FR3016372A1 - Procede de preparation de cellules pluripotentes induites - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne un procédé de préparation de cellules souches pluripotentes induites (iPS) par culture de cellules somatiques soumises à un procédé de reprogrammation cellulaire, caractérisé en ce que les cellules somatiques sont cultivées en présence de nétrine-1 ou d'un analogue de nétrine-1 au moins en début du procédé de reprogrammation cellulaire

Description

PROCEDE DE PREPARATION DE CELLULES PLURIPOTENTES INDUITES DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention concerne un procédé de préparation de cellules pluripotentes induites (iPS) présentant une meilleure efficacité et une meilleure homogénéité des cellules iPS obtenues. Cette amélioration est obtenue par l'emploi de nétrine-1 ou d'un analogue de nétrine-1 venant prévenir ou bloquer la mort cellulaire médiée par les récepteurs DCC (Deleted in Colorectal Carcinome) ou Unc5s (Unc5A, Unc5B, Unc5C et Unc5D) de la nétrine-1, dans les phases initiales du procédé de reprogrammation cellulaire. ETAT DE LA TECHNIQUE De nombreux travaux sont à présent connus pour avoir montré que des cellules somatiques peuvent être dé-différenciées en cellules nommées cellules souches pluripotentes induites ou iPS, qui présentent des caractéristiques similaires aux cellules souches embryonnaires. La génération de ces cellules souches pluripotentes induites (iPS) est très prometteuse pour la médecine régénératrice.

Les procédés de dé-différenciation ou reprogrammation cellulaire consistent généralement à exprimer un ou plusieurs facteurs exogènes clés permettant la reprogrammation des cellules somatiques pour maintenir une pluripotence de cellule souche. Des procédés de reprogrammation cellulaire consistant à cultiver des cellules somatiques sur un milieu de culture approprié pour les rendre et les maintenir pluripotentes par l'expression de différents facteurs de transcription, ont été largement décrits dans la littérature, notamment par l'expression de facteurs de la famille Oct, Sox, Klf et Myc, et tout particulièrement l'utilisation d'un mélange Oct4, Sox2, K1f4 et c -Myc ou cocktail OSKM. Ces procédés de reprogrammation cellulaire sont bien connus de l'homme du métier. On citera notamment pour revue la référence suivante : Gonzalez et al., Nat Rev Genet 2011, 12:231-242. Toutefois, ces procédés se révèlent stochastiques et peu efficaces et le développement des applications thérapeutiques des iPS est limité par la faible efficacité des procédés de reprogrammation et l'hétérogénéité des résultats.

Les inventeurs, par l'étude des mécanismes de mort cellulaire induite au cours de ce procédé de reprogrammation cellulaire, ont pu mettre en avant l'importance du rôle joué par la nétrine-1 et ses récepteurs DCC et Unc5s, en particulier DCC, dans les cellules somatiques soumises à cette reprogrammation en iPS.

La Nétrine-1 ou Ntn1 est une protéine sécrétée diffusible apparentée à la laminine. La Nétrine-1 est le ligand des récepteurs DCC (Deleted in Colorectal Cancer) et UNC5A-D (UNCoordinated 5 A, B, C et D). Historiquement, la Nétrine-1 (du sanskrit, « celui qui guide ») a été le premier facteur de guidage axonal caractérisé pour son rôle dans le ciblage des axones des neurones commissuraux de la moelle épinière (Serafini et al., 1994; Kennedy et al., 2004; Serafini et al., 1996). Son rôle-clé dans le contrôle du guidage axonal et de la migration neuronale a par la suite été confirmé dans d'autres territoires du système nerveux (Moore et al., 2007). Plus récemment, différents articles ont établi le rôle de la Nétrine-1 et de ses récepteurs dans le contrôle de l'angiogenèse (Lu et al., 2004; Park et al., 2004 ; Wilson et al., 2006; Larrivee et al. 2007; Navankasatussas et al., 2008 ; Ahmed et al., 2010 ; Epting et al., 2010) ou de la tumorigénèse (Mazelin et al., 2004 ; Fitamant et al., 2008). Son implication dans le contrôle de la tumorigénèse a été mise en évidence par le fait que la netrin-1, en se liant sur ses récepteurs DCC ou UNC5, bloque l'activité pro-apoptotique de ces récepteurs non-liés (Mehlen et Goldschneider, Oncogene, 2010 ; Mehlen et al., Nature Review Cancer, 2011). EXPOSE DE L'INVENTION La présente invention consiste en un procédé de préparation de cellules souches pluripotentes induites (iPS) par culture de cellules somatiques soumises à un procédé de reprogrammation cellulaire, caractérisé en ce que les cellules somatiques sont cultivées en présence de nétrine-1 ou d'un analogue de nétrine-1 au moins en début du procédé de reprogrammation cellulaire. La présente invention consiste également à utiliser la nétrine-1 ou un analogue de nétrine-1 pour préparer des cellules souches pluripotentes induites (iPS) par culture de cellules somatiques soumises à un procédé de reprogrammation cellulaire, en particulier pour améliorer l'efficacité de reprogrammation cellulaire des cellules somatiques en iPS.35 DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION L'invention ne concerne pas l'identification de nouveaux systèmes pour la reprogrammation des cellules somatiques en iPS. L'invention concerne l'inhibition de la mort cellulaire induite par le procédé de reprogrammation en agissant sur l'interaction des récepteurs DCC ou Unc5s des cellules somatiques avec la nétrine-1 ou un analogue de la nétrine-1. En effet, les inventeurs ont pu mettre en évidence que lors du procédé de reprogrammation cellulaire, l'expression de la nétrine-1 diminue rapidement alors que celle de son récepteur DCC est maintenue, situation conduisant à une mort cellulaire 10 médiée par DCC. L'invention consiste donc à compenser cette diminution en nétrine-1 dans le milieu de culture en début de procédé de reprogrammation, au moment où son expression diminue. L'invention consiste donc à cultiver les cellules somatiques en cours de 15 reprogrammation cellulaire en présence de nétrine-1 dans le milieu de culture, ou d'un analogue de nétrine-1, afin de prévenir ou bloquer la mort cellulaire médiée par les récepteurs DCC ou Unc5s dans les cellules somatiques lors de leur reprogrammation. Elle présente l'avantage d'être simple à mettre en oeuvre puisqu'elle utilise une 20 molécule soluble, la nétrine-1 ou un analogue de nétrine-1, sans nécessité d'intégration génomique supplémentaire, pour prévenir ou bloquer la mort cellulaire induite par le procédé de reprogrammation des cellules somatiques en iPS. Selon un premier aspect, la présente invention concerne donc un procédé de préparation in vitro de cellules souches pluripotentes induites (iPS) par culture de 25 cellules somatiques soumises à un procédé de reprogrammation cellulaire, caractérisé en ce que les cellules somatiques sont cultivées en présence de nétrine-1 ou d'un analogue de nétrine-1 au moins en début du procédé de reprogrammation cellulaire. Ainsi, la présente invention couvre un procédé de préparation in vitro de cellules 30 souches pluripotentes induites (iPS) qui comprend les étapes suivantes : - cultiver des cellules somatiques, - soumettre ces cellules à un procédé de reprogrammation cellulaire, dans un milieu de culture qui contient de la nétrine-1 ou un analogue de nétrine-1 au moins en début de procédé de reprogrammation.

Dans le cadre de l'invention, on entend par « cellules souches pluripotentes induites » ou « iPS », des cellules obtenues par reprogrammation cellulaire in vitro de cellules somatiques dans lesquelles des facteurs de pluripotence de cellules souches ont été introduits.

La reprogrammation cellulaire se réfère à un procédé de dédifférenciation de cellules somatiques en cellules souches pluripotentes. Les inventeurs ont pu montrer d'une part que la présence de nétrine-1 augmentait l'efficacité du procédé de reprogrammation de cellules somatiques en iPS. Ils ont aussi montré que le blocage ou l'inhibition de l'interaction de la nétrine-1 avec son récepteur DCC résultait en une baisse de l'efficacité de la reprogrammation cellulaire des cellules somatiques en iPS par rapport à un procédé témoin sans ajout de nétrine-1 ou d'inhibiteur de l'interaction nétrine-1/DCC. Ainsi, la présente invention qui s'attache à favoriser la survie des cellules somatiques en cours de reprogrammation cellulaire peut être mise en oeuvre quelle 15 que soit la méthode de reprogrammation employée. Dans le cadre de l'invention, la nétrine-1 se réfère de préférence à la nétrine-1 humaine et notamment au polypeptide correspondant à la séquence de 604 acides aminés ci-dessous telle que déposée dans la base Genbank sous le numéro d'accès NP 004813, 17 novembre 2006, ou à sa forme mature qui correspond aux acides 20 aminés 25 à 604 de cette séquence. mmravweala alaavaclvg avrggpglsm fagqaaqpdp csdenghprr cipdfvnaaf 61 gkdvrvsstc grpparycvv sergeerlrs chlcnasdpk kahppafltd InnphnItcw 121 qsenylqfph nvtltlslgk kfevtyvslq fcsprpesma iyksmdygrt wvpfqfystq 181 crkmynrphr apitkqneqe avctdshtdm rplsggliaf stldgrpsah dfdnspvlqd 25 241 wvtatdirva fsrlhtfgde neddselard syfyavsdlq vggrckcngh aarcvrdrdd 301 slvcdcrhnt agpecdrckp fhydrpwqra tareanecva cncnlharrc rfnmelykls 361 grksggvcln crhntagrhc hyckegyyrd mgkpithrka ckacdchpvg aagktcnqtt 421 gqcpckdgvt gitcnrcakg yqqsrspiap cikipvappt taassveepe dcdsyckask 481 gklkinmkky ckkdyavqih ilkadkagdw wkftvniisv ykqgtsrirr gdqslwirsr 30 541 diackcpkik plkkylllgn aedspdqsgi vadksslviq wrdtwarrlr kfqqrekkgk 601 ckka La présente invention couvre également l'utilisation des séquences d'acides aminés de Ntn1, précurseur de 604 acides aminés (aa) ou forme mature (aa25- aa604)) avec des modifications mineures, comme par exemple des substitutions 35 conservatives, dès lors que celles-ci n'affectent pas de manière significative l'activité de la nétrine-1 pour prévenir ou bloquer la mort cellulaire induite pas ses récepteurs, et en particulier par DCC. La nétrine-1 qui est présente dans le milieu de culture au moins au début du procédé de reprogrammation cellulaire peut être naturelle ou recombinante, de préférence recombinante. Avantageusement, le milieu de culture contient la nétrine-1 recombinante disponible dans le commerce chez Adipogen (réf : AG-40B-00400000). Elle peut être ajoutée directement dans le milieu de culture, ou bien être produite par des cellules qui surexpriment le gène codant la nétrine-1 et qui sont co-cultivées avec les cellules somatiques en cours de reprogrammation. La nétrine-1 peut également être exprimée par les cellules somatiques elles-mêmes, notamment par transfection. De la même manière, et notamment comme décrit ci-dessus pour la nétrine-1, un analogue de la nétrine-1 peut être présent dans le milieu de culture, directement ou produit par des cellules. Par analogue de nétrine-1, on entend toute substance capable de prévenir ou de bloquer la mort cellulaire induite par les récepteurs DCC ou Unc5s, en particulier la mort cellulaire induite par le récepteur DCC. Ces analogues sont donc des agonistes de la nétrine-1, qui peuvent par exemple se fixer aux récepteurs DCC ou Unc5s ou encore induire l'oligomérisation de ces récepteurs et notamment de DCC, et empêcher l'induction de la mort cellulaire médiée par ces récepteurs. Parmi les exemples d'analogues de nétrine-1, on peut notamment citer des anticorps agonistes des récepteurs DCC ou Unc5s, des fragments polypeptidiques de nétrine-1 capables de prévenir ou bloquer la mort cellulaire médiée par DCC ou Unc5s. Dans le cadre du procédé selon la présente invention, le milieu de culture des cellules somatiques soumises à une reprogrammation cellulaire peut donc contenir un ou des fragments de la nétrine-1, et en particulier des fragments de la séquence d'acides aminés déposée dans la base Genbank sous le numéro d'accès NP 004813, 17 novembre 2006, dès lors qu'il(s) conserve(nt) la propriété d'inhibition ou de blocage de la mort cellulaire médiée par ses récepteurs, et notamment par DCC. Parmi ces fragments, on peut notamment citer des fragments d'au moins 30 acides aminés, ou d'au moins 40 acides aminés, ou d'au moins 50 acides aminés, ou encore d'au moins 60 acides aminés. Les méthodes permettant de mesurer l'inhibition de la mort cellulaire médiée par DCC ou Unc5s sont bien connues de l'homme du métier.

De manière particulièrement avantageuse, la nétrine-1 ou l'analogue de nétrine1 est ajouté directement dans le milieu de culture. L'effet de l'apport en nétrine-1 sur l'efficacité du procédé dépend de la dose que l'on apporte, plus la dose est élevée meilleur est le résultat obtenu. Dans les essais réalisés par les inventeurs, le meilleur résultat a été obtenu avec une concentration en nétrine-1 de 900 ng/ml. L'homme du métier saura choisir la concentration en nétrine-1 ou en analogue de nétrine-1 la mieux adaptée pour le procédé qu'il mettra en oeuvre en tenant compte à la fois de l'amélioration de l'efficacité, mais aussi du prix de reviens du procédé lorsque l'on ajoute la quantité de nétrine-1 ou d'analogue de nétrine-1. De manière avantageuse, la concentration en nétrine-1 présente dans le milieu de culture est d'au moins 100 ng/ml, préférentiellement supérieure ou égale à 150 ng/ml. Pour l'emploi d'analogues de nétrine-1, l'homme du métier saura choisir la quantité appropriée de cet analogue de manière à obtenir la même efficacité que pour la nétrine-1. La nétrine-1 ou l'analogue de nétrine-1 est avantageusement présent dans le milieu de culture des cellules somatiques en cours de reprogrammation au moins pendant les 7 premiers jours à compter de l'initiation du procédé de reprogrammation (JO). Les inventeurs ont notamment montré qu'il n'est pas utile de prolonger la présence de nétrine-1 au-delà de cette période, aucun avantage supplémentaire n'étant apporté en termes d'efficacité de reprogramment en iPS. En fonction du mode d'apport de la nétrine-1 ou de l'analogue de nétrine-1 dans le milieu de culture, l'homme du métier saura adapter la fréquence de cet apport en tenant compte de la stabilité, de la disponibilité de la nétrine-1 ou de l'analogue de nétrine-1 dans le milieu de culture utilisé Avantageusement, lorsque la nétrine-1 est ajoutée directement dans le milieu de culture, elle est ajoutée chaque jour, et en particulier à une concentration d'au moins 100 ng/ml, notamment à l'occasion des changements de milieu nécessaires lors du 30 procédé de reprogrammation. La présente invention peut être mise en oeuvre quelle que soit la méthode de reprogrammation cellulaire employée. Le procédé de reprogrammation utilisé peut comprendre l'expression dans les cellules somatiques d'un ou de plusieurs facteurs de pluripotence de cellule souche 35 choisi(s) dans le groupe constitué de Oct, Sox, Klf, et Myc.

De manière avantageuse, l'invention est mise en oeuvre dans un procédé de reprogrammation comprenant, voire consistant en, l'expression des facteurs de transcription Oct4, Sox2 , Klf4 et c-Myc, encore nommé cocktail OSKM, qui est à ce jour la méthode la plus courante employée par l'homme du métier.

Ces facteurs de pluripotence de cellule souche peut être exprimées dans les cellules somatiques à l'aide de différentes techniques, telles que l'infection virale, la transfection notamment à l'aide de liposomes, l'électroporation, la perméabilité protéique membranaire, etc. De manière avantageuse, ces facteurs de pluripotence de cellule souche sont introduits par une étape d'infection virale des cellules somatiques, avec des virus permettant l'expression de séquences d'acides nucléiques codant ces facteurs, et notamment choisis parmi les lentivirus, rétrovirus, adénovirus, Sendaï virus. Ces méthodes sont bien connues de l'homme du métier, et notamment décrites dans Gonzalez et al., Nat Rev Genet 2011, 12:231-242; Zhou et al., Stem Cells 2009, 27:2667-2674; Weltner et al., J Virol 2012, 86:4463-4467; Fusaki et al., Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci 2009, 85:348-362; Nishimura et al., J Biol Chem 2011, 286:4760-4771. Le procédé de l'invention peut en outre comprendre une étape d'introduction d'un système rapporteur dans les cellules somatiques pour indiquer l'efficacité de la génération et la production des iPS, en particulier choisi parmi des systèmes fluorescents tels que la GFP, des systèmes colorimétriques, des systèmes de résistances aux antibiotiques, etc. Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, la présente invention est mise en oeuvre à l'aide d'un procédé de reprogrammation cellulaire qui est effectué sans intégration génomique et/ou sans expression d'oncogènes. Différents types de cellules somatiques peuvent être reprogrammées en iPS dans le cadre du procédé de la présente invention, et notamment des fibroblastes, des kératinocytes, des cellules T, des hépatocytes, des cellules de cordon ombilical, des cellules adipeuses, et des cellules sanguines, et avantageusement des fibroblastes. La présente invention trouve une application toute particulière pour préparer des iPS de mammifères. Ainsi, les cellules somatiques employées dans le cadre du procédé de l'invention peuvent être choisies dans le groupe constitué du rat, souris, lapin, cochon, mouton, chèvre, vache, singe et humain. Avantageusement, les cellules somatiques utilisées sont des cellules somatiques humaines, et notamment des fibroblastes humains. Selon un deuxième aspect, la présente invention est aussi relative à l'utilisation de nétrine-1 ou d'un analogue de nétrine-1 pour préparer des cellules souches pluripotentes induites (iPS) par culture de cellules somatiques soumises à un procédé de reprogrammation cellulaire, en particulier pour améliorer l'efficacité de reprogrammation cellulaire des cellules somatiques en iPS. Tous les modes de réalisation avantageux et particuliers mentionné ci-dessus s'agissant du procédé de préparation d'iPS sont également des modes de mise en oeuvre avantageux dans le cadre de l'utilisation de nétrine-1 ou analogue de nétrine-1 pour préparer des iPS. DESCRIPTION DES FIGURES La figure 1 représente le niveau d'expression de la nétrine-1 et de son récepteur DCC (A) , et des récepteurs Unc5B et Unc5C (B) au cours du procédé de reprogrammation de MEF (Mouse Embyronic Fibroblasts), aux jours 0, 2, 4 et 6 après infection avec des particules rétrovirales codant OSKM. La figure 2 représente l'effet de l'inactivation de l'expression de la nétrine-1 sur la reprogrammation de MEF infectés avec des particules lentivirales OSKM. La figure 3 représente l'effet de doses croissantes de Ntn1 sur l'efficacité de la reprogrammation cellulaire. La figure 4 représente l'effet de l'apport séquentiel de Ntn1 sur l'efficacité de la reprogrammation cellulaire (d0-7 : 7 premiers jours, d7-14 : du jour 7 au jour 14 et d0- 14 : 14 premiers jours). La figure 5 représente l'effet d'anticorps bloquant Ntn1 sur l'efficacité de la reprogrammation cellulaire (d0-7 : 7 premiers jours, d7-14 : du jour 7 au jour 14 et d014 : 14 premiers jours). La figure 6 représente l'effet de l'inactivation de l'expression du récepteur DCC (A) et de l'expression de Ntn1 (B) sur l'efficacité de la reprogrammation cellulaire. La figure 7 représente l'activité phosphatase alkaline (A) et l'analyse de clustering hiérarchical DESeq (B) des clones de cellules iPS dérivés en condition "contrôle" ou en présence de Nétrine-1 recombinante.

La figure 8 représente l'analyse des altérations chromosomiques majeures entre les lignées iPS contrôle (histogramme blanc) et dérivées en présence de Ntn1 (histogramme noir). La figure 9 représente l'analyse histologique des tératomes induits par l'injection in vivo de clones iPS dérivées en présence de Ntn1 (Echelle de taille: 100pm). La figure 10 représente l'effet de la Nétrine-1 recombinante (histogramme noir) sur l'émergence de colonies SSEA4 positives à partir de fibroblastes de prépuce humain remis en culture sur fibroblastes traités à la mitomycine C 7 jours après l'infection (barre d'échelle correspond à 200 pm) par rapport au contrôle (histogramme blanc). EXEMPLES Culture cellulaire et expériences de RNAi: Les fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) sont dérivés d'embryons à E13.5 de différentes souches. Les cellules pre-iPS, iPS et ES sont cultivées sur des MEF irradies ou en gélatine comme décrit précédemment. Les cellules 293T et plat-E sont cultivées en DMEM supplémenté avec 10% de FCS et de la penicillin/streptomicin. Les cellules iPS sont cultivées en milieu KSR+LIF ou KSR 2i+LIF. Les expériences de shRNA sont réalisées avec des vecteurs pLK0.1 et des siRNA de Sigma (SHCLNG-NM_008744 for Ntn1, SHCLNG-NM_007831 for Dcc and EMU022741 for Mbd3). Anticorps: Les anticorps utilisés dans cette étude pour l'immunofluorescence et le FACS sont les suivants: anti-Oct4 (Santa Cruz, C10), anti-Netrin-1 (R&D systems, mab1109), anti-thyl (Ebiosciences, 53-2.1), anti-SSEA1 (Stem cell technologies, 60060PE) and NL493 conjugated anti-SSEA4 antibody (R and D Systems SCO23). Nétrine-1 recombinante : La netrine-1 recombinante utilisée est disponible dans le commerce, chez 30 Adipogen (réf : AG-40B-0040-0000). Production rétrovirale et lentivirale. Les cellules plat-E ont été utilisées pour produire des particules rétrovirales à partir de vecteurs pMX-s codant les cDNA de Oct4, Sox2, Klf4 et c-Myc, comme décrit précédemment par les inventeurs. Des particules virales codant la mcherry ont été utilisées pour suivre l'efficacité d'infection des MEF. Des cellules 293T ont été utilisées pour produire les particules lentivirales. Génération de cellules iPS de souris. Des cellules MEF ont été passées dans des boites de 6 puits. 12 heures plus tard, ces cellules ont été infectées avec des quantités équivalentes de chaque particule rétrovirale en présence de polybrene à une concentration de 8pg/ml polybrene. Le milieu de culture est remplacé 24 heures après l'infection et 48 heures après l'infection, les MEF sont collectés et remis en culture sur des fibroblastes irradiés dans du milieu de culture pour cellules iPS. Le milieu de culture a ensuite été remplacé chaque jour avec du milieu frais et les colonies émergentes ont été comptées ou collectées 12-14 jours post-infection. Génération de cellules iPS humaines. Les expériences ont été réalisées avec 5x105 cellules de prépuce humain (HFF, Millipore) mis en culture dans un puits d'une plaque de 6 puits et en présence de milieu de culture FibroGROTm-LS medium (Millipore) jusqu'a leur remise en culture sur fibroblastes. Les cellules ont été infectées sur la nuit avec 4 virus Sendai codant respectivement pour Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc (CytotuneTM, Life Technologies) a une MOI de 3. Le milieu de culture est changé le lendemain et remplacé par du milieu contenant ou non de la Netrin-1 recombinante a 150 ou 750 ng/mL. Le milieu est ensuite changé chaque jour. 7 jours après l'infection, les cellules sont dissociées avec de la tryple express (Life Technologies), comptées et remises en culture sur des MEF traitées à la mitomycine C (Sigma Aldrich) a une densité cellulaire de 5x10, 1x105 ou 2x105 HFF par plaque. Le jour suivant, le milieu est remplacé par du DMEM/F12 (Life Technologies) supplémenté avec 20% de PluriQTM Serum Replacement (GlobalStem), 0.1 mmol/L acides aminés non essentiels, 1 mmol/L L-glutamine, 0.1 mmol/L 2-mercaptoethanol, penicillin/streptomycin (Life Technologies), 12.5 ng/ml human basic fibroblast growth factor (Milytenyi Biotec) en présence ou non de Nétrin1 recombinante. Le milieu est ensuite changé chaque jour. Au jour 26, des colonies reprogrammées sont piquées manuellement et transférées sur de nouveaux MEF traités à la mitomycine C pour amplification. RNA-Sequencing: La qualité de l'ARN a été analysée en utilisant un Bioanalyser (Agilent). Les bibliothèques ont été construites et séquencées sur un HiSeq de Illumina 2000.35 Formation de tératomes. 5x106 cellules iPS ont été injectées sous les capsules rénales de souris immunodéficientes (SCID) de 7 semaines (CB17/SCID, Charles River). Après 3 semaines, les souris ont été euthanasiées et les tumeurs ont été enlevées chirurgicalement et fixées dans du formol à 4% ou dans de la PFA pour cryosections. La même procédure a été utilisée avec injection de 5x105 cellules iPS dans les testicules. Exemple 1 : étude de l'expression de la nétrine-1 lors du procédé de 10 reprogrammation de cellules somatiques murines. Des fibroblastes embryonnaires murins (MEF) ont été infectés avec des particules rétrovirales codant OSKM pendant 6 jours. L'expression de la nétrine-1, des récepteurs DCC, Unc5B et Unc5C a été mesurée au cours du temps (JO, J2, J4, et J6 pour la Nétrine-1 et DCC, et JO, J3 et J6 pour Unc5B et Unc5c). 15 Les résultats sont représentés sur la figure 1 annexée. Les Q-RTPCR présentent les profils d'expression de Ntn1, Dcc, Unc5B et Unc5C au cours des 6 premiers jours de la reprogrammation cellulaire vers l'état pluripotent et dans des cellules iPS établies. Les données sont normalisées aux gènes de ménage RS17 et L19, représentées de manière relative au niveau d'expression dans les MEF et 20 correspondent à la moyenne ± SEM de 3 expériences indépendantes. Ils montrent une expression bi-phasique de la nétrine-1 avec une forte réduction pendant les 6 premiers jours du procédé de reprogrammation cellulaire suivie d'une réactivation dans les cellules iPS. En parallèle, l'expression du récepteur DCC reste stable (Fig. 1A), alors que celle d'autres récepteurs tels que Unc5B et Unc5C est 25 rapidement réprimée (Fig. 1B). Ainsi, l'expression de Ntn1 est réduite alors que celle de son récepteur Dcc est maintenue dans les phases initiales de la reprogrammation cellulaire. Le même profil d'expression a été observé avec un système Dox-inductible lors de la reprogrammation de MEF (résultats non annexés). 30 Exemple 2: effet de l'inactivation de la nétrine-1 sur l'efficacité de la reprogrammation de cellules somatiques murines L'effet de l'inactivation de l'expression de Ntn1 sur la reprogrammation cellulaire a été analysé par quantification des colonies alkaline phosphatase positives. Des 35 MEF ont été infectés avec des particules lentivirales codant trois shRNA différents qui ciblent Ntn1, deux jours avant la transduction OSKM. Le nombre de colonies produites dans la condition contrôle de MEF infectés par des particules shscrambled est porté à 100% pour chaque expérience. Trois shRNA différents ont été utilisés (Ntn1 sh#1, Ntn1 sh#2 et Ntn1 sh#3). Les données présentées correspondent à la moyenne ± SEM de trois expériences indépendantes réalisées avec des lots de MEF et de particules virales différents. Les résultats sont regroupés sur la figure 2 annexée. Ils montrent que la déplétion en nétrine-1 conduit à une diminution significative de la reprogrammation cellulaire, comme l'indique le nombre de colonies AP-positives.

Exemple 3 : effet de la compensation de la déficience en Ntnl sur la reprogrammation cellulaire Différentes concentrations de Netrin-1 recombinante ont été ajoutées quotidiennement aux cellules (0,15 4/m1; 1 4/m1 et 4 µg/ml) et le nombre de colonies AP positives compté 12-14 jours post-OSKM infection. Les résultats sont regroupés sur la figure 3 annexée. Ils montrent que l'apport exogène de Netrin-1 recombinante améliore l'efficacité de reprogrammation cellulaire de façon dose dépendante ; la dose la plus importante permettant d'augmenter le nombre de colonies AP-positives d'un facteur 4.

Afin d'étudier si la Ntn1 est requise tout au long du procédé de reprogrammation cellulaire, l'effet de traitements séquentiels de Nétrine-1 recombinante sur la reprogrammation cellulaire a été étudié par quantification des colonies AP positives. Le nombre de colonies obtenu sans traitement est porté à 100% pour chaque expérience individuelle. Les données présentées correspondent à la moyenne ± SEM de trois expériences indépendantes. Le student T-test a été utilisé pour les analyses statistiques. Les résultats sont regroupés sur la figure 4 annexée. Ils montrent que l'ajout de Ntn1 recombinante au cours des 7 premiers jours du procédé de reprogrammation cellulaire (d0-7) est suffisant pour conduire à l'effet d'amélioration de la reprogrammation. A l'inverse, le traitement des cellules du jour 7 au jour 14 de la reprogrammation (d7-14) n'a aucun impact positif en termes d'efficacité. Ces résultats démontrent l'impact positif de la présence précoce de Nétrine-1 lors du procédé de reprogrammation de cellules somatiques en iPS, ce qui a été confirmé par les résultats obtenus à partir des mêmes expériences réalisées avec des anticorps bloquant la Ntn1 (Fig. 5). Exemple 4 : étude de l'impact de la diminution d'expression de DCC, plus 5 ou moins Ntnl, lors de la phase précoce de reprogrammation cellulaire L'effet de l'inactivation de l'expression du récepteur DCC a été étudié à l'aide d'une stratégie lentivirale shRNA par quantification des colonies alkaline phosphatase positives (AP-positives), et les résultats sont regroupés sur la figure 6 annexée dans laquelle le nombre de colonies produites dans la condition contrôle de MEF infectés 10 par des particules shscrambled est porté à 100% pour chaque expérience. Trois shRNA différents ont été utilisés (DCC sh#1, DCC sh#2 et DCC sh#3). Les données présentées correspondent à la moyenne ± SEM de trois expériences indépendantes réalisées avec des lots de MEF et de particules virales différents. Les résultats montrent que l'inactivation de DCC améliore la reprogrammation 15 cellulaire (Fig. 6A). De plus, l'effet de l'inactivation de Ntn1 sur la reprogrammation cellulaire est reversé par l'inactivation de Dcc (Fig. 6B), faisant apparaitre le binôme Ntn1/DCC comme un nouveau médiateur clé de la reprogrammation cellulaire des cellules somatiques en iPS. 20 Exemple 5 : utilisation de Ntnl comme facteur soluble pour améliorer la reprogrammation de cellules somatiques murines et humaines en iPS Des clones iPS murins Oct4-GFP dérivés dans des conditions standard (contrôle) ou en présence de 600 ng/ml de Ntn1 pendant les 7 premiers jours de la reprogrammation cellulaire ont été individuellement repiqués et mis en culture. 25 La morphologie et l'activité AP qui a été mesurée sont similaire entre les clones iPS contrôle et en présence de Ntn1 (Fig. 7A), ce qui a été confirmé par l'étroite corrélation révélée par l'analyse de clustering hiérarchical DESeq de cellules MEF Oct4-GFP, pré-iPS, iPS dérivés en condition "contrôle" ou en présence de Nétrine-1 recombinante à deux passages différents : p5 et p25 (Fig. 7B). 30 Les résultats obtenus à l'aide de protocoles de reprogrammation utilisant des facteurs de pluripotence de cellule souche différents, tels que Pou5f1, Sox2, Klf4, Nanog, Fgf4, Esrrb, Utf1 et Dppa3 permettent d'arriver aux mêmes conclusions (résultats non annexés). Après 40 passages en culture, la quantification des altérations 35 chromosomiques majeures n'a révélée aucune différence significative entre les lignées iPS contrôle et dérivées en présence de Ntn1 recombinante, comme le montrent les résultats regroupés sur la figure 8. Par conséquent, la reprogrammation de cellules somatiques murines en iPS en présence de Ntn1 n'a pas d'effet néfaste sur la stabilité chromosomique.

Le potentiel de différenciation des iPS murines dérivées en présence de Ntn1 a été étudiée in vivo par l'analyse histologique de tératomes obtenus à partir de l'injection de cellules iPS dérivées en présence de Nétrine-1 recombinante (Fig. 9) et in vitro par la formation de corps embyoïdes (EB), démontrant l'émergence de dérivés des trois types de feuillets embryonnaires (endoderme, mésoderme et ectoderme) (résultats non annexés). Il a également été confirmé que les cellules iPS murines dérivées en présence de Ntn1 s'intègrent de manière appropriée dans les blastocystes hôtes (résultats non annexés). Enfin, l'effet de la Ntn1 recombinante sur la reprogrammation de fibroblastes humains de prépuce a été analysé après un marquage sur cellules vivantes avec un anticorps dirigé contre SSEA4. Les résultats regroupés sur la figure 10 annexée montrent que le traitement avec la Ntn1 recombinante (0,15 µg/ml) induit une augmentation d'un facteur 15 de l'efficacité de la reprogrammation cellulaire. En conclusion, la reprogrammation de cellules somatiques en iPS réalisée en présence de Nétrine-1 lors des phases précoces du procédé de reprogrammation cellulaire améliore l'efficacité de génération de cellules iPS, en particulier murines et humaines.

Claims (9)

1. REVENDICATIONS1. Procédé de préparation de cellules souches pluripotentes induites (iPS) par culture de cellules somatiques soumises à un procédé de reprogrammation cellulaire, caractérisé en ce que les cellules somatiques sont cultivées en présence de nétrine-1 ou d'un analogue de nétrine-1 au moins en début du procédé de reprogrammation cellulaire.
2. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les cellules somatiques soumises à un procédé de reprogrammation cellulaire sont cultivées dans un milieu de culture comprenant au moins 100 ng/ml de nétrine-1.
3. 3. Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que les cellules somatiques soumises à un procédé de reprogrammation cellulaire sont cultivées au moins pendant les 7 premiers jours à compter de l'initiation du procédé de reprogrammation dans un milieu de culture comprenant la nétrine-1 ou un analogue de nétrine-1.
4. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la nétrine-1 ou l'analogue de nétrine-1 est ajouté dans le milieu de culture chaque jour à une concentration d'au moins 100 ng/ml.
5. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape d'introduction d'un système rapporteur dans les cellules somatiques pour indiquer l'efficacité de la génération et la production des iPS.
6. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le procédé de reprogrammation cellulaire est effectué sans intégration génomique et/ou sans expression d'oncogènes.
7. 7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que les cellules somatiques sont choisies dans le groupe constitué de fibroblastes, des kératinocytes, des cellules T, des hépatocytes, des cellules de cordon ombilical, des cellules adipeuses, et des cellules sanguines.
8. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les cellules somatiques sont des cellules somatiques de mammifères, enparticulier choisi dans le groupe constitué du rat, souris, lapin, cochon, mouton, chèvre, vache, singe et humain, avantageusement sont des cellules somatiques humaines.
9. 9. Utilisation de nétrine-1 ou d'un analogue de nétrine-1 pour préparer des cellules souches pluripotentes induites (iPS) par culture de cellules somatiques soumises à un procédé de reprogrammation cellulaire, en particulier pour améliorer l'efficacité de reprogrammation cellulaire des cellules somatiques en iPS.