FR3017625A1 - PREDICTIVE METHOD FOR DETERMINING TISSUE RADIOSENSITIVITY - Google Patents
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Description
Méthode prédictive pour déterminer la radiosensibilité tissulaire Domaine technique de l'invention L'invention concerne le domaine de la radiobiologie médicale, et plus particulièrement le domaine des méthodes de laboratoire radiobiologiques. L'invention concerne une nouvelle méthode prédictive de la radiosensibilité cellulaire, tissulaire et clinique, qui se base sur la détermination et le recoupement de plusieurs paramètres et critères cellulaires et enzymatiques.FIELD OF THE INVENTION The invention relates to the field of medical radiobiology, and more particularly to the field of radiobiological laboratory methods. The present invention relates to a novel predictive method of cellular, tissue and clinical radiosensitivity, which is based on the determination and cross-checking of several cellular and enzymatic parameters and criteria.
Etat de la technique Environ 1 à 15% des patients traités par radiothérapie pour un cancer montrent une réaction tissulaire (tel qu'une dermite ou une rectite) qui peut mettre en jeu le bon déroulement du traitement dans la mesure où elle peut conduire le médecin à décider l'arrêt du traitement radiothérapeutique avant la fin du protocole prévu. Par ailleurs, cette réaction tissulaire est un indicateur d'une sensibilité particulièrement élevée du patient au rayonnement ionisant. Ainsi, le traitement radiothérapeutique, même interrompu au moment de l'apparition des premiers signes tissulaires visibles, peut augmenter la morbidité voire la mortalité post-traitement des patients, non seulement parce que le cancer qu'il était censé traiter n'a pas pu être éradiqué complètement dû à l'arrêt prématuré du traitement, mais encore à cause de l'endommagement collatéral des tissus sain induit par le rayonnement lui-même.STATE OF THE ART Approximately 1 to 15% of patients treated with radiotherapy for cancer show a tissue reaction (such as a dermatitis or proctitis) that may affect the smooth course of treatment as it may lead to the physician decide to stop the radiotherapeutic treatment before the end of the planned protocol. Moreover, this tissue reaction is an indicator of a particularly high sensitivity of the patient to ionizing radiation. Thus, radiotherapy treatment, even if interrupted at the time of the appearance of the first visible tissue signs, may increase the morbidity or even the post-treatment mortality of the patients, not only because the cancer it was supposed to treat was not able to to be eradicated completely due to premature discontinuation of treatment, but also because of the collateral damage of healthy tissue induced by the radiation itself.
On sait également que la question de la sensibilité des tissus au rayonnement ionisant est inséparable de celles des mécanismes de réparation des dommages de l'ADN. En effet, au niveau cellulaire, le rayonnement ionisant peut casser certains types de liaisons chimiques en générant des radicaux libres (en particulier par peroxydation) et d'autres espèces réactives à l'origine des dommages de l'ADN. L'endommagement de l'ADN par des agressions endogènes ou exogènes (telles que les radiations ionisantes et les radicaux libres), peut aboutir à différents types de dommages de l'ADN en fonction notamment de l'énergie déposée : les dommages de bases, les cassures simple-brin et les cassures double-brin (CDB). Les CDB non réparées sont associées à la mort cellulaire, la toxicité et plus spécifiquement la radiosensibilité. Les CDB mal réparées sont associées à l'instabilité génomique, aux phénomènes mutagènes et à la prédisposition au cancer. L'organisme dispose de systèmes de réparation spécifiques à chaque type de dommage de l'ADN. En ce qui concerne les CDB, les mammifères possèdent deux principaux modes de réparation : la réparation par suture (ligation des brins) et la réparation par recombinaison (insertion d'un brin homologue ou non- homologue). On sait que la sensibilité des tissus au rayonnement ionisant est très variable d'un organe à l'autre et d'un individu à l'autre ; l'idée d'une « radiosensibilité intrinsèque » a été conceptualisée par Fertil et Malaise en 1981. Ainsi, les diverses études sur les effets thérapeutiques et les effets secondaires de la radiothérapie ont montré qu'il existe des individus qui jouissent d'une radiorésistance particulièrement élevée, et des individus qui montrent au contraire une radiosensibilité qui peut aller d'un effet secondaire reconnu cliniquement mais sans conséquence jusqu'à un effet létal. Même en dehors de certains rares cas de radiosensibilité extrême, dont l'origine génétique semble avérée, on pense que la radiosensibilité découle d'une manière générale d'une prédisposition génétique : elle est donc propre à un individu. Il serait donc désirable de disposer d'une méthode d'essai prédictive pour pouvoir déterminer la dose maximale cumulée qu'un patient donné peut recevoir sans risque. Cette question se pose en premier lieu en radiothérapie dans un contexte de fortes doses ionisantes. Toutefois, cette question est également susceptible de se poser pour toute autre exposition à de fortes doses ionisantes, équivalentes à celles utilisées en radiothérapie. On sait que deux protéines de la famille des kinases, appelées couramment ATM et ATR, sont impliquées dans la détection, la réparation et la signalisation des CDB ; leur action nécessite au moins la présence d'une protéine connue sous la désignation BRCA1 et d'une cascade de phosphorylations ordonnée des différents substrats d'ATM (voir l'article de N. Foray et al., «A subset of ATM- and ATR-dependent phosphorylation events requires the BRCA1 protein », paru dans The EMBO Journal vol. 22(11), p. 2860-2871 (2003)). L'essai a été entrepris d'utiliser l'enzyme ATM dans un modèle explicatif de la radiosensibilité cellulaire (voir Joubert et al., "DNA double- strand break repair defects in syndromes associated with acute radination response ; At least two different assays to predict intrinsic radiosensitivity ?", paru dans Int. J. Radiat. Biol., vol. 84(2), p. 107-125 (2008)), et cela a permis d'identifier trois types de radiosensibilité : les cellules radiorésistantes (radiosensibilité dite de Groupe I), les cellules modérément radiosensibles (radiosensibilité dite de Groupe II), et les cellules extrêmement radiosensibles (radiosensibilité dite de Groupe III,. Cependant, aucun modèle prédictif n'a été proposé sur cette base. De nombreux documents décrivent les conditions dans lesquelles l'ATM peut contribuer à la détection et la réparation de l'endommagement de l'ADN. La demande de brevet WO 2004/013634 (KUDOS Pharmaceuticals Ltd) décrit l'identification d'une composante de voie de signalisation de dommage ATM-dépendant de l'ADN qui interagit avec d'autres facteurs de réponse aux dommages de l'ADN, y compris le complexe MRE11/Rad51/NBS1. La demande de brevet US 2007/0072210 (Ouchi et Aglipay) propose une méthode de criblage d'agents thérapeutiques potentiels qui favorisent une réponse aux dommages de l'ADN, dans laquelle on mélange une protéine appelée BAAT1 (qui est associée à une prédisposition au cancer du sein liée au gène BRCA1), une protéine ATM et le composé candidat ; si la phosphorylation de l'ATM est augmentée par rapport à un mélange témoin ne comportant pas le composé candidat, ce dernier est identifié comme un potentiel principe actif favorisant la réparation de l'ADN. La demande de brevet EP 2 466 310 Al (Helmholtz Zentrum München) décrit la réparation de ruptures de l'ADN de type double brin en présence de la forme phosphorylée de l'histone H2AX (appelée gamma-H2AX ou g-H2AX). La demande WO 00/47760 et le brevet US 7,279,290 (St. Jude's Children's Research Hospital) décrivent le rôle de la fonction kinase de l'ATM dans la réparation de l'ADN. Ces derniers documents décrivent donc des voies de réparation mais n'offrent aucune corrélation pour établir un lien avec la clinique. Le brevet EP 1 616 011 B1 (International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology) propose une méthode pour le diagnostic d'un défaut génétique dans la réparation de l'ADN basée sur trois étapes : la culture de cellules isolées d'un échantillon à tester, l'incubation de ces cellules avec un polypeptide chimérique, la caractérisation de la réponse cellulaire. Ladite réponse cellulaire est le taux d'expression d'un marqueur biochimique consistant en protéines intracellulaires de type p53, ATM, Chk1 , Chk2, BRCA1, BRCA2, Nbs1 , MRE11, Rad50, Rad51 et des histones. Toutefois, l'expression radioinduite peut ne pas être prédictive de la fonctionnalité de ces protéines (certains syndromes présentent un taux d'expression normale alors que la protéine est mutée) : ces procédures ne sont pas des tests fonctionnels.It is also known that the question of tissue sensitivity to ionizing radiation is inseparable from that of DNA damage repair mechanisms. Indeed, at the cellular level, ionizing radiation can break certain types of chemical bonds by generating free radicals (in particular by peroxidation) and other reactive species that cause DNA damage. Damage to DNA by endogenous or exogenous aggressions (such as ionizing radiation and free radicals) can lead to different types of DNA damage depending in particular on the deposited energy: base damage, single-strand breaks and double-strand breaks (DSBs). Unrepaired CBD is associated with cell death, toxicity and more specifically radiosensitivity. Badly repaired CBD is associated with genomic instability, mutagenicity, and susceptibility to cancer. The body has specific repair systems for each type of DNA damage. For CBD, mammals have two primary modes of repair: suture repair (ligation of strands) and recombinant repair (insertion of a homologous or non-homologous strand). It is known that the sensitivity of tissues to ionizing radiation is very variable from one organ to another and from one individual to another; the idea of "intrinsic radiosensitivity" was conceptualized by Fertil and Malaise in 1981. Thus, various studies on the therapeutic effects and side effects of radiotherapy have shown that there are individuals who enjoy radioresistance particularly high, and individuals that show instead a radiosensitivity that can range from a clinically recognized side effect but without consequences to a lethal effect. Even apart from some rare cases of extreme radiosensitivity, whose genetic origin seems to be proven, it is thought that radiosensitivity generally results from a genetic predisposition: it is therefore specific to an individual. It would therefore be desirable to have a predictive test method to determine the maximum cumulative dose that a given patient can safely receive. This question arises first of all in radiotherapy in a context of high ionizing doses. However, this question is also likely to arise for any other exposure to high ionizing doses, equivalent to those used in radiotherapy. Two proteins of the kinase family, commonly known as ATM and ATR, are known to be involved in the detection, repair and signaling of CBD; their action requires at least the presence of a protein known as the BRCA1 designation and an ordered phosphorylation cascade of the different ATM substrates (see the article by N. Foray et al., "A subset of ATM- and ATR-dependent phosphorylation events requires BRCA1 protein, published in The EMBO Journal 22 (11), 2860-2871 (2003)). The test was undertaken to use the ATM enzyme in an explanatory model of cellular radiosensitivity (see Joubert et al., "DNA double-strand break repair defects in syndromes associated with acute radiation At least two different assays to predict intrinsic radiosensitivity? ", published in Int.J. Radiat Biol., vol 84 (2), pp. 107-125 (2008)), and this has identified three types of radiosensitivity: radiation-resistant cells ( Group I radiosensitivity), moderately radiosensitive cells (so-called Group II radiosensitivity), and extremely radiosensitive cells (so-called Group III radiosensitivity), but no predictive model has been proposed on this basis. the conditions under which the ATM can contribute to the detection and repair of DNA damage The patent application WO 2004/013634 (KUDOS Pharmaceuticals Ltd) describes the identification of a component of e-ATM-dependent damage signaling that interacts with other DNA damage response factors, including the MRE11 / Rad51 / NBS1 complex. US Patent Application 2007/0072210 (Ouchi and Aglipay) provides a method of screening for potential therapeutic agents that promote a DNA damage response, in which a protein called BAAT1 (which is associated with a predisposition to breast cancer linked to the BRCA1 gene), an ATM protein and the candidate compound; if the phosphorylation of the ATM is increased relative to a control mixture not comprising the candidate compound, the latter is identified as a potential active ingredient promoting the repair of the DNA. Patent Application EP 2 466 310 A1 (Helmholtz Zentrum München) describes the repair of breaks in double-stranded DNA in the presence of the phosphorylated form of histone H2AX (called gamma-H2AX or g-H2AX). WO 00/47760 and US Pat. No. 7,279,290 (St. Jude's Children's Research Hospital) describe the role of ATM kinase function in DNA repair. These latter documents describe repair routes but offer no correlation to establish a link with the clinic. Patent EP 1 616 011 B1 (International Center for Genetic Engineering and Biotechnology) proposes a method for the diagnosis of a genetic defect in DNA repair based on three steps: the culture of cells isolated from a test sample , incubating these cells with a chimeric polypeptide, characterizing the cellular response. Said cellular response is the level of expression of a biochemical marker consisting of intracellular proteins of p53, ATM, Chk1, Chk2, BRCA1, BRCA2, Nbs1, MRE11, Rad50, Rad51 and histone type. However, the radioinduced expression may not be predictive of the functionality of these proteins (some syndromes have a normal expression level while the protein is mutated): these procedures are not functional tests.
Les demandes de brevet WO 01/90408, WO 2004/059004 et WO 2006/136686 (Commissariat à l'Energie Atomique) décrivent d'autres méthodes pour constater l'endommagement de l'ADN suite à une irradiation ionisante. Le premier document concerne la mise en évidence d'activités d'incision des lésions de l'ADN, il ne permet pas la quantification des activités enzymatiques d'excision et de resynthèse de l'ADN ni de la réparation des CDB. Les deux autres documents décrivent l'évaluation quantitative des capacités d'un milieu biologique à réparer son ADN à l'aide d'ADN double-brin circulaire superenroulé (selon le troisième document : immobilisé dans un film d'hydrogel de polyacrylamide poreux). Ces procédés ne concernent pas directement les CDB dans leur environnement physiologique in situ et aucune corrélation n'existe pour valider leur application en clinique. KR20030033519 propose de déduire la sensibilité au rayonnement de l'activité de la catalyse ou de la superoxyde dismutase, KR20030033518 utilise la glutathione peroxydase ou la glucose 6-phosphate dehydrogenase. De telles méthodes ne détectent pas des marqueurs directement reliés à l'endommagement ou à la réparation de l'ADN. La demande de brevet US 2011/312514 (Dana Farber Cancer Institute) propose d'utiliser la détection des foci FANCD2 comme marqueur. La demande de brevet US 2007/0264648 (National lnstitute of Radiological Sciences) propose l'utilisation des oligomères de l'ADN pour la prédiction de l'apparition d'effets secondaires lors des radiothérapies. Toutefois, certaines radiosensibilités peuvent être observées alors que le taux de foci FANCD2 est normal.Patent applications WO 01/90408, WO 2004/059004 and WO 2006/136686 (Atomic Energy Commission) describe other methods for detecting damage to DNA following ionizing irradiation. The first document concerns the detection of incision activities of DNA lesions, it does not allow the quantification of enzymatic activities of excision and resynthesis of DNA or the repair of CBD. The other two documents describe the quantitative evaluation of the ability of a biological medium to repair its DNA using supercoiled circular double-stranded DNA (according to the third document: immobilized in a porous polyacrylamide hydrogel film). These methods do not directly concern CBD in their physiological environment in situ and no correlation exists to validate their clinical application. KR20030033519 proposes to deduce the radiation sensitivity of the activity of catalysis or superoxide dismutase, KR20030033518 uses glutathione peroxidase or glucose 6-phosphate dehydrogenase. Such methods do not detect markers directly related to DNA damage or repair. US Patent Application 2011/312514 (Dana Farber Cancer Institute) proposes to use detection of FANCD2 foci as a marker. US Patent Application 2007/0264648 (National Institute of Radiological Sciences) proposes the use of oligomers of DNA for predicting the occurrence of side effects in radiotherapy. However, some radiosensitivity can be observed while the FANCD2 foci rate is normal.
Les demandes de brevet US 2008/234946 et US 2012/041908 (University of South Florida et al.) décrivent une méthode pour la prédiction de la radiosensibilité de cellules cancéreuse, et non pas de cellules saines ; elle est en plus basée sur des données génomiques et non des tests fonctionnels Le brevet US 8,269,163 (New York University School of Medecine) décrit un grand nombre de protéines susceptibles d'être utilisées comme marqueurs pour apprécier de manière simple et rapide l'importance de l'exposition accidentelle au rayonnement ionisant qu'une personne a subie, en vue de trier les patients et de les orienter vers un traitement d'urgence approprié. Ce dernier brevet concerne la dosimétrie biologique (détermination de la dose accidentelle) alors que la détection de la radiosensibilité s'effectue à partir d'une dose connue. La demande de brevet WO 2010/88650 (University of Texas) décrit des méthodes et compositions pour identifier les cellules cancéreuses qui sont soit sensibles soit résistantes à un traitement de radiothérapie particulier ; elles n'est donc pas applicable à tout traitement radiothérapeutique. La demande de brevet WO 2010/136942 (Philips) décrit une méthode globale pour surveiller un patient lors d'une radiothérapie à l'aide de biomarqueurs. Le procédé comprend l'obtention d'au moins un descripteur dérivé d'une image extrait d'une modalité d'image, dans lequel le descripteur appartient à un tissu d'intérêt pour lequel est prévue une radiothérapie ou à un tissu dans le voisinage de ce volume cible. Le procédé comprend en outre la sélection d'au moins un marqueur biologique spécifique d'une maladie apte à détecter ou quantifier des effets secondaires de la radiothérapie dans la zone des tissus d'intérêt. En outre, le procédé comprend la récupération d'au moins une valeur de mesure in vitro du biomarqueur spécifique de la maladie sélectionnée. En outre, le procédé comprend le traitement du au moins descripteur de la au moins une valeur de biomarqueur in vitro au moyen d'une technique de corrélation, résultant en un signal de sortie indicatif de la radiotoxicité dans la région du tissu d'intérêt. Toutefois, l'enseignement de ce brevet ne tient compte que de la toxicité dépendant du tissu et non de l'individu et est principalement basée sur l'analyse d'images.US patent applications 2008/234946 and US 2012/041908 (University of South Florida et al.) Disclose a method for predicting radiosensitivity of cancer cells, not healthy cells; it is in addition based on genomic data and not on functional tests. US Patent No. 8,269,163 (New York University School of Medicine) describes a large number of proteins that can be used as markers to appreciate in a simple and rapid way the importance of the accidental exposure to ionizing radiation that a person has undergone, with a view to sorting patients and directing them to appropriate emergency treatment. The latter patent concerns biological dosimetry (determination of the accidental dose) while the detection of radiosensitivity is carried out starting from a known dose. Patent application WO 2010/88650 (University of Texas) describes methods and compositions for identifying cancer cells that are either sensitive or resistant to a particular radiotherapy treatment; they are therefore not applicable to any radiotherapeutic treatment. Patent application WO 2010/136942 (Philips) describes a global method for monitoring a patient during radiotherapy using biomarkers. The method comprises obtaining at least one descriptor derived from an image extracted from an image modality, in which the descriptor belongs to a tissue of interest for which radiotherapy or tissue is provided in the vicinity. of this target volume. The method further includes selecting at least one disease-specific biological marker for detecting or quantifying side effects of radiotherapy in the area of the tissues of interest. In addition, the method includes recovering at least one in vitro measurement value of the biomarker specific for the selected disease. In addition, the method comprises treating the at least one descriptor of the at least one in vitro biomarker value using a correlation technique, resulting in an output signal indicative of radiotoxicity in the region of the tissue of interest. However, the teaching of this patent only takes into account the tissue-dependent and not the individual-specific toxicity and is mainly based on image analysis.
La demande de brevet WO 2010/109357 décrit un procédé et un appareil pour la planification de protocole de radiothérapie adaptative basée sur l'optimisation de la probabilité de complication des tissus normaux et la probabilité de contrôle tumoral selon des marqueurs spécifiques à chaque patient. Les valeurs des marqueurs associées à des tissus normaux comprennent des valeurs de tests in vitro, les signatures par spectrométrie de masse des protéines, des données de l'anamnèse et les antécédents du patient. Les valeurs d'essai in vitro peuvent être d'origine cellulaire, protéomique et génétique tel que, mais sans s'y limiter, divers comptages de cellules, HB, CRP, PSA, TNF-alpha, ferritine, transferrine, LDH, IL-6, l'hepcidine, créatinine, glucose, HbAlc, et la longueur des télomères. Les marqueurs de l'anamnèse et des antécédents du patient incluent la chirurgie abdominale antérieure, les médicaments hormonaux ou de anticoagulants, le diabète, l'âge, et les mesures liées à la croissance tumorale. Les biomarqueurs non liés à la radiotoxicité sont également envisagés, tels que les biomarqueurs associés à diverses formes d'ablation ou agents chimiothérapeutiques. Toutetois, la radiosensibilité individuelle n'y est pas prise en compte. Malgré ce vaste état de la technique, la demanderesse constate que les brevets décrits ci-dessus ne décrivent pas une méthode de quantification de la radiosensibilité individuelle permettant d'évaluer le risque de réactions tissulaires post-radiothérapie, qui puisse être employé pour tout patient et tout type de rayonnement ionisant susceptible d'induire des CDB, et qui soit prédictif. Le problème de founir une méthode prédictive de la radiosensibilité individuelle reste donc sans solution opérationnelle. La présente invention vise à proposer une nouvelle méthode prédictive de la radiosensibilité tissulaire et clinique.Patent application WO 2010/109357 describes a method and apparatus for adaptive radiotherapy protocol planning based on optimizing the probability of complication of normal tissues and the probability of tumor control according to markers specific to each patient. The normal tissue marker values include in vitro test values, protein spectrometric signatures, history data, and patient history. The in vitro test values can be of cellular, proteomic and genetic origin such as, but not limited to, various cell counts, HB, CRP, PSA, TNF-alpha, ferritin, transferrin, LDH, IL-1. 6, hepcidin, creatinine, glucose, HbAlc, and telomere length. Anamnesis and patient history markers include anterior abdominal surgery, hormonal medications or anticoagulants, diabetes, age, and measures related to tumor growth. Biomarkers unrelated to radiotoxicity are also contemplated, such as biomarkers associated with various forms of ablation or chemotherapeutic agents. However, individual radiosensitivity is not taken into account. Despite this broad state of the art, the applicant notes that the patents described above do not describe a method of quantifying the individual radiosensitivity to assess the risk of post-radiotherapy tissue reactions, which can be used for any patient and any type of ionizing radiation likely to induce CBD, and which is predictive. The problem of providing a predictive method of individual radiosensitivity therefore remains without an operational solution. The present invention aims to propose a new predictive method of tissue and clinical radiosensitivity.
Objets de l'invention Les inventeurs ont constaté, et la méthode selon l'invention part de ce constat, que les cassures double-brin (CDB) de l'ADN sont les dommages radioinduits les plus prédictifs de la radiosensibilité quand ils sont non-réparés d'une part, et de l'instabilité génomique quand ils sont mal réparés d'autre part. Les inventeurs ont découvert que les CDB sont prises en charge par le mode majoritaire de réparation dit de suture, et/ou par le mode minoritaire de réparation fautive dit recombinaison MRE11- dépendante. L'équilibre entre ces deux modes de réparation est contrôlé par la protéine ATM. Le marqueur pH2AX indique un site CDB reconnu par le mode de réparation par suture. Le marqueur MRE11 indique un site de CDB qui a été pris en charge par la réparation fautive MRE11-dépendante. Le marqueur pATM renseigne sur l'activation de la voie de suture par phosphorylation de H2AX et l'inhibition de la voie M RE1 1-dépendante.OBJECTS OF THE INVENTION The inventors have found, and the method according to the invention is based on this observation, that the double-strand breaks (DSBs) of the DNA are the most radioinduced radiation-induced damage of radiosensitivity when they are not repaired on the one hand, and genomic instability when they are poorly repaired on the other. The inventors have discovered that CBD are supported by the majority mode of repair called suture, and / or by the minority mode of faulty repair called MRE11-dependent recombination. The balance between these two modes of repair is controlled by the ATM protein. The pH2AX marker indicates a CBD site recognized by the suture repair mode. The MRE11 marker indicates a CBD site that has been supported by the MRE11-dependent fault repair. The pATM marker provides information on activation of the suture pathway by phosphorylation of H2AX and inhibition of the 1-dependent RE1 M-pathway.
Les inventeurs ont par ailleurs observé un transfert des formes cytoplasmiques de la protéine ATM dans le noyau celluliare à la suite d'un stress de type oxydatif, et notamment à la suite d'un stress lié à un rayonnement ionisant induisant des CDB.The inventors have also observed a transfer of the cytoplasmic forms of the ATM protein into the celluloid nucleus following an oxidative-type stress, and in particular following a stress linked to an ionizing radiation inducing CBD.
Pour constater l'endommagement d'une ADN par une aggression exogène, il faut tenir compte, d'une part, de l'état spontané de l'ADN, et, d'autre part, de son état radioinduit. Par ailleurs, après irradiation, il faut tenir compte de la réparation de l'ADN, dont la cinétique dépend du mécanisme de réparation et donc du type d'endommagement radioinduit. On sait par ailleurs que l'efficacité et la rapidité de la réparation de l'ADN varie d'un individu à l'autre, et qu'il existe en outre des conditions génétiques particulières qui conduisent à une radiosensibilité exceptionnelle. Selon l'invention le problème est résolu par une méthode basée sur : 1) une amplification de cellules non transformées, notamment de cellules issues de biopsies de peau ; 2) un modèle mécanistique valable pour les cellules humaines quiescentes ; 3) des tests fonctionnels de la reconnaissance, de la réparation et de la signalisation des CDB valables quelle que soit la modalité thérapeutique.To observe the damage of a DNA by an exogenous aggression, one must take into account, on the one hand, the spontaneous state of the DNA, and on the other hand, its radioinduced state. Furthermore, after irradiation, the DNA repair must be taken into account, the kinetics of which depends on the repair mechanism and therefore on the type of radiation induced damage. It is also known that the efficiency and speed of DNA repair varies from one individual to another, and that there are also particular genetic conditions that lead to exceptional radiosensitivity. According to the invention the problem is solved by a method based on: 1) an amplification of non-transformed cells, in particular cells derived from skin biopsies; 2) a mechanistic model valid for quiescent human cells; 3) Functional tests for the recognition, repair and signaling of valid CBD regardless of the therapeutic modality.
Un premier objet de l'invention est un procédé pour prédire la radiosensibilité cellulaire d'un échantillon cellulaire envers un rayonnement ionisant, ledit échantillon cellulaire ayant été obtenu à partir de cellules prélevées sur un patient dans une zone non irradiée ou peu irradiée, dans lequel procédé : (i) on amplifie lesdites cellules prélevées, ces cellules amplifiées constituant « l'échantillon cellulaire » ; (ii) on détermine sur ledit échantillon cellulaire le nombre moyen de foci nucléaires obtenus avec le marqueur pH2AX aux temps d'observation t (ce nombre moyen étant appelé NpH2Ax(t)), lesdits temps d'observation t étant le temps t=0 min (appelé tO, état non irradié) et le temps d'observation t4 (et de préférence en plus les temps t1, t2 et t3) après irradiation avec une dose absorbée D; (iii) on détermine la dose totale à ne pas dépasser (DTNPD), exprimée en Gray (Gy), en utilisant au moins le paramètre NpH2Ax(t4), et dans lequel procédé - t4 est une valeur fixe qui représente le temps pour lequel le taux de cassures ADN atteint sa valeur résiduelle, et qui est avantageusement choisie entre 6 fois t3 et 8 fois t3, mais doit être dans ce cas être au moins de 12 heures, et de préférence comprise entre 12h et 48h, et qui est encore plus préférentiellement d'environ 24 heures ; - t3 est une valeur fixe qui représente le temps au bout duquel environ 25% des cassures double-brin (CDB) sont réparées dans des cellules témoins issues de patients radiorésistants, et qui est avantageusement choisie entre 3 fois t2 et 5 fois t2, mais doit dans ce cas être au moins de 2,5 heures et au plus de 6 heures, et est de préférence comprise entre 3 heures et 5 heures, et est encore plus préférentiellement environ 4 heures ; - t2 est une valeur fixe qui représente le temps au bout duquel environ 50% des CDB sont réparées dans des cellules témoins issues de patients radiorésistants, et qui est avantageusement choisie entre 5 fois t1 et 7 fois t1, mais qui doit dans ce cas être au moins de 35 minutes et au plus de 90 minutes, et est de préférence compris entre 45 minutes et 75 minutes, et est encore plus préférentiellement environ 60 minutes ; - t1 est une valeur fixe qui représente le temps au bout duquel le nombre de CDB reconnues atteint son maximum dans des cellules témoins issues de patients radiorésistants, et qui est avantageusement choisie entre 5 minutes et 15 minutes après l'arrêt de l'irradiation, de préférence entre 7,5 minutes et 12,5 minutes, et encore plus préferentiellement à environ 10 minutes.A first subject of the invention is a method for predicting the cellular radiosensitivity of a cell sample to ionizing radiation, said cell sample having been obtained from cells taken from a patient in a non-irradiated or poorly irradiated zone, in which method: (i) amplifying said sampled cells, said amplified cells constituting "the cell sample"; (ii) determining on said cell sample the average number of nuclear foci obtained with the pH2AX marker at observation times t (this average number being called NpH2Ax (t)), said observation times t being the time t = 0 min (called t0, non-irradiated state) and the observation time t4 (and preferably in addition to the times t1, t2 and t3) after irradiation with an absorbed dose D; (iii) determining the total dose not to be exceeded (DTNPD), expressed in Gray (Gy), using at least the parameter NpH2Ax (t4), and in which process - t4 is a fixed value which represents the time for which the rate of DNA breaks reaches its residual value, and which is advantageously chosen between 6 times t3 and 8 times t3, but must in this case be at least 12 hours, and preferably between 12h and 48h, and which is still more preferably about 24 hours; t3 is a fixed value which represents the time after which approximately 25% of the double-strand breaks (DSB) are repaired in control cells from radioresistant patients, and which is advantageously chosen between 3 times t2 and 5 times t2, but in this case must be at least 2.5 hours and at most 6 hours, and is preferably between 3 hours and 5 hours, and is even more preferably about 4 hours; t2 is a fixed value which represents the time after which approximately 50% of the CBDs are repaired in control cells originating from radioresistant patients, and which is advantageously chosen between 5 times t1 and 7 times t1, but which must in this case be at least 35 minutes and at most 90 minutes, and is preferably between 45 minutes and 75 minutes, and even more preferably about 60 minutes; t1 is a fixed value which represents the time after which the number of recognized CBDs reaches its maximum in control cells from radioresistant patients, and which is advantageously chosen between 5 minutes and 15 minutes after stopping irradiation, preferably between 7.5 minutes and 12.5 minutes, and even more preferably about 10 minutes.
Dans un mode de réalisation avantageux on utilise également le nombre moyen de foci nucléaires obtenus avec le marqueur pH2AX aux temps d'observation t1, t2 et t3 pour vérifier la forme la courbe cinétique de réconnaissance et de réparation des CDB. La dose totale à ne pas dépasser (DTNPD), exprimée en Gray (Gy), est un paramètre important pour le radiothérapeute, qui permet de prédire quelle dose maximale un patient donné peut absorber sans subir une réaction potentiellement létale ; ce paramètre permet également d'écarter de la radiothérapie les patients qui présentent une radiosensibilité particulièrement forte.In an advantageous embodiment, the average number of nuclear foci obtained with the pH2AX marker at the observation times t1, t2 and t3 is also used to verify the shape of the kinetic curve of recognition and repair of CBD. The total dose not to be exceeded (DTNPD), expressed in Gray (Gy), is an important parameter for the radiation therapist, who can predict what maximum dose a given patient can absorb without experiencing a potentially lethal reaction; this parameter also makes it possible to exclude from radiation therapy patients who have a particularly strong radiosensitivity.
Selon l'invention, on peut déterminer la DTNPD selon la formule DTNPD = 60/NpH2Ax(t4) si NpH2Ax(t0) 3, ou selon la formule DTNPD = 60/[NpH2Ax(t4) + Nel2Ax(t0)] si NpH2Ax(t0) > 3, Dans une variante du procédé selon l'invention on détermine sur ledit échantillon cellulaire également le nombre moyen de micronoyaux observés aux temps t pour 100 cellules [en %] (ce nombre moyen étant appelé NMN(t)), les temps t étant au moins tO (non irradié) et t4 après irradiation avec une dose absorbée D, on utilise le paramètre NNM(t4) dans la détermination de la DTNPD.According to the invention, the DTNPD can be determined according to the formula DTNPD = 60 / NpH2Ax (t4) if NpH2Ax (t0) 3, or according to the formula DTNPD = 60 / [NpH2Ax (t4) + Nel2Ax (t0)] if NpH2Ax ( In a variant of the method according to the invention, the mean number of micronuclei observed at time t per 100 cells [in%] is also determined on said cell sample (this average number being called NMN (t)), the time t being at least t0 (non-irradiated) and t4 after irradiation with an absorbed dose D, the parameter NNM (t4) is used in the determination of DTNPD.
On détermine alors la DTNPD selon la formule DTNPD = 120/[2 x NpH2Ax(t4) + NNM(t4)], et/ou selon la formule DTNPD = 120/[2 x NpH2Ax(t4) + NNM(t4)] si Nel2Ax(t0) 3, ou selon la formule DTNPD = 120/[2 x NpH2Ax(t4) + NpH2Ax(t0) + NNM(t4)] si Nel2Ax(t0) > 3. Le procédé selon l'invention utilise au moins un échantillon de tissu sain, de préférence des fibroblastes. Ces derniers sont de préférence prélevé sur le tissu conjonctif du patient. Ce prélèvement peut être effectué par biopsie. Ainsi, dans un mode de réalisation avantageux lesdites cellules prélevées sont des cellules fibroblastiques issues d'une biopsie de peau d'un patient (prélevées typiquement selon une méthode connue sous le nom « punch dermatologique »). L'échantillon de tissu est cultivé dans un milieu de culture approprié.The DTNPD is then determined according to the formula DTNPD = 120 / [2 x NpH2Ax (t4) + NNM (t4)], and / or according to the formula DTNPD = 120 / [2 x NpH2Ax (t4) + NNM (t4)] if Nel2Ax (t0) 3, or according to the formula DTNPD = 120 / [2 x NpH2Ax (t4) + NpH2Ax (t0) + NNM (t4)] if Nel2Ax (t0)> 3. The method according to the invention uses at least one sample of healthy tissue, preferably fibroblasts. These are preferably taken from the connective tissue of the patient. This sampling can be done by biopsy. Thus, in an advantageous embodiment, said cells are fibroblastic cells derived from a skin biopsy of a patient (typically taken by a method known as "dermatological punch"). The tissue sample is grown in a suitable culture medium.
La première étape du procédé selon l'invention qui suit le prélèvement des cellules (à savoir dans le mode de réalisation préféré l'établissemement de la biopsie en lignée fibroblastique) consiste à caractériser l'état spontané de l'ADN (état à tO), c'est-à-dire sans irrradiation. Cette étape peut comporter notamment l'examen de la taille des noyaux, la présence de micronoyaux, des éventuels corps apoptotiques spontanés et de cellules multilésées : on observe les cellules sous un microscope à fluorescence. En utilisant le colorant DAPI (4'6'-diamidino-2-phénylindole, n° CAS 28718-90-3 pour le dihydrochlorure) on détermine le taux de micronoyaux pour 100 cellules, qui est un indicateur de l'instabilité génomique. On détermine également les corps apoptotiques.The first step of the process according to the invention which follows the removal of the cells (namely in the preferred embodiment of the establishment of the fibroblastic line biopsy) consists in characterizing the spontaneous state of the DNA (state at t0). that is to say without irradiation. This step may include in particular the examination of the size of the nuclei, the presence of micronuclei, possible spontaneous apoptotic bodies and multilésées cells: the cells are observed under a fluorescence microscope. Using the DAPI dye (4'6'-diamidino-2-phenylindole, CAS RN 28718-90-3 for dihydrochloride) the micronucleus level per 100 cells is determined, which is an indicator of genomic instability. Apoptotic bodies are also determined.
On détermine également la population de noyaux anormalement gros, dont la présence indique la décondensation de la chromatine. Ledit rayonnement ionisant est défini par sa dose absorbée (paramètre appelé D et exprimé en Gray). Dans le cadre de la présente invention la dose absorbée D est comprise entre 0,5 Gy et 4 Gy, de préférence comprise entre 1 Gy et 3 Gy, de préférence entre 1,7 et 2,3 Gy, et est encore plus préférentiellement de 2 Gy. Ces zones correspondent typiquement à une séance individuelle de traitement radiothérapeutique, le nombre de séances dépendant de la localisation, du type et du stade d'avancement de la tumeur. Il est essentiel pour la méthode selon l'invention que toutes les valeurs de temps t1, t2, t3 et t4 soient définies en début d'une série d'essais (i.e. au moins pour un patient donné, et de préférence pour une pluralité de patients afin de calibrer la méthode par rapport à un ensemble d'observations statistiquement significatifs) et soient les mêmes pour toutes les déterminations de tous les paramètres qui se réfèrent à ces intervalles de temps. Dans le procédé selon l'invention, t1 est avantageusement compris entre 8 et 12 minutes, et/ou t2 est avantageusement compris entre 50 et 70 minutes, et/ou t3 est avantageusement compris entre 3,5 et 4,5 heures, et/ou t4 est avantageusement compris entre 22 et 26 heures ; de préférence toutes ses quatre conditions sont remplies.The population of abnormally large nuclei, whose presence indicates the decondensation of chromatin, is also determined. Said ionizing radiation is defined by its absorbed dose (parameter called D and expressed in Gray). In the context of the present invention, the absorbed dose D is between 0.5 Gy and 4 Gy, preferably between 1 Gy and 3 Gy, preferably between 1.7 and 2.3 Gy, and is even more preferably 2 Gy. These areas typically correspond to an individual session of radiotherapeutic treatment, the number of sessions depending on the location, type and stage of the tumor. It is essential for the method according to the invention that all the time values t1, t2, t3 and t4 are defined at the beginning of a series of tests (ie at least for a given patient, and preferably for a plurality of patients to calibrate the method against a set of statistically significant observations) and be the same for all determinations of all parameters that refer to these time intervals. In the process according to the invention, t1 is advantageously between 8 and 12 minutes, and / or t2 is advantageously between 50 and 70 minutes, and / or t3 is advantageously between 3.5 and 4.5 hours, and / or or t4 is advantageously between 22 and 26 hours; preferably all four conditions are met.
Dans une variante du procédé qui est particulièrement intéressante et facile à standardiser, t1 est 10 minutes, t2 est 60 minutes, t3 est 4 heures, t4 est 24 heures, et D est 2 Gy. La détermination de NpH2Ax(t) fait avantageusement intervenir un test 30 d'immunofluorescence. Les cellules témoins issues de patients radiorésistants peuvent être prélevées sur des patients sélectionnés à partir d'un examen clinique comme patients n'ayant pas montré de réactions tissulaires significatives pendant ou à la suite d'un traitement 35 radiothérapeutique. Elles peuvent également être sélectionnées en tant que cellules montrant un taux de survie clonogénique in vitro supérieur à 55% après une irradiation avec une dose absorbée de 2 Gy. Nous décrivons ici un mode de réalisation typique.In a variant of the process which is particularly interesting and easy to standardize, t1 is 10 minutes, t2 is 60 minutes, t3 is 4 hours, t4 is 24 hours, and D is 2 Gy. The determination of NpH2Ax (t) advantageously involves an immunofluorescence test. Control cells from radiation-resistant patients may be taken from patients selected from clinical examination as patients who have not shown significant tissue reactions during or following radiotherapeutic treatment. They can also be selected as cells exhibiting an in vitro clonogenic survival rate of greater than 55% after irradiation with an absorbed dose of 2 Gy. We describe here a typical embodiment.
On observe les cellules avec le marqueur pH2AX. On peut ajouter l'observations avec les marqueurs pATM et/ou MRE11 aux temps d'observation t (ces nombres moyens étant appelés respectivement NpATm(t) et NmREi (t)) et au moins un temps d'observation sélectionné parmi t=t1, t2 , t3 et t4 après irradiation avec une dose absorbée D. Dans un mode de réalisation on détermine le nombre de foci avec le marqueur pH2AX et la présence de cellules multilésées. On note la localisation de la protéine pATM et celle de la protéine MRE11 (nucleaire ou cytoplasmique). Cette première étape permet d'identifier une éventuelle instabilité génomique à l'état spontanée. La seconde étape du procédé selon l'invention comprend l'irradiation avec la dose absorbée D voulue (par exemple 2 Gy) et l'évaluation de la réponse cellulaire au rayonnement ionisant. a) Dans un premier mode de réalisation, on étudie la réparation des CDB radioinduites par suture, qui est le mode majoritaire de leur réparation. On détermine le nombre de foci pH2AX par cellule à t4 et optionnellement aussi à t1, t2 et possiblement aussi à t3 ; la détermination à t3 permet de consolider la définition de l'allure des cinétiques de t1 à t4. Dans un mode de réalisation avantageux, après la durée t4 on détermine également le taux de micronoyaux pour en déduire le taux de micronoyaux radioinduits. Cela permet d'estimer la radiosensibilité selon l'importance des CDB non réparées. b) Dans un deuxième mode de réalisation on approfondit l'étude de la réponse cellulaire au rayonnement ionisant à travers la mesure de la fonctionnalité de l'activité kinase ATM-dépendante. On sait que dans les cellules radiorésistantes témoin, les formes phosphorylées de la protéine ATM (pATM) sont cytoplasmiques à l'état spontané. La demanderesse a découvert qu'à l'état irradié, elles ont tendance à devenir nucléaires. Une fois passées dans le noyau, les formes pATM activent les mécanismes de réparation par suture et inhibent la voie de réparation fautive dépendante de MRE11. A titre d'exemple, si après l'irradiation (par exemple avec une dose absorbée de 2 Gy) les formes pATM montent une localisation cytoplasmique, on en conclut que les formes pATM ne passent pas ou ne peuvent pas passer normalement du cytoplasme au noyau. Cela peut être causé par une mutation d'ATM ou de tout autre partenaire protéine d'ATM qui l'aiderait à passer dans le noyau après irradiation : en tout cas, cela indique une radiosensibilité significative.The cells are observed with the pH2AX marker. The observations with the markers pATM and / or MRE11 can be added to the observation times t (these average numbers being respectively called NpATm (t) and NmREi (t)) and at least one observation time selected from t = t1 , t2, t3 and t4 after irradiation with an absorbed dose D. In one embodiment, the number of foci with the pH2AX marker and the presence of multilosed cells are determined. The location of the pATM protein and that of the MRE11 protein (nuclear or cytoplasmic) are noted. This first step makes it possible to identify a possible genomic instability in the spontaneous state. The second step of the process according to the invention comprises irradiation with the desired absorbed dose D (for example 2 Gy) and evaluation of the cellular response to ionizing radiation. a) In a first embodiment, the repair of radiation-induced CDBs by suture, which is the majority mode of their repair, is studied. The number of pH2AX foci per cell is determined at t4 and optionally also at t1, t2 and possibly also at t3; the determination at t3 makes it possible to consolidate the definition of the kinetic rate of t1 to t4. In an advantageous embodiment, after the time t4, the level of micronucleus is also determined to deduce the level of radioinduced micronuclei. This makes it possible to estimate radiosensitivity according to the importance of unrepaired CBD. b) In a second embodiment, the study of the cellular response to ionizing radiation is further investigated by measuring the functionality of the ATM-dependent kinase activity. It is known that in control radio-resistant cells, the phosphorylated forms of the ATM protein (pATM) are spontaneously cytoplasmic. The applicant has discovered that, in the irradiated state, they tend to become nuclear. Once passed into the nucleus, the pATM forms activate the suture repair mechanisms and inhibit the MRE11-dependent fault repair pathway. For example, if after irradiation (for example with an absorbed dose of 2 Gy) the pATM forms mount a cytoplasmic localization, it is concluded that the pATM forms do not pass or can not pass normally from the cytoplasm to the nucleus . This can be caused by a mutation of ATM or any other ATM protein partner that would help it pass into the nucleus after irradiation: in any case, this indicates a significant radiosensitivity.
Cette détermination optionnelle de la localisation de la protéine pATM est effectuée au moins à t1 et t2, et optionnellement aussi à t3 et t4. c) dans un troisième mode de réalisation pouvant être combiné avec les précédents, on approfondit l'étude de la réponse cellulaire au rayonnement ionisant à travers la voie MRE11-dépendante. En plus de la voie majeure de réparation par suture dont la capacité est quantifiable par immunofluorescence pH2AX, la demanderesse a identifié une autre voie de réparation, alternative à la suture et qui est susceptible de la remplacer en cas de déficience : c'est la réparation par recombinaison MRE11 dépendante. Sa capacité est quantifiable par l'étude cinétique de l'immunofluorescence des foci MRE11. Cette mesure est effectuée au moins à t1, t2 et t3, et optionnellement aussi à t4. Selon les constatations de la demanderesse, dans les lignées témoins radiorésistantes, MRE11 est cytoplasmique et le nombre de foci MRE11 est très faible jusqu'à 4 heures après une dose 2 Gy (typiquement 7 ± 2 foci MRE11) ; le marquage devient cytoplasmique environ 24 heures après l'irradiation. Dans une dernière étape on procède à l'évaluation des résultats en calculant les scores afin de prédire l'état d'endommagement radioinduit et/ou la radiosensibilité du patient, et en particulier la DTNPD qui lui est propre.This optional determination of the location of the pATM protein is performed at least at t1 and t2, and optionally also at t3 and t4. c) in a third embodiment that can be combined with the above, the study of the cellular response to ionizing radiation through the MRE11-dependent pathway is studied in greater depth. In addition to the major suture repair pathway whose capacity is quantifiable by pH2AX immunofluorescence, the applicant has identified another alternative route of repair, which is an alternative to the suture and which is likely to replace it in case of impairment: it is the repair by recombination MRE11 dependent. Its capacity is quantifiable by the kinetic study of the immunofluorescence of MRE11 foci. This measurement is performed at least at t1, t2 and t3, and optionally also at t4. According to the findings of the applicant, in the radio-resistant control lines, MRE11 is cytoplasmic and the number of MRE11 foci is very low up to 4 hours after a 2 Gy dose (typically 7 ± 2 MRE11 foci); the labeling becomes cytoplasmic about 24 hours after irradiation. In a final step, the results are evaluated by calculating the scores in order to predict the radioinduced damage state and / or the radiosensitivity of the patient, and in particular the DTNPD that is specific to him.
Description A. Définitions générales35 Les termes « endommagement radioinduit », « radioinduit », « radiosensibilité, « radiorésistance », « radiotoxicité », « radiothérapie » se réfèrent tous à un rayonnement ionisant, notamment à un rayonnement de type particules, tel que constitué par des particules de type alpha (a) ou béta ([3), ou encore à un rayonnement électromagnétique à haute énergie, notamment de type gamma (y) ou X. B. Description détaillée Nous décrivons ici un mode de réalisation avec plusieurs variantes qui convient pour un patient humain. 1 Préparation de l'essai Avant tout prélèvement de cellules et avant toute manipulation des cellules prelévées, les opérateurs respectifs (appartenant par exemple à un laboratoire d'analyses cytologiques) sont informés (typiquement par le médecin) du statut d'infection éventuelle du patient par HIV ou hépatite C pour que les opérateurs puissent prendre les mesures appropriées de sécurité biologique accrue lors du prélèvement, de la manipulation et de la gestion de la culture cellulaire. Puis, l'opérateur prélève au patient un échantllon cellulaire. De préférence il lui prélève par biopsie un échantillon de peau ; ce prélèvement peut se faire avantageusement selon une méthode connue sous le nom « punch dermatologique ». L'échantillon cellulaire est placé dans du milieu DMEM+20% sérum de veau fetal stérile. L'échantillon est transféré sans délai dans un laboratoire spécialisé, sachant que l'échantillon ne doit pas rester plus de 38 h à la température ambiante. Dès réception, l'échantillon cellulaire (typiquement la biopsie) est établie sous la forme d'une lignée cellulaire amplifiable sans agent de transformation virale ou chimique suivant une procédure ancillaire et bien connue des laboratoires de culture. Dès que le nombre de cellules est suffisant (1 - 3 semaines), les premières expériences sont réalisées en utilisant le procédé selon l'invention. Les cellules sont ensemencées sur lamelles de verre dans des boîtes de Petri. Une partie de ces lamelles sont irradiées sur un irradiateur médical suivant une dosimétrie certifiée avec une dose absorbée D (par exemple 2 Gy). Une autre partie n'est pas irradié ; elle repésente l'état spontané (dose absorbée 0 Gy). L'irradiation peut être effectuée par exemple avec un accélérateur médical qui délivre des photons de 6 MV avec un débit de dose absorbée de 3 Gy min-1. Après l'irradiation et pour subir les temps de réparation mentionnés ci-dessous, les cellules restent dans l'incubateur de culture à 37°C. Pour les cellules irradiées, on acquiert des caractéristiques correpondant à l'état radio- induit après plusieurs temps de réparation (temps de réparation post-irradiation). On acquiert de préférence au moins deux et encore plus préférentiellement au moins trois points, à savoir : t1, t2, t3 et t4. Lesdites caractéristiques sont représentées par les foci correspondant au marqueur pH2AX. Les cellules sur lamelles de verre sont ensuite fixées, lysées et hybridées. La procédure suivante, connue en tant que telle (voir la publication citée de Bodgi et al.), peut être utilisée : les cellules ont été fixés dans 3% paraformaldéhyde et 2% sucrose pendant 15 minutes à température ambiante et perméabilisées dans 20 mM solution tampon HEPES (acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazine éthane sulfonique) à pH 7,4, 50 mM NaCI, 3 mM MgC12, 300 mM sucrose, 0,5% Triton X-100 (un surfactant non-ionique de formule t-Oct-C6H4-(OCH2CH2)x0H avec x= 9-10, CAS N° 9002-93-1, fourni par Sigma Aldrich) pendant 3 minutes. Puis les lamelles de couverture ont été lavées dans du tampon phosphate salin (connu sous le sigle PBS) avant coloration immunologique. L'incubation a eu lieu pendant 40 min à 37°C dans du PBS additioné de 2% d'albumine de sérum bovin (connu sous le sigle BSA ou fraction V, fourni par Sigma Aldrich) et a été suivi par un lavage au PBS. Les anticorps primaires anti-pH2AX ont été utilisés à une concentration de 1 :800, les autres anticorps primaires à 1 :100. Les incubations avec des anticorps secondaires FITC anti-souri ou TRITC anti-lapin (1:100, fournis par Sigma Aldrich) ont été effectuées à 27°C dans du BSA à 2% pendant 20 minutes. On a traité des lamelles de verre avec du VectashieldTM contenant du DAPI (4,6-Diamidino- 2-phénylindole) pour marquer le noyeau. La coloration avec du DAPI pemet aussi, de manière indirecte, la détermination du nombre de cellules en phase G1 (noyaux avec coloration DAPI homogène), en phase S (noyaux avec de nombreux foci pH2AX), en phase G2 (noyaux avec coloration DAPI hétérogène) et métaphases (chromosomes visibles).Description A. General definitions35 The terms "radioinduced damage", "radioinduced", "radiosensitivity", "radioresistance", "radiotoxicity", "radiotherapy" all refer to ionizing radiation, including particulate radiation, as constituted by particles of the alpha (a) or beta ([3) type, or else at high energy electromagnetic radiation, in particular of the gamma (y) or XB type Detailed description We describe here an embodiment with several variants which is suitable for a human patient. 1 Preparation of the test Before any cell collection and before any manipulation of the prelévées cells, the respective operators (belonging for example to a cytological analysis laboratory) are informed (typically by the doctor) of the possible infection status of the patient by HIV or hepatitis C so that operators can take appropriate measures of increased biosecurity when collecting, handling and managing cell culture. Then, the operator takes the patient a cell sample. Preferably he biopsy samples a skin sample; this sampling can be advantageously done according to a method known as the "dermatological punch". The cell sample is placed in DMEM medium + 20% sterile fetal calf serum. The sample is transferred without delay to a specialized laboratory, knowing that the sample should not remain more than 38 hours at room temperature. Upon receipt, the cell sample (typically the biopsy) is established as an amplifiable cell line without viral or chemical transformation agent following an ancillary procedure and well known to the culture laboratories. As soon as the number of cells is sufficient (1 - 3 weeks), the first experiments are carried out using the method according to the invention. The cells are seeded on glass slides in Petri dishes. Part of these lamellae are irradiated on a medical irradiator according to a certified dosimetry with an absorbed dose D (for example 2 Gy). Another part is not irradiated; it represents the spontaneous state (absorbed dose 0 Gy). The irradiation can be carried out for example with a medical accelerator which delivers 6 MV photons with an absorbed dose rate of 3 Gy min-1. After irradiation and to undergo the repair times mentioned below, the cells remain in the culture incubator at 37 ° C. For the irradiated cells, characteristics corresponding to the radio-induced state are acquired after several repair times (post-irradiation repair time). At least two and even more preferably at least three points are preferably acquired, namely: t1, t2, t3 and t4. Said characteristics are represented by the foci corresponding to the pH2AX marker. The cells on glass slides are then fixed, lysed and hybridized. The following procedure, known per se (see the cited publication by Bodgi et al.), Can be used: the cells were fixed in 3% paraformaldehyde and 2% sucrose for 15 minutes at room temperature and permeabilized in 20 mM solution HEPES buffer (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazine ethanesulfonic acid) pH 7.4, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 300 mM sucrose, 0.5% Triton X-100 (a nonionic surfactant) of formula t-Oct-C6H4- (OCH2CH2) xOH with x = 9-10, CAS No. 9002-93-1, provided by Sigma Aldrich) for 3 minutes. The coverslips were then washed in phosphate buffered saline (known as PBS) prior to immunostaining. Incubation was for 40 min at 37 ° C in PBS supplemented with 2% bovine serum albumin (known as BSA or fraction V, provided by Sigma Aldrich) and followed by PBS washing. . The primary anti-pH2AX antibodies were used at a concentration of 1: 800, the other primary antibodies at 1: 100. Incubations with FITC anti-mouse or TRITC anti-rabbit secondary antibodies (1: 100, provided by Sigma Aldrich) were performed at 27 ° C in 2% BSA for 20 minutes. Glass slides were treated with VectashieldTM containing DAPI (4,6-Diamidino-2-phenylindole) to mark the core. Staining with DAPI also indirectly determines the number of cells in phase G1 (nuclei with homogeneous DAPI staining), in phase S (nuclei with many pH2AX foci), in phase G2 (nuclei with heterogeneous DAPI staining ) and metaphases (visible chromosomes).
L'acquisition des résultats est effectuée à partir de ces lamelles sur microscope à immunofluorescence (modèle Olympus par exemple). La lecture peut être directe (typiquement par comptage des foci sur au moins 50 cellules en Go/Gi pour chaque point) ou par logiciel d'analyse d'image dédié, ou encore sur un microscope automatisé ; de préférence les méthodes par logiciel ou microscope automatisé sont calibrées avec des déterminations manuelles. Afin d'obtenir des résultats d'une fiabilité statistique suffisante pour servir comme base d'un diagnostic, au moins 3 series d'expériences (irradiation) indépendantes sont effectuées et la moyenne de chacun des nombres de foci pour les temps définis est 10 calculée. 2. Détermination des paramètres biologiques et cliniques 2.1 Généralités et marqueurs utilisés 15 L'invention est basée entre autres sur l'utilisation de données acquises pour le marqueur pH2AX sur des cellules non-irradiées (état spontané) et irradiées (état radioinduit). La méthode est basée sur l'étude cinétique du marquage par ce marqueur en fonction de la durée de réparation : on marque les échantillons après un laps de 20 temps déterminé à compter de l'arrêt de l'irradiation, et on étudie leur immunofluorescence. On peut mesurer les courbes cinétiques complètes, par exemple représentées par 5 points se situant avantageusement à tO, t1 (de préférence 10 minutes), t2 (de préférence 1h), t3 (de préférence 4h) et t4 (de préférence 24h), sachant que tO correspond à l'état avant irradiation (état spontané). Il est avantageux 25 d'y associer les doonées acquises avec deux autres marqueur, à savoir pATM et MRE11. Mais la demanderesse s'est rendu compte que certains points (correspondant à certains temps de réparation) sont plus importants que d'autres, et que certains points 30 ne sont pas prédictifs. Grâce à la sélection judicieuse des paramètres déterminés à des temps donnés, on peut ainsi diminiuer le nombre de mesures et donc diminuer le coût global du diagnostic, sans diminuer le pouvoir prédictif de la méthode. C'est cette méthode simplifiée qui constitue la base de la méthode prédictive selon l'invention.The results are acquired from these slides on an immunofluorescence microscope (Olympus model, for example). The reading can be direct (typically by counting the foci on at least 50 cells in GB / Gi for each point) or by dedicated image analysis software, or on an automated microscope; preferably the software or automated microscope methods are calibrated with manual determinations. In order to obtain results of sufficient statistical reliability to serve as a basis for diagnosis, at least 3 sets of independent (irradiation) experiments are performed and the average of each of the foci numbers for the defined times is calculated. . 2. Determination of biological and clinical parameters 2.1 General and markers used The invention is based inter alia on the use of acquired data for the pH2AX marker on non-irradiated cells (spontaneous state) and irradiated (radioinduced state). The method is based on the kinetic study of the labeling by this marker as a function of the duration of the repair: the samples are marked after a lapse of time determined as of the end of the irradiation, and their immunofluorescence is studied. It is possible to measure the complete kinetic curves, for example represented by 5 points advantageously located at t0, t1 (preferably 10 minutes), t2 (preferably 1h), t3 (preferably 4h) and t4 (preferably 24h), knowing that t0 corresponds to the state before irradiation (spontaneous state). It is advantageous to associate the acquired doonates with two other markers, namely pATM and MRE11. But the plaintiff has realized that some points (corresponding to certain times of repair) are more important than others, and that some points 30 are not predictive. Thanks to the judicious selection of the parameters determined at given times, it is thus possible to reduce the number of measurements and thus reduce the overall cost of the diagnosis, without reducing the predictive power of the method. It is this simplified method that forms the basis of the predictive method according to the invention.
Les moyennes de chaque point et chaque dose avec chaque marqueurs sont calculées avec les erreurs écart-types de la moyenne (SEM) vu que l'échantillonnage est n=3 (pas d'écart-type gaussien de type standard error SE). (i) pH2AX désigne les formes phosphorylées en sérine 439 du variant X de l'histone H2AX qui marque, selon les constatations de la demanderesse, le nombre de cassures double-brin de l'ADN (CDB) qui sont reconnues par le mode de réparation majoritaire et fidèle, la suture. Le marqueur pH2AX est essentiellement nucléaire sous forme uniquement de foci nucléaire et seuls le nombre et la taille des foci seront analysés. (ii) pATM désigne les formes phosphorylées en sérine 1981 de la protéine kinase ATM. Selon les constatation de la demanderesse, ATM passe du cytoplasme au noyau après irradiation en conditions normales (statut radiorésistant). Les formes pATM se concentrent principalement dans le cytoplasme puis marquent des sites de CDB. Le marqueur pATM se distingue par une localisation qui peut être cytoplasmique homogène (pas de foci cytoplasmique) sans foci nucléaire, uniquement nucléaire sous forme uniquement de foci nucléaires (pas de localisation nucléaire homogène), soit cytoplasmique et foci nucléaire. (iii) MRE11 est une endonucléase qui casse l'ADN. Selon les constatations de la demanderesse, MRE11 marque les CDB mal réparées quand le processus de réparation est finalisé. Le marqueur MRE11 peut être soit cytoplasmique sans foci, soit cytoplasmique et nucléaire sans foci, soit cytoplasmique et nucléaire avec foci.The averages of each point and each dose with each marker are calculated with the standard deviation errors of the mean (SEM) since the sampling is n = 3 (no Gaussian standard deviation standard error SE). (i) pH2AX denotes the phosphorylated forms in serine 439 of the histone H2AX X variant which marks, according to the findings of the applicant, the number of double-strand breaks in the DNA (CDB) which are recognized by the method of Majority and faithful repair, the suture. The pH2AX marker is essentially nuclear in the form of only nuclear foci and only the number and size of the foci will be analyzed. (ii) pATM refers to the phosphorylated forms in 1981 serine of the ATM protein kinase. According to the applicant's finding, ATM passes from the cytoplasm to the nucleus after irradiation under normal conditions (radioresistant status). The pATM forms are mainly concentrated in the cytoplasm and then mark CBD sites. The pATM marker is distinguished by a location that can be homogeneous cytoplasmic (no cytoplasmic foci) without nuclear foci, only nuclear in the form of nuclear foci (no homogeneous nuclear localization), or cytoplasmic and nuclear foci. (iii) MRE11 is an endonuclease that breaks DNA. According to the plaintiff's findings, MRE11 marks the badly repaired CBDs when the repair process is finalized. The marker MRE11 can be either cytoplasmic without foci, or cytoplasmic and nuclear without foci, or cytoplasmic and nuclear with foci.
La contrecoloration au DAPI (un marqueur d'ADN connu de l'homme du métier) permet de localiser le noyau pour situer la localisation cytoplasmique ou nucléaire (cette répartition étant modifiée pour MRE11 et pATM sous l'influence de la radiation ionisante), pour quantifier les micronoyaux, les corps apoptotiques et la taille des noyaux qui sont des marqueurs cellulaires complémentaires aux données sur les foci. 2.2 Paramètres biologiques On définit et détermine comme indiqué : - NpH2Ax(t), NpATm(t), NMRE11(t) les nombres moyens de foci nucléaires obtenus avec les marqueurs pH2AX, pATM, et MRE11 aux temps d'observations tO (non irradié) ou t1, t2, t3, t4 après irradiation (dose absorbée: 2 Gy), sachant que la détermination du paramètre NpH2Ax(t) est obligatoire dans le cadre de la méthode selon l'invention, alors que celle des autres paramètres NpATm(t) et NMRE11(t) est facultative mais avantageuse ; - NMN(t) le nombre de micronoyaux observés spontanément (à t = tO, i.e. sans irradiation) ou à t = t4 après irradiation avec une dose absorbée de 2 Gy pour 100 cellules (en %). 2.3 Evaluation prédictive Elle vise la prédiction de paramètres cliniques ou radiothérapiques à partir des données biologiques mesurées. Il s'agit d'une analyse quantitative directement issue de la valeur mathématique des scores ou de formules mathématiques reliant les scores ; l'analyse concerne la dose totale à ne pas dépasser pour éviter une réaction potentiellement létale (critère appelé DTNPD) applicable à un patient qui va subir ou qui est en train de subir une radiothérapie : La dose totale à ne pas dépasser (DTNPD), exprimée en Gray (Gy), est un paramètre important pour le radiothérapeute, qui permet de prédire quelle dose maximale un patient donné peut absorber sans subir une réaction potentiellement létale ; ce paramètre permet également d'écarter de la radiothérapie les patients qui présentent une radiosensibilité particulièrement forte. Selon l'invention, on peut déterminer la DTNPD selon la formule DTNPD = 60/NpH2Ax(t4) si NpH2Ax(t0) 3, ou selon la formule DTNPD = 60/[NpH2Ax(t4) + NpH2Ax(t0)] si NpH2Ax(t0) > 3, Dans une variante du procédé selon l'invention on détermine sur ledit échantillon cellulaire également le nombre moyen de micronoyaux observés aux temps t pour 100 cellules [en %] (ce nombre moyen étant appelé NMN(t)), les temps t étant au moins tO (non irradié) et t4 après irradiation avec une dose absorbée D, on utilise le paramètre NNM(t4) dans la détermination de la DTNPD. On détermine alors la DTNPD selon la formule DTNPD = 120/[2 x NpH2Ax(t4) + NNM(t4)], et/ou selon la formule DTNPD = 120/[2 x NpH2Ax(t4) + NNM(t4)] si Nel2Ax(t0) 3, ou selon la formule DTNPD = 120/[2 x NpH2Ax(t4) + Nel2Ax(t0) + NNM(t4)] si Nel2Ax(t0) > 3. Sur la base de cette analyse quantitative un diagnostic plus qualitatif peut ensuite être effectué ; il sera influencé par l'analyse quantitative mais tiendra compte d'éventuels éléments cliniques portés à la connaissance du praticien.15Counterpoloration with DAPI (a DNA marker known to those skilled in the art) makes it possible to locate the nucleus to locate the cytoplasmic or nuclear localization (this distribution being modified for MRE11 and pATM under the influence of ionizing radiation), for quantify the micronuclei, apoptotic bodies and nuclei size that are complementary cell markers to the foci data. 2.2 Biological parameters One defines and determines as indicated: - NpH2Ax (t), NpATm (t), NMRE11 (t) the average numbers of nuclear foci obtained with the markers pH2AX, pATM, and MRE11 with the observation times tO (non irradiated ) or t1, t2, t3, t4 after irradiation (absorbed dose: 2 Gy), knowing that the determination of the parameter NpH2Ax (t) is mandatory within the framework of the method according to the invention, while that of the other parameters NpATm ( t) and NMRE11 (t) is optional but advantageous; - NMN (t) the number of micronuclei observed spontaneously (at t = t0, i.e. without irradiation) or at t = t4 after irradiation with an absorbed dose of 2 Gy per 100 cells (in%). 2.3 Predictive evaluation It aims to predict clinical or radiotherapeutic parameters based on measured biological data. It is a quantitative analysis directly derived from the mathematical value of the scores or mathematical formulas linking the scores; the analysis concerns the total dose not to be exceeded to avoid a potentially lethal reaction (called DTNPD criterion) applicable to a patient who is going to undergo or who is undergoing radiotherapy: the total dose not to be exceeded (DTNPD), expressed in Gray (Gy), is an important parameter for the radiation therapist, who can predict which maximum dose a given patient can absorb without experiencing a potentially lethal reaction; this parameter also makes it possible to exclude from radiation therapy patients who have a particularly strong radiosensitivity. According to the invention, the DTNPD can be determined according to the formula DTNPD = 60 / NpH2Ax (t4) if NpH2Ax (t0) 3, or according to the formula DTNPD = 60 / [NpH2Ax (t4) + NpH2Ax (t0)] if NpH2Ax ( In a variant of the method according to the invention, the mean number of micronuclei observed at time t per 100 cells [in%] is also determined on said cell sample (this average number being called NMN (t)), the time t being at least t0 (non-irradiated) and t4 after irradiation with an absorbed dose D, the parameter NNM (t4) is used in the determination of DTNPD. The DTNPD is then determined according to the formula DTNPD = 120 / [2 x NpH2Ax (t4) + NNM (t4)], and / or according to the formula DTNPD = 120 / [2 x NpH2Ax (t4) + NNM (t4)] if Nel2Ax (t0) 3, or according to the formula DTNPD = 120 / [2 x NpH2Ax (t4) + Nel2Ax (t0) + NNM (t4)] if Nel2Ax (t0)> 3. On the basis of this quantitative analysis a diagnosis more qualitative can then be done; it will be influenced by the quantitative analysis but will take into account any clinical elements brought to the knowledge of the practitioner.
Claims (3)
Priority Applications (17)
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