FR3021330A1

FR3021330A1 - METHOD FOR ASSAYING DNA APTAMERS

Info

Publication number: FR3021330A1
Application number: FR1454506A
Authority: FR
Inventors: Gerald Perret; Clement Costa
Original assignee: LFB SA
Current assignee: LFB SA
Priority date: 2014-05-20
Filing date: 2014-05-20
Publication date: 2015-11-27
Also published as: WO2015177740A1

Abstract

La présente invention concerne un procédé de dosage d'acides nucléiques de type ADN, susceptibles d'être relargués dans un liquide d'écoulement d'une colonne de chromatographie par affinité, contenant un support sur lequel sont immobilisés lesdits aptamères ADN, lesdits acides nucléiques de type ADN représentant les aptamères ADN entiers, ou un fragment de ceux-ci, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) fournir un échantillon dudit liquide d'écoulement susceptible de contenir des acides nucléiques de type ADN relargués par le support de la colonne de chromatographie par affinité ; b) réaliser une amplification par PCR des acides nucléiques de type ADN contenus dans ledit échantillon, en utilisant un mélange réactionnel comprenant (i) un couple d'amorces nucléotidiques sens et anti-sens non dégénérées spécifiques desdits acides nucléiques de type ADN et (ii) un agent intercalant fluorescent, afin d'obtenir un produit d'amplification sous la forme d'acides nucléiques ADN double brins complexés avec ledit agent intercalant fluorescent ; et c) quantifier les aptamères ADN, ou leurs fragments, en mesurant le niveau d'un signal de fluorescence généré par ledit produit d'amplification et en comparant ce niveau de fluorescence à celui obtenu par une gamme standard générée par une concentration connue dudit aptamère ADN.The present invention relates to a method for assaying nucleic acids of the DNA type, capable of being salted out in a flow liquid of an affinity chromatography column, containing a support on which said DNA aptamers are immobilized, said nucleic acids DNA type representing the entire DNA aptamers, or a fragment thereof, said method comprising the steps of: a) providing a sample of said flow liquid likely to contain DNA nucleic acids released from the support of the column affinity chromatography; b) performing PCR amplification of the DNA nucleic acids contained in said sample, using a reaction mixture comprising (i) a pair of nucleotide non-degenerate sense and antisense primers specific for said DNA nucleic acids and (ii) ) a fluorescent intercalating agent, to obtain an amplification product in the form of double-stranded DNA nucleic acids complexed with said fluorescent intercalating agent; and c) quantifying the DNA aptamers, or fragments thereof, by measuring the level of a fluorescence signal generated by said amplification product and comparing this level of fluorescence to that obtained by a standard range generated by a known concentration of said aptamer DNA.

Description

DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention se rapporte à un procédé de dosage d'acides nucléiques de type ADN, issus d'un relargage aptamères ADN immobilisés sur le support d'une colonne de chromatographie par affinité, permettant de contrôler l'intégrité de ladite colonne et la qualité du produit purifié. Ce procédé permet, notamment, de mesurer le relargage des aptamères ADN à partir du support. Plus précisément, le dosage des aptamères de type ADN est réalisé par la méthode de PCR quantitative, dans un mélange réactionnel contenant i) un couple d'amorces nucléotidiques non dégénérées, spécifiques desdits aptamères ADN, et ii) un agent intercalant fluorescent s'hybridant avec le produit de l'amplification, c'est-à-dire des acides nucléiques ADN double brins. ART ANTERIEUR Les aptamères sont des oligonucléotides, synthétiques, de type ARN ou ADN (simple brin ou double brins), capables de se lier spécifiquement à un ligand. Ce ligand peut être lui-même de nature très variée, notamment des protéines, des sucres, des lipides, des petites molécules organiques, voire même des cellules entières. Les aptamères nucléiques ARN ou ADN sont classiquement sélectionnés par la mise en oeuvre du procédé SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) décrit par Tuerk et al. (1990, Science, Vol. 249 : 505-510), ou l'une de ses nombreuses variantes. Le procédé SELEX a été mis au point afin de sélectionner des aptamères nucléiques se liant spécifiquement à un ligand d'intérêt. Une banque combinatoire d'oligonucléotides synthétiques est utilisée comme produit de départ. Les acides nucléiques qui ont une bonne affinité et une bonne spécificité pour le ligand d'intérêt sont sélectionnés à la suite d'une pluralité de cycles successifs de fixation/amplification sur le ligand cible. De par leurs caractéristiques de liaison spécifique à très haute affinité à un ligand cible, les aptamères nucléiques sont souvent considérés comme étant des anticorps de nature nucléotidiques. De plus, les aptamères nucléiques sont décrit comme non immunogènes, n'induisent pas d'effets secondaires résultant d'une réponse immunitaire non voulue et sont manipulables dans des conditions de fortes concentration saline et à des pH très variés, notamment à pH basique. Grâce à toutes ces caractéristiques, et de manière plus générale, les aptamères nucléiques trouvent une application dans des domaines aussi variés que : - (i) la détection de ligands cibles, en particulier pour le diagnostic médical ; c'est le cas par exemple de l'identification et la détection de biomarqueurs pour certaines pathologies, la détection de toxine bactérienne, voire la détection et l'isolation de cellules entières, comme par exemple des bactéries pathogènes ; - (ii) l'utilisation des aptamères pour l'adressage de principes actifs de manière ciblées vers un type de cellules spécifique, voire à l'échelle cellulaire ; - (iii) la conception de nouveaux principes actifs ; et - (iv) la purification de ligands cibles, en particulier la purification de protéines d'intérêt thérapeutique. Dans le cadre plus spécifique de la purification de molécules d'intérêts par chromatographie d'affinité, divers travaux ont par ailleurs rapporté la mise au point de méthodes d'obtention de supports solides sur lesquels sont immobilisés des aptamères nucléiques (Romig et al. (1999, J Chrommatography B : Biomedical Sciences et Applications, Vol. 731 (2) : 275-284), Deng et al. (2003, J Chromatogr A, Vol. 1005 (12) : 123-130), par Connor et al. (2006, J Chromatogr A, Vol. 1111 (2) : 115-119), Ravelet et al. (2006, J Chromatogr A, Vol. 1117 (1) : 1-10), Ruta et al. (2008, Anal Bioanal Chem, Vol. 390 (4) : 1051-1057), Zhao et al. (2008, Anal Chem, Vol. 80 (10) : 3915-3920 ; 2008, Anal Chem, Vol. 80 (19) : 7586-7593)). Toutefois, les supports décrits dans ces publications ont en général une utilisation qui est restreinte à des séparations de petites quantités de ligands et ne sont pas adaptés à la purification de protéines, par exemple de protéines d'intérêt thérapeutique, à une échelle industrielle. Avec le temps, certains auteurs se sont attachés à la conception de supports de chromatographie d'affinité à base d' aptamères nucléiques susceptibles de pouvoir être compatibles avec une purification de protéines à l'échelle industrielle. On peut citer par exemple les travaux de Han et al. (2012, J Chomatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, Vol. 903 : 112-117), qui ont visé la mise au point d'un support pour chromatographie d'affinité sur lequel sont immobilisés des aptamères nucléiques anti-lysozyme.FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to a method for assaying nucleic acids of DNA type, resulting from a DNA aptamer release, immobilized on the support of an affinity chromatography column, making it possible to control the integrity of the said column and the quality of the purified product. This method makes it possible, in particular, to measure the release of DNA aptamers from the support. More specifically, the assay of DNA-type aptamers is carried out by the quantitative PCR method, in a reaction mixture containing i) a pair of nondegenerate nucleotide primers, specific for said DNA aptamers, and ii) a fluorescent intercalating agent which hybridises with the amplification product, i.e., double-stranded DNA nucleic acids. PRIOR ART Aptamers are synthetic oligonucleotides of the RNA or DNA (single-stranded or double-stranded) type, capable of binding specifically to a ligand. This ligand can itself be very varied in nature, including proteins, sugars, lipids, small organic molecules, or even whole cells. RNA or DNA nucleic aptamers are conventionally selected by the use of the SELEX method (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) described by Tuerk et al. (1990, Science, Vol 249: 505-510), or one of its many variants. The SELEX method has been developed to select nucleic aptamers specifically binding to a ligand of interest. A combinatorial library of synthetic oligonucleotides is used as the starting material. Nucleic acids that have good affinity and good specificity for the ligand of interest are selected following a plurality of successive cycles of fixation / amplification on the target ligand. Because of their specific binding characteristics with a very high affinity to a target ligand, nucleic aptamers are often considered to be antibodies of nucleotide nature. In addition, the nucleic aptamers are described as non-immunogenic, do not induce side effects resulting from an unwanted immune response and are manipulable under conditions of high salt concentration and at very varied pH, especially at basic pH. Thanks to all these characteristics, and more generally, the nucleic aptamers find application in fields as varied as: - (i) the detection of target ligands, in particular for medical diagnosis; this is the case, for example, of the identification and detection of biomarkers for certain pathologies, the detection of bacterial toxin, and even the detection and isolation of whole cells, such as, for example, pathogenic bacteria; - (ii) the use of aptamers for addressing active principles in a targeted manner to a specific type of cell, or even at the cellular level; - (iii) the design of new active ingredients; and (iv) purifying target ligands, particularly the purification of proteins of therapeutic interest. In the more specific context of the purification of molecules of interest by affinity chromatography, various studies have also reported the development of methods for obtaining solid supports on which nucleic aptamers are immobilized (Romig et al. 1999, J Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications, Vol 731 (2): 275-284), Deng et al (2003, J Chromatogr A, Vol 1005 (12): 123-130), by Connor et al. (2006, J Chromatogr A, Vol 1111 (2): 115-119), Ravelet et al (2006, J Chromatogr A, Vol 1117 (1): 1-10), Ruta et al (2008, Anal Bioanal Chem, Vol 390 (4): 1051-1057), Zhao et al (2008, Anal Chem, Vol 80 (10): 3915-3920, 2008, Anal Chem, Vol 80 (19): 7586 -7593)). However, the supports described in these publications generally have a use which is restricted to separations of small amounts of ligands and are not suitable for the purification of proteins, for example proteins of therapeutic interest, on an industrial scale. Over time, some authors have focused on the design of nucleotide aptamer affinity chromatography media that may be compatible with commercial protein purification. For example, the work of Han et al. (2012, Chomatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, Vol 903: 112-117), which aimed at the development of a support for affinity chromatography on which anti-lysozyme nucleic aptamers are immobilized.

A terme, des supports de chromatographie d'affinité à base d'aptamères nucléiques, aptes à être mis en oeuvre de manière fiable, reproductible, durable et à des coûts compatibles avec une utilisation à l'échelle industrielle seront rendus accessibles au public. Le demandeur a notamment mis au point un support de chromatographie utilisable à l'échelle industrielle (WO 2012/090183). La disponibilité concrète de supports d'affinité à base d'aptamères nucléiques pour les industriels rendra nécessaire la conception de protocoles complets de purification, dont les conditions opératoires seront spécifiquement adaptées à cette nouvelle technologie.Eventually, nucleic aptamer-based affinity chromatography supports that can be used in a reliable, reproducible, sustainable manner and at costs compatible with use on an industrial scale will be made accessible to the public. The applicant has in particular developed a chromatography medium that can be used on an industrial scale (WO 2012/090183). The practical availability of affinity supports based on nucleic aptamers for manufacturers will make it necessary to design complete purification protocols, whose operating conditions will be specifically adapted to this new technology.

Comme cela est classique, de tels protocoles de purification, notamment lorsqu'ils sont destinés à la purification de protéines d'intérêt thérapeutique destinées à être administrées à l'homme ou l'animal, devront comprendre une ou plusieurs étapes (i) de détermination de l'intégrité du support d'affinité, lequel est susceptible de subir des détériorations avec les durées croissantes d'utilisation, et (ii) de détermination qualitative des produits purifiés obtenus. En effet, lors du procédé de séparation de protéines par chromatographie d'affinité, par exemple au moyen de colonnes dans lesquelles sont fixés des molécules de protéine A ou des anticorps spécifiques, il est bien connu que le support d'affinité subit des détériorations. Notamment, ces détériorations peuvent résulter en un relargage des substances qui se détachent du support, et entraînant dans le flux d'écoulement de la colonne, comme par exemple des fragments de protéine A ainsi que des anticorps ou des fragments d'anticorps. En conséquence, pour ces techniques d'immuno-affinité, des tests de mesure de l'intégrité du support sont couramment réalisés, lesquels incluent une détection et/ou une quantification des anticorps ou fragments d'anticorps dans le flux d'écoulement de la colonne de chromatographie ou dans la préparation de protéine purifiée obtenue. Ainsi, lorsque les ligands d'intérêt ont un usage médical chez l'homme ou l'animal, le demandeur pense qu'il est essentiel de vérifier l'intégrité du support d'affinité à base d'aptamères nucléiques, aux fins notamment de vérifier la survenue d'un éventuel relargage de l'aptamère nucléique au cours de la purification, de nature à contaminer la protéine purifiée.As is conventional, such purification protocols, especially when they are intended for the purification of proteins of therapeutic interest intended to be administered to humans or animals, will have to comprise one or more stages of (i) determination. the integrity of the affinity support, which is liable to deterioration with increasing periods of use, and (ii) qualitative determination of the purified products obtained. Indeed, during the process of protein separation by affinity chromatography, for example by means of columns in which are fixed protein A molecules or specific antibodies, it is well known that the affinity support undergoes deterioration. In particular, these deteriorations may result in the release of the substances which become detached from the support and which result in the flow of the column, for example protein A fragments as well as antibodies or antibody fragments. Consequently, for these immunoaffinity techniques, assays for measuring the integrity of the support are commonly performed, which include detection and / or quantification of the antibodies or antibody fragments in the flow of the chromatography column or in the purified protein preparation obtained. Thus, when the ligands of interest have a medical use in humans or animals, the applicant believes that it is essential to verify the integrity of the nucleic aptamer-based affinity support, in particular for the purposes of to check the occurrence of a possible release of the nucleic aptamer during purification, such as to contaminate the purified protein.

De manière similaire à ce qui est pratiqué pour l'utilisation de supports de chromatographie couramment utilisés, le demandeur a estimé qu'il était important de concevoir des tests de mesure de l'intégrité du support de séparation par affinité, lorsque des supports de chromatographie d'affinité basés sur des aptamères nucléiques seront concrètement utilisés dans des processus de séparation des protéines thérapeutiques, à l'échelle industrielle. Ces tests de mesure devront être intégrés dans les protocoles d'évaluation de l'étape de purification à l'échelle industrielle et potentiellement dans les tests de libération des protéines thérapeutiques purifiées. Il existe donc un besoin évident de mettre au point un protocole de dosage de ces aptamères ADN, susceptibles d'être relargués par une colonne de chromatographie d'affinité, qui soit facilement mis en oeuvre à l'échelle industrielle, reproductible, très sensible et peu coûteux. RESUME DE L'INVENTION Selon un premier aspect, l'invention concerne un procédé de dosage d'acides nucléiques de type ADN, susceptibles d'être relargués dans un liquide d'écoulement d'une colonne de chromatographie par affinité, contenant un support sur lequel sont immobilisés lesdits aptamères ADN, lesdits acides nucléiques de type ADN représentant les aptamères ADN entiers, « ou un fragment de ceux-ci », ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) fournir un échantillon dudit liquide d'écoulement susceptible de contenir des acides nucléiques de type ADN relargués par le support de la colonne de chromatographie par affinité ; b) réaliser une amplification par PCR des acides nucléiques de type ADN contenus dans ledit échantillon, en utilisant un mélange réactionnel comprenant (i) un couple d'amorces nucléotidiques sens et anti-sens non dégénérées spécifiques desdits acides nucléiques de type ADN et (ii) un agent intercalant fluorescent, afin d'obtenir un produit d'amplification sous la forme d'acides nucléiques ADN double brins complexés avec ledit agent intercalant fluorescent ; et c) quantifier les aptamères ADN, ou leurs fragments, en mesurant le niveau d'un signal de fluorescence généré par ledit produit d'amplification et en comparant ce niveau de fluorescence à celui obtenu par une gamme standard générée par une concentration connue dudit aptamère ADN. De manière avantageuse, le liquide d'écoulement est obtenu après une étape choisie parmi la charge de l'échantillon à analyser sur la colonne de chromatographie par affinité, le lavage de la colonne, l'élution et la régénération de ladite colonne de chromatographie par affinité. Selon un mode préféré de réalisation, l'amorce nucléotidique non dégénérée anti-sens s'apparie à une première extrémité de l'acide nucléique de type ADN à doser. De la même manière, la séquence complémentaire de l'amorce nucléotidique 10 non dégénérée sens s'apparie à une deuxième extrémité de l'acide nucléique complémentaire de l'ADN à doser. Les amorces nucléotidiques sens et anti-sens ne se chevauchent pas. De manière avantageuse, chaque amorce nucléotidique non dégénérée recouvre au moins 7 bases de la séquence de l'acide nucléique de type ADN à doser et au maximum 15 50% de la séquence de l'acide nucléique de type ADN à doser. De préférence, le couple d'amorces nucléotidiques non dégénérées est contenu dans le mélange réactionnel à une concentration finale allant de 50 à 1000 nM, avantageusement au moins 800 nM. 20 Selon un mode de réalisation préféré, l'agent intercalant fluorescent est choisi parmi les fluorophores de la famille des cyanines asymétriques, avantageusement un fluorophore de formule chimique C32H37N4S, encore plus avantageusement un fluorophore de numéro CAS 163795-75-3. En pratique, le fluorophore est connue sous le nom de SYBRTM Green. 25 De manière avantageuse, l'étape de PCR quantitative (ou Q-PCR) comprend 20 à 50 cycles, avantageusement 40 cycles. De préférence, chaque cycle contient une étape de dénaturation de 15 secondes à 95°C et une étape d'hybridation et d'élongation de 1 minute à 60°C. Un deuxième aspect de l'invention concerne l'utilisation du procédé 30 précédemment décrit pour déterminer l'intégrité de la colonne de chromatographie par affinité au cours de sa mise en oeuvre.Similar to what is practiced for the use of commonly used chromatographic media, the Applicant has found it important to design assays for measuring the integrity of the affinity separation support when chromatographic media are used. Nucleic aptamer-based affinity will be concretely used in therapeutic protein separation processes on an industrial scale. These measurement tests will have to be integrated in the evaluation protocols of the purification stage on an industrial scale and potentially in the release tests of the purified therapeutic proteins. There is therefore a clear need to develop a protocol for assaying these DNA aptamers, capable of being released by an affinity chromatography column, which is easily implemented on an industrial scale, reproducible, very sensitive and cheap. SUMMARY OF THE INVENTION According to a first aspect, the invention relates to a process for assaying nucleic acids of the DNA type, capable of being salted out in a flow liquid of an affinity chromatography column, containing a support on wherein said DNA aptamers are immobilized, said DNA nucleic acids representing whole DNA aptamers, or "a fragment thereof", said method comprising the steps of: a) providing a sample of said flow liquid likely to contain nucleic acids of the DNA type released by the support of the affinity chromatography column; b) performing PCR amplification of the DNA nucleic acids contained in said sample, using a reaction mixture comprising (i) a pair of nucleotide non-degenerate sense and antisense primers specific for said DNA nucleic acids and (ii) ) a fluorescent intercalating agent, to obtain an amplification product in the form of double-stranded DNA nucleic acids complexed with said fluorescent intercalating agent; and c) quantifying the DNA aptamers, or fragments thereof, by measuring the level of a fluorescence signal generated by said amplification product and comparing this level of fluorescence to that obtained by a standard range generated by a known concentration of said aptamer DNA. Advantageously, the flow liquid is obtained after a step selected from the load of the sample to be analyzed on the affinity chromatography column, the washing of the column, the elution and the regeneration of said chromatography column. affinity. According to a preferred embodiment, the antisense nonsegenic nucleotide primer pairs with a first end of the DNA nucleic acid to be assayed. In the same way, the complementary sequence of the nondegenerate nucleotide primer is paired with a second end of the nucleic acid complementary to the DNA to be assayed. The sense and antisense nucleotide primers do not overlap. Advantageously, each nondegenerate nucleotide primer covers at least 7 bases of the sequence of the DNA nucleic acid to be assayed and at most 50% of the sequence of the DNA nucleic acid to be assayed. Preferably, the non-degenerate nucleotide primer pair is contained in the reaction mixture at a final concentration ranging from 50 to 1000 nM, advantageously at least 800 nM. According to a preferred embodiment, the fluorescent intercalating agent is chosen from fluorophores of the asymmetric cyanine family, advantageously a fluorophore of chemical formula C32H37N4S, and even more advantageously a fluorophore of CAS number 163795-75-3. In practice, the fluorophore is known as SYBRTM Green. Advantageously, the quantitative PCR (or Q-PCR) step comprises 20 to 50 cycles, advantageously 40 cycles. Preferably, each cycle contains a denaturation step of 15 seconds at 95 ° C and a hybridization and elongation step of 1 minute at 60 ° C. A second aspect of the invention relates to the use of the method previously described for determining the integrity of the affinity chromatography column during its implementation.

Un troisième et dernier aspect de l'invention concerne l'utilisation du procédé objet de la présente demande pour déterminer la contamination d'un échantillon provenant de l'élution de la colonne de chromatographie par affinité par un acide nucléique de type ADN.A third and final aspect of the invention concerns the use of the method that is the subject of the present application for determining the contamination of a sample originating from the elution of the affinity chromatography column by a DNA nucleic acid.

L'invention est illustrée plus en détail ci-dessous grâce à aux exemples non limitatifs et à l'aide des figures suivantes. DESCRIPTION DES FIGURES La Figure 1 illustre une courbe standard du nombre de cycles seuil 10 correspondant à un changement de fluorescence (Ct) en fonction d'une gamme standard de concentrations connues de l'aptamère nucléique MaptHl.1 CSO. La Figure 2 illustre les profils d'une courbe de dissociation, ou courbe de fusion, correspondant à une mesure de fluorescence en fonction de la température, pour chacune des concentrations de la gamme de concentrations finales de l'aptamère nucléique 15 MaptHl.1 CSO dans l'échantillon (allant de 100 pg/ml à 0,01 pg/ml, grâce à une série de dilutions au 1/10ème). La Figure 3 illustre une courbe standard du nombre de cycles seuil correspondant à un changement de fluorescence (Ct) en fonction d'une gamme standard de concentrations connues de l'aptamère nucléique Nonapta 5.1. 20 La Figure 4 illustre les profils d'une courbe de dissociation, ou courbe de fusion, correspondant à une mesure de fluorescence en fonction de la température, pour chacune des concentrations de la gamme de concentrations finales de l'aptamère nucléique Nonapta 5.1 dans l'échantillon (allant de 1000 pg/ml à 0,1 pg/ml, grâce à une série de dilutions au 1/10ème). 25 DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION La présente invention fournit un procédé de dosage d'acides nucléiques dans un échantillon, adapté à la détection et/ou la quantification d'aptamères nucléiques ADN, ou de fragments de ces derniers, lesdits acides nucléiques provenant d'un support de 30 chromatographie d'affinité desquels ils se sont détachés. Après de longues recherches, le demandeur a mis au point un procédé fiable, reproductible, de très grande sensibilité et peu coûteux, apte à détecter et/ou quantifier les acides nucléiques issus d'un relargage d'aptamères ADN, ou bien de fragments de ces d' aptamères ADN, initialement immobilisés sur un support de chromatographie d'affinité. On rappelle que les aptamères nucléiques consistent en des oligonuléotides de petite taille ; ils ont généralement une longueur inférieure à 50 nucléotides et sont donc difficiles à isoler, détecter, et a fortiori quantifier, surtout lorsqu'ils sont présents à des concentrations très faibles au sein d'un échantillon à tester. La principale difficulté pour doser de petits oligonucléotides peut être surmontée par la technique d'amplification par PCR dite en temps réel ou PCR quantitative (Q-PCR).The invention is illustrated in more detail below by way of the non-limiting examples and with the aid of the following figures. DESCRIPTION OF THE FIGURES FIG. 1 illustrates a standard curve of the number of threshold cycles corresponding to a change in fluorescence (Ct) as a function of a standard range of known concentrations of the MaptH1.1 CSO nucleic aptamer. Figure 2 illustrates the profiles of a dissociation curve, or melting curve, corresponding to a fluorescence as a function of temperature, for each of the concentrations in the final concentration range of the MaptH1.1 CSO nucleic aptamer. in the sample (ranging from 100 μg / ml to 0.01 μg / ml, through a series of 1 / 10th dilutions). Figure 3 illustrates a standard curve of the number of threshold cycles corresponding to a change in fluorescence (Ct) as a function of a standard range of known concentrations of the Nonapta 5.1 nucleic aptamer. Figure 4 illustrates the profiles of a dissociation curve, or melting curve, corresponding to a fluorescence as a function of temperature, for each of the concentrations in the final concentration range of the Nonapta 5.1 nucleic aptamer in the sample (ranging from 1000 μg / ml to 0.1 μg / ml, using a series of 1/10 dilution). DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention provides a method for assaying nucleic acids in a sample, suitable for the detection and / or quantification of DNA nucleic aptamers, or fragments thereof, said nucleic acids derived from nucleic acids. affinity chromatography support from which they have become detached. After extensive research, the applicant has developed a reliable, reproducible, very sensitive and inexpensive method, capable of detecting and / or quantifying nucleic acids from a DNA aptamer release, or fragments of DNA aptamers, initially immobilized on an affinity chromatography support. It is recalled that the nucleic aptamers consist of oligonuleotides of small size; they generally have a length of less than 50 nucleotides and are therefore difficult to isolate, detect, and a fortiori quantify, especially when they are present at very low concentrations in a sample to be tested. The main difficulty in assaying small oligonucleotides can be overcome by the so-called real-time PCR or quantitative PCR (Q-PCR) technique.

Cette technique, dont le principe est connu a notamment été utilisée pour la caractérisation des aptamères ADN retenus à l'issue de chaque cycle du procédé SELEX de sélection d'aptamères (Ruff et al., 2012, ISRN Mol. Biol., Vol. 2012, Article ID 939083). Néanmoins, cette technique semble tout à fait adaptée pour amplifier des aptamères présentant une taille largement supérieure à 50 nucléotides (dans ce cas 74 nucléotides). Ainsi, selon un mode de réalisation particulièrement préféré, les aptamères de type ADN susceptibles d'être relargués ont une longueur inférieure à 74 nucléotides. Par longueur inférieure à 74 nucléotides, on entend une longueur de 73, 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31 ou 30 nucléotides. Selon un autre mode de réalisation préféré, les aptamères de type ADN susceptibles d'être relargués ont une longueur inférieure à 50 nucléotides. Par une longueur « inférieur à 50 nucléotides » on englobe une longueur inférieure à 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 36, 35, 34, 33, 32, 31 et 30 25 nucléotides. Selon un autre mode de réalisation préféré, les aptamères de type ADN susceptibles d'être relargués ont une longueur comprise entre 20 et 60 nucléotides, de préférence une longueur comprise entre 20 et 50 nucléotides, de préférence une longueur de 36 ou 39 nucléotides. 30 Par ailleurs, la technique d'amplification par Q-PCR permet aussi la détection et la quantification d'aptamères liés à un ligand cible. Dans ce contexte, la détection et la quantification du ligand cible sont réalisées de manière indirecte. Les aptamères ADN sont en effet utilisés comme molécules détectables, à la place des anticorps, utilisés dans les techniques antérieures. Ce procédé, parfois désigné « apta-PCR », a été décrit notamment par Pinto et al. (2009, Mol Biosyst, Vol. 5(5) : 548-553).This technique, the principle of which is known, has in particular been used for the characterization of DNA aptamers retained at the end of each cycle of the SELEX process for selecting aptamers (Ruff et al., 2012, ISRN Mol Biol., Vol. 2012, Article ID 939083). Nevertheless, this technique seems quite suitable for amplifying aptamers having a size much greater than 50 nucleotides (in this case 74 nucleotides). Thus, according to a particularly preferred embodiment, the aptamers of the DNA type capable of being salted out have a length of less than 74 nucleotides. By length less than 74 nucleotides is meant a length of 73, 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31 or 30 nucleotides . According to another preferred embodiment, the aptamers of the DNA type that can be salted out are less than 50 nucleotides in length. A length "less than 50 nucleotides" is less than 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 36, 35, 34, 33 , 32, 31 and 25 nucleotides. According to another preferred embodiment, the aptamers of the DNA type capable of being salted out have a length of between 20 and 60 nucleotides, preferably a length of between 20 and 50 nucleotides, preferably a length of 36 or 39 nucleotides. In addition, the Q-PCR amplification technique also allows the detection and quantification of target ligand bound aptamers. In this context, the detection and quantification of the target ligand is carried out indirectly. DNA aptamers are indeed used as detectable molecules, instead of antibodies, used in the prior art. This process, sometimes referred to as "apta-PCR", has been described in particular by Pinto et al. (2009, Mol Biosyst, Vol.5 (5): 548-553).

Les méthodes ci-dessus sont compatibles avec la technologie SYBRTM Green, c'est-à-dire un agent intercalant fluorescent qui se fixe uniquement sur des ADN double brin. La mise en oeuvre des différents protocoles d'extraction et de PCR quantitative disponibles nécessite de se plier à des recommandations contraignantes. Celles-ci concernent tout particulièrement : - la fragilité et la volatilité de l'aptamère simple brin et de taille inférieure à 100 nucléotides ; - la nature de l'acide nucléique à amplifier, généralement double brin et supérieure à 50 nucléotides, pour une taille optimale de 150 nucléotides ; - la nature des amorces nucléotidiques, qui sont généralement conçues par des programmes spécifiques, pour tenir compte de certains paramètres tels que leur longueur, leur taux en résidus C+G, la présence de plusieurs nucléotides particuliers contigus, leur température de fusion, leur contenu en base A ou T à chaque extrémité de l'amorce, le risque d'auto-repliement d'une amorce sur elle-même ou d'appariement des deux amorces; - la quantité minimale (et/ou maximale) d'acides nucléiques à amplifier, initialement présent dans l'échantillon ; - les paramètres de temps et de température des cycles d'amplification. Toutes ces contraintes rendent a priori l'utilisation d'une technique de PCR quantitative difficilement réalisable dans le but recherché, à savoir le dosage d'aptamères, 25 ou de fragments d'aptamères relargués à partir d'un support de colonne de chromatographie par affinité, sur lequel ces aptamères sont immobilisés. En effet, le demandeur s'attend à ce que la fixation des aptamères sur un support de colonne de chromatographie par affinité soit suffisamment forte pour résister aux étapes de charge de l'échantillon, de lavage, élution et régénération de la colonne. 30 De plus, il est bien connu que ces différentes étapes sont mises en oeuvre avec une grande quantité de liquide.The above methods are compatible with SYBRTM Green technology, ie a fluorescent intercalating agent that binds only to double-stranded DNAs. The implementation of the different quantitative extraction and quantitative PCR protocols available requires binding recommendations. These particularly concern: - the fragility and volatility of the single-stranded aptamer and size less than 100 nucleotides; the nature of the nucleic acid to be amplified, generally double-stranded and greater than 50 nucleotides, for an optimal size of 150 nucleotides; - the nature of the nucleotide primers, which are generally designed by specific programs, to take into account certain parameters such as their length, their level of C + G residues, the presence of several contiguous individual nucleotides, their melting point, their content at the base A or T at each end of the primer, the risk of self-folding of a primer on itself or pairing of the two primers; the minimum amount (and / or maximum) of nucleic acids to be amplified, initially present in the sample; the time and temperature parameters of the amplification cycles. All these constraints make a priori the use of a quantitative PCR technique difficult to achieve for the purpose, namely the assay of aptamers, or fragments of aptamers released from a chromatographic column support. affinity, on which these aptamers are immobilized. Indeed, the Applicant expects the attachment of aptamers on an affinity chromatography column support to be sufficiently strong to withstand the steps of sample loading, washing, elution and regeneration of the column. In addition, it is well known that these different steps are carried out with a large amount of liquid.

Ainsi, on peut s'attendre à ce que la quantité d'acides nucléiques relarguée soit très faible. De manière inattendue, le demandeur s'est aperçu que la technique de PCR quantitative pouvait, sous certaines conditions, être adaptée au dosage d'acides nucléiques.Thus, it can be expected that the amount of nucleic acid released is very small. Unexpectedly, the applicant realized that the quantitative PCR technique could, under certain conditions, be adapted to the nucleic acid assay.

De manière surprenante, en s'éloignant des recommandations des fabricants, la mise au point d'un procédé de dosage a pu être déterminée sur un aptamère intègre. L'invention concerne un procédé de dosage d'acides nucléiques de type ADN, susceptibles d'être relargués dans un liquide d'écoulement d'une colonne de chromatographie par affinité, contenant un support sur lequel sont immobilisés lesdits aptamères ADN, lesdits acides nucléiques de type ADN représentant les aptamères ADN entiers, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) fournir un échantillon dudit liquide d'écoulement susceptibles de contenir des acides nucléiques de type ADN relargués par le support de la colonne de chromatographie par affinité ; b) réaliser une amplification par PCR des acides nucléiques de type ADN contenus dans ledit échantillon en utilisant un mélange réactionnel comprenant (i) un couple d'amorces nucléotidiques sens et anti-sens non dégénérées spécifiques desdits acides nucléiques de type ADN et (ii) un agent intercalant fluorescent, afin d'obtenir un produit d'amplification sous la forme d'acides nucléiques ADN double brins complexés avec ledit agent intercalant fluorescent. c) quantifier les aptamères ADN, en mesurant le niveau d'un signal de fluorescence généré par ledit produit d'amplification et en comparant ce niveau de fluorescence à celui obtenu par une gamme standard générée par une concentration connue 25 dudit aptamère ADN. De manière surprenante, le demandeur a montré que la simple utilisation d'un agent intercalant permet de doser des acides nucléiques de type ADN de petites tailles et qui par ailleurs est facilement mis en oeuvre à l'échelle industrielle, reproductible, très 30 sensible et peu coûteux fonctionne, contrairement à l'utilisation d'autres méthodes classiquement utilisées pour la Q- PCR pour le dosage d'acides nucléiques, pour lesquelles la mise en oeuvre n'est pas adaptée à un tel dosage. C'est le cas, notamment, de la technique Q-PCR classique, pour laquelle il est connu d'utiliser un mélange réactionnel comprenant (i) un couple d'amorces nucléotidiques sens et anti-sens de petite taille non dégénérées spécifiques desdits acides nucléiques de type ADN et (ii) une sonde de petite taille spécifique desdits acides nucléiques, amorces et sonde modifiées ou non par la substitution de quelques nucléotides par un nucléotide équivalent de type « LNA » (locked nucleic acid), la sonde étant couplée en 5' à un reporter fluorescent (chimie TaqMan), lequel émet un signal en cas d'amplification lié à l'activité 5'exonucléase de la Taq Polymerase. Il sera en effet montré dans les exemples qu'une telle méthode classique (sonde 10 TaqMan) ne permet pas le dosage d'un aptamère de 39 nucléotides (voir exemple 3). En pratique, le liquide d'écoulement est obtenu après une étape de charge, de lavage, d'élution ou de régénération de ladite colonne de chromatographie par affinité. De par leur forte concentration ionique et/ou leur pH, les tampons utilisés pour 15 les différentes étapes de purification classiques par chromatographie par affinité peuvent être en effet plus ou moins délétères pour la colonne en elle-même. Un avantage dans le choix d'aptamères nucléotidiques pour la réalisation de support de colonne de chromatographie est le fait que les aptamères peuvent résister à de fortes concentrations en sels et qu'ils peuvent être soumis à des conditions de pH très 20 variés. La quantification du relargage des aptamères lors de la mise en oeuvre de la chromatographie par affinité est essentielle pour contrôler le rendement de la purification, et surtout pour mesurer le degré de contamination des aptamères dans le produit de 25 l'élution, c'est-à-dire le ligand d'intérêt. La mise au point de ce procédé de dosage repose sur l'utilisation d'amorces nucléotidiques non dégénérées sens et anti-sens qui s'apparient chacune à une des extrémités de l'aptamère ADN. Le choix des amorces nucléotidiques peut ne pas être réalisé par un logiciel 30 spécialisé, mais peut s'appuyer simplement sur la séquence de l'aptamère cible. Dans la plupart des protocoles de PCR à disposition, le « design » des amorces peut être long et fastidieux, car un certain nombre de paramètres sont à vérifier.Surprisingly, by moving away from the manufacturers' recommendations, the development of an assay procedure could be determined on an intact aptamer. The invention relates to a method of assaying nucleic acids of the DNA type, capable of being released into a flow liquid of an affinity chromatography column, containing a support on which said DNA aptamers are immobilized, said nucleic acids DNA type representing the entire DNA aptamers, said method comprising the following steps: a) providing a sample of said flow liquid likely to contain DNA nucleic acids released by the support of the affinity chromatography column; b) performing PCR amplification of the DNA nucleic acids contained in said sample using a reaction mixture comprising (i) a pair of nucleotide non-degenerate sense and antisense primers specific for said DNA nucleic acids and (ii) a fluorescent intercalating agent, to obtain an amplification product in the form of double-stranded DNA nucleic acids complexed with said fluorescent intercalating agent. c) quantifying the DNA aptamers, by measuring the level of a fluorescence signal generated by said amplification product and comparing this level of fluorescence to that obtained by a standard range generated by a known concentration of said DNA aptamer. Surprisingly, the Applicant has shown that the simple use of an intercalating agent makes it possible to assay DNA nucleic acids of small size and which, moreover, is easily used on an industrial scale, reproducible, very sensitive and inexpensive works, unlike the use of other methods conventionally used for Q-PCR for the determination of nucleic acids, for which the implementation is not suitable for such an assay. This is the case, in particular, of the conventional Q-PCR technique, for which it is known to use a reaction mixture comprising (i) a pair of small, nondegenerate nucleotide sense and antisense primers specific for said acids nucleic acid and (ii) a small probe specific for said nucleic acids, primers and probe modified or not by the substitution of a few nucleotides by an equivalent nucleotide of the type "LNA" (locked nucleic acid), the probe being coupled in 5 'to a fluorescent reporter (TaqMan chemistry), which emits a signal in case of amplification related to the 5'exonuclease activity of Taq Polymerase. It will indeed be shown in the examples that such a conventional method (TaqMan probe) does not allow the assay of an aptamer of 39 nucleotides (see Example 3). In practice, the flow liquid is obtained after a step of charging, washing, eluting or regenerating said affinity chromatography column. Because of their high ion concentration and / or their pH, the buffers used for the various conventional purification steps by affinity chromatography can in fact be more or less deleterious for the column itself. An advantage in selecting nucleotide aptamers for making chromatography column support is that aptamers can withstand high salt concentrations and can be subjected to a wide variety of pH conditions. Quantification of aptamer release when performing affinity chromatography is essential to control the purification performance, and especially to measure the degree of aptamer contamination in the elution product, that is, to say the ligand of interest. The development of this assay method is based on the use of non-degenerate sense and antisense nucleotide primers which each pair with one of the ends of the DNA aptamer. The choice of nucleotide primers may not be made by specialized software, but may simply rely on the sequence of the target aptamer. In most PCR protocols available, the "design" of the primers can be long and tedious because a number of parameters are to be verified.

C'est le cas par exemple de la longueur, du taux en résidus C+G, de la présence de plusieurs nucléotides identiques contigus, de la température de fusion, du contenu en bases A ou T à chaque extrémité de l'amorce. De plus, il est avantageux que les amorces nucléotidiques sens et anti-sens ne se chevauchent pas. Ainsi, chaque amorce nucléotidique non dégénérée recouvre au maximum 50 % de la séquence de l'aptamère ADN. L'expression « au maximum 50% », relative au recouvrement de la séquence de l'aptamère ADN, englobe au maximum 49%, 48%, 46%, 45%, 44%, 43%, 42%, 41%, 40%, 39%, 38%, 37%, 36%, 35%, 34%, 33%, 31%, 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%. 47%, 32%, 17%, En pratique, chaque amorce nucléotidique non dégénérée recouvre au moins 7 bases de la séquence de l'acide nucléique de type ADN à doser. L'expression « au moins 7 bases » englobe au moins 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 et 36 bases. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, chaque amorce nucléotidique non dégénérée possède une taille comprise entre 10 et 30 nucléotides, de préférence entre 10 et 20 nucléotides, de préférence d'environ 15 nucléotides. En pratique, le couple d'amorces nucléotidiques non dégénérées est contenu dans le mélange réactionnel à une concentration finale allant de 50 à 1 000 nM, avantageusement au moins 800 nM. Ainsi, la concentration finale en amorces nucléotidiques non dégénérées englobe une concentration finale d'au moins 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950 et 975 nM.This is the case, for example, of the length, the level of C + G residues, the presence of several contiguous identical nucleotides, the melting temperature, the content of A or T bases at each end of the primer. In addition, it is advantageous that the sense and antisense nucleotide primers do not overlap. Thus, each nondegenerate nucleotide primer covers at most 50% of the DNA aptamer sequence. The expression "at most 50%", relating to the recovery of the DNA aptamer sequence, encompasses a maximum of 49%, 48%, 46%, 45%, 44%, 43%, 42%, 41%, 40%. %, 39%, 38%, 37%, 36%, 35%, 34%, 33%, 31%, 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%. 47%, 32%, 17% In practice, each nondegenerate nucleotide primer covers at least 7 bases of the sequence of the DNA nucleic acid to be assayed. The term "at least 7 bases" includes at least 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 and 36 bases. In a particularly preferred embodiment, each nondegenerate nucleotide primer has a size of between 10 and 30 nucleotides, preferably between 10 and 20 nucleotides, preferably about 15 nucleotides. In practice, the pair of nondegenerate nucleotide primers is contained in the reaction mixture at a final concentration ranging from 50 to 1000 nM, advantageously at least 800 nM. Thus, the final concentration of nondegenerate nucleotide primers includes a final concentration of at least 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950 and 975 nM.

Dans le cadre dans cette invention, il est essentiel que la détection de l'aptamère amplifié ne soit pas réalisé par une sonde de type TaqMan ou Beacon, mais par un agent intercalant fluorescent car la taille de l'aptamère rend impossible la présence de deux amorces et d'une sonde sans chevauchement. En pratique, le fluorophore est choisi parmi les fluorophores de la famille des cyanines asymétriques. Plus précisément, il s'agit d'un fluorophore connu sous le nom de SYBRTM Green, soit un fluorophore de formule chimique C32H37N4S, de numéro CAS 163795-75-3.In the context of this invention, it is essential that the detection of the amplified aptamer is not carried out by a TaqMan or Beacon type probe, but by a fluorescent intercalating agent because the size of the aptamer makes the presence of two primers and a probe without overlap. In practice, the fluorophore is chosen from fluorophores of the asymmetric cyanine family. Specifically, it is a fluorophore known as SYBRTM Green, a fluorophore of chemical formula C32H37N4S, CAS number 163795-75-3.

Le fluorophore SYBRTM Green se fixe de manière aspécifique sur un ADN double brins, et est plus sensible et beaucoup moins toxique que le bromure d' éthidium. De manière classique, et comme recommandé par les fabricants de kit PCR, l'étape de PCR quantitative (Q-PCR) comprend 20 à 50 cycles.The SYBRTM Green fluorophore binds aspecifically to double stranded DNA, and is more sensitive and much less toxic than ethidium bromide. Typically, and as recommended by the PCR kit manufacturers, the quantitative PCR step (Q-PCR) comprises 20 to 50 cycles.

En pratique, 40 cycles, voire dans certaines conditions critiques 50 cycles peuvent être réalisés en routine, ce qui constitue un nombre de cycles suffisant pour détecter une faible quantité initiale en aptamère d'intérêt. De préférence, chaque cycle contient une étape de 15 secondes à 95°C et une étape de 1 minute à 60°C. De manière surprenante et inattendue, la présente invention permet de détecter des aptamères à une concentration dans l'échantillon aussi basse que 0,1 pg/ml, soit un gain de sensibilité d'un facteur 20 000, par rapport à l'utilisation d'un kit de Q-PCR selon les recommandations du fabricant (concentration initiale environ égale à 1 ng/50 soit 20 ng/ml). Ainsi, la présente invention fournit un procédé de dosage d'aptamères de type ADN qui présente les caractéristiques suivantes : - facilité de mise en oeuvre, pas de « design » des amorces, une seule étape de PCR et une mesure de la fluorescence ; - économique, à cause des amorces non dégénérées et de l'utilisation de l'agent intercalant fluorescent SYBRTM Green ; - plus sensible que le dosage des acides nucléiques selon les protocoles classiques. La présente invention concerne aussi l'utilisation du procédé précédemment décrit pour déterminer l'intégrité de la colonne de chromatographie par affinité au cours de sa mise en oeuvre. Au moins le relargage des aptamères sera important, au plus la colonne aura une durée de vie importante. Il est à noter que ce procédé de dosage peut avantageusement être mis en oeuvre comme une méthode de contrôle qualité dans le processus d'immobilisation des aptamères sur un support solide. Ce procédé de dosage permet donc de rendre accessible et peu coûteux le contrôle en routine du niveau d'immobilisation des aptamères par de nombreux procédés chimiques et ou enzymatiques, en vue de la fabrication de colonnes de chromatographie par affinité.In practice, 40 cycles, or even in certain critical conditions 50 cycles can be performed routinely, which is a sufficient number of cycles to detect a small initial amount of aptamer of interest. Preferably each cycle contains a 15 second step at 95 ° C and a 1 minute step at 60 ° C. Surprisingly and unexpectedly, the present invention makes it possible to detect aptamers at a concentration in the sample as low as 0.1 μg / ml, a sensitivity gain of a factor of 20,000, compared with the use of a Q-PCR kit according to the manufacturer's recommendations (initial concentration approximately equal to 1 ng / 50, ie 20 ng / ml). Thus, the present invention provides a method for assaying DNA aptamers which has the following characteristics: ease of implementation, no "design" of the primers, a single PCR step and a fluorescence measurement; - Economical, because of nondegenerate primers and the use of SYBRTM Green fluorescent intercalator; - more sensitive than the nucleic acid assay according to conventional protocols. The present invention also relates to the use of the method described above for determining the integrity of the affinity chromatography column during its implementation. At least the release of aptamers will be important, the longer the column will have a long life. It should be noted that this assay method can advantageously be implemented as a quality control method in the immobilization process of aptamers on a solid support. This assay method thus makes it possible to make accessible and inexpensive the routine control of the aptamer level of immobilization by numerous chemical and or enzymatic processes, with a view to the manufacture of affinity chromatography columns.

Enfin, et comme vu ci-dessus, l'invention se rapporte à une utilisation du procédé de dosage pour déterminer la contamination d'un échantillon provenant de l'élution de la colonne de chromatographie par affinité par un acide nucléique de type ADN. Ceci contribue donc à une analyse de type contrôle qualité du ligand, de type médicament ou autre, purifié par chromatographie d'affinité, en vue de garantir son usage sans danger pour l'homme et/ou l'animal. La présente invention est en outre illustrée, sans y être limitée, par les exemples suivants.Finally, and as seen above, the invention relates to a use of the assay method for determining the contamination of a sample originating from the elution of the affinity chromatography column by a DNA nucleic acid. This therefore contributes to a quality control type analysis of the ligand, of the drug or other type, purified by affinity chromatography, in order to guarantee its safe use for humans and / or animals. The present invention is further illustrated, but not limited to, by the following examples.

EXEMPLES Exemple 1 : Procédé de dosage de l'aptamère Mapt H1.1-CSO dirigé contre le facteur H du complément selon un procédé conforme à l'invention. a) Séquences - aptamère d'intérêt Mapt H1.1-CSO : SEQ ID No. 1: ggt ctc ggg cac ggg tca ggc ggt tat acg gtg ccc (36 nucléotides). - amorce nucléotidique sens (AH1): SEQ ID No. 2 : ggt ctc ggg cac ggg tca (18 nucléotides, contenu en C+G= 72 %) - amorce nucléotidique anti-sens (AH2): SEQ ID No. 3 : ggg cac cgt ata acc (15 nucléotides, contenu en C+G= 60 %). Les deux amorces recouvrent 92 % de la totalité de la séquence. Le taux de recouvrement ne permet pas d'utiliser une sonde de type « TaqMan », mais est compatible 25 avec un agent intercalant fluorescent de type SYBRTM Green. b) Utilisation du Kit SYBRTM Green de Life Technologies - dilution dans de l'eau pour préparation injectable (PPI) du SYBRTM Green PCR Master Mix à 1X final ; - ajout des amorces sens et anti-sens à une concentration finale de 0,8 pM 30 chacune ; - programme universel Life Technologies, soit 40 cycles, avec pour chaque cycle, une étape de dénaturation à 95°C pendant 15 secondes, suivie par une étape d'hybridation et d'élongation à 60°C pendant 1 minute. c) Détermination de la gamme standard (courbe étalon) Une gamme étalon a été préparée à partir d'une solution d'aptamère Mapt H1.1-CSO à une concentration de 1iag/m1 (51.1.1 ajouté au Master Mix), pour laquelle une série de dilution au 1/10ème est réalisée dans de l'eau pour préparation injectable. On obtient ainsi une gamme de standard (STD) de concentration suivante : - « STD I », de concentration finale en aptamères égale à 100 pg/ml. - « STD II », de concentration finale égale à 10 pg/ml. - « STD III », de concentration finale égale à 1 pg/ml. - « STD IV », de concentration finale égale à 0,1 pg/ml. - « STD V », de concentration finale égale à 0,01 pg/ml La Figure 1 décrit une courbe étalon représentant le cycle seuil (ou cycle threshold, Ct) en fonction du log de la concentration en aptamère. Le cycle seuil Ct représente le nombre de cycle d'amplification à partir duquel le niveau de fluorescence de base devient significatif et correspond à une amplification détectable. Dans la Figure 1, la Q-PCR est quantitative sur une large gamme de concentration, allant jusqu'à 0,01 pg/ml environ.EXAMPLES Example 1 Method for Assaying the Mapt H1.1-CSO Aptamer Against the Complement Factor H in a Process According to the Invention a) Sequences - aptamer of interest Mapt H1.1-CSO: SEQ ID NO. 1: ggtc ggg tc ggc ggt tat acg gtg ccc (36 nucleotides). - sense nucleotide primer (AH1): SEQ ID No. 2: ggtc ggg cac ggg tca (18 nucleotides, C + G content = 72%) - antisense nucleotide primer (AH2): SEQ ID No. 3: ggg cac cgt ata acc (15 nucleotides, content in C + G = 60%). Both primers cover 92% of the entire sequence. The recovery rate does not permit the use of a "TaqMan" type probe, but is compatible with SYBRTM Green fluorescent intercalator. b) Use of Life Technologies SYBRTM Green kit - Injection water dilution (PPI) of SYBRTM Green PCR Master Mix at 1X final; addition of sense and antisense primers to a final concentration of 0.8 μM each; - Universal Life Technologies program, ie 40 cycles, with for each cycle, a denaturation step at 95 ° C for 15 seconds, followed by a hybridization and elongation step at 60 ° C for 1 minute. c) Determination of the standard range (standard curve) A standard range was prepared from a solution of Mapt H1.1-CSO aptamer at a concentration of 1iag / m1 (51.1.1 added to the Master Mix), for which a dilution series at 1 / 10th is carried out in water for injection. A standard range (STD) of the following concentration is thus obtained: - "STD I", of final concentration in aptamers equal to 100 μg / ml. - "STD II", of final concentration equal to 10 μg / ml. - "STD III", of final concentration equal to 1 μg / ml. - "STD IV", of final concentration equal to 0.1 μg / ml. - "STD V", of final concentration equal to 0.01 μg / ml Figure 1 describes a standard curve representing the threshold cycle (or threshold cycle, Ct) as a function of the log of the aptamer concentration. The threshold cycle Ct represents the number of amplification cycles from which the basic fluorescence level becomes significant and corresponds to a detectable amplification. In Figure 1, Q-PCR is quantitative over a wide concentration range, up to about 0.01 μg / ml.

Ainsi, l'utilisation en routine d'un protocole de Q-PCR comptant 40 cycles, permettra de détecter, en fonction de la séquence d'intérêt, une concentration initiale en aptamère aussi faible que 0,01 pg/ml. La Figure 2 décrit la courbe de dissociation de tous les amplicons de la gamme standard. Elle est obtenue à la fin de la PCR par une augmentation lente et progressive de la température de 60 à 95°C. La dissociation de l'amplicon est suivie par l'obtention d'une Tm (température de dissociation) qui dépend de sa taille et de sa séquence. Ainsi, pour un même amplicon, quel que soit sa quantité, le Tm est identique, ce qui permet donc de valider sa spécificité, puisque le SYBRTM Green, en tant qu'agent intercalant, se fixe sur tout brin d'ADN double brin en cours d'amplification. Dans ce cas, on obtient un Tm homogène et attendu, c'est-à-dire un Tm compatible avec le Tm du Mapt H1.1-CSO, soit un Tm compris entre 78,5 et 78,8°C.Thus, the routine use of a 40-cycle Q-PCR protocol will make it possible to detect, depending on the sequence of interest, an initial aptamer concentration as low as 0.01 μg / ml. Figure 2 depicts the dissociation curve of all amplicons in the standard range. It is obtained at the end of the PCR by a slow and gradual increase in temperature from 60 to 95 ° C. The dissociation of the amplicon is followed by obtaining a Tm (dissociation temperature) which depends on its size and its sequence. Thus, for the same amplicon, regardless of its quantity, the Tm is identical, which therefore makes it possible to validate its specificity, since the SYBRTM Green, as intercalating agent, binds to any strand of double-stranded DNA in amplification course. In this case, a homogeneous and expected Tm is obtained, that is to say a Tm compatible with the Tm of Mapt H1.1-CSO, ie a Tm between 78.5 and 78.8 ° C.

Exemple 2 : Procédé de dosage de l'aptamère Nonapta 5.1 dirigé contre le Facteur IX de la coagulation selon un procédé conforme à l'invention. a) Séquences - Aptamère d'intérêt Nonapta 5.1 SEQ ID No. 4 : acc ttt aac cca cta gtc taa gcg ggt cta gcg tcg tcc (39 nucléotides) - amorce nucléotidique sens (F9-1) SEQ ID No. 5 : acc ttt aac cca cta gtc (18 nucléotides, contenu en C+G = 44%) - amorce nucléotidique anti-sens (F9-2) SEQ ID No. 6 : gga cga cgc tag acc (15 nucléotides, contenu en C+G = 67%) Les deux amorces nucléotidiques spécifiques n'ont pas fait l'objet d'un « design » à l'aide d'un logiciel spécifique, mais tiennent compte de certaines contraintes.Example 2 Method for Assaying the Nonapta 5.1 Aptamer Against Factor IX Coagulation According to a Method According to the Invention a) Sequences - Aptamer of interest Nonapta 5.1 SEQ ID NO: 4: acc ttt aac cca cta gtc gcg ggt cta gcg tcg tcc (39 nucleotides) - nucleotide primer sense (F9-1) SEQ ID No. 5: acc ttt aac cca cta gtc (18 nucleotides, C + G content = 44%) - antisense nucleotide primer (F9-2) SEQ ID No. 6: gga cga cgc acc tag (15 nucleotides, C + G content = 67 %) The two specific nucleotide primers have not been "designed" with the help of specific software, but take into account certain constraints.

Les deux amorces recouvrent 85 % de la totalité de la séquence. Le taux de recouvrement ne permet pas d'utiliser une sonde de type « TaqMan », mais est compatible avec un agent intercalant fluorescent de type SYBRTM Green. b) Procédé Le mode opératoire suivi est le même que celui décrit dans le premier exemple par utilisation du kit SYBRTM Geen Applied. c) Résultats La Figure 3 décrit une courbe étalon représentant le cycle seuil (ou cycle Threshold, Ct) en fonction du log de la concentration en aptamère. La Q-PCR est quantitative sur une large gamme de concentration, allant jusqu'à 0,1 pg/ml environ, qui correspond à un Ct moyen situé entre 23 et 24. A partir de Ct supérieur à 27, le signal se confond avec le bruit de fond et n'est plus quantifiable. Ainsi, l'utilisation en routine d'un protocole de Q-PCR comptant 40 cycles, permettra là aussi de détecter une concentration initiale en aptamère aussi faible que 0,1 pg/ml. Comme précédemment pour l'exemple 1, il a pu être montré une homogénéité des valeurs de Tm de l'amplicon Nonapta 5.1, et ce, quel que soit sa quantité (Figure 4).Both primers cover 85% of the entire sequence. The recovery rate does not make it possible to use a "TaqMan" type probe, but is compatible with a SYBRTM Green type fluorescent intercalator. b) Method The procedure followed is the same as that described in the first example using the SYBRTM Geen Applied kit. c) Results Figure 3 depicts a standard curve representing the threshold cycle (or Threshold cycle, Ct) as a function of the log of aptamer concentration. The Q-PCR is quantitative over a wide concentration range, up to about 0.1 μg / ml, which corresponds to an average Ct between 23 and 24. From Ct greater than 27, the signal merges with background noise and is no longer quantifiable. Thus, routine use of a 40-cycle Q-PCR protocol will again detect an initial aptamer concentration as low as 0.1 μg / ml. As previously for Example 1, it was possible to show a homogeneity of the Tm values of the Nonapta 5.1 amplicon, regardless of its quantity (FIG. 4).

Exemple 3 : Q-PCR réalisé avec une sonde TaqMan pour le dosage de l'aptamère nucléotidique Nonapta 5.1 selon un procédé « classique ». Les deux exemples suivants correspondent à une méthode alternative de dosage 5 d' aptamère ADN par Q-PCR par utilisation d'une sonde TaqMan. Etant donné la petite taille du nucléotide à amplifier, et étant donné que les deux amorces périphériques et la sonde interne ne peuvent se chevaucher, il est nécessaire d'utiliser des amorces et une sonde de très petite taille (taille inférieure ou égale à 10 nucléotides). Les Tm correspondants des amorces étant très basses, le choix se porte sur 10 des amorces modifiées de type LNA (« locked nucleic acid », comprenant une liaison de type 2'-O, 4'-C methylène), ce qui consiste à remplacer quelques nucléotides par des nucléotides modifiés (modified RNA nucleotide) qui augmentent la stabilité thermique des amorces (et donc leur Tm). La sonde est elle-même modifiée de type LNA, sa Tm devant être supérieure à la Tm des deux amorces. 15 Exemple 3.1 : dosage avec deux amorces LNA et une sonde LNA de petite taille. a) Séquences : - Aptamère nonapta 5.1 20 SEQ ID No. 4 : acc ttt aac cca cta gtc taa gcg ggt cta gcg tcg tcc - Amorce sens-LNA* : SEQ ID No. 7 : cc[t] t[t][a] [a][c]c c - Amorce anti-sens-LNA* : SEQ ID No. 8 : gg[a] c[g]a c[g]c t 25 - Sonde-LNA* : SEQ ID No. 9 : Fam-tc[t] a[a]g [c]g[g] gt-bhql * En crochet, sont indiqués les nucléotides modifiés (nucléotide de type LNA) ; Fam représente une carboxy-fluorescéine déoxythymidine ; Bhql représente une Black Hole Quencher-1 déoxythymidine. 30 b) Procédé et résultats Un premier essai a été réalisé avec le kit TaqMan Universal Master Mix de Life Technologies et utilisation du programme universel de Life Technologies (Tableau 1, PCR1). Il n'y a pas eu d'amplification observée. Un deuxième essai a été réalisé en travaillant à trois températures et en abaissant la température d'hybridation (annealing) tenant compte du Tm des amorces (Tableau 1, PCR2). La PCR n'a pas non plus fonctionné comme indiqué dans le tableau 1. Tableau 1 PCR Conditions Résultat PCR 1 (Programme Life Technologies) 95°C' / 60°C2 Pas d'amplification PCR 2 95°C1/ 45°C3 / 60°C4 Pas d'amplification température de dénaturation ; température d'hybridation et d'élongation ; température d'hybridation ; 4température d'élongation. En l'absence de réponse, des essais complémentaires ont été réalisés pour voir si l'absence d'amplification était due à la sonde-LNA ou aux deux amorces-LNA. Les 15 deux amorces-LNA ont été évaluées en conditions SYBRTM Green sans la sonde-LNA. Trois essais ont été réalisés avec trois conditions différentes dont un abaissement de la température d'Annealing (Tableau 2, PCR1, PCR2, PCR3). Les PCR n'ont pas fonctionné comme indiqué dans le tableau 2. 20 Tableau 2 PCR Conditions Résultat PCR 1 95°C' /45°C2 Pas d'amplification PCR 2 95°C' / 45°C3 / 60°C4 Pas d'amplification PCR 3 95°C' / 40°C2 Pas d'amplification 'température de dénaturation ; 2température d'hybridation et d'élongation ; 3température d'hybridation ; 4température d'élongation.Example 3 Q-PCR carried out with a TaqMan probe for the determination of the Nonapta 5.1 nucleotide aptamer according to a "conventional" method. The following two examples correspond to an alternative Q-PCR DNA aptamer assay method using a TaqMan probe. Given the small size of the nucleotide to be amplified, and since the two peripheral primers and the internal probe can not overlap, it is necessary to use primers and a probe of very small size (size less than or equal to 10 nucleotides) ). Since the corresponding Tm of the primers are very low, the choice is made of LNA-type modified primers ("locked nucleic acid", comprising a 2'-O, 4'-C methylene type bond), which consists in replacing a few nucleotides by modified nucleotides (modified RNA nucleotides) which increase the thermal stability of the primers (and therefore their Tm). The probe itself is modified of the LNA type, its Tm must be greater than the Tm of the two primers. Example 3.1: Assay with two LNA primers and a small LNA probe. a) Sequences: - Aptamer nonapta 5.1 SEQ ID NO: 4: acc ttt aac cca cta gtc gcg gctcta gcg tcg tcc - Meaning-LNA * primer: SEQ ID No. 7: cc [t] t [t] [ a] [a] [c] cc - Antisense primer-LNA *: SEQ ID No. 8: gg [a] c [g] ac [g] ct 25 - Probe-LNA *: SEQ ID No. 9: Fam-tc [t] a [a] g [c] g [g] gt-bhql * In brackets, the modified nucleotides (LNA nucleotide) are indicated; Fam represents a carboxy-fluorescein deoxythymidine; Bhql represents a Black Hole Quencher-1 deoxythymidine. B) Method and Results A first test was carried out with the Life Technologies TaqMan Universal Master Mix kit and use of the Life Technologies universal program (Table 1, PCR1). There was no amplification observed. A second test was carried out by working at three temperatures and lowering the annealing temperature, taking into account the Tm of the primers (Table 1, PCR2). The PCR also did not work as indicated in Table 1. Table 1 PCR Conditions Result PCR 1 (Life Technologies Program) 95 ° C '/ 60 ° C2 No PCR amplification 2 95 ° C1 / 45 ° C3 / 60 ° C4 No amplification denaturation temperature; hybridization and elongation temperature; hybridization temperature; 4 elongation temperature. In the absence of response, additional tests were performed to see if the lack of amplification was due to the LNA-probe or both LNA-primers. Both primers-LNA were evaluated under SYBRTM Green conditions without the LNA probe. Three trials were performed with three different conditions including a lowering of Annealing temperature (Table 2, PCR1, PCR2, PCR3). The PCRs did not work as indicated in Table 2. Table 2 PCR Conditions Result PCR 1 95 ° C '/ 45 ° C2 No PCR amplification 2 95 ° C' / 45 ° C3 / 60 ° C4 No PCR amplification 95 ° C / 40 ° C No amplification of denaturation temperature; Hybridization and elongation temperature; Hybridization temperature; 4 elongation temperature.

Il n'y a donc pas d'amplification avec les petites amorces-LNA en présence ou en absence de sonde-LNA aux différentes conditions opératoires testées, même les moins stringentes. On en déduit que les nucléotides LNA modifient trop la structure de ces amorces et déstabilisent la Taq Polymérase lors de son ancrage.There is therefore no amplification with the small primers-LNA in the presence or absence of probe-LNA under the various operating conditions tested, even the least stringent. It is deduced that the LNA nucleotides modify the structure of these primers too much and destabilize the Taq Polymerase during its anchoring.

Exemple 3.2 : Q-PCR avec deux amorces de petite taille et une sonde-LNA de petite taille a) Séquences : - Amorce sens : SEQ ID No. 10 : cct tta acc c - Amorce anti-sens : gac gac gct - Sonde 1* : SEQ ID No. 11 : Fam-tct [a]ag [c]gg gt-bhql - Sonde 2* : SEQ ID No. 12 : Fam-tct aa[g] cgg gt-bhql * En crochet, sont indiqués les nucléotides modifiés (nucléotides de type LNA) ; Fam représente une carboxy-fluorescéine déoxythymidine ; Bhql représente une 20 Black Hole Quencher-1 déoxythymidine. b) Procédé et résultats La Q-PCR a été réalisée en présence des deux amorces avec l'une ou l'autre sonde-LNA avec le kit TaqMan Universal Master Mix et avec une température 25 d'hybridation (annealing) de 30°C. Les PCR n'ont pas fonctionné. En l'absence d'amplification, un essai complémentaire a été réalisé pour voir si l'absence d'amplification était due aux sondes-LNA ou aux deux amorces. Les deux amorces ont été testées en Sybr Green en l'absence de sonde avec une température d'hybridation (annealing) abaissée à 20°C pour évaluer leur capacité de fixation ou de 30 stabilité. La PCR n'a pas fonctionné.Example 3.2: Q-PCR with two small primers and one small LNA probe a) Sequences: - sense primer: SEQ ID No. 10: cct tta acc c - antisense primer: gac gac gct - probe 1 *: SEQ ID No. 11: Fam-tct [a] ag [c] ggt-bhql - Probe 2 *: SEQ ID No. 12: Fam -tct aa [g] cggt-bhql * In crochet, are indicated modified nucleotides (LNA nucleotides); Fam represents a carboxy-fluorescein deoxythymidine; Bhql represents a Black Hole Quencher-1 deoxythymidine. b) Method and Results The Q-PCR was carried out in the presence of the two primers with either LNA-probe with the TaqMan Universal Master Mix Kit and with an annealing temperature of 30 ° C. . PCRs did not work. In the absence of amplification, a complementary test was carried out to see if the absence of amplification was due to the LNA probes or to the two primers. Both primers were tested in Sybr Green in the absence of probe with annealing temperature lowered to 20 ° C to assess their binding or stability ability. The PCR did not work.

Conclusion Les essais de Q-PCR réalisés sur deux amorces périphériques sens et anti-sens de taille recommandée (quinzaine de nucléotides) par utilisation d'un intercalant de type SYBRTM Green sont possibles sur un aptamère d'une trentaine de nucléotides. Ils supposent la détermination d'une courbe de dissociation pour valider la spécificité de l'amplification. Les essais de Q-PCR réalisés en sonde TaqMan ne sont pas concluants : - Si la taille recommandée des amorces est maintenue, une sonde ne peut être utilisée car il y a chevauchement avec les amorces. - Si des amorces de plus petite taille (9 à 10 nucléotides) sont utilisées, leur Tm est trop bas et est critique dans les conditions habituelles de la PCR. - Si des amorces de plus petite taille (9 à 10 nucléotides) modifiées par le remplacement de plusieurs nucléotides de type LNA pour augmenter leur Tm sont utilisées, cela impacte aussi sur leur structure et l'accrochage de la Taq Polymérase pour initier l'amplification.Conclusion The Q-PCR tests performed on two peripheral primers sense and antisense of recommended size (fifteen nucleotides) using a SYBRTM Green intercalant are possible on an aptamer of about thirty nucleotides. They assume the determination of a dissociation curve to validate the specificity of the amplification. TaqMan Q-PCR assays are inconclusive: - If the recommended primer size is maintained, a probe can not be used because it overlaps with the primers. - If smaller primers (9 to 10 nucleotides) are used, their Tm is too low and is critical under the usual conditions of PCR. - If smaller primers (9 to 10 nucleotides) modified by the replacement of several nucleotides of the LNA type to increase their Tm are used, this also impacts on their structure and the attachment of the Taq Polymerase to initiate the amplification .

Claims

REVENDICATIONS1. A method of assaying nucleic acids of the DNA type, capable of being released in a flow liquid of an affinity chromatography column, containing a support on which said DNA aptamers are immobilized, said DNA nucleic acids representing the whole DNA aptamers, or a fragment thereof, said method comprising the steps of: a) providing a sample of said flow liquid likely to contain DNA nucleic acids released by the support of the affinity chromatography column; b) performing PCR amplification of the DNA nucleic acids contained in said sample, using a reaction mixture comprising (i) a pair of nucleotide non-degenerate sense and antisense primers specific for said DNA nucleic acids and (ii) ) a fluorescent intercalating agent, to obtain an amplification product in the form of double-stranded DNA nucleic acids complexed with said fluorescent intercalating agent; and c) quantitating DNA aptamers, or fragments thereof, by measuring the level of a fluorescence signal generated by said amplification product and comparing this level of fluorescence to that obtained by a standard range generated by a known concentration of said DNA aptamer.

2. Assay method according to claim 1 characterized in that the aptamers of the DNA type capable of being salted out have a length of less than 74 nucleotides.

3. Assay method according to one of the preceding claims, characterized in that the aptamers of the DNA type capable of being salted out have a length of less than 50 nucleotides.

4. assay method according to one of the preceding claims characterized in that the aptamers of the DNA type capable of being salted out have a length of 36 or 39 nucleotides. 30

5. Assay method according to one of the preceding claims characterized in that the flow liquid is obtained after a step selected from the charge, washing, elution and regeneration of said affinity chromatography column.

6. assay method according to one of the preceding claims characterized in that the nonsegenic antisense nucleotide primer pairs with a first end of the DNA nucleic acid to be assayed.

7. assay method according to one of the preceding claims characterized in that the complementary sequence of the nondegenerate nucleotide primer sense is related to a second end of the DNA nucleic acid to be assayed.

8. Assay method according to one of the preceding claims characterized in that the sense and antisense nucleotide primers do not overlap.

9. Assay method according to one of the preceding claims, characterized in that each nondegenerate nucleotide primer covers at least 7 bases of the DNA nucleic acid sequence to be assayed and at most 50% of the sequence of the nucleic acid sequence. nucleic acid of the DNA type to be assayed.

10. assay method according to one of the preceding claims characterized in that the pair of nondegenerate nucleotide primers is contained in the reaction mixture at a final concentration ranging from 50 to 1000 nM, preferably at least 800 nM.

11. assay method according to one of the preceding claims characterized in that the fluorescent intercalating agent is selected from fluorophores of the family of asymmetric cyanines, preferably a fluorophore of chemical formula C32H37N4 S, more preferably a number fluorophore CAS 163795-75-3.

12. assay method according to one of the preceding claims characterized in that the quantitative PCR step (or Q-PCR) comprises 20 to 50 cycles, preferably 40 cycles.

13. Assay method according to one of the preceding claims, characterized in that each cycle contains a step of 15 seconds at 95 ° C and a step of 1 minute at 60 ° C.

14. Use of the method according to any one of the preceding claims for determining the integrity of the affinity chromatography column during its implementation. 30

15. Use of the method according to one of claims 1 to 13 for determining the contamination of a sample from the elution of the affinity chromatography column by a DNA nucleic acid.