CN106459909A - 生产诱导多能细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种生产诱导多能干(iPS)细胞的方法，该方法通过培养经历细胞重编程的体细胞实现，其特征在于所述体细胞是至少在细胞重编程方法开始时有Netrin‑1或Netrin‑1类似物存在的情况下培养的。

Description

生产诱导多能细胞的方法
技术领域
本发明涉及一种生产诱导多能细胞(iPSC)的方法，该方法提高了效率和所得的iPS细胞的同质性。这种提高是通过在细胞重编程过程的初始阶段使用Netrin-1或Netrin-1类似物防止或阻止由Netrin-1的DCC(结肠癌缺陷(Deleted in Colorectal Carcinoma))或UNC5s(UNC5A、UNC5B、UNC5C和UNC5D)受体介导的细胞死亡来实现。
背景技术
目前，很多研究报道显示体细胞可以去分化成为称之为诱导多能干细胞或iPS细胞的细胞，所述细胞表现出和胚胎干细胞相似的特性。
这些诱导多能干细胞(iPS细胞或iPSC)的生成对再生医学来说是非常有前景的。
细胞去分化或重编程方法通常需要一种或多种允许体细胞重编程的关键外源因子的表达，以维持干细胞的多能性。细胞重编程的方法已经在文献中大量记载，通过所述方法在合适培养基中培养体细胞，以使它们通过不同转录因子的表达变成多能的并保持多能性，特别是通过Oct，Sox，Klf和Myc家族因子的表达，更特别地是使用Oct4，Sox2，Klf4和c-Myc混合物或OSKM混合物。
本领域技术人员熟知这些细胞重编程的方法。对于综述，特别提到以下参考文献：Gonzalez等，Nat Rev Genet 2011，12：231-242。
但是，这些方法显示出是随机的而且很少有效，iPSC治疗应用的发展受限于重编程方法的低效和结果的异质性。
通过研究在整个细胞重编程过程中诱导细胞死亡的机制，发明者已经能够证明Netrin-1和它的DCC、UNC5s受体，特别是DCC受体在经该重编程变成iPS细胞的体细胞中具有重要作用。
Netrin-1或Ntn1是一种与层粘连蛋白相关的可扩散分泌蛋白。Netrin-1是DCC(结肠癌缺陷)和UNC5A–D(非配位的(UNCoordinated)5A、B、C和D)受体的配体。历史上，Netrin-1(来自于梵文“引导者”)是以其在靶向脊髓连和神经元轴突中的作用为特征的第一轴突导向因子(Serafini等，1994；Kennedy等，2004；Serafini等，1996)。它在控制轴突导向和神经元迁移中的关键作用，随后在神经系统的其他区域被证实(Moore等，2007)。最近，多篇不同文章已经证实了Netrin-1和它的受体在控制血管生成(Lu等，2004；Park等，2004；Wilson等，2006；Larrivee等，2007；Navankasatussas等，2008；Ahmed等，2010；Epting等，2010)或肿瘤发生(Mazelin等，2004；Fitamant等，2008)中的作用。Netrin-1通过与DCC或UNC5S受体结合可阻断这些非结合的受体的促凋亡作用，这一事实证明了Netrin-1参与肿瘤生成的控制(Mehlen和Goldschneider，Oncogene，2010；Mehlen等，Nature Review Cancer，2011)。
发明内容
本发明的主题是通过培养经历细胞重编程过程的体细胞生产诱导多能干细胞的(iPSC)的方法，其特征在于所述体细胞至少在细胞重编程开始时在有Netrin-1或Netrin-1类似物存在的条件下培养。
本发明的另一个主题是Netrin-1或Netrin-1的类似物通过培养经历细胞重编程过程的体细胞来生产诱导多能干细胞(iPSC)，特别是提高体细胞重编程成iPS细胞的效力的用途。
具体实施方式
本发明并不涉及鉴定将体细胞重编程成iPSC的新系统。本发明涉及通过作用于体细胞的DCC或UNC5s受体与Netrin-1或Netrin-1类似物之间的相互作用，抑制重编程过程诱导的细胞死亡。
发明人已能证明在细胞重编程过程中，Netrin-1的表达迅速减少而它的DCC受体的表达得到保持，这种情况导致了DCC介导的细胞死亡。
因此，本发明的目的是在重编程过程开始时，在Netrin-1的表达减少时，在培养基中补偿这种Netrin-1的减少。
本发明因此涉及在有Netrin-1或Netrin-1类似物存在的培养基中培养处于细胞重编程过程中的体细胞，以防止或阻止在体细胞重编程时由体细胞中的DCC或UNC5s受体介导的细胞死亡。
本发明有易于实施的优势，因为本发明使用可溶分子Netrin-1或Netrin-1类似物——而不需要额外的基因组整合——来防止或阻止由体细胞重编程成iPS细胞过程诱导的细胞死亡。
根据第一方面，本发明因此涉及一种通过培养经历细胞重编程的体细胞生产诱导多能干细胞的(iPSC)体外方法，其特征在于，所述体细胞至少在细胞重编程过程开始时在有Netrin-1或Netrin-1的类似物存在的条件下培养。
本发明因而涵盖一种制备诱导多能干细胞(iPSC)的体外方法，所述方法包括以下步骤：
-培养体细胞；
-使这些细胞在如下培养基中经历细胞重编程过程，即所述培养基至少在重编程过程开始时含有Netrin-1或Netrin-1类似物。
在本发明中，“诱导多能干细胞”或“iPSC”是指，由添加了干细胞多能因子的体细胞经体外细胞重编程得到的细胞。
细胞重编程是指体细胞去分化成为多能干细胞的过程。
发明人已首次证明，Netrin-1的存在提高了体细胞重编程成iPSC的效力。他们还证明，相对于不添加Netrin-1或Netrin-1/DCC相互作用抑制剂的参照过程，阻止或抑制Netrin-1与其DCC受体相互作用会降低体细胞重编程成iPSC的效力。
因而，本发明的实施可以不考虑所用的重编程方法，本发明旨在促进细胞重编程过程中体细胞的存活。
在本发明中，Netrin-1优选地指人Netrin-1，特别是指对应于如下604个氨基酸的序列如于2006年11月17日存入Genbank库中编号为NP_004813的序列的多肽，或是指其对应于该序列氨基酸25-604的成熟形式。
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本发明也包括经少量修改如保守替换的Ntn1氨基酸序列、604个氨基酸(aa)的前体或成熟形式(aa25-aa604)的用途，只要这些修改不显著影响Netrin-1防止或阻止由Netrin-1受体特别是DCC诱发的细胞死亡中所起的作用。
至少在细胞重编程过程开始时，包含于培养基中的Netrin-1可以是天然的或重组的，优选为重组的。有利地，培养基中包含购自Adipogen的重组Netrin-1(ref:AG–40B–0040–0000)。
Netrin-1可以直接加入培养基中，或由过表达编码Netrin-1的基因并在重编程过程中与体细胞共同培养的细胞来产生。Netrin-1也可以由体细胞自身表达，特别是通过转染。
类似地，正如以上对Netrin-1的描述，Netrin-1的类似物可以直接存在于培养基中或由细胞产生。Netrin-1的类似物是指可以模拟Netrin-1生物活性的任何物质，也就是能够应用Netrin-1生物活性的任何物质，优选为能够防止或阻止由DCC或UNC5s受体，尤其是DCC受体诱发的细胞死亡的任何物质。这些类似物因而是能够例如附着于DCC或UNC5s受体，或能够诱导这些受体特别是DCC寡聚化，和能阻止诱发由这些受体介导的细胞死亡的Netrin-1激动剂。这些类似物可以通过使用本领域技术人员所知的并能测定一种物质附着于DCC或UNC5s受体的能力的任何方法来选择，所述方法具体而言可能包括ELISA类的免疫酶测定。这些类似物也可以通过使用任何能检测一种物质抑制Netrin-1附着于DCC受体或UNC5s受体的能力的方法来选择，优选竞争性或非竞争性地抑制Netrin-1与这些受体的结合，更优选它们竞争性抑制Netrin-1与这些受体结合的能力。这些类似物可通过使用能测定一种物质防止或阻止由DCC或UNC5s受体诱发的细胞死亡的能力的任何方法来进一步选择，，这类方法的实例在本专利申请中有阐述。在Netrin-1类似物的实例中，可特别提到DCC或UNC5s受体的激动剂抗体，能够防止或阻止由DCC或UNC5s介导的细胞死亡的Netrin-1多肽片断。在本发明所述的方法中，经历细胞重编程的体细胞的培养基因而可包含一个或多个的Netrin-1片断，特别是2006年11月17日存入Genbank库编号为NP_004813的氨基酸序列的片断，条件是这个或这些片段保留了抑制或阻止由这些受体特别是DCC介导的细胞死亡的性质。在这些片断中，那些具有至少30氨基酸，或至少40个氨基酸，或至少50个氨基酸，或至少60个氨基酸的片段被特别引用。
能测定抑制DCC或UNC5s介导的细胞死亡的方法是本领域技术人员所熟知的。
特别有利地，Netrin-1或Netrin-1类似物被直接添加到培养基中。
Netrin-1的加入对方法效力的影响取决于所加的剂量，剂量越高得到的效果越好。在发明人所做的试验中，Netrin-1的浓度为900ng/ml时取得的效果最好。关于Netrin-1或Netrin-1类似物的加入量，兼顾提高的效力和方法的成本，选择Netrin-1或Netrin-1类似物最适合所实施方法的浓度是本领域技术人员力所能及的。
有利地，培养基中所含的Netrin-1浓度至少为100ng/ml,优选为150ng/ml或更高。
当使用的是Netrin-1类似物时，本领域技术人员能够选择适量的这种类似物以得到和Netrin-1一样的效力。
在重编程过程中，自重编程过程开始(D0)起至少前7天Netrin-1或Netrin-1类似物有利地包含于体细胞培养基中。发明人特别表明，不需要延长Netrin-1的存在时间使其超出这一期间，因为这对于有效地重编程成iPS细胞并没有额外的好处。
关于添加Netrin-1或Netrin-1类似物到培养基所用的模式，考虑到在所用培养基中Netrin-1或Netrin-1类似物的稳定性和可利用性，本领域技术人员将有能力调整添加的频率。有利地，当直接添加Netrin-1至培养基时，尤其是在重编程过程中每当需要更换培养基时，每天添加Netrin-1，特别以至少100ng/ml的浓度添加。
本发明的实施可不考虑所用的细胞重编程过程。
所用的重编程过程可以包括一个或多个选自Oct、Sox、Klf和Myc的干细胞多能因子在体细胞中表达。
有利地，本发明在如下重编程过程中实施，所述重编程过程包含被称之为OSKM混合物的Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc转录因子的表达甚至由其组成，这是本领域技术人员目前最常使用的过程。
这些干细胞多能因子可以通过不同的技术，诸如病毒感染、转染特别是使用脂质体转染、电穿孔、膜蛋白质渗透等，在体细胞中表达。
有利地，这些干细胞多能因子通过体细胞的病毒感染步骤添加，所使用的病毒允许编码这些因子的核酸序列表达，并特别地选自慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、仙台病毒。这些方法为本领域技术人员所熟知并具体记载于Gonzalez等，Nat Rev Genet 2011，12：231-242；Zhou等，Stem Cells 2009，27：2667-2674；Weltner等，J Virol 2012，86：4463-4467；Fusaki等，Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci 2009，85:348-362；Nishimura等，J BiolChem 2011，286：4760-4771。
本发明所述的方法可进一步包括向体细胞添加报告系统以指示iPS细胞生成和生产的效力，所述系统特别地选自荧光系统如GFP、比色系统、抗生素抗性系统等。
根据一个特别优选的实施方案，通过在没有基因组整合和/或没有癌基因的表达条件下进行重编程过程来实施本发明。
在本发明的方法中，可以将不同类型的体细胞重编程成为iPSC，特别是成纤维细胞、角质形成细胞、T细胞、肝细胞、脐带细胞、脂肪细胞、肠细胞和血细胞，有利地是成纤维细胞。
本发明特别应用于制备哺乳动物iPSC。因而本发明方法中所用的体细胞可以选自大鼠、小鼠、兔、猪、绵羊、山羊、牛、猴和人。有利地，所用的体细胞是人的体细胞，特别地是人成纤维细胞。根据一个特别的方面，所用的体细胞是人肠上皮细胞。
根据第二个方面，本发明还涉及使用Netrin-1或Netrin-1类似物通过培养经历细胞重编程过程的体细胞来制备诱导多能干细胞(iPSC)，特别来提高体细胞重编程成iPSC的效力。
上述提到的所有关于iPSC生产方法的具体和有利的实施方案也是Netrin-1或Netrin-1类似物用于生产iPSC的用途的有利实施方案。
附图说明
图1示出了在MEF(小鼠胚胎成纤维细胞)重编程过程中，感染编码OSKM的逆转录病毒颗粒后第0、2、4、6天，Netrin-1和它的DCC受体(图1A)以及它的UNC5B和UNC5C受体的表达水平(图1B)。
图2示出了Netrin-1表达的失活对感染了OSKM慢病毒颗粒的MEF重编程的影响(图2A)和对由多西环素处理引起重编程的肠上皮细胞重编程的影响(图2B)。
图3示出了增加Ntn1的剂量对细胞重编程效力的影响(图3A)和对由多西环素处理引起重编程的肠上皮细胞重编程的影响(图3B)。
图4示出了连续添加Ntn1对细胞重编程效力的影响(D0-7：前7天；D7-14:从第7天到第14天；D0-14：前14天)。
图5示出了Ntn1阻断抗体对细胞重编程效力的影响(D0-7：前7天；D7-14:从第7天到第14天；D0-14：前14天)。
图6示出了DCC受体表达的失活(A)和Ntn1表达的失活化(B)对细胞重编程效力的影响。
图7示出了在“对照”条件下或有重组Netrin-1存在的条件下，得到的iPS细胞克隆的碱性磷酸酶活性(A)和DESeq分层聚类分析(B)。
图8示出了对照iPSC系(白色柱状图)和在Ntn1存在下的衍生物(黑色柱状图)的主要染色体紊乱的分析。
图9示出了体内注射在Ntn1存在下得到的iPSC克隆所诱导的畸胎瘤的组织学分析(标尺：100μm)。
图10示出了相对于对照(白色柱状图)，重组Netrin-1(黑色柱状图)对来自于如下人包皮成纤维细胞的阳性SSEA4集落出现的影响，所述人包皮成纤维细胞在感染7天后被放置在用丝裂霉素C处理的成纤维细胞中培养(标尺相当于200μm)。
实施例
细胞培养和RNAi试验：
小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)来自不同品系的E13.5的胚胎。按照先前所述的方式在辐照的MEF或明胶上培养pre-iPS、iPS和ES细胞。在添加了10％FCS和青霉素/链霉素的DMEM中培养293T和plat-E细胞。在KSR+LIF或KSR 2i+LIF培养基中培养iPS细胞。shRNA试验使用Sigma的pLKO.1载体和siRNA(针对Ntn1的SHCLNG–NM_008744，针对Dcc的SHCLNG–NM_007831和针对Mbd3的EMU022741)进行。
抗体：
本试验中用于免疫荧光测定和FACS的抗体如下：抗-Oct4(Santa Cruz，C10)，抗-Netrin-1(R&D Systems，mab1109)，抗-thy1(Ebiosciences，53-2.1)，抗-SSEA1(干细胞技术公司(Stem cell technologies)，60060PE)和NL493缀合抗SSEA抗体(R&D SystemsSC023)。
重组Netrin-1：
使用的重组Netrin-1可以从Adipogen购得(编号:AG–40B–0040–0000)。
逆转录病毒和慢病毒生产
如发明人先前所述，plat–E细胞用于产生来自于PMX-s载体的逆转录病毒颗粒，所述PMX-s载体编码Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的cDNA。编码mCherry的病毒颗粒用来监测MEF感染的效力。293T细胞用于生产慢病毒颗粒。
小鼠iPS细胞的生成
MEF细胞在6孔培养皿中传代。12小时之后，在浓度为8μg/ml的聚凝胺存在下，用等量的每种逆转录病毒颗粒感染这些细胞。感染24小时后，更换培养基，感染48小时之后，收集MEF，换成用用于iPS细胞的培养基在辐照的成纤维细胞上培养。培养基每天用新的培养基更换，感染后12-14天，对出现的集落计数并收集。分离肠上皮，将上皮碎片置于辐照的饲养细胞层上培养。因为使用的是具有Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc重编程因子可诱导表达盒的小鼠，这里的多能重编程过程是用多西环素处理细胞(2μg/ml，持续14天)来诱导的。
人iPS细胞的生成
使用5x105人包皮细胞(HFF，Millipore)进行该试验，将所述人包皮细胞置于6孔培养板中的一个孔中在FibroGROTM-LS培养基(Millipore)中培养，直到换成在成纤维细胞上培养。用分别编码Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的4种仙台病毒(CytotuneTM，生命科技公司(Life Technologies))过夜感染这些细胞，感染复数为3。第二天更换培养基，替换为含有或不含有150或 750ng/mL的重组Netrin-1的培养基。随后培养基每天更换。感染7天后，用TrypLE Express(生命科技公司)分离细胞，计数，然后换成在丝裂霉素C(Sigma Aldrich)处理过的MEF上培养，细胞密度为5x10，1x105或2x105HFF/板。第二天培养基换为DMEM/F12(生命科技公司)，所述DMEM/F12添加了20％PluriQTM血清替代物(GlobalStem)、0.1mmol/L非必需氨基酸、1mmol/L L-谷氨酰胺、0.1mmol/L 2-巯基乙醇、青霉素/链霉素(生命科技公司)、12.5ng/ml人碱性成纤维细胞生长因子(Milytenyi Biotec)，含有或不含有重组Netrin-1。此后培养基每天更换。在第26天重编程集落进行手动传代培养，并转移至丝裂霉素C处理过的新的MEF进行扩增。
RNA测序
使用Bioanalyser(Agilent)分析RNA特性。在Illumina HiSeq 2000上构建文库并测序。
畸胎瘤的形成
将5x106iPS细胞注射至7周龄免疫缺陷小鼠(SCID)(CB17/SCID，Charles River)的肾被膜下方。3周以后，将小鼠安乐死，通过外科手术移除肿瘤并在4％的福尔马林或PFA中固定以冰冻切片。使用相同的步骤在睾丸中注射5x105iPS细胞。
实施例1：鼠体细胞重编程过程中Netrin-1的表达研究
用编码OSKM的逆转录病毒颗粒感染鼠胚胎成纤维细胞(MEF)6天。随时间测量Netrin-1以及DCC、UNC5B和UNC5C受体的表达(Netrin-1和DCC是在D0、D2、D4和D6测量，UNC5B和UNC5C是在D0、D3和D6测量)。
结果如附图1所示。q-RTPCR分析显示了细胞重编程成多能状态前6天以及在确立的iPS细胞中的Ntn1、DCC、UNC5B和UNC5C的表达谱。这些数据用RS17和L19管家基因归一化，表示为相对于MEF中的表达水平，相当于3个独立测试的平均值±SEM。
它们显示出细胞重编程过程的前6天，Netrin-1的两相表达显著减小，随后是在iPS细胞中的重新活化。并行地，DCC受体的表达保持稳定(图1A)，然而其他受体如UNC5B和UNC5C受体的表达迅速受到抑制(图1B)。因此在细胞重编程的初始阶段Ntn1的表达减少，而它的DCC受体的表达得到保持。
多西环素(Dox)-诱导系统在MEF重编程期间也观察到了相同的表达谱(结果未附)。
实施例2：Netrin-1的失活对重编程鼠体细胞效力的影响
Ntn1的表达失活对细胞重编程的影响可以通过量化阳性碱性磷酸酶集落或阳性Nanog来分析。阳性AP细胞通过表明细胞酶活性的测试来表征。阳性Nanog细胞通过使用Nanog特异性抗体进行的免疫荧光法来表征。在OSKM转导前两天，用编码靶向Ntn1的三种不同shRNA的慢病毒颗粒感染MEF。每个实验对照MEF产生的集落数为100％，所述对照MEF用包含不靶向Netrin-1的对照shRNAs的shscrambled颗粒感染。使用的是三种不同的shRNA(Ntn1sh#1、Ntn1sh#2和Ntn1sh#3)。给出的数据相当于使用不同批次的MEF和病毒颗粒进行的三个独立的测试的平均值±SEM。
结果集中列于附图2。它们显示出Netrin-1的消耗导致细胞重编程显著减少，正如鼠胚胎成纤维细胞的AP阳性集落的数目所显示的那样(图2A)。
使用另一类体细胞——肠上皮细胞得到了相似的结果(图2B)。
实施例3：Ntn-1缺乏的补偿对细胞重编程的影响
每天添加不同浓度的重组Netrin-1至细胞(0.15μg/ml；1μg/ml和4μg/ml)，在感染OSKM后12-14天对阳性AP集落进行计数。
结果集中列于附图3。它们显示出重组Netrin-1的外部供给以剂量依赖方式提高细胞重编程的效力；最高的剂量使鼠胚胎成纤维细胞的AP-阳性集落的数目增长了4倍(图3A)。
使用另一类体细胞——肠上皮细胞，得到了相似的结果(图3B)。
为了检测是否在细胞重编程的整个过程中都需要Ntn1，通过量化AP阳性集落来检测重组Netrin-1的连续处理对细胞重编程的影响。对每一个单独的测试，没经处理的得到的集落数目为100％。所给数据相当于三个独立实验的平均值±SEM。用T检验(Student’s Ttest)检验进行统计分析。
结果集中列于附图4中。它们显示出，在细胞重编程过程的前7天(D0-7)添加重组Ntn1足以得到促进重编程的效果。相反，从重编程的第7天到第14天(D7-D14)，对细胞的处理没有对效力产生积极的影响。
这些结果表明，在体细胞重编程成iPS细胞过程中Netrin-1的早期存在具有积极影响，用Ntn-1阻断抗体进行相同的实验得到的结果证实这一点(图5)。
实施例4：细胞重编程初期阶段有较多或较少的Ntn1时DCC表达减少的影响研究
使用shRNA慢病毒方法通过量化阳性碱性磷酸酶集落(AP阳性)检测了DCC受体表达失活的影响；结果集中列于附图6中，其中每一个实验，在对照条件下在感染shscrambled颗粒的MEF中产生的集落数量为100％。使用了三种不同的shRNA(DCC sh#1、DCC sh#2和DCCsh#3)。所给的数据相当于使用不同批次MEF和病毒颗粒进行的三个独立实验的平均值±SEM。
结果显示，DCC的失活促进了细胞重编程(图6A)。另外，Ntn1失活对细胞重编程的影响被DCC的失活逆转(图6B)，表明Ntn1/DCC对是体细胞重编程成为iPS细胞的新的关键介质。
实施例5：Ntn1作为可溶因子用于促进鼠和人的体细胞重编程成为iPSC的应用
将标准条件(对照)下或细胞重编程前7天存在600ng/ml Ntn1的条件下产生的鼠Oct4-GFP iPSC克隆分别传代并放置培养。
对照iPSC克隆和有Ntn1存在时测得的AP形态和活性是相似的(图7A)，这通过MEFOct4–GFP、pre–iPS和iPS细胞的DESeq分层聚类分析所揭示的密切联系得到证实，上述MEFOct4-GFP、pre-iPS和iPS细胞来自“对照”条件或在有重组Netrin-1存在的条件下的两个不同传代：p5和p25(图7B)。
使用不同干细胞多能因子如Pou5f1、Sox2、Klf4、Nanog、Fgf4、Esrrb、Utf1和Dppa3进行的重编程实验方案所得的结果得出了相同的结论(结果未附)。
在培养传代40代之后，主要染色体紊乱的量化并没有揭示在对照iPSC细胞系和那些在重组Ntn1存在下得到的细胞系之间有显著性差异，如图8集中的结果所示。
因此在Ntn1存在下将鼠体细胞重编程成iPS细胞并没有给染色体稳定性带来不良影响。
在Ntn1存在下得到的鼠iPSC的分化潜能，通过如下畸胎瘤的组织学分析进行体内检测(图9)，所述畸胎瘤通过注射在重组Netrin-1存在下产生的iPSCs获得，并通过类胚体(EB)的形成进行体外检测，检测表明出现了三种胚层(内胚层、中胚层、外胚层)衍生物(结果未附)。这也证实了Ntn1存在下得到的鼠iPS细胞适当地整合到了宿主胚泡中(结果未附)。
最后在用针对SSEA4的抗体标记活细胞之后，分析重组Ntn1对人包皮成纤维细胞重编程的影响。结果集中列于附图10，结果显示使用重组Ntn1(0.15μg/ml)处理引起细胞重编程的效力增长15倍。
综上所述，在细胞重编程过程的早期有Netrin-1存在时将体细胞重编程成iPS细胞，提高了iPS细胞生成的效力，特别是鼠和人的细胞。

Claims (13)

1.一种通过培养经历细胞重编程过程的体细胞生产诱导多能干细胞(iPSC)的方法，其特征在于，所述体细胞是至少在细胞重编程过程开始时有Netrin-1或Netrin-1类似物存在的条件下培养的，所述Netrin-1类似物能够模拟Netrin-1的生物活性。
2.根据权利要求1所述生产诱导多能干细胞(iPSC)的方法，其特征在于，所述Netrin-1类似物选自DCC或UNC5s受体的激动剂抗体和能够防止或阻止由DCC或UNC5s介导的细胞死亡的Netrin-1的多肽片断。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述经历细胞重编程过程的体细胞在含有至少100ng/ml Netrin-1的培养基中培养。
4.根据权利要求1-3之一所述的方法，其特征在于，所述经历细胞重编程过程的体细胞自重编程过程开始起至少前7天在含有Netrin-1或Netrin-1类似物的培养基中培养。
5.根据前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，Netrin-1或Netrin-1类似物每天以至少100ng/ml的浓度添加至培养基。
6.根据前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述重编程过程包括一种或多种干细胞多能因子在体细胞中的表达，所述干细胞多能因子选自Oct、Sox、Klf和c–Myc。
7.根据前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述重编程过程包括Oct4、Sox2、Klf4和c–Myc转录因子的表达。
8.根据前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括添加报告系统至体细胞以指示iPS细胞生成和生产效力的步骤。
9.根据前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述细胞重编程过程在没有基因组整合和/或没有癌基因的表达条件下进行。
10.根据前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述体细胞选自成纤维细胞、角质形成细胞、T细胞、肝细胞、脐带细胞、脂肪细胞、肠细胞和血细胞。
11.根据前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述体细胞为哺乳动物的体细胞，特别为选自大鼠、小鼠、兔、猪、绵羊、山羊、牛、猴和人的哺乳动物，有利地是人的体细胞。
12.Netrin-1或Netrin-1类似物的用途，用于通过培养经历细胞重编程过程的体细胞来制备诱导多能干细胞(iPSC)，特别是提高体细胞重编程成iPS细胞的效力。
13.根据权利要求12所述的用途，其特征在于，所述Netrin-1类似物选自DCC或UNC5s受体的激动剂抗体和能够防止或阻止由DCC或UNC5s介导的细胞死亡的Netrin-1多肽片断。
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