production d'acide gras de 0,004 gAG.gx.11-1 à 0,0017 gAG.gx.h-1. Du point de vue du profil lipidique, il est observé des évolutions importantes de la composition en acides gras des lipides accumulés avant et après le pulse de cérulénine. En notant 0 h, le temps de l'injection (temps de culture 28,2 h), il apparait que le profil en acide gras avant l'apport en cérulénine est majoritairement composé de C16:1 (17 %), C18:2 (31 %) et C16:0 (29 %) avec des teneurs en acide gras à courte ou moyenne chaine (moins de 15 atomes de carbone) inférieures à 1 %. Le degré d'insaturation, défini par le rapport entre le nombre de moles d'insaturation et le nombre de moles d'acide gras, est de 0,95 +/_ 2% et la longueur moyenne de chaîne carbonée, définie par le nombre moyen de carbone de l'ensemble des acides gras, est de 16,98 +L2%. Après le pulse de cérulénine, dès 15 min, on observe l'apparition d'acides gras à courte chaîne. Cette accumulation d'acide gras atteint 24,5 % après 3 h de culture. C'est un résultat inattendu.
Entre l'injection et 3 h après l'injection de cérulénine, Y. /ipo/ytica synthétise et accumule des acides gras néo-synthétisés avec un degré d'insaturation moyen de 0,6 et un nombre moyen d'atomes de carbone de 12,74 carbone (Table 1). Les teneurs massiques en acide gras de longueur de chaine carbonée C4:0-C8:0, C9:0- C12:0 et C13:0-C15:0 augmentent à partir du pulse de cérulénine : la variation de masse par rapport à la composition lipidique antérieure au pulse atteint respectivement 0,05 gAG.g.-1, 0,07 gAG.gx-1 et 0,07 gAG.gx-1 en 3 h pour les trois groupes précités (figure 6). Par contre, la teneur massique en acide palmitique (C16:0) augmente de 0,014 gAG.g'-1 et l'acide palmitoléique (C16:1) de 0,023 gAG.g'-1 par rapport à la composition lipidique antérieure au pulse (figure 7). La vitesse spécifique de synthèse de l'acide gras de plus courte ou moyenne chaine est multipliée par un facteur 14 lorsqu'on compare les dynamiques avant et 3 h après le pulse. En définissant Fru, la fraction massique d'un groupe d'acides gras de longueur de chaine carbonée Cp à Cp par rapport à la masse totale d'acide gras accumulée, il apparait que F4,8 est multiplié par 70 en 3 h, F9,12 par 28 et F13,15 par 15. Pour les acides gras de longueur de chaine supérieure à 15, une forte diminution de la fraction massique des acide gras C16:0 et C18:2 est observée alors que la fraction massique du C18:3 augmente jusqu'à 6% (figure 8). Ceci se traduit au niveau du degré d'insaturation par une diminution de 0,95 à 0,75 en 3 h et une réduction de la longueur de la chaine carbonée de 16,98 à 15,3.
Table 1: Degré d'insaturation et longueur des chaines carbonées des acides gras libres ou estérifiés présents chez Y. /ipo/ytica pendant la phase d'accumulation de lipide avant, pendant et après un pulse de 7 mgcendemn.gx -1 lors d'une culture fed-batch de Y .lipolytica. (Culture B) -2h Oh + 15 min. + lh + 3h Degré d'insaturation 0,97 0,95 0,92 0,73 0,75 Longueur de la chaine carbonée 16,97 16,98 16,83 16,3 15,3 L'effet de l'inhibition partielle de la cinétique d'élongation des acides gras par le pulse de cérulénine disparait après 9h de culture : le profil acides gras redevient identique au profil d'acides gras accumulés avant le pulse.
Une expérience complémentaire d'ajout d'un second pulse permet de reproduire les mêmes phénomènes biologiques qu'après le premier pulse. Les profils en acide gras 3 h après le pulse 1 et 2 sont illustrés par la Figure 9. Ils sont tous les deux similaires pour l'ensemble des acides gras.
Conclusions Une dose de 7 mg n.gx -1 de cérulénine permet, pendant la phase de synthèse de lipides - --acenden chez Y. /ipo/ytica sur glucose en mode fed batch : -ll le maintien de la dynamique de croissance et de la synthèse de lipides, -ll l'accumulation d'acides gras à courtes chaînes (C4-C15) par l'inhibition partielle de la cinétique d'élongation des acides gras. Une stratégie d'apports séquences de doses en cérulénine s'avère indispensable pour maintenir la modulation du profil d'acide gras synthétisés par Y. /ipo/ytica en favorisant l'accumulation d'acides gras à courte ou moyenne chaine.15

Claims (13)

  1. REVENDICATIONS1. Procédé de synthèse d'acides gras à courte ou moyenne chaine, de préférence comprise entre 4 et 15 atomes de carbones, par culture d'un microorganisme eucaryote du règne des Fungi, naturellement oléagineux ou rendu oléagineux, caractérisé en ce que la culture est réalisée en présence d'un inhibiteur de l'acide gras synthase dans le milieu de culture.
  2. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'inhibiteur de l'acide gras synthase est choisi de préférence parmi la cérulénine et ses analogues, le triclosan (5- chloro-2-(2,4-dichlorophenoxy)phenol), le TOFA (5 - (tétradécyloxy)-2-20 furannecarboxylique), le bischloroanthrabenzoxocinone, la thiolactomycine, la platensimycine ainsi que les analogues de ces molécules de préférence, le C75 (acide 4-méthylène-2-octy1-5-oxo-tétrahydro-furan-3-carboxylique), le C93 (ou FAS93), le FAS31, l' orlistat (N-Formyl-L-leucine (1 S)-1 - [[(2S,3 S)-3-hexy1-4-oxo-2-ox etanyl]methyl]dodecyl ester), le GSK837149A (dibenzènesulfonamide urée), l'isoniazide, le platencine, le pyrazinamide, l'éthionamide, le diazoborine, l'hexachlorophène, le diclofénac, l'épigallocatechin-3-gallate (EGCG), la lutéoline, la taxifoline, le kaempférol, la quercetine, l'apigénine, 1' anthécotulide, l'anthécularine, la 4-hydroxyanthécotulide, la 4-acétoxyanthécotulide, le C247, et plus préférentiellement l'inhibiteur de l'acide gras synthase est la cérulénine.
  3. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le microorganisme est du genre Yarrowia, Saccharomyces, Rhodotorula, ou Rhodosporidium.
  4. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le microorganisme est la levure Yarrowia lipolytica ou Rhodotorula glutinis, de preférence Yarrowia lipolytica.
  5. 5. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la cérulénine est introduite soit par ajout en continu, soit par ajout pulsé, unique ou multiples et successifs, dans le milieu de culture, plus préférentiellement par ajout en continu.
  6. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la concentration de cérulénine varie de 1 à 25 mg/g de levure sèche et de préférence de 1 à 14 mg/g de levure sèche.
  7. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 caractérisé en ce que le rapport entre la vitesse de consommation du carbone et la vitesse de consommation d'azote (rc/rN) a une valeur comprise entre 12 et 16 moles de carbone consommé par mole d'azote consommé.
  8. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisé en ce que le l'apport de phosphore dans le milieu de culture pourra être ajusté de manière à maintenir la teneur en phosphore intracellulaire de la levure à une valeur variant de 4 à 27 mg/g de biomasse.
  9. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que les acides gras à courtes ou moyennes chaines, de préférence comprise entre 4 et 15 atomes de carbone sont obtenus sous forme d'un mélange d'acides gras libres et de triglycérides.
  10. 10. Utilisation des acides gras à courtes ou moyennes chaines, de préférence compris entre 4 et 15 atomes de carbone tels qu'obtenus par le procédé selon l'une quelconques des revendications 1 à 9, dans le domaine de l'oléochimie tel que pour la production de lubrifiants, d'additifs, d'agents tensio-actifs, de solvants, de plastifiants, de polymères pour des applications d'adhésifs, de peinture, de colles, d'emballages, de mousses ou d'enrobage.
  11. 11. Utilisation des acides gras à courtes ou moyennes chaines, de préférence compris entre 4 et 15 atomes de carbone tels qu'obtenus par le procédé selon l'une des revendications 1 à 9 pour la production de molécules énergétiques, en particulier pour la production de biocarburants.
  12. 12. Utilisation des acides gras à courtes ou moyennes chaines de préférence comprise entre 4 et 15 atomes de carbone tels qu'obtenus par le procédé selon l'une des revendications 1 à 9 pour le traitement cosmétique de la peau ou des cheveux.30
  13. 13. Acides gras à courtes ou moyennes chaines de préférence comprise entre 4 et 15 atomes de carbone tels qu'obtenus par le procédé selon l'une des revendications 1 à 9 pour leur utilisation en tant que médicament.5
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