FR3067467A1

FR3067467A1 - RAPID PREDICTIVE METHOD FOR CHARACTERIZING THE RADIOSENSITIVITY AND / OR THE TISSUE REACTION OF AN INDIVIDUAL TO AN IRRADIATION

Info

Publication number: FR3067467A1
Application number: FR1755262A
Authority: FR
Inventors: Sandrine PEREIRA
Original assignee: Neolys Diagnostics
Current assignee: Neolys Diagnostics Fr
Priority date: 2017-06-13
Filing date: 2017-06-13
Publication date: 2018-12-14
Anticipated expiration: 2037-06-13
Also published as: FR3067467B1

Abstract

Procédé pour caractériser la radiosensibilité d un échantillon cellulaire d un individu envers un rayonnement ionisant, ledit échantillon cellulaire ayant été obtenu à partir de cellules prélevées sur ledit individu, ledit procédé étant caractérisé en ce que - la radiosensibilité est déterminée à partir de la quantité de la protéine ATM phosphorylée pATM à l état basal t0, - ledit procédé ne comprend pas d irradiation dudit échantillon cellulaire.A method for characterizing the radiosensitivity of an individual cell sample to ionizing radiation, said cell sample having been obtained from cells taken from said individual, said method being characterized in that - the radiosensitivity is determined from the amount of the pATM phosphorylated ATM protein in the basal state t0, said method does not include irradiating said cell sample.

Description

Méthode prédictive rapide pour caractériser la radiosensibilité et/ou la réaction tissulaire d’un individu envers une irradiationRapid predictive method for characterizing the radiosensitivity and / or tissue reaction of an individual to irradiation

Domaine technique de l’inventionTechnical field of the invention

L’invention concerne le domaine de la radiobiologie médicale, et plus particulièrement le domaine des méthodes de laboratoire radiobiologiques. L’invention concerne une nouvelle méthode prédictive de la radiosensibilité cellulaire, tissulaire et clinique qui se base sur la détermination et le recoupement d‘un paramètre et de critères cellulaires et enzymatiques ainsi qu’un kit de prédiction de la radiosensibilité cellulaire, tissulaire et clinique d’un individu.The invention relates to the field of medical radiobiology, and more particularly to the field of radiobiological laboratory methods. The invention relates to a new method for predicting cellular, tissue and clinical radiosensitivity which is based on the determination and cross-checking of a cellular and enzymatic parameter and criteria, as well as a kit for predicting cellular, tissue and clinical radiosensitivity. of an individual.

Etat de la techniqueState of the art

Environ 1 à 15% des patients traités par radiothérapie pour un cancer montrent une réaction tissulaire (tel qu’une dermite ou une rectite) qui peut mettre en jeu le bon déroulement du traitement dans la mesure où elle peut conduire le médecin à décider l’arrêt du traitement radiothérapeutique avant la fin du protocole prévu. Par ailleurs, cette réaction tissulaire est un indicateur d’une sensibilité particulièrement élevée du patient au rayonnement ionisant. Ainsi, le traitement radiothérapeutique, même interrompu au moment de l’apparition des premiers signes tissulaires visibles, peut augmenter la morbidité voire la mortalité post-traitement des patients, non seulement parce que le cancer qu’il était censé traiter n’a pas pu être éradiqué complètement dû à l’arrêt prématuré du traitement, mais encore à cause de l’endommagement collatéral des tissus sains induit par le rayonnement lui-même.About 1 to 15% of patients treated with radiotherapy for cancer show a tissue reaction (such as dermatitis or proctitis) which can jeopardize the proper course of treatment insofar as it can lead the doctor to decide stopping radiotherapy treatment before the end of the planned protocol. Furthermore, this tissue reaction is an indicator of a particularly high sensitivity of the patient to ionizing radiation. Thus, radiotherapy treatment, even when interrupted when the first visible tissue signs appear, can increase the morbidity or even the post-treatment mortality of patients, not only because the cancer it was supposed to treat could not be eradicated completely due to the premature cessation of treatment, but also due to the collateral damage to healthy tissue induced by the radiation itself.

On sait également que la question de la sensibilité des tissus au rayonnement ionisant est inséparable de celles des mécanismes de réparation des dommages de l’ADN. En effet, au niveau cellulaire, le rayonnement ionisant peut casser certains types de liaisons chimiques en générant des radicaux libres (en particulier par peroxydation) et d’autres espèces réactives à l’origine des dommages de l’ADN. L’endommagement de l’ADN par des agressions endogènes ou exogènes (telles que les radiations ionisantes et les radicaux libres), peut aboutir à différents types de dommages de l’ADN en fonction notamment de l’énergie déposée : les dommages de bases, les cassures simple-brin et les cassures double-brin (CDB). Les CDB non réparées sont associées à la mort cellulaire, la toxicité et plus spécifiquement la radiosensibilité. Les CDB mal réparées sont associées à l’instabilité génomique, aux phénomènes mutagènes et à la prédisposition au cancer. L’organisme dispose de systèmes de réparation spécifiques à chaque type de dommage de l’ADN. En ce qui concerne les CDB, les mammifères possèdent deux principaux modes de réparation : la réparation par suture (ligation des brins) et la réparation par recombinaison (insertion d’un brin homologue ou non-homologue).We also know that the question of the sensitivity of tissues to ionizing radiation is inseparable from those of the mechanisms of repair of DNA damage. In fact, at the cellular level, ionizing radiation can break certain types of chemical bonds by generating free radicals (in particular by peroxidation) and other reactive species that cause DNA damage. DNA damage by endogenous or exogenous attacks (such as ionizing radiation and free radicals), can lead to different types of DNA damage depending in particular on the energy deposited: base damage, single-strand breaks and double-strand breaks (CDB). Unrepaired CBD is associated with cell death, toxicity and more specifically radiosensitivity. Poorly repaired CBD is associated with genomic instability, mutagenic phenomena, and a predisposition to cancer. The body has specific repair systems for each type of DNA damage. With regard to CBD, mammals have two main modes of repair: suture repair (strand ligation) and recombinant repair (insertion of a homologous or non-homologous strand).

On sait que la sensibilité des tissus au rayonnement ionisant est très variable d’un organe à l’autre et d’un individu à l’autre ; l’idée d’une « radiosensibilité intrinsèque » a été conceptualisée par Fertil et Malaise en 1981. Ainsi, les diverses études sur les effets thérapeutiques et les effets secondaires de la radiothérapie ont montré qu’il existe des individus qui jouissent d’une radiorésistance particulièrement élevée, et des individus qui montrent au contraire une radiosensibilité qui peut aller d’un effet secondaire reconnu cliniquement mais sans conséquence jusqu’à un effet létal. Même en dehors de certains rares cas de radiosensibilité extrême, dont l’origine génétique semble avérée, la radiosensibilité semble découler d’une manière générale d’une prédisposition génétique : elle est donc propre à un individu. Il serait donc désirable de disposer d’une méthode d’essai prédictive pour pouvoir déterminer la dose maximale cumulée qu’un individu donné tel qu’un patient donné peut recevoir sans risque. Cette question se pose en premier lieu en radiothérapie dans un contexte de fortes doses ionisantes. Toutefois, cette question est également susceptible de se poser pour toute autre exposition à de fortes doses ionisantes, équivalentes à celles utilisées en radiothérapie.We know that the sensitivity of tissues to ionizing radiation varies greatly from one organ to another and from one individual to another; the idea of "intrinsic radiosensitivity" was conceptualized by Fertil and Malaise in 1981. Thus, the various studies on the therapeutic effects and the side effects of radiotherapy have shown that there are individuals who enjoy radioresistance particularly high, and individuals who show on the contrary a radiosensitivity which can go from a clinically recognized side effect but without consequence to a lethal effect. Even apart from some rare cases of extreme radiosensitivity, the genetic origin of which seems to be proven, radiosensitivity seems to derive in general from a genetic predisposition: it is therefore specific to an individual. It would therefore be desirable to have a predictive testing method in order to be able to determine the maximum cumulative dose that a given individual such as a given patient can safely receive. This question first arises in radiotherapy in the context of high ionizing doses. However, this question is also likely to arise for any other exposure to high ionizing doses, equivalent to those used in radiotherapy.

On sait que deux protéines de la famille des kinases, appelées couramment ATM et ATR, sont impliquées dans la détection, la réparation et la signalisation des CDB ; leur action nécessite au moins la présence d’une protéine connue sous la désignation BRCA1 et d’une cascade de phosphorylations ordonnée des différents substrats d’ATM (voir l’article de N. Foray et al., «A subset of ATM- and ATR-dependent phosphorylation events requires the BRCA1 protein », paru dans The EMBO Journal vol. 22(11), p. 2860-2871 (2003)). L’essai a été entrepris d’utiliser l’enzyme ATM dans un modèle explicatif de la radiosensibilité cellulaire (voir Joubert et al., “DNA double-strand break repair defects in syndromes associated with acute radiation response ; At least two different assays to predict intrinsic radiosensitivity ?”, paru dans Int. J. Radiat. Biol., vol. 84(2), p. 107-125 (2008)), et cela a permis d’identifier trois types de radiosensibilité : les cellules radiorésistantes (radiosensibilité dite de Groupe I), les cellules modérément radiosensibles (radiosensibilité dite de Groupe II), et les cellules extrêmement radiosensibles (radiosensibilité dite de Groupe III).It is known that two proteins of the kinase family, commonly called ATM and ATR, are involved in the detection, repair and signaling of CBDs; their action requires at least the presence of a protein known under the designation BRCA1 and of a cascade of ordered phosphorylations of the various substrates of ATM (see the article by N. Foray et al., “A subset of ATM- and ATR-dependent phosphorylation events requires the BRCA1 protein ”, published in The EMBO Journal vol. 22 (11), p. 2860-2871 (2003)). The trial was undertaken to use the ATM enzyme in an explanatory model of cellular radiosensitivity (see Joubert et al., “DNA double-strand break repair defects in syndromes associated with acute radiation response; At least two different assays to predict intrinsic radiosensitivity? ”, published in Int. J. Radiat. Biol., vol. 84 (2), pp. 107-125 (2008)), and this made it possible to identify three types of radiosensitivity: radio-resistant cells ( so-called Group I radiosensitivity), moderately radiosensitive cells (so-called Group II radiosensitivity), and extremely radiosensitive cells (so-called Group III radiosensitivity).

De nombreux documents décrivent les conditions dans lesquelles l’ATM peut contribuer à la détection et la réparation de l’endommagement de l’ADN (Gately et al « Characterization of ATM Expression, Localization, and Associated DNA-dependent Protein Kinase Activity » Molecular biology of the cell 1998 ; Khalil et al « ATM in focus: A damage sensor and cancer target» biodiscovery, 2012; Bhatti et al «ATM protein kinase: the linchpin of cellular defenses to stress » Cellular and Molecular Life Science, 2011 ; Khoronenkova et Dianov, «ATM prevents DSB formation by coordinating SSB repair and cell cycle progression », P NAS 2014).Numerous documents describe the conditions under which ATM can contribute to the detection and repair of DNA damage (Gately et al "Characterization of ATM Expression, Localization, and Associated DNA-dependent Protein Kinase Activity" Molecular biology of the cell 1998; Khalil et al "ATM in focus: A damage sensor and cancer target" biodiscovery, 2012; Bhatti et al "ATM protein kinase: the linchpin of cellular defenses to stress" Cellular and Molecular Life Science, 2011; Khoronenkova and Dianov, "ATM prevents DSB formation by coordinating SSB repair and cell cycle progression", P NAS 2014).

Ces derniers documents décrivent donc des voies de réparation des CDB induites par irradiation mais n’offrent aucune corrélation pour établir un lien avec les observations et diagnostics cliniques. La demande WO 2015 / 121 596 A1 décrit une méthode prédictive permettant de caractériser la radiosensibilité et la réaction tissulaire d’un patient envers un rayonnement ionisant thérapeutique. Plus particulièrement cette méthode inclut l’irradiation d’un échantillon biologique, la détection et la quantification de foci nucléaires radioinduits sur du tissu conjonctif de type fibroblastique par l’utilisation d’au moins deux marqueurs de détection parmi pH2AX, pATM et MRE11.These latter documents therefore describe CDB repair pathways induced by irradiation but offer no correlation to establish a link with clinical observations and diagnoses. Application WO 2015/121 596 A1 describes a predictive method for characterizing the radiosensitivity and the tissue reaction of a patient towards a therapeutic ionizing radiation. More particularly, this method includes the irradiation of a biological sample, the detection and the quantification of radioinduced nuclear foci on connective tissue of fibroblastic type by the use of at least two detection markers among pH2AX, pATM and MRE11.

C’est la seule méthode de l’état de la technique qui permet de quantifier la radiosensibilité individuelle, d’évaluer le risque de réactions tissulaires post-radiothérapie, et qui puisse être employé pour tout patient et tout type de rayonnement ionisant susceptible d’induire des CDB, et qui soit prédictif. Toutefois, cette méthode nécessite un équipement spécifique pour l’irradiation des échantillons cellulaires et la quantification des foci nucléaires radioinduits. En particulier, l’analyse des foci dans des cellules de type lymphocyte est assez difficile à cause de la petite taille de leur noyau et rend cette méthode complexe et chronophage. Le problème que la présente invention cherche à résoudre est de proposer une méthode prédictive permettant de caractériser la radiosensibilité et la réaction tissulaire d’un individu tel qu’un patient envers un rayonnement ionisant, qui soit plus simple à utiliser que celle décrite dans le document WO 2015/121 596 A1.It is the only prior art method which makes it possible to quantify individual radiosensitivity, to assess the risk of tissue reactions post-radiotherapy, and which can be used for any patient and any type of ionizing radiation capable of induce CBD, and that is predictive. However, this method requires specific equipment for the irradiation of cellular samples and the quantification of radio-induced nuclear foci. In particular, the analysis of foci in lymphocyte-like cells is quite difficult because of the small size of their nucleus and makes this method complex and time-consuming. The problem that the present invention seeks to solve is to provide a predictive method for characterizing the radiosensitivity and the tissue reaction of an individual such as a patient towards ionizing radiation, which is simpler to use than that described in the document. WO 2015/121 596 A1.

En particulier, la présente invention vise à proposer une nouvelle méthode prédictive rapide, simple et fiable de la radiosensibilité individuelle permettant d’effectuer un criblage des individus tels que des patients et de les orienter si le test est positif vers une méthode plus complète de la radiosensibilité tissulaire et clinique.In particular, the present invention aims to propose a new rapid, simple and reliable method for predicting individual radiosensitivity allowing screening of individuals such as patients and of directing them if the test is positive towards a more complete method of tissue and clinical radiosensitivity.

Objets de l’inventionObjects of the invention

Les inventeurs ont constaté, et la méthode selon l’invention part de ce constat, que le marqueur pATM renseigne sur l’activation de la voie de suture par phosphorylation de H2AX et l’inhibition de la voie MRE11-dépendante.The inventors have found, and the method according to the invention starts from this observation, that the pATM marker provides information on the activation of the suture pathway by phosphorylation of H2AX and the inhibition of the MRE11-dependent pathway.

Les inventeurs ont par ailleurs constaté que la quantité de pATM présente à l’état basal dans le cytoplasme et le noyau d’une cellule est fonction du type cellulaire étudié. De manière surprenante, les inventeurs ont aussi constaté que le statut de radiosensibilité d’un individu peut être facilement déterminé en fonction de la quantité de pATM présente à l’état basal dans le cytoplasme et le noyau d’une cellule d’un type cellulaire donné, et ce, sans que cette cellule subisse un stress lié à un rayonnement ionisant induisant des CDB au sein de la cellule.The inventors have also found that the amount of pATM present in the basal state in the cytoplasm and the nucleus of a cell is a function of the cell type studied. Surprisingly, the inventors have also found that the radiosensitivity status of an individual can be easily determined as a function of the amount of pATM present in the basal state in the cytoplasm and the nucleus of a cell type cell. given, and this, without this cell undergoing stress linked to ionizing radiation inducing CBD within the cell.

On sait que l’efficacité et la rapidité de la réparation de l’ADN varie d’un individu à l’autre, et qu’il existe en outre des conditions génétiques particulières qui conduisent à une radiosensibilité exceptionnelle.It is known that the efficiency and speed of DNA repair varies from one individual to another, and that there are also specific genetic conditions that lead to exceptional radiosensitivity.

Selon l’invention le problème est résolu par une méthode basée sur : 1) la détection de la quantité de protéine ATM totale, cytoplasmique et nucléaire ; 2) un modèle mécanistique valable pour les cellules humaines notamment des cellules sanguines; 3) des tests fonctionnels quelle que soit la modalité thérapeutique.According to the invention the problem is solved by a method based on: 1) detection of the amount of total, cytoplasmic and nuclear ATM protein; 2) a mechanistic model valid for human cells, in particular blood cells; 3) functional tests whatever the therapeutic modality.

De manière surprenante, les inventeurs ont découvert que la radiosensibilité d’un individu peut être prédite à partir de cellules non irradiées.Surprisingly, the inventors have discovered that the radiosensitivity of an individual can be predicted from unirradiated cells.

De manière surprenante, les inventeurs ont découvert que la radiosensibilité d’un individu peut être prédite à partir de cellules prélevées dans le sang dudit individu.Surprisingly, the inventors have discovered that the radiosensitivity of an individual can be predicted from cells taken from the blood of said individual.

De manière surprenante, les inventeurs ont découvert que la radiosensibilité d’un individu peut aussi être prédite à partir de cellules mucosales, de cellules épithéliales, de fibroblastes tels que ceux présents au niveau des bulbes capillaires, de l’épithélium de la face interne des joues ou issus de peau, dudit individu.Surprisingly, the inventors have discovered that the radiosensitivity of an individual can also be predicted from mucosal cells, epithelial cells, fibroblasts such as those present at the level of the hair bulbs, of the epithelium of the internal face of the cheeks or derived from skin, of said individual.

De manière surprenante, les inventeurs ont découvert que la radiosensibilité d’un individu peut être prédite par un simple test ELISA, sans utiliser de techniques de comptage des foci.Surprisingly, the inventors have discovered that the radiosensitivity of an individual can be predicted by a simple ELISA test, without using foci counting techniques.

La présente méthode s’applique à la détermination de la radiosensibilité par rapport à des fortes doses telles qu’habituellement utilisées dans la prise en charge des cancers par rayonnements ionisants (électrons, photons, protons, particules) tels qu’en protonthérapie ou en radiothérapie. En radiothérapie, les doses absorbées sont en générale comprises entre 0,5 Gy et 6 Gy. Cette plage de dose correspond typiquement à une séance individuelle de traitement radiothérapeutique, le nombre de séances dépendant de la localisation, du type et du stade d’avancement de la tumeur. La dose pour une séance de traitement radiothérapeutique est souvent de l’ordre de 2 Gy.The present method applies to the determination of radiosensitivity compared to high doses as usually used in the management of cancers by ionizing radiation (electrons, photons, protons, particles) such as in proton therapy or in radiotherapy. . In radiotherapy, the doses absorbed are generally between 0.5 Gy and 6 Gy. This dose range typically corresponds to an individual session of radiotherapeutic treatment, the number of sessions depending on the location, type and stage of advancement of the tumor. The dose for a radiotherapy treatment session is often around 2 Gy.

Un premier objet de l’invention est un procédé pour caractériser la radiosensibilité d’un échantillon cellulaire d’un individu envers un rayonnement ionisant, ledit échantillon cellulaire ayant été obtenu à partir de cellules prélevées sur ledit individu, ledit procédé étant caractérisé en ce que la radiosensibilité est déterminée à partir de la quantité de la protéine ATM phosphorylée pATM à l’état basal t₀, ledit procédé ne comprend pas d’irradiation dudit échantillon cellulaire.A first object of the invention is a method for characterizing the radiosensitivity of a cell sample of an individual to ionizing radiation, said cell sample having been obtained from cells taken from said individual, said method being characterized in that radiosensitivity is determined from the amount of the phosphorylated ATM protein pATM in the basal state t ₀ , said method does not include irradiation of said cell sample.

Avantageusement, on utilise pour la détermination de la quantité de la protéine pATM une méthode immuno-enzymatique, tel qu’un test ELISA.Advantageously, an enzyme-linked immunosorbent assay is used for determining the amount of the pATM protein, such as an ELISA test.

Dans ce mode de réalisation avantageux, la quantité de la protéine pATM activée peut être détectée dans le cytoplasme et le noyau cellulaire par un test ELISA.In this advantageous embodiment, the amount of activated pATM protein can be detected in the cytoplasm and the cell nucleus by an ELISA test.

Ces modes de réalisation sont adaptés à tout type d’échantillon cellulaire, mais de manière avantageuse, l’échantillon cellulaire est choisi parmi :These embodiments are suitable for any type of cell sample, but advantageously, the cell sample is chosen from:

un échantillon sanguin comprenant des lymphocytes ou des lymphoblastes, et un échantillon issu d’une biopsie comprenant des fibroblastes.a blood sample including lymphocytes or lymphoblasts, and a biopsy sample including fibroblasts.

Un second objet de l’invention est un procédé pour caractériser la radiosensibilité d’un échantillon cellulaire d’un individu envers un rayonnement ionisant, ledit échantillon cellulaire ayant été obtenu à partir de cellules prélevées sur ledit individu, dans lequel procédé (a) optionnellement, on isole des cellules nucléées cibles de l’échantillon cellulaire ;A second object of the invention is a method for characterizing the radiosensitivity of a cell sample of an individual to ionizing radiation, said cell sample having been obtained from cells taken from said individual, in which method (a) optionally , target nucleated cells are isolated from the cell sample;

(b) on extrait les fractions totales ou les fractions cytoplasmiques et nucléaires ou les fractions nucléaires de l’échantillon cellulaire ;(b) extracting the total fractions or the cytoplasmic and nuclear fractions or the nuclear fractions from the cell sample;

(c) on détermine sur les dites fractions dudit échantillon cellulaire, la quantité de la protéine ATM phosphorylée pATM à l’état basal t₀ ;(c) the quantity of the phosphorylated ATM protein pATM in the basal state t ₀ is determined on the said fractions of said cell sample;

(d) on détermine la radiosensibilité de l’échantillon cellulaire en utilisant au moins le nombre moyen pATM _t0 (nue normalisé) ou le nombre moyen pATM tO (cyto+nuc normalisé) ou le nombre moyen pATM _t0 (total normalisé) ;(d) the radiosensitivity of the cell sample is determined by using at least the average number pATM _t0 (normalized nude) or the average number pATM tO (normalized cyto + nuc) or the average number pATM _t0 (normalized total);

et où • pATM æ (nue normalisé), exprimé en ppm, désigne la quantité moyenne de pATM présente dans le compartiment nucléaire à l’état basal t₀ exprimée en ng divisée par la quantité totale de protéines cellulaires extraites dudit compartiment nucléaire exprimée en pg;and where • pATM æ (normalized nude), expressed in ppm, denotes the average amount of pATM present in the nuclear compartment in the basal state t ₀ expressed in ng divided by the total quantity of cellular proteins extracted from said nuclear compartment expressed in pg ;

• pATM to (cyto+nuc normalisé), exprimé en ppm, désigne la quantité moyenne de pATM présente dans les compartiments cytoplasmiques et nucléaires à l’état basal t₀exprimée en ng divisée par la quantité totale de protéines cellulaires extraites desdits compartiments cytoplasmiques et nucléaires exprimée en pg;PATM to (normalized cyto + nuc), expressed in ppm, denotes the average amount of pATM present in the cytoplasmic and nuclear compartments in the basal state t ₀ expressed in ng divided by the total amount of cellular proteins extracted from said cytoplasmic compartments and nuclear expressed in pg;

• pATM to (total normalisé), exprimé en ppm, désigne la quantité totale moyenne de pATM extraite des cellules exprimée en ng divisée par la quantité totale de protéines extraites desdites cellules exprimée en pg.• pATM to (normalized total), expressed in ppm, denotes the average total quantity of pATM extracted from the cells expressed in ng divided by the total quantity of proteins extracted from said cells expressed in pg.

Avantageusement, les dites cellules nucléées cibles sont choisis parmi : des cellules mucosales, des cellules épithéliales, des lymphoblastes, des lymphocytes et des fibroblastes, et encore plus préférentiellement parmi des lymphoblastes, des lymphocytes et des fibroblastes.Advantageously, said target nucleated cells are chosen from: mucosal cells, epithelial cells, lymphoblasts, lymphocytes and fibroblasts, and even more preferably from lymphoblasts, lymphocytes and fibroblasts.

Dans un autre mode de réalisation, la radiosensibilité d’un échantillon cellulaire d’un individu envers un rayonnement ionisant est déterminée sur des fibroblastes issus de biopsie dudit individu et dans lequel on considère que l’échantillon est radiorésistant si pATM æ (nue normalisé) B, on considère que l’échantillon est radiosensible si pATM æ (nue normalisé) < B, où pATM æ (nue normalisé), exprimé en ppm, a la signification indiquée ci-dessus, et - B est une valeur décimale comprise entre 0,1x10'⁴ et 5x10'³.In another embodiment, the radiosensitivity of a cell sample from an individual to ionizing radiation is determined on fibroblasts derived from a biopsy of said individual and in which the sample is considered to be radioresistant if pATM æ (nude normalized) B, the sample is considered to be radiosensitive if pATM æ (normalized nude) <B, where pATM æ (normalized nude), expressed in ppm, has the meaning indicated above, and - B is a decimal value between 0 , 1x10 ' ⁴ and 5x10' ³ .

Dans un autre mode de réalisation, la radiosensibilité d’un échantillon cellulaire d’un individu envers un rayonnement ionisant est déterminée sur des fibroblastes issus de biopsie dudit individu et dans lequel on considère que l’échantillon est radiorésistant si pATM æ (cyto+nuc normalisé) C, on considère que l’échantillon est radiosensible si pATM æ (cyto+nuc normalisé) < C, où pATM to (cyto+nuc normalisé), exprimé en ppm, a la signification indiquée ci-dessus, et C est une valeur décimale comprise entre 0,1x10'⁴ et 5x10'².In another embodiment, the radiosensitivity of a cell sample from an individual to ionizing radiation is determined on fibroblasts derived from a biopsy of said individual and in which the sample is considered to be radioresistant if pATM æ (cyto + nuc normalized) C, the sample is considered to be radiosensitive if pATM æ (normalized cyto + nuc) <C, where pATM to (normalized cyto + nuc), expressed in ppm, has the meaning indicated above, and C is a decimal value between 0.1x10 ' ⁴ and 5x10' ² .

Dans un autre mode de réalisation, la radiosensibilité d’un échantillon cellulaire d’un individu envers un rayonnement ionisant est déterminée sur des fibroblastes issus de biopsie dudit individu et dans lequel on considère que l’échantillon est radiorésistant si pATM æ (total normalisé) D, on considère que l’échantillon est radiosensible si pATM æ (total normalisé) < D, où pATM æ (total normalisé), exprimé en ppm, a la signification indiquée ci-dessus, et D est une valeur décimale comprise entre 0,1x10'⁴ et 5x10'¹.In another embodiment, the radiosensitivity of a cell sample of an individual to ionizing radiation is determined on fibroblasts derived from a biopsy of said individual and in which the sample is considered to be radioresistant if pATM æ (normalized total) D, the sample is considered to be radiosensitive if pATM æ (normalized total) <D, where pATM æ (normalized total), expressed in ppm, has the meaning indicated above, and D is a decimal value between 0, 1x10 ' ⁴ and 5x10' ¹ .

Dans un autre mode de réalisation, la radiosensibilité d’un échantillon cellulaire d’un individu envers un rayonnement ionisant est déterminée sur des lymphoblastes et/ou des lymphocytes issus de cellules sanguines dudit individu et dans lequel on considère que l’échantillon est radiorésistant si pATM æ (nue normalisé) A, on considère que l’échantillon est radiosensible si pATM æ (nue normalisé) < A, où pATM æ (nue normalisé), exprimé en ppm, a la signification indiquée ci-dessus, et - A représente une valeur entière ou décimale comprise entre 0,1 x 10'² et 20.In another embodiment, the radiosensitivity of a cell sample of an individual to ionizing radiation is determined on lymphoblasts and / or lymphocytes derived from blood cells of said individual and in which the sample is considered to be radioresistant if pATM æ (normalized nude) A, the sample is considered to be radiosensitive if pATM æ (normalized nude) <A, where pATM æ (normalized nude), expressed in ppm, has the meaning indicated above, and - A represents an integer or decimal value between 0.1 x 10 ' ² and 20.

Dans un autre mode de réalisation, la radiosensibilité d’un échantillon cellulaire d’un individu envers un rayonnement ionisant est déterminée sur des lymphoblastes et/ou des lymphocytes issus de cellules sanguines dudit individu et dans lequel on considère que l’échantillon est radiorésistant si pATM æ (total normalisé) A, on considère que l’échantillon est radiosensible si pATM æ (total normalisé) < A, où pATM æ (total normalisé), exprimé en ppm, a la signification indiquée ci-dessus, et A représente une valeur entière ou décimale comprise entre 0,1 x 10'² et 20.In another embodiment, the radiosensitivity of a cell sample of an individual to ionizing radiation is determined on lymphoblasts and / or lymphocytes derived from blood cells of said individual and in which the sample is considered to be radioresistant if pATM æ (normalized total) A, the sample is considered to be radiosensitive if pATM æ (normalized total) <A, where pATM æ (normalized total), expressed in ppm, has the meaning indicated above, and A represents a integer or decimal value between 0.1 x 10 ' ² and 20.

Un troisième objet de l’invention est un kit pour caractériser la radiosensibilité d’un échantillon cellulaire d’un individu envers un rayonnement ionisant, comprenant :A third object of the invention is a kit for characterizing the radiosensitivity of a cell sample of an individual towards ionizing radiation, comprising:

a) des moyens d’extraction des fractions totales de l’échantillon cellulaire,a) means for extracting the total fractions from the cell sample,

b) des moyens de détermination sur les dites fractions dudit échantillon cellulaire de la quantité de la protéine ATM phosphorylée pATM à l’état basal to.b) means for determining on said fractions of said cell sample the amount of the phosphorylated ATM protein pATM in the basal state to.

Un quatrième objet de l’invention est l’utilisation de ce kit pour déterminer la radiosensibilité d’un échantillon cellulaire d’un individu envers un rayonnement ionisant.A fourth object of the invention is the use of this kit for determining the radiosensitivity of a cell sample of an individual to ionizing radiation.

Description des figuresDescription of the figures

Les figures 1 et 2 illustrent certains aspects de l’invention, mais ne limitent pas sa portée.Figures 1 and 2 illustrate certain aspects of the invention, but do not limit its scope.

La figure 1 représente une courbe sensibilité/spécificité (appelée aussi un diagramme ROC, de l’anglais Receiver Operating Characteristics). Ce diagramme permet d’évaluer la performance d’un test en représentant le taux de vrais positifs (fraction des individus détectés positifs qui sont détectés correctement par ce test) en fonction du taux de faux positifs (fraction des individus détectés positifs par ce test alors qu’ils sont en réalité négatifs). Ce diagramme montre les performances de la prédiction de la radiosensibilité d’un individu évaluée à partir de fibroblastes selon la méthode du test ELISA explicité ultérieurement où l’échantillon est considéré radiorésistant si pATM æ (nue normalisé) B ppm ou radiosensible si pATM _to (nue normalisé) < B ppm, avec pATM _to (nue normalisé), exprimé en ppm, désignant la quantité moyenne de pATM présente dans le compartiment nucléaire à l’état basal t₀ exprimée en ng divisée par la quantité totale de protéines cellulaires extraites dudit compartiment nucléaire exprimée en pg et détectée par ELISA.FIG. 1 represents a sensitivity / specificity curve (also called an ROC diagram, from the English Receiver Operating Characteristics). This diagram makes it possible to evaluate the performance of a test by representing the rate of true positives (fraction of individuals detected positive who are correctly detected by this test) as a function of the rate of false positives (fraction of individuals detected positive by this test then that they are actually negative). This diagram shows the performance of the prediction of the radiosensitivity of an individual evaluated from fibroblasts according to the method of the ELISA test explained later where the sample is considered to be radio-resistant if pATM æ (nude normalized) B ppm or radiosensitive if pATM _t o (normalized nude) <B ppm, with pATM _t o (normalized nude), expressed in ppm, designating the average quantity of pATM present in the nuclear compartment in the basal state t ₀ expressed in ng divided by the total quantity of cellular proteins extracted from said nuclear compartment expressed in pg and detected by ELISA.

Cette valeur de B décimale, est ainsi comprise 0,1x10'⁴ et 5x10'². Cette valeur B seuil est fixée et est déterminée par la courbe ROC (tests statistiques en binaire) en fonction du nombre de vrais ou de faux positifs tolérés, i.e. en fonction de la sensibilité et de la spécificité voulues.This value of B decimal, is thus included 0.1x10 ' ⁴ and 5x10' ² . This threshold value B is fixed and is determined by the ROC curve (statistical tests in binary) as a function of the number of true or false positives tolerated, ie as a function of the desired sensitivity and specificity.

Pour une sensibilité de 0,68 et une spécificité de 0,95, B est de 0,0076 ppm.For a sensitivity of 0.68 and a specificity of 0.95, B is 0.0076 ppm.

La figure 2 représente l’arbre de classification des échantillons cellulaires éprouvés en fonction du paramètre pATM _to (nue normalisé) et de la valeur seuil B de 0,0076 ppm. L'approche de classification utilisée est fondée sur la méthode des arbres binaire de décision (L. Breiman, J. Friedman, R. Olshen etc. Stone, « Classification and régression trees», Wadsworth & Brooks, 1984.). Lorsque pour un échantillon cellulaire donné, la quantité de pATM _t0 (nue normalisé) est supérieure ou égale à la valeur seuil B (ici 0,0076 ppm), il est alors radiorésistant et est classé dans la catégorie 0. Lorsque la quantité de pATM _ω (nue normalisé) est inférieure à la valeur seuil B, l’échantillon est considéré comme radiosensible et est classé dans la catégorie 1.FIG. 2 represents the classification tree of the cellular samples tested as a function of the pATM parameter _t o (normalized nude) and of the threshold value B of 0.0076 ppm. The classification approach used is based on the binary decision tree method (L. Breiman, J. Friedman, R. Olshen etc. Stone, “Classification and regression trees”, Wadsworth & Brooks, 1984.). When for a given cell sample, the amount of pATM _t0 (normalized nude) is greater than or equal to the threshold value B (here 0.0076 ppm), it is then radioresistant and is classified in category 0. When the amount of pATM _ω (normalized nude) is less than the threshold value B, the sample is considered to be radiosensitive and is classified in category 1.

Sur 40 échantillons cellulaires éprouvés, 26 sont classés dans la catégorie 0, i.e. radiorésistants et 14 sont classés dans la catégorie 1, i.e. radiosensibles.Out of 40 cell samples tested, 26 are classified in category 0, i.e. radio-resistant and 14 are classified in category 1, i.e. radiosensitive.

Parmi les 26 échantillons classés dans la catégorie 0, 20 sont des vrais positifs (fraction des individus détectés positifs qui sont détectés correctement par ce test) et 6 des faux positifs (fraction des individus détectés positifs par ce test alors qu’ils sont en réalité négatifs).Among the 26 samples classified in category 0, 20 are true positives (fraction of individuals detected positive who are detected correctly by this test) and 6 are false positives (fraction of individuals detected positive by this test when they are in reality negative).

Parmi les 14 échantillons classés dans la catégorie 1,13 sont des vrais positifs et 1 est un faux positif.Among the 14 samples classified in category 1.13 are true positives and 1 is a false positive.

La figure 3 représente la répartition sous forme d’histogramme des échantillons cellulaires éprouvés en fonction de la quantité de pATM _t0 (nue normalisé) mesurée sur l’échantillon en ppm (i.e. quantité moyenne de pATM présente dans le compartiment nucléaire à l’état basal t₀ exprimée en ng divisée par la quantité totale de protéines cellulaires extraites dudit compartiment nucléaire exprimée en pg). La valeur seuil B permettant de classer les échantillons selon leur statut de radiosensibilité en fonction de la quantité de pATM _to(nuc normalisé) est représentée sur l’histogramme par une barre verticale à 0,0076 ppm.FIG. 3 represents the distribution in the form of a histogram of the cellular samples tested as a function of the amount of pATM _t0 (normalized nude) measured on the sample in ppm (ie average amount of pATM present in the nuclear compartment in the basal state t ₀ expressed in ng divided by the total quantity of cellular proteins extracted from said nuclear compartment expressed in pg). The threshold value B for classifying the samples according to their radiosensitivity status as a function of the amount of pATM _t o (normalized nuc) is represented on the histogram by a vertical bar at 0.0076 ppm.

La figure 4 représente selon le test de Wilcoxon (aussi appelé test U de Mann-Whitney ou test de la somme des rangs de Wilcoxon), la quantité de pATM æ (cyto+nuc normalisé) mesurée sur les échantillons cellulaires en ppm (i.e. quantité moyenne de pATM présente dans les compartiments cytoplasmiques et nucléaires à l’état basal t₀ exprimée en ng divisée par la quantité totale de protéines cellulaires extraites desdits compartiments cytoplasmiques et nucléaires exprimée en pg) en fonction de leur statut de radiosensibilité. Le test de Wilcoxon est un test statistique non paramétrique permettant de tester l'hypothèse selon laquelle la distribution des données est la même pour deux groupes, ici pour les deux statuts de radiosensibilité. Les résultats de ce test sont caractérisés par la probabilité p selon laquelle la différence observée entre les deux groupes, i.e. deux statuts de radiosensibilité est uniquement due au hasard. Plus la valeur p est faible, plus la probabilité d’avoir deux groupes de données significativement différents est élevée. La probabilité p associée à ce test est de 0,001 et est relativement faible indiquant l’existence de deux groupes de données distincts, i.e. de deux groupes de radiosensibilité.Figure 4 represents according to the Wilcoxon test (also called Mann-Whitney U test or test of the sum of the rows of Wilcoxon), the quantity of pATM æ (normalized cyto + nuc) measured on the cellular samples in ppm (ie quantity mean of pATM present in the cytoplasmic and nuclear compartments in the basal state t ₀ expressed in ng divided by the total quantity of cellular proteins extracted from said cytoplasmic and nuclear compartments expressed in pg) as a function of their radiosensitivity status. The Wilcoxon test is a non-parametric statistical test allowing to test the hypothesis according to which the distribution of the data is the same for two groups, here for the two radiosensitivity statuses. The results of this test are characterized by the probability p according to which the difference observed between the two groups, ie two radiosensitivity statuses, is only due to chance. The lower the p-value, the higher the probability of having two significantly different groups of data. The probability p associated with this test is 0.001 and is relatively low, indicating the existence of two distinct groups of data, ie two groups of radiosensitivity.

Les points présents en dehors des barres d’incertitudes (°) sont des points aberrants.The points present outside the uncertainty bars (°) are outliers.

La figure 5 représente les variations des proportions de pATM æ (nue normalisé) présente dans le noyau cellulaire de lymphoblastes issus d’échantillons sanguins des patients GM03798, GM03380, GM07078, 37792 et 40479.FIG. 5 represents the variations in the proportions of pATM æ (normalized nude) present in the cell nucleus of lymphoblasts derived from blood samples from patients GM03798, GM03380, GM07078, 37792 and 40479.

La figure 6 représente une matrice illustrant les corrélations existantes entre les quantités de pATM présente dans le noyau et le cytoplasme cellulaire de lymphoblastes issus d’échantillons sanguins d’individus à l’état basal (0 Gy - état non irradié), après 5 min et 10 min post irradiation à 2 Gy.FIG. 6 represents a matrix illustrating the correlations existing between the quantities of pATM present in the nucleus and the cell cytoplasm of lymphoblasts derived from blood samples from individuals in the basal state (0 Gy - non-irradiated state), after 5 min and 10 min post irradiation at 2 Gy.

0Gy_nuc désigne la quantité moyenne de pATM nucléaire présente à l’état basal t₀, exprimée en ppm.0Gy_nuc designates the average amount of nuclear pATM present in the basal state t ₀ , expressed in ppm.

5mn_nuc désigne la quantité moyenne de pATM nucléaire observée dans le noyau 5 minutes après exposition de l’échantillon cellulaire à une irradiation avec une dose de 2 Gy. 5mn_nuc est exprimée en ppm.5mn_nuc denotes the average amount of nuclear pATM observed in the nucleus 5 minutes after exposure of the cell sample to irradiation with a dose of 2 Gy. 5mn_nuc is expressed in ppm.

10mn_nuc désigne la quantité moyenne de pATM nucléaire observée dans le noyau 10 minutes après exposition de l’échantillon cellulaire à une irradiation avec une dose de 2 Gy.10mn_nuc denotes the average amount of nuclear pATM observed in the nucleus 10 minutes after exposure of the cell sample to irradiation with a dose of 2 Gy.

10mn_nuc est exprimée en ppm.10mn_nuc is expressed in ppm.

0Gy_cyto désigne la quantité moyenne de pATM présente à l’état basal t₀ dans le cytoplasme des lymphoblastes, exprimée en ppm.0Gy_cyto designates the average amount of pATM present in the basal state t ₀ in the cytoplasm of the lymphoblasts, expressed in ppm.

5mn_cyto désigne la quantité moyenne de pATM observée dans le cytoplasme des lymphoblastes 5 minutes après exposition de l’échantillon cellulaire à une irradiation avec une dose de 2 Gy.5mn_cyto designates the average amount of pATM observed in the lymphoblast cytoplasm 5 minutes after exposure of the cell sample to irradiation with a dose of 2 Gy.

5mn_cyto est exprimée en ppm.5mn_cyto is expressed in ppm.

10mn_cyto désigne la quantité moyenne de pATM observée dans le cytoplasme des lymphoblastes 10 minutes après exposition de l’échantillon cellulaire à une irradiation avec une dose de 2 Gy.10mn_cyto denotes the average amount of pATM observed in the cytoplasm of lymphoblasts 10 minutes after exposure of the cell sample to irradiation with a dose of 2 Gy.

10mn_cyto est exprimée en ppm.10mn_cyto is expressed in ppm.

Ces quantités exprimées en ppm représentent la quantité moyenne de pATM observée dans un compartiment donné en ng divisée par la quantité totale de protéines présentes dans ledit compartiment en pg.These amounts expressed in ppm represent the average amount of pATM observed in a given compartment in ng divided by the total amount of proteins present in said compartment in pg.

Les groupes A, B et C, représentés sur la figure 6, montrent les corrélations existantes entre les variables précitées.Groups A, B and C, shown in Figure 6, show the correlations between the above variables.

Description de l’inventionDescription of the invention

A. Définitions généralesA. General definitions

Les termes « endommagement radioinduit », « radioinduit », « radiosensibilité », « radiorésistance », « radiotoxicité », « radiothérapie » se réfèrent tous à un rayonnement ionisant (au sens de la définition donnée par IUPAC, connue de l’homme du métier), et notamment à un rayonnement de type particules, tel que constitué par des particules de type proton, alpha (a) ou béta (β), ou encore à un rayonnement électromagnétique à haute énergie, notamment de type gamma (y) ou X.The terms “radio-induced damage”, “radio-induced”, “radiosensitivity”, “radioresistance”, “radiotoxicity”, “radiotherapy” all refer to ionizing radiation (within the meaning of the definition given by IUPAC, known to the person skilled in the art ), and in particular to a particle-type radiation, such as consisting of particles of the proton, alpha (a) or beta (β) type, or else to high energy electromagnetic radiation, in particular of the gamma (y) or X type. .

On entend par « état basal » d’une protéine, le niveau d’expression de ladite protéine en l’absence d’activation ou de répression, notamment en l’absence d’endommagement induit par un stress oxydatif, notamment en l’absence d’endommagement par rayonnement.The term “basal state” of a protein is understood to mean the level of expression of said protein in the absence of activation or repression, in particular in the absence of damage induced by oxidative stress, in particular in the absence radiation damage.

On entend par « compartiment nucléaire », l’ensemble des espaces d’une cellule nucléée délimitée par une membrane nucléaire et constituant le noyau.The term “nuclear compartment” means all of the spaces of a nucleated cell delimited by a nuclear membrane and constituting the nucleus.

On entend par « compartiment cytoplasmique », l’ensemble des espaces d’une cellule nucléée délimitée par une membrane cytoplasmique et constituant le cytoplasme excluant le compartiment nucléaire.The term "cytoplasmic compartment" means all of the spaces of a nucleated cell delimited by a cytoplasmic membrane and constituting the cytoplasm excluding the nuclear compartment.

On entend par « fraction totale », un extrait de l’échantillon cellulaire obtenu après lyse totale contenant l’ensemble des protéines de la cellule dont les protéines nucléaires et cytoplasmiques et plus particulièrement des protéines pATM.The term “total fraction” is understood to mean an extract from the cell sample obtained after total lysis containing all of the proteins of the cell including nuclear and cytoplasmic proteins and more particularly pATM proteins.

On entend par « fractions cytoplasmiques », un extrait du compartiment cyotplasmique de l’échantillon cellulaire obtenu après fractionnement subcellulaire, cet extrait contenant des protéines cytoplasmiques dont des protéines pATM.The term “cytoplasmic fractions” means an extract from the cyotplasmic compartment of the cell sample obtained after subcellular fractionation, this extract containing cytoplasmic proteins including pATM proteins.

On entend par « fractions nucléaires », un extrait du compartiment nucléaire de l’échantillon cellulaire obtenu après fractionnement subcellulaire, cet extrait contenant des protéines nucléaires dont des protéines pATM.The term "nuclear fractions" means an extract from the nuclear compartment of the cell sample obtained after subcellular fractionation, this extract containing nuclear proteins, including pATM proteins.

Les paramètres biologiques pATM _{t0 (}nuc), pATM _{t0 (}nuc normalisé), pATM _t0 (_Cyto + nue), pATM _t0(cyto+nuc normalisé), pATM to (total), pATM to (total normalisé), utilisés dans le cadre de la présente description, sont définis à la section 4b ci-dessous.The biological parameters pATM _{t0 (} nuc), pATM _{t0 (} normalized nuc), pATM _t0 ( _Cy to + nude), pATM _t0 (cyto + nuc normalized), pATM to (total), pATM to (normalized total), used in the part of this description, are defined in section 4b below.

B. Description détailléeB. Detailed description

Nous décrivons ici un mode de réalisation avec plusieurs variantes qui convient pour un individu tel qu’un patient humain. Le procédé selon l’invention utilise au moins un échantillon de tissu sain, de préférence des fibroblastes ou lymphoblastes/lymphocytes. Les premiers sont de préférence prélevés sur le tissu conjonctif d‘un individu et les deuxièmes dans le sang. Ce prélèvement peut être effectué par biopsie ou prélèvement sanguin.Here we describe an embodiment with several variants which is suitable for an individual such as a human patient. The method according to the invention uses at least one sample of healthy tissue, preferably fibroblasts or lymphoblasts / lymphocytes. The former are preferably taken from an individual's connective tissue and the latter from the blood. This sample can be taken by biopsy or blood sample.

1. Préparation de l’essai1. Preparation of the test

Avant tout prélèvement de cellules et avant toute manipulation des cellules prélevées, les opérateurs respectifs (appartenant par exemple à un laboratoire d’analyses cytologiques) sont informés (typiquement par le médecin) du statut d’infection éventuelle de l’individu par HIV ou hépatite C pour que les opérateurs puissent prendre les mesures appropriées de sécurité biologique accrue lors du prélèvement, de la manipulation et de la gestion de la culture cellulaire.Before any cell sampling and before any manipulation of the cells collected, the respective operators (belonging for example to a cytological analysis laboratory) are informed (typically by the doctor) of the status of possible infection of the individual by HIV or hepatitis C so that operators can take appropriate measures of increased biological safety during the collection, handling and management of cell culture.

Puis, l’opérateur prélève audit individu un échantillon cellulaire tel qu’un échantillon sanguin comportant des lymphoblastes ou des lymphocytes ou un échantillon de peau comportant des fibroblastes.Then, the operator takes from said individual a cell sample such as a blood sample comprising lymphoblasts or lymphocytes or a skin sample comprising fibroblasts.

- Echantillon cellulaire de peau- Cellular skin sample

L’échantillon cellulaire de peau est en général prélevé par biopsie via la méthode du « punch dermatologique » connue de l’homme du métier. L’échantillon cellulaire est ensuite placé dans du milieu DMEM+20% sérum de veau foetal stérile puis transféré sans délai dans un laboratoire spécialisé, afin que l’échantillon ne reste pas plus de 38 h à la température ambiante et ne soit pas altéré.The skin cell sample is generally taken by biopsy using the "dermatological punch" method known to those skilled in the art. The cell sample is then placed in DMEM medium + 20% sterile fetal calf serum and then transferred without delay to a specialized laboratory, so that the sample does not remain more than 38 h at room temperature and is not altered.

L’échantillon cellulaire issu d’une biopsie peut être utilisé tel quel, dès réception. Il peut aussi être établi sous la forme d’une lignée cellulaire amplifîable suivant une procédure bien connue des laboratoires de culture et de l’homme du métier : en utilisant notamment la dispersion trypsique (trypsination), les cellules sont à nouveau diluées dans du milieu renouvelé et ainsi de suite jusqu’à obtention du nombre de cellules souhaité. Après obtention d’un nombre de cellules suffisant, (généralement au bout d’une à trois semaines), les premières expériences sont réalisées en utilisant le procédé selon l’invention. Les cellules sont ensemencées sur lamelles de verre dans des boîtes de Pétri. Ces fibroblastes à l’état basal ainsi obtenus sont ensuite utilisés tels quels, sans être irradiés (dose absorbée 0 Gy).The cell sample from a biopsy can be used as is, upon receipt. It can also be established in the form of an amplifiable cell line according to a procedure well known to culture laboratories and to those skilled in the art: using in particular tryptic dispersion (trypsination), the cells are again diluted in medium. renewed and so on until the desired number of cells is obtained. After obtaining a sufficient number of cells (generally after one to three weeks), the first experiments are carried out using the method according to the invention. The cells are seeded on glass slides in petri dishes. These fibroblasts in the basal state thus obtained are then used as such, without being irradiated (absorbed dose 0 Gy).

- Echantillon sanguin- Blood sample

L’échantillon sanguin comporte notamment des lymphoblastes ou des lymphocytes.The blood sample includes lymphoblasts or lymphocytes.

Les lymphocytes et/ou lymphoblastes peuvent être isolés par tout moyen approprié. Les lymphocytes et/ou lymphoblastes sont de préférence isolés à partir du sang total frais via la technique du Ficoll® connue de l’homme du métier depuis plus de 30 ans et notamment décrite dans l’article de B0yum. paru en 1968 intitulé « Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. » (Paper IV). Scand. J. Clin. Lab. Invest. 21 Suppl. 97, p.77-89.Lymphocytes and / or lymphoblasts can be isolated by any suitable means. The lymphocytes and / or lymphoblasts are preferably isolated from fresh whole blood via the Ficoll® technique known to those skilled in the art for more than 30 years and in particular described in the article by Boum. published in 1968 entitled "Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. (Paper IV). Scand. J. Clin. Lab. Invest. 21 Suppl. 97, p.77-89.

La séparation des constituants du sang peut être effectuée par centrifugation sur un coussin constitué d’un copolymère de saccharose (sucrose) et d’épichlorhydrine, le Ficoll®. Après centrifugation dans des conditions appropriées connues de l’homme du métier, les constituants du sang sont séparés par densité. Après élimination du surnageant contenant le plasma et les plaquettes, les lymphocytes et/ou lymphoblastes sont extraits de l’échantillon cellulaire, puis sont lavés par au moins un cycle de centrifugation/redispersion afin d’éliminer toute trace de Ficoll®, qui est un polymère toxique pour les cellules. Après élimination du surnageant contenant le Ficoll®, les lymphocytes ainsi purifiés sont redispersés dans un milieu de culture adapté, de préférence dans un milieu de culture de type RPMI 1640 fourni par la société Gibco et comprenant 10 % de sérum de veau fœtal et 1% de pénicilline/streptomycine. Ces lymphocytes à l’état basal ainsi obtenus sont ensuite utilisés tels quels, sans être irradiés (dose absorbée 0 Gy).The blood components can be separated by centrifugation on a cushion made of a copolymer of sucrose (sucrose) and epichlorohydrin, Ficoll®. After centrifugation under appropriate conditions known to a person skilled in the art, the constituents of the blood are separated by density. After removal of the supernatant containing the plasma and the platelets, the lymphocytes and / or lymphoblasts are extracted from the cell sample, then are washed by at least one centrifugation / redispersion cycle in order to remove all traces of Ficoll®, which is a polymer toxic to cells. After elimination of the supernatant containing the Ficoll®, the lymphocytes thus purified are redispersed in a suitable culture medium, preferably in a culture medium of RPMI 1640 type supplied by the company Gibco and comprising 10% fetal calf serum and 1% penicillin / streptomycin. These basal lymphocytes thus obtained are then used as such, without being irradiated (absorbed dose 0 Gy).

Le matériel biologique, sur lequel sont réalisées les expérimentations, peut être notamment des lymphoblastes, des lymphocytes isolés ou des cellules isolées à partir de tissu.The biological material on which the experiments are carried out can be in particular lymphoblasts, isolated lymphocytes or cells isolated from tissue.

2. Extraction des fractions totales ou des fractions cytoplasmiques et nucléaires ou des fractions nucléaires de l’échantillon cellulaire2. Extraction of the total fractions or of the cytoplasmic and nuclear fractions or of the nuclear fractions from the cell sample

Le matériel biologique est soumis à une lyse totale par tout moyen approprié. De préférence, la lyse des cellules est réalisée par l’utilisation d’un tampon de lyse RIPA (Thermofisher) selon la méthodologie décrite dans l’article de Kirby et al., « Adult hippocampal neural stem and progenitor cells regulate the neurogenic niche by secreting VEGF » Proc Natl Acad Sci U S A 2015; (112):13 p.4128-4133 ou à un fractionnement subcellulaire afin de récupérer les protéines totales ou d’extraire et de séparer les protéines cytoplasmiques des protéines nucléaires à l’état basal. Dans un mode de réalisation, ce fractionnement est réalisé par le biais d’un kit (PIERCE) selon la méthodologie décrite par exemple dans l’article de Trotter et Archer, « Reconstitution of glucocorticoid receptor-dependent transcription in vivo », Molecular and Cellular Biology (2004).The biological material is subjected to total lysis by any appropriate means. Preferably, the lysis of the cells is carried out by the use of a RIPA lysis buffer (Thermofisher) according to the methodology described in the article by Kirby et al., "Adult hippocampal neural stem and progenitor cells regulate the neurogenic niche by VEGF secreting »Proc Natl Acad Sci USA 2015; (112): 13 p.4128-4133 or to a subcellular fractionation in order to recover total proteins or to extract and separate cytoplasmic proteins from nuclear proteins in the basal state. In one embodiment, this fractionation is carried out by means of a kit (PIERCE) according to the methodology described for example in the article by Trotter and Archer, "Reconstitution of glucocorticoid receptor-dependent transcription in vivo", Molecular and Cellular Biology (2004).

Dans le cas du fractionnement subcellulaire, les fractions cytoplasmiques et nucléaires peuvent être détectées par des tests d’immunotransfert appelés aussi « Western blot ». Des anticorps permettant de déceler la présence de protéines cibles spécifiques de chaque compartiment sont employés, tels que l’anti-tubuline ou l’anti-actine pour le compartiment cytoplasmique et l’anti-topoisomérase pour le compartiment nucléaire. Après isolation des compartiments cytoplasmiques et nucléaires, des tests d’immunotransfert peuvent ensuite être réalisés sur les mélanges protéiques contenus dans chacune des fractions cytoplasmiques et nucléaires isolées afin de détecter la présence de protéines ATM phosphorylées dans chacune des fractions. Les protéines ATM phosphorylées sont présentes dans chacune des fractions cytoplasmiques et nucléaires.In the case of subcellular fractionation, the cytoplasmic and nuclear fractions can be detected by immunoblot tests also called "Western blot". Antibodies to detect the presence of target specific proteins for each compartment are used, such as anti-tubulin or anti-actin for the cytoplasmic compartment and anti-topoisomerase for the nuclear compartment. After isolation of the cytoplasmic and nuclear compartments, immunoblot tests can then be carried out on the protein mixtures contained in each of the isolated cytoplasmic and nuclear fractions in order to detect the presence of phosphorylated ATM proteins in each of the fractions. The phosphorylated ATM proteins are present in each of the cytoplasmic and nuclear fractions.

L’isolation et la capture des protéines ATM phosphorylées dans chacune des fractions totales, cytoplasmiques et nucléaires sont réalisées par tout moyen approprié, de préférence par un test ELISA.The isolation and the capture of phosphorylated ATM proteins in each of the total, cytoplasmic and nuclear fractions are carried out by any appropriate means, preferably by an ELISA test.

3. Quantification des protéines pATM par Test ELISA :3. Quantification of pATM proteins by ELISA Test:

L’isolation et la capture des protéines ATM phosphorylées (donc actives) dans chacune des fractions totales, cytoplasmiques et/ou nucléaires est réalisée par TEST ELISA (Kit R&D Systems et Novateinbio) grâce à l’emploi de plaques revêtues d’un anticorps spécifique anti-pATM (R&D Systems et Novateinbio). Dans chaque fraction, la quantité de pATM présente est ensuite analysée par luminescence à 450 nm grâce à un lecteur de plaques et la quantité totale de protéines présente est déterminée par un test Bradford connu de l’homme du métier.The isolation and capture of phosphorylated ATM proteins (therefore active) in each of the total, cytoplasmic and / or nuclear fractions is carried out by TEST ELISA (Kit R&D Systems and Novateinbio) thanks to the use of plates coated with a specific antibody anti-pATM (R&D Systems and Novateinbio). In each fraction, the amount of pATM present is then analyzed by luminescence at 450 nm using a plate reader and the total amount of protein present is determined by a Bradford test known to those skilled in the art.

Dans chaque puit de chaque plaque permettant de réaliser ce test ELISA, ont été déterminées parmi la quantité totale de protéines présente en pg, la quantité de pATM présente en ng.In each well of each plate making it possible to carry out this ELISA test, the quantity of protein present in pg, the quantity of pATM present in ng, were determined.

Cette méthode a été mise en oeuvre et validée sur cinq lignées de lymphoblastes et 40 lignées de fibroblastes humains.This method has been implemented and validated on five lymphoblast lines and 40 human fibroblast lines.

4. Détermination des paramètres biologiques et cliniques4. Determination of biological and clinical parameters

a. Généralitésat. Overview

La méthode selon l’invention est basée sur l’analyse de l’activité kinase de la protéine ATM présente dans l’échantillon cellulaire à l’état basal étudié, et plus particulièrement sur la quantification de la protéine ATM active, i.e. du marqueur pATM présent dans les cellules nucléées dudit échantillon, i.e. dans les fractions totales, cytoplasmiques et nucléaires de ces cellules à l’état basal, i.e. non-exposées (état spontané).The method according to the invention is based on the analysis of the kinase activity of the ATM protein present in the cell sample in the basal state studied, and more particularly on the quantification of the active ATM protein, ie of the pATM marker. present in the nucleated cells of said sample, ie in the total, cytoplasmic and nuclear fractions of these cells in the basal state, ie unexposed (spontaneous state).

Les moyennes obtenues pour chaque point sont calculées avec les erreurs écart-types de la moyenne (appelé « SEM ») sur un nombre de réplicats supérieur ou égal à 2. Lorsque le nombre de réplicats est inférieur à 30, l’écart-type gaussien de type « standard error SE » ne peut être appliqué.The means obtained for each point are calculated with the standard deviation errors of the mean (called "SEM") on a number of replicates greater than or equal to 2. When the number of replicates is less than 30, the Gaussian standard deviation "standard error SE" cannot be applied.

b. Paramètres biologiquesb. Biological parameters

Les paramètres employés selon l’invention sont présentés ci-après.The parameters used according to the invention are presented below.

pATM æ (nue) désigne la quantité moyenne de pATM nucléaire présente à l’état basal t₀, exprimée en ng.pATM æ (naked) designates the average amount of nuclear pATM present in the basal state t ₀ , expressed in ng.

pATM æ (nue normalisé) désigne la quantité moyenne de pATM présente dans le compartiment nucléaire à l’état basal t₀ exprimée en ng détectée par ELISA divisée par la quantité totale de protéines cellulaires extraites dudit compartiment nucléaire exprimée en pg. pATM to (nue normalisé) est exprimé en ppm.pATM æ (normalized nude) designates the average amount of pATM present in the nuclear compartment in the basal state t ₀ expressed in ng detected by ELISA divided by the total quantity of cellular proteins extracted from said nuclear compartment expressed in pg. pATM to (normalized nude) is expressed in ppm.

pATM æ (cyto+nuc) désigne la quantité moyenne de pATM présente dans les compartiments cytoplasmiques et nucléaires à l’état basal t₀, exprimée en ng.pATM æ (cyto + nuc) designates the average amount of pATM present in the cytoplasmic and nuclear compartments in the basal state t ₀ , expressed in ng.

pATM æ (cyto+nuc normalisé) désigne la quantité moyenne de pATM présente dans les compartiments cytoplasmiques et nucléaires à l’état basal t₀ exprimée en ng détectée par ELISA divisée par la quantité totale de protéines cellulaires extraites desdits compartiments cytoplasmiques et nucléaires exprimée en pg. pATM æ (cyto+nuc normalisé) est exprimé en ppm.pATM æ (normalized cyto + nuc) designates the average amount of pATM present in the cytoplasmic and nuclear compartments in the basal state t ₀ expressed in ng detected by ELISA divided by the total quantity of cellular proteins extracted from said cytoplasmic and nuclear compartments expressed in pg. pATM æ (normalized cyto + nuc) is expressed in ppm.

pATM æ (total) désigne la quantité totale moyenne de pATM présente à l’état basal t₀extraite des cellules présentes dans l’échantillon analysé, exprimée en ng.pATM æ (total) denotes the average total amount of pATM present in the basal state t ₀ extracted from the cells present in the analyzed sample, expressed in ng.

pATM æ (total normalisé) désigne la quantité totale moyenne de pATM extraite des cellules exprimée en ng divisée par la quantité totale de protéines extraites desdites cellules exprimée en pg. pATM _t0 (total normalisé) est exprimé en ppm.pATM æ (normalized total) designates the average total amount of pATM extracted from cells expressed in ng divided by the total amount of proteins extracted from said cells expressed in pg. pATM _t0 (normalized total) is expressed in ppm.

Dans le cadre de la présente invention, les paramètres employés sont mesurés à l’état basal t₀ et, de préférence, par un test ELISA.In the context of the present invention, the parameters used are measured in the basal state t ₀ and, preferably, by an ELISA test.

c. Evaluation prédictivevs. Predictive evaluation

La méthode selon l’invention vise la prédiction de paramètres cliniques tels que le statut de radiosensibilité à partir de données biologiques mesurées, i.e. quantité des formes actives de la protéine ATM dans les compartiments cytoplasmiques et nucléaires de cellules nucléées données.The method according to the invention is aimed at predicting clinical parameters such as the radiosensitivity status from measured biological data, i.e. quantity of the active forms of the ATM protein in the cytoplasmic and nuclear compartments of given nucleated cells.

Cette évaluation prédictive est issue d’une corrélation entre des données cliniques observées sur des lignées cellulaires telles que le grade CTCAE et des données biologiques mesurées.This predictive assessment is based on a correlation between clinical data observed on cell lines such as CTCAE grade and measured biological data.

La classification dite CTCAE (Common Terminology Criteria for Adverse Events, appelée en français « Critères d’évaluation de la morbidité selon la classification du National Cancer Institute»), éditée en 2006 par le National Cancer Institute des Etats Unis d’Amérique, est une terminologie descriptive des évènements indésirables (en particulier des effets secondaires) en thérapie du cancer.The classification known as CTCAE (Common Terminology Criteria for Adverse Events, called in French "Criteria for assessing morbidity according to the classification of the National Cancer Institute"), published in 2006 by the National Cancer Institute of the United States of America, is a descriptive terminology of adverse events (particularly side effects) in cancer therapy.

Un événement indésirable correspond à tout signe défavorable et involontaire, symptôme ou maladie temporellement associé à l'utilisation d'un traitement médical ou d’une procédure qui peut ou non être considéré comme lié au traitement ou à la procédure médicale. Un événement indésirable est une représentation unique d'un événement spécifique utilisé pour la documentation médicale et lors d’analyses scientifiques.An adverse event corresponds to any unfavorable and involuntary sign, symptom or illness temporally associated with the use of a medical treatment or a procedure which may or may not be considered as linked to the medical treatment or procedure. An adverse event is a unique representation of a specific event used for medical documentation and for scientific analysis.

La classification dite CTCAE présente une brève définition de chaque événement 5 indésirable pour clarifier le sens de l’événement indésirable. Cette échelle, valable pour d’autres stress génotoxique (ex : blessures causées par le feu) est particulièrement utilisée en radiothérapie.The so-called CTCAE classification presents a brief definition of each adverse event to clarify the meaning of the adverse event. This scale, valid for other genotoxic stresses (ex: injuries caused by fire) is particularly used in radiotherapy.

Le grade se réfère à la sévérité de l’événement indésirable. La CTCAE affiche 5 grades de sévérité (de 1 à 5) présentant des descriptions cliniques uniques de sévérité pour chaque événement indésirable et décrits dans le tableau 1 ci-après. Chaque grade de sévérité est défini par des réactions tissulaires précises.The grade refers to the severity of the adverse event. The CTCAE displays 5 grades of severity (from 1 to 5) presenting unique clinical descriptions of severity for each adverse event and described in Table 1 below. Each grade of severity is defined by specific tissue reactions.

Tableau 1 : dernière version de l’échelle CTCAE éditée par le National Cancer Institute des Etats Unis d’Amérique le 14 juin 2010Table 1: latest version of the CTCAE scale published by the National Cancer Institute of the United States of America on June 14, 2010

grade 1 grade 1 Sévérité légère; symptômes asymptomatiques ou légers; observations cliniques ou diagnostiques seules; intervention non indiquée Mild severity; asymptomatic or mild symptoms; clinical or diagnostic observations alone; intervention not indicated grade 2 grade 2 Sévérité modérée; intervention minimale, intervention locale ou non invasive indiquée; évènement limitant les activités de la vie quotidienne instrumentées et adaptées à l'âge (préparation du repas, faire les courses, utilisation du téléphone...) Moderate severity; minimal intervention, local or non-invasive intervention indicated; event limiting the activities of daily life instrumented and adapted to age (meal preparation, shopping, use of the telephone ...) grade 3 grade 3 Sévérité grave ou médicalement significative, mais ne mettant pas immédiatement la vie en danger; hospitalisation ou prolongation de l'hospitalisation indiquée; évènement invalidant; évènement limitant les activités de soins de la vie quotidienne (bains, s’habiller, se nourrir, utilisation des toilettes, prise de médicaments, et ne pas être alité) Severe or medically significant severity, but not immediately life threatening; hospitalization or extension of hospitalization indicated; disabling event; event limiting daily life care activities (bathing, dressing, eating, using the toilet, taking medication, and not being bedridden) grade 4 grade 4 Conséquences potentiellement mortelles; intervention urgente indiquée Life-threatening consequences; urgent intervention indicated grade 5 grade 5 Décès lié à l'événement indésirable Adverse event death

A ces 5 grades, est ajouté un grade 0 correspondant à une absence d’effet tissulaire.To these 5 grades, a grade 0 is added corresponding to an absence of tissue effect.

La méthode selon l’invention permet un diagnostic qualitatif, qui est directement issu de la valeur mathématique des scores ou de formules mathématiques utilisant ces scores.The method according to the invention allows a qualitative diagnosis, which is directly derived from the mathematical value of the scores or from mathematical formulas using these scores.

Selon l’invention, le statut de radiosensibilité peut être déterminé surtout type de cellules nucléées et de préférence sur des lymphocytes, des lymphoblastes ou des fibroblastes.According to the invention, the radiosensitivity status can be determined especially type of nucleated cells and preferably on lymphocytes, lymphoblasts or fibroblasts.

- Evaluation prédictive du statut de radiosensibilité à partir d’un échantillon sanguin- Predictive evaluation of the radiosensitivity status from a blood sample

Dans un mode de réalisation avantageux, la radiosensibilité d’un échantillon cellulaire d’un individu envers un rayonnement ionisant est déterminée sur des lymphoblastes et/ou des lymphocytes issus de cellules sanguines dudit individu de la manière suivante :In an advantageous embodiment, the radiosensitivity of a cell sample of an individual to ionizing radiation is determined on lymphoblasts and / or lymphocytes derived from blood cells of said individual in the following manner:

on considère que l’échantillon est radiorésistant si pATM æ (nue normalisé) A on considère que l’échantillon est radiosensible si pATM æ (nue normalisé) < A où pATM æ (nue normalisé) a la signification indiquée ci-dessus à la section 4b, etthe sample is considered to be radioresistant if pATM æ (normalized nude) A the sample is considered to be radiosensitive if pATM æ (normalized nude) <A where pATM æ (normalized nude) has the meaning indicated above in the section 4b, and

- A est une valeur entière ou décimale comprise entre 0,1x10'² et 20.- A is an integer or decimal value between 0.1x10 ' ² and 20.

Dans un autre mode de réalisation avantageux, la radiosensibilité d’un échantillon cellulaire d’un individu envers un rayonnement ionisant est déterminée sur des lymphoblastes et/ou des lymphocytes issus de cellules sanguines dudit individu de la manière suivante :In another advantageous embodiment, the radiosensitivity of a cell sample of an individual to ionizing radiation is determined on lymphoblasts and / or lymphocytes derived from blood cells of said individual in the following manner:

on considère que l’échantillon est radiorésistant si pATM æ (total normalisé) A on considère que l’échantillon est radiosensible si pATM æ (total normalisé) < A où pATM æ (total normalisé) a la signification indiquée ci-dessus à la section 4b, etthe sample is considered to be radio-resistant if pATM æ (normalized total) A the sample is considered to be radiosensitive if pATM æ (normalized total) <A where pATM æ (normalized total) has the meaning indicated above in the section 4b, and

Le statut de radiosensibilité peut être déterminé en fonction de pATM to (nue normalisé) ou de pATM æ (total normalisé)· Dans un mode de réalisation préféré, avec un échantillon sanguin, un seul test est réalisé, i.e. soit celui basé sur pATM to (nue normalisé), soit celui basé sur pATM to (total normalisé)·The radiosensitivity status can be determined according to pATM to (normalized nude) or pATM æ (normalized total) · In a preferred embodiment, with a blood sample, only one test is performed, ie that based on pATM to (normalized nude), i.e. that based on pATM to (normalized total) ·

Ces résultats sont basés sur une analyse de corrélation des variables discriminantes (technique statistique permettant d'affecter à un individu son statut de radiosensibilité à partir de ses caractéristiques physiques). La valeur seuil A a été déterminée par une analyse de corrélation des valeurs discriminantes.These results are based on a correlation analysis of the discriminating variables (statistical technique allowing to assign to an individual his radiosensitivity status based on his physical characteristics). The threshold value A was determined by a correlation analysis of the discriminating values.

- Evaluation prédictive du statut de radiosensibilité à partir d’un échantillon de peau- Predictive evaluation of the radiosensitivity status from a skin sample

Le statut de radiosensibilité d’un individu est déterminé à partir d’un échantillon de peau dudit individu en fonction d’une valeur seuil exprimée en valeur relative en partie par million (ppm).The radiosensitivity status of an individual is determined from a skin sample of said individual according to a threshold value expressed in relative value in part per million (ppm).

Dans un mode de réalisation avantageux, la radiosensibilité d’un échantillon cellulaire d’un individu envers un rayonnement ionisant est déterminée sur des fibroblastes issus d’une biopsie de peau dudit individu de la manière suivante :In an advantageous embodiment, the radiosensitivity of a cell sample of an individual to ionizing radiation is determined on fibroblasts obtained from a skin biopsy of said individual in the following manner:

on considère que l’échantillon est radiorésistant si pATM æ (nue normalisé) B on considère que l’échantillon est radiosensible si pATM æ (nue normalisé) < B où pATM æ (nue normalisé) a la signification indiquée ci-dessus à la section 4b, et B est une valeur entière ou décimale comprise entre 0,1x10'⁴ et 5x10'³.the sample is considered to be radio-resistant if pATM æ (normalized nude) B the sample is considered to be radiosensitive if pATM æ (normalized nude) <B where pATM æ (normalized nude) has the meaning indicated above in the section 4b, and B is an integer or decimal value between 0.1x10 ' ⁴ and 5x10' ³ .

Cette valeur B seuil est fixée et est déterminée par la courbe ROC (tests statistiques en binaire) en fonction du nombre de vrais ou de faux positifs tolérés, i.e. en fonction de la sensibilité et de la spécificité voulues. Pour une sensibilité de 0,68 et une spécificité de 0,95, B est de 0,0076 ppm (cf. figures 1 et 2). La figure 2 représente l’arbre de classification pour 40 échantillons cellulaires éprouvés en fonction du paramètre pATM to (nue normalisé) et de la valeur seuil B de 0,0076 ppm (cf. figure 3).This threshold value B is fixed and is determined by the ROC curve (statistical tests in binary) as a function of the number of true or false positives tolerated, i.e. as a function of the desired sensitivity and specificity. For a sensitivity of 0.68 and a specificity of 0.95, B is 0.0076 ppm (see Figures 1 and 2). FIG. 2 represents the classification tree for 40 cell samples tested as a function of the pATM to parameter (nude normalized) and of the threshold value B of 0.0076 ppm (cf. FIG. 3).

Dans un autre mode de réalisation avantageux, la radiosensibilité d’un échantillon cellulaire d’un individu envers un rayonnement ionisant est déterminée sur des fibroblastes issus d’une biopsie de peau dudit individu de la manière suivante :In another advantageous embodiment, the radiosensitivity of a cell sample of an individual to ionizing radiation is determined on fibroblasts obtained from a skin biopsy of said individual in the following manner:

on considère que l’échantillon est radiorésistant si pATM æ (cyto+nuc normalisé) C on considère que l’échantillon est radiosensible si pATM æ (cyto+nuc normalisé) < C où pATM æ (cyto+nuc normalisé) a la signification indiquée ci-dessus à la section 4b, et C est une valeur entière ou décimale comprise entre 0,1x10'⁴ et 5x10'².the sample is considered to be radio-resistant if pATM æ (normalized cyto + nuc) C the sample is considered to be radiosensitive if pATM æ (normalized cyto + nuc) <C where pATM æ (normalized cyto + nuc) has the meaning indicated above in section 4b, and C is an integer or decimal value between 0.1x10 ' ⁴ and 5x10' ² .

La détermination de la radiosensibilité d’un échantillon cellulaire d’un individu envers un rayonnement ionisant selon cette dernière méthode a été validée par le test de Wilcoxon avec une probabilité de 0,001 indiquant l’existence de deux groupes de données distincts, i.e. de deux groupes de radiosensibilité (cf. figure 4).The determination of the radiosensitivity of a cell sample of an individual towards ionizing radiation according to this latter method was validated by the Wilcoxon test with a probability of 0.001 indicating the existence of two distinct groups of data, ie of two groups radiosensitivity (see Figure 4).

- on considère que l’échantillon est radiorésistant si pATM æ (total normalisé) D on considère que l’échantillon est radiosensible si pATM æ (total normalisé) < D où pATM æ (total normalisé) a la signification indiquée ci-dessus à la section 4b, et- the sample is considered to be radio-resistant if pATM æ (normalized total) D it is considered that the sample is radiosensitive if pATM æ (normalized total) <D where pATM æ (normalized total) has the meaning indicated above in section 4b, and

- D est une valeur entière ou décimale comprise entre 0,1x10'⁴ et 5x10'¹.- D is an integer or decimal value between 0.1x10 ' ⁴ and 5x10' ¹ .

Les valeurs B et C seuils sont fixées et sont déterminées par la courbe ROC (tests statistiques en binaire) (Figure 1) qui permet d’évaluer la performance de ce test en représentant le taux de vrais positifs (fraction des individus détectés positifs qui sont détectés correctement par ce test) en fonction du taux de faux positifs (fraction des individus détectés positifs par ce test alors qu’ils sont en réalité négatifs) (Figure 2). La valeur seuil D est déterminée par déduction des deux autres valeurs seuils B et C.The threshold values B and C are fixed and are determined by the ROC curve (statistical tests in binary) (Figure 1) which makes it possible to evaluate the performance of this test by representing the rate of true positives (fraction of individuals detected positive who are correctly detected by this test) as a function of the false positive rate (fraction of individuals detected positive by this test when they are actually negative) (Figure 2). The threshold value D is determined by deduction from the other two threshold values B and C.

Ces formules sont issues de données cliniques observées sur les lignées de fibroblastes présentées dans les tableaux 2 et 3 suivants et corrélées à la quantité de pATM æ (nue normalisé) θ'-l de pATM to (cyto+nuc normalisé)· Les quantités de pATM to (nue normalisé) ©t de pATM to (cyto+nuc normalisé) ont la signification indiquée ci-dessus à la section 4b.These formulas are derived from clinical data observed on the fibroblast lines presented in the following tables 2 and 3 and correlated with the amount of pATM æ (normalized nude) θ'-l of pATM to (normalized cyto + nuc) · The quantities of pATM to (normalized nude) © and pATM to (normalized cyto + nuc) have the meaning given above in section 4b.

Tableau 2 : Ouantités relatives de la protéine pATM dans le noyau en ppm (pATM æ (nue normalisé)) à l’état basal dans les fibroblastesTable 2: Relative quantities of the pATM protein in the nucleus in ppm (pATM æ (normalized nude)) in the basal state in fibroblasts

Lignée Line pATM to (nue normalisé) (PPm) pATM to (normalized nude) (PPm) Grade CTCAE observé cliniquement (nombre entier) CTCAE grade observed clinically (whole number) Statut de radiosensibilité déterminé cliniquement « + » = radiorésistant « - » = radiosensible Clinically determined radiosensitivity status "+" = Radio-resistant "-" = radiosensitive 03OLL 03OLL 24,76 24.76 1 1 + + HDF HDF 5,04 5.04 0 0 + + HFF2 HFF2 10,87 10.87 0 0 + + IMR90 IMR90 16,95 16.95 0 0 + + THORS2TS1 THORS2TS1 10,53 10.53 1 1 + + 1 BR3 1 BR3 6,91 6.91 0 0 + +

DIJ002 DIJ002 43,44 43.44 1 1 + + DIJ003 DIJ003 27,27 27.27 1 1 + + DIJ006 DIJ006 35,46 35.46 1 1 + + DIJ004 DIJ004 11,24 11.24 1 1 + + DIJ005 DIJ005 10,05 10,05 1 1 + + NeoGre002 NeoGre002 19,8 19.8 1 1 + + NeoGre003 NeoGre003 9,7 9.7 1 1 + + NeoGre004 NeoGre004 64,54 64.54 1 1 + + 02CUR 02CUR 5,94 5.94 2 2 - - 1603946-CAR-AI 1603946-CAR-AI 3,08 3.08 2 2 - - 1306835 1306835 6,77 6.77 2 2 - - 01 CJP 01 CJP 7,54 7.54 3 3 - - 01 DAX 01 DAX 33,8 33.8 3 3 - - 02CAV 02CAV 1,25 1.25 3 3 - - 02CLB 02CLB 5,64 5.64 4 4 - - 02MTZ 02MTZ 3,52 3.52 3 3 - - 03HLS 03HLS 2,45 2.45 3 3 - - 03HM 03HM 3,44 3.44 2 2 - - 04CAV 04CAV 2,91 2.91 4 4 - - 05HM 05HM 5,53 5.53 3 3 - - 07HM 07HM 10,54 10.54 3 3 - - 08HNG 08HNG 0,21 0.21 3 3 - - 09HM 09HM 9,71 9.71 2 2 - - 10HM 10HM 4,02 4.02 2 2 - - 11HM 11HM 3,23 3.23 2 2 - - 04CLB 04CLB 25,1 25.1 2 2 - - 07CLB 07CLB 31,66 31.66 3 3 - - 14CLB 14CLB 0,08 0.08 3 3 - - 17CLB 17CLB 3,99 3.99 3 3 - - 21CLB 21CLB 4,96 4.96 2 2 - - 34CLB 34CLB 17,49 17.49 3 3 - -

Tableau 3 : Quantités relatives en ppm de la protéine pATM dans les compartiments cytoplasmiques et nucléaires (pATM æ (cyto+nuc normalisé)) présente dans les fibroblastes à l’état basalTable 3: Relative quantities in ppm of the pATM protein in the cytoplasmic and nuclear compartments (pATM æ (normalized cyto + nuc)) present in the fibroblasts in the basal state

Lignée Line pATM to (cyto+nuc normalisé) (PPm) pATM to (cyto + nuc standardized) (Ppm) Grade CTCAE observé cliniquement (nombre entier) CTCAE grade observed clinically (whole number) statut de radiosensibilité déterminé cliniquement « + » = radiorésistant « - » = radiosensible clinically determined radiosensitivity status "+" = Radio-resistant "-" = radiosensitive 03OLL 03OLL 26,13 26,13 1 1 + + HDF HDF 7,82 7.82 0 0 + + HFF2 HFF2 14,09 14.09 0 0 + + IMR90 IMR90 24,26 24.26 0 0 + + THORS2TS1 THORS2TS1 13,16 13.16 1 1 + + HFL1 HFL1 18,5 18.5 0 0 + + Wi38 Wi38 18,91 18.91 0 0 + + 1 Br3 1 Br3 8,48 8.48 0 0 + + DIJ002 DIJ002 45,63 45,63 1 1 + + DIJ003 DIJ003 31,07 31,07 1 1 + + DIJ006 DIJ006 38,01 38,01 1 1 + + DIJ004 DIJ004 11,96 11.96 1 1 + + DIJ005 DIJ005 11,96 11.96 1 1 + + NeoGre002 NeoGre002 21,67 21.67 1 1 + + NeoGre003 NeoGre003 11,02 11,02 1 1 + + NeoGre004 NeoGre004 66,21 66.21 1 1 + + 02CUR 02CUR 7,96 7.96 2 2 - - 1603946-CAR-AI 1603946-CAR-AI 3,81 3.81 2 2 - - 1306835 1306835 7,8 7.8 2 2 - - 01 CJP 01 CJP 8,38 8.38 3 3 - - 01 DAX 01 DAX 38,9 38.9 3 3 - - 02CAV 02CAV 1,94 1.94 3 3 - - 02CLB 02CLB 7,5 7.5 4 4 - - 02MTZ 02MTZ 4,21 4.21 3 3 - - 03HLS 03HLS 3,25 3.25 3 3 - - 03HM 03HM 4,65 4.65 2 2 - - 04CAV 04CAV 3,68 3.68 4 4 - - 05HM 05HM 8,99 8.99 3 3 - - 07HM 07HM 12,43 12.43 3 3 - - 08HNG 08HNG 0,26 0.26 3 3 - - 09HM 09HM 11,22 11.22 2 2 - - 10HM 10HM 5,12 5.12 2 2 - - 11HM 11HM 4,14 4.14 2 2 - -

04CLB 04CLB 28,24 28.24 2 2 - - 07CLB 07CLB 34,58 34.58 3 3 - - 14CLB 14CLB 0,1 0.1 3 3 - - 17CLB 17CLB 6,78 6.78 3 3 - - 21CLB 21CLB 6,44 6.44 2 2 - - 34CLB 34CLB 18,86 18.86 3 3 - -

d. Les niveaux et méthodes d’analysed. Levels and methods of analysis

Dans un mode de réalisation, tous les paramètres mesurés expérimentalement entrent dans la détermination des scores. En cas de conflit entre scores on répète certaines mesures ou détermination, ou on effectue d’autres essais expérimentaux de manière à ajouter d’autres mesures entrant dans la détermination des scores. Le niveau de certains paramètres seuls tels que le pATM æ (nue normalisé) suffit à établir un score et un diagnostic.In one embodiment, all the parameters measured experimentally are used to determine the scores. In the event of a conflict between scores, certain measurements or determination are repeated, or other experimental tests are carried out so as to add other measurements entering into the determination of scores. The level of certain parameters alone such as the pATM æ (normalized nude) is sufficient to establish a score and a diagnosis.

5. Evaluation prédictive du statut de radiosensibilité à partir d’un échantillon cellulaire en employant un kit selon l’invention5. Predictive evaluation of the radiosensitivity status from a cell sample using a kit according to the invention

Un kit selon l’invention peut être employé pour caractériser la radiosensibilité d’un échantillon cellulaire d’un individu envers un rayonnement ionisant. Ce kit comprendA kit according to the invention can be used to characterize the radiosensitivity of a cell sample of an individual towards ionizing radiation. This kit includes

a) des moyens d’extraction des fractions totales de l’échantillon cellulaire, i.e. des réactifs tels qu’un tampon de lyse connu de l’homme du métier,a) means for extracting the total fractions from the cell sample, i.e. reagents such as a lysis buffer known to a person skilled in the art,

b) des moyens de détermination sur les dites fractions dudit échantillon cellulaire de la quantité de la protéine ATM phosphorylée pATM à l’état basal, tels qu’une plaque revêtue d’un anticorps spécifique anti-pATM permettant d’effectuer un test ELISA.b) means for determining on said fractions of said cell sample the amount of the phosphorylated ATM protein pATM in the basal state, such as a plate coated with a specific anti-pATM antibody allowing an ELISA test to be carried out.

ExemplesExamples

L’invention est illustrée ci-dessous par des exemples qui cependant ne limitent pas l’invention. Ces exemples portent sur l’analyse de lignées cellulaires d’individus permettant la détermination du statut de radiosensibilité auquel appartient l’individu.The invention is illustrated below by examples which however do not limit the invention. These examples relate to the analysis of cell lines of individuals allowing the determination of the radiosensitivity status to which the individual belongs.

1.1.

Préparation de l’échantillon cellulairePreparation of the cell sample

Un échantillon sanguin d’un individu comportant des lymphocytes ou des lymphoblastes a été prélevé. Les lymphocytes ont été isolés à partir du sang total frais via la technique du Ficoll® décrite précédemment.A blood sample from an individual with lymphocytes or lymphoblasts was taken. The lymphocytes were isolated from fresh whole blood using the Ficoll® technique described above.

La séparation des constituants du sang a été obtenue par centrifugation sur un coussin de Ficoll® (polymère glucidique de masse molaire élevée). Après centrifugation pendant 20 min à 400 g à température ambiante, les constituants du sang ont été séparés par densité. Après élimination du surnageant contenant le plasma et les plaquettes, les lymphocytes ont été extraits de l’échantillon cellulaire, puis ont été lavés dans du PBS 1X et recentrifugés dans les mêmes conditions, de façon à éliminer toute trace de Ficoll®. Après élimination du surnageant contenant le Ficoll®, les lymphocytes ainsi purifiés ont été redispersés dans du PBS 1X.The blood components were separated by centrifugation on a Ficoll® cushion (high molecular weight carbohydrate polymer). After centrifugation for 20 min at 400 g at room temperature, the blood components were separated by density. After removal of the supernatant containing the plasma and the platelets, the lymphocytes were extracted from the cell sample, then were washed in PBS 1X and recentrifuged under the same conditions, so as to remove all traces of Ficoll®. After removal of the supernatant containing Ficoll®, the lymphocytes thus purified were redispersed in PBS 1X.

Des lymphocytes à l’état basal ont ainsi été obtenus et ont ensuite été utilisés tels quels, sans être irradiés (dose absorbée 0 Gy).Lymphocytes in the basal state were thus obtained and were then used as such, without being irradiated (absorbed dose 0 Gy).

Un échantillon cellulaire de peau d’un individu a été prélevé par biopsie via la méthode du « punch dermatologique ». L’échantillon cellulaire a ensuite été placé dans du milieu DMEM+20% sérum de veau fêtai stérile. L’échantillon cellulaire a ensuite été établi sous la forme d’une lignée cellulaire amplifiable. En utilisant notamment la dispersion trypsique, les cellules ont ensuite été de nouveau diluées dans du milieu renouvelé et ainsi de suite jusqu’à obtention du nombre de cellules souhaitées. Après une semaine de culture, les premières expériences ont été réalisées en utilisant le procédé selon l’invention. Les cellules ainsi obtenues, i.e. les fibroblastes ont ensuite été utilisées tels quels, sans être irradiés (dose absorbée 0 Gy).A skin cell sample from an individual was taken by biopsy using the "skin punch" method. The cell sample was then placed in DMEM medium + 20% sterile fetal calf serum. The cell sample was then established as an amplifiable cell line. Using in particular the tryptic dispersion, the cells were then again diluted in renewed medium and so on until the desired number of cells was obtained. After a week of culture, the first experiments were carried out using the method according to the invention. The cells thus obtained, i.e. the fibroblasts were then used as such, without being irradiated (absorbed dose 0 Gy).

Séparation des compartiments cytoplasmiques et nucléaires des cellules nucléées par fractionnement subcellulaireSeparation of cytoplasmic and nuclear compartments of nucleated cells by subcellular fractionation

Un fractionnement subcellulaire permettant de séparer les protéines pATM cytoplasmiques des protéines pATM nucléaires a été effectué sur les fibroblastes cultivés issus de l’échantillon cellulaire de peau de l’individu et sur les lymphocytes issus de l’échantillon sanguin de l’individu précités. Ce fractionnement a été réalisé en utilisant le kit d’extraction nucléaire et cytoplasmique NE-PER de PIERCE selon le protocole du fabriquant et la méthodologie décrite dans l’article de Trotter, K. W. and Archer, T. K., Molecular and Cellular Biology (2004) « Reconstitution of glucocorticoid receptordependent transcription in vivo ».Subcellular fractionation to separate cytoplasmic pATM proteins from nuclear pATM proteins was carried out on cultured fibroblasts from the individual's skin cell sample and on lymphocytes from the aforementioned individual's blood sample. This fractionation was carried out using the PIERCE NE-PER nuclear and cytoplasmic extraction kit according to the manufacturer's protocol and the methodology described in the article by Trotter, KW and Archer, TK, Molecular and Cellular Biology (2004) " Reconstitution of glucocorticoid receptordependent transcription in vivo ”.

La présence des protéines dans chacune des fractions cytoplasmiques et nucléaires a été vérifiée par un test «Western blot» connu de l’homme du métier avec des anticorps spécifiques de chaque compartiment cytoplasmique (anti-tubuline ou anti-actine) et nucléaire (anti-topoisomérase).The presence of the proteins in each of the cytoplasmic and nuclear fractions was verified by a “Western blot” test known to those skilled in the art with antibodies specific to each cytoplasmic (anti-tubulin or anti-actin) and nuclear (anti- topoisomerase).

2. Détermination de la quantité de pATM présente dans les cellules nucléées à l’état basal par un test ELISA (Kit R&D Systems et Novateinbio)2. Determination of the amount of pATM present in nucleated cells in the basal state by an ELISA test (Kit R&D Systems and Novateinbio)

La quantité des formes phosphorylées des protéines ATM (pATM) a été mesurée sur les cellules cultivées puis fractionnées, en fonction du type cellulaire étudié. La quantité de protéine pATM a ainsi été mesurée dans chacune des fractions cytoplasmiques et nucléaires des fibroblastes cultivés issus de l’échantillon cellulaire de peau de l’individu et dans chacune des fractions cytoplasmiques et nucléaires des lymphocytes issus de l’échantillon sanguin de l’individu.The quantity of phosphorylated forms of ATM proteins (pATM) was measured on the cultured cells and then fractionated, depending on the cell type studied. The amount of pATM protein was thus measured in each of the cytoplasmic and nuclear fractions of cultured fibroblasts from the individual's skin cell sample and in each of the cytoplasmic and nuclear fractions of lymphocytes from the blood sample of the individual.

La quantification des formes phosphorylées des protéines ATM (pATM) dans chacune des fractions cytoplasmiques et nucléaires a été réalisée par test ELISA (Kit).The quantification of the phosphorylated forms of ATM proteins (pATM) in each of the cytoplasmic and nuclear fractions was carried out by ELISA test (Kit).

Pour chacune des fractions cytoplasmiques et nucléaires, 50 pL ont été prélevés et disposés dans un puit d’une plaque revêtue d’un anticorps spécifique anti-pATM (R&D Systems et Novateinbio). Dans chaque puit, la quantité de pATM présente a ensuite été analysée par luminescence à 450 nm grâce à un lecteur de plaques et la quantité totale de protéines a été déterminée par un test Bradford connu de l’homme du métier.For each of the cytoplasmic and nuclear fractions, 50 μL were removed and placed in a well of a plate coated with a specific anti-pATM antibody (R&D Systems and Novateinbio). In each well, the amount of pATM present was then analyzed by luminescence at 450 nm using a plate reader and the total amount of protein was determined by a Bradford test known to those skilled in the art.

3. Détermination de la radiosensibilité d’individus à partir de lymphoblastes issus de ces mêmes individus et de la quantité relative de protéines pATM to (nue normalisé) obtenue par test Elisa3. Determination of the radiosensitivity of individuals from lymphoblasts derived from these same individuals and of the relative amount of pATM to proteins (normalized nude) obtained by Elisa test

Plusieurs échantillons cellulaires issus de patients ont ainsi été analysés. Afin d’obtenir des résultats d’une fiabilité statistique suffisante, 3 séries d’analyses indépendantes ont été effectuées par échantillon. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau ciaprès (cf. tableau 4), et ce, pour différents échantillons sanguins de patients.Several cell samples from patients were thus analyzed. In order to obtain results of sufficient statistical reliability, 3 series of independent analyzes were carried out per sample. The results obtained are presented in the table below (see Table 4), for various blood samples from patients.

Tableau 4 : Quantités de la protéine pATM nucléaire (pATM æ (nue normalisé)) présente dans des lymphoblastes issus de patients à l’état basalTable 4: Quantities of the nuclear pATM protein (pATM æ (normalized nude)) present in lymphoblasts from patients in the basal state

Lignée Line Grade CTCAE observé cliniquement (nombre entier) CTCAE grade observed clinically (whole number) statut de radiosensibilité déterminé cliniquement status of radiosensitivity determined clinically pATM to (nue normalisé) (PPm) pATM to (nude standard) (Ppm) statut de radiosensibilité déterminé selon l’invention status of radiosensitivity determined according to the invention GM03798 GM03798 0 0 radiorésistant radioresistant 10,640 10,640 radiorésistant radioresistant GM03380 GM03380 1 1 radiosensible radiosensitive 6,219 6.219 radiosensible radiosensitive GM07078 GM07078 1 1 radiosensible radiosensitive 4,133 4,133 radiosensible radiosensitive 37792 37792 1 1 radiosensible radiosensitive 6,328 6.328 radiosensible radiosensitive 40479 40479 1 1 radiosensible radiosensitive 9,330 9,330 radiosensible radiosensitive

Dans le tableau 4, pATM æ (nue normalisé) a la signification indiquée ci-dessus à la section 4b. pATM to (nue normalisé) est exprimé en ppm.In Table 4, pATM æ (nude normalized) has the meaning given above in section 4b. pATM to (normalized nude) is expressed in ppm.

Les patients 40479 et 37792 présentent des mutations sur le gène BRCA1 induisant une tendance à développer des cancers du sein ou de l'ovaire.Patients 40479 and 37792 have mutations in the BRCA1 gene, inducing a tendency to develop breast or ovarian cancer.

Les lignées de lymphoblastes GM07078, 40479 et 37792 correspondent à des patients 10 pour lesquels les grades CTCAE sont connus.The GM07078, 40479 and 37792 lymphoblast lines correspond to patients for which the CTCAE grades are known.

Pour les 5 lignées cellulaires (lymphoblastes) présentées dans le tableau 4, le statut de radiosensibilité déterminé cliniquement correspond à celui déterminé par la méthode selon l’invention en fonction de la quantité relative de pATM æ (nue normalisé) et de la valeur seuil A.For the 5 cell lines (lymphoblasts) presented in table 4, the radiosensitivity status determined clinically corresponds to that determined by the method according to the invention as a function of the relative amount of pATM æ (nude normalized) and of the threshold value A .

Selon l’invention, on considère que l’échantillon est :According to the invention, the sample is considered to be:

- radiorésistant si pATM _t0 (nue normalisé) A radiosensible si pATM to (nue normalisé) *· A.- radio-resistant if pATM _t0 (normalized nude) A radio-sensitive if pATM to (normalized nude) * · A.

oùor

- pATM æ (nue normalisé), exprimée en ppm, a la signification indiquée ci-dessus à la section 4b, et- pATM æ (normalized nude), expressed in ppm, has the meaning indicated above in section 4b, and

- A est une valeur entière ou décimale comprise entre 0,1x10 '² et 20.- A is an integer or decimal value between 0.1x10 ' ² and 20.

Au vu de ces valeurs seuils, le patient GM03798 est considéré comme radiorésistant et les patients GM03380, GM07078, 37792 et 40479 sont considérés comme radiosensibles. La figure 5 montre les variations des proportions de pATM dans le noyau à l’état basal pour ces patients.In view of these threshold values, patient GM03798 is considered to be radio-resistant and patients GM03380, GM07078, 37792 and 40479 are considered to be radiosensitive. Figure 5 shows the variations in the proportions of pATM in the basal nucleus for these patients.

4. Validation de la méthode permettant de déterminer la radiosensibilité d’un individu selon l’invention4. Validation of the method for determining the radiosensitivity of an individual according to the invention

Un échantillon sanguin d’un individu comportant des lymphoblastes a été prélevé. Les lymphoblastes ont été isolés à partir du sang total frais via la technique du Ficoll® décrite précédemment. Des lymphocytes à l’état basal ont ainsi été obtenus. Une partie de ces lymphoblastes a ensuite été utilisée telle quelle, sans que les lymphoblastes soient irradiés (dose absorbée 0 Gy - état basal) et une partie de ces lymphoblastes a été irradiée sur un irradiateur médical suivant une dosimétrie certifiée avec une dose absorbée D de 2 Gy. L’irradiation a été effectuée avec un accélérateur médical qui délivre des photons de 6 MV avec un débit de dose absorbée de 3 Gy min¹. Après irradiation, les cellules restent dans l’incubateur de culture à 37°C, et on détermine la quantité de pATM présente dans le noyau et le cytplasme cellulaire des lymphoblastes à l’état radio-induit après 5 minutes et 10 minutes de réparation (temps de réparation post-irradiation).A blood sample from an individual with lymphoblasts was taken. The lymphoblasts were isolated from fresh whole blood using the Ficoll® technique described above. Basal lymphocytes were thus obtained. A part of these lymphoblasts was then used as such, without the lymphoblasts being irradiated (absorbed dose 0 Gy - basal state) and a part of these lymphoblasts was irradiated on a medical irradiator according to a certified dosimetry with an absorbed dose D of 2 Gy. The irradiation was carried out with a medical accelerator which delivers photons of 6 MV with an absorbed dose rate of 3 Gy min ¹ . After irradiation, the cells remain in the culture incubator at 37 ° C., and the quantity of pATM present in the nucleus and the cellular cytplasm of the lymphoblasts in the radio-induced state is determined after 5 minutes and 10 minutes of repair ( post-irradiation repair time).

La figure 6 représente une matrice illustrant les corrélations existantes entre les quantités de pATM présentes dans le noyau et le cytoplasme cellulaire de lymphoblastes issus d’échantillons sanguins d’individus à l’état basal (0 Gy - état non irradié), après 5 minutes et 10 minutes de réparation (temps de réparation post-irradiation).FIG. 6 represents a matrix illustrating the correlations existing between the quantities of pATM present in the nucleus and the cell cytoplasm of lymphoblasts derived from blood samples from individuals in the basal state (0 Gy - non-irradiated state), after 5 minutes and 10 minutes of repair (post-irradiation repair time).

Le coefficient de corrélation prend une valeur comprise entre 0 et 1. 0 signifie qu’il existe aucune corrélation linéaire entre les deux variables testées alors que 1 indique qu’il existe une relation de proportionnalité entre les deux. Selon la figure 6, la proportion de protéines pATM dans le noyau avant irradiation et celles après irradiation ne peuvent être corrélées (cf. groupe A). La proportion de protéines pATM dans le noyau avant irradiation n’est pas corrélée aux proportions des protéines pATM présentes dans le compartiment cytoplasmique, et ce, que ce soit à l’état basal non irradié ou à 5 ou à 10 minutes post irradiation. Dans ce cas, le coefficient de corrélation entre 0Gy_nuc et 0Gy_cyto ou 5mn_cyto ou 10mn_cyto est proche de 0. Les quantités de pATM présentes dans le noyau à 5 min et 10 min post irradiation peuvent être corrélées entre elles (cf. groupe B avec un coefficient de corrélation proche de 1). Les quantités de pATM présentes dans le cytoplasme à l’état basal (0 Gy), à 5 min et 10 min post irradiation peuvent être corrélées ensemble (cf. groupe C avec un coefficient de corrélation proche de 1).The correlation coefficient takes a value between 0 and 1. 0 means that there is no linear correlation between the two variables tested while 1 indicates that there is a proportional relationship between the two. According to FIG. 6, the proportion of pATM proteins in the nucleus before irradiation and those after irradiation cannot be correlated (cf. group A). The proportion of pATM proteins in the nucleus before irradiation is not correlated with the proportions of pATM proteins present in the cytoplasmic compartment, whether in the non-irradiated basal state or at 5 or 10 minutes post irradiation. In this case, the correlation coefficient between 0Gy_nuc and 0Gy_cyto or 5mn_cyto or 10mn_cyto is close to 0. The amounts of pATM present in the nucleus at 5 min and 10 min post irradiation can be correlated with each other (cf. group B with a coefficient correlation close to 1). The amounts of pATM present in the cytoplasm in the basal state (0 Gy), at 5 min and 10 min post irradiation can be correlated together (cf. group C with a correlation coefficient close to 1).

Claims

1. Method for characterizing the radiosensitivity of a cell sample of an individual to ionizing radiation, said cell sample having been obtained from cells taken from said individual, said method being characterized in that the radiosensitivity is determined from the quantity of the phosphorylated ATM protein pATM in the basal state t ₀ , said method does not include irradiation of said cell sample.

2. Method according to claim 1, in which an immunoenzymatic method is used for determining the amount of the pATM protein.

3. Method according to any one of claims 1 or 2, in which the amount of the phosphorylated ATM protein pATM is detected by an ELISA test.

4. Method according to any one of claims 1 to 3, wherein the cell sample is chosen from: a blood sample comprising lymphocytes or lymphoblasts and a sample from a biopsy comprising fibroblasts.

5. Method according to any one of claims 1 to 4, in which (a) optionally, target nucleated cells are isolated from the cell sample;

(b) extracting the total fractions or the cytoplasmic and nuclear fractions or the nuclear fractions from the cell sample;

(c) the quantity of the phosphorylated ATM protein pATM in the basal state t ₀ is determined on the said fractions of said cell sample;

(d) the radiosensitivity of the cell sample is determined by using at least the average number pATM _t0 (normalized nude) or the average number pATM tO (normalized cyto + nuc) or the average number pATM _t0 (normalized total);

and where • pATM æ (normalized nude), expressed in ppm, denotes the average amount of pATM present in the nuclear compartment in the basal state t ₀ expressed in ng divided by the total quantity of cellular proteins extracted from said nuclear compartment expressed in pg ;

PATM æ (normalized cyto + nuc), expressed in ppm, denotes the average quantity of pATM present in the cytoplasmic and nuclear compartments in the basal state t ₀ expressed in ng divided by the total quantity of cellular proteins extracted from said cytoplasmic compartments and nuclear expressed in pg;

• pATM to (normalized total), expressed in ppm, denotes the average total quantity of pATM extracted from the cells expressed in ng divided by the total quantity of proteins extracted from said cells expressed in pg.

6. Method according to any one of claims 1 to 5, in which the said target nucleated cells are chosen from: mucosal cells, epithelial cells, lymphoblasts, lymphocytes and fibroblasts, and even more preferably from lymphoblasts, lymphocytes and fibroblasts.

7. Method according to any one of claims 1 to 6, in which the radiosensitivity of a cell sample of an individual to ionizing radiation is determined on fibroblasts derived from a biopsy of said individual and in which the sample is considered to be is radioresistant if pATM æ (normalized nude) B, the sample is considered to be radiosensitive if pATM æ (normalized nude) <B, where pATM æ (normalized nude), expressed in ppm, denotes the average amount of pATM present in the nuclear compartment in the basal state t ₀ expressed in ng divided by the total quantity of cellular proteins extracted from said nuclear compartment expressed in pg, and

- B is a decimal value between 0.1x10 ' ⁴ and 5x10' ³ .

8. Method according to any one of claims 1 to 6, in which the radiosensitivity of a cell sample of an individual to ionizing radiation is determined on fibroblasts derived from a biopsy of said individual and in which the sample is considered to be is radioresistant if pATM æ (normalized cyto + nuc) C, the sample is considered to be radiosensitive if pATM æ (normalized cyto + nuc) <C, where pATM to (normalized cyto + nuc), expressed in ppm, denotes the quantity mean of pATM present in the cytoplasmic and nuclear compartments in the basal state t ₀ expressed in ng divided by the total quantity of cellular proteins extracted from said cytoplasmic and nuclear compartments expressed in pg, and C is a decimal value between 0.1x10 ' ⁴ and 5x10 ' ² .

9. Method according to any one of claims 1 to 6, in which the radiosensitivity of a cell sample of an individual to ionizing radiation is determined on fibroblasts derived from a biopsy of said individual and in which the sample is considered to be is radioresistant if pATM æ (normalized total) D, the sample is considered to be radiosensitive if pATM æ (normalized total) <D, where pATM æ (normalized total), expressed in ppm, denotes the average total quantity of pATM extracted from cells expressed in ng divided by the total quantity of proteins extracted from said cells expressed in pg, and

D is a decimal value between 0.1x10 ' ⁴ and 5x10' ¹ .

10. Method according to any one of claims 1 to 6, in which the radiosensitivity of a cell sample of an individual to ionizing radiation is determined on lymphoblasts and / or lymphocytes derived from blood cells of said individual and in which the sample is considered to be radio-resistant if pATM æ (normalized nude) A, it is considered that the sample is radiosensitive if pATM æ (normalized nude) <A, where pATM æ (normalized nude), expressed in ppm, denotes the quantity mean of pATM present in the nuclear compartment in the basal state t ₀ expressed in ng divided by the total quantity of cellular proteins extracted from said nuclear compartment expressed in pg,

A represents an integer or decimal value between 0.1 x 10 ' ² and 20.

11. Method according to any one of claims 1 to 6, in which the radiosensitivity of a cell sample of an individual to ionizing radiation is determined on lymphoblasts and / or lymphocytes derived from blood cells of said individual and in which the sample is considered to be radio-resistant if pATM æ (normalized total) A, it is considered that the sample is radiosensitive if pATM æ (normalized total) <A, where pATM æ (normalized total), expressed in ppm, denotes the quantity average total pATM extracted from cells expressed in ng divided by the total quantity of proteins extracted from said cells expressed in pg,

A represents an integer or decimal value between 0.1 x 10 ' ² and 20.

12. Kit for characterizing the radiosensitivity of an individual's cell sample to ionizing radiation, comprising:

a) means for extracting the total fractions from the cell sample,

b) means for determining said fractions of said cell sample from

10 the amount of the phosphorylated ATM protein pATM in the basal state to.

13. Use of a kit according to claim 12 for determining the radiosensitivity of a cell sample of an individual towards ionizing radiation.