FR3003269A1 - Methode de culture et de selection de microorganismes et installation de mise en oeuvre - Google Patents

Abstract

L'invention concerne une méthode et une installation de sélection de microorganismes du type comprenant les étapes suivantes : a) on fournit une population de microorganismes présentant une pluralité de types de microorganismes ; b) on fournit une substance aqueuse liquide pour recevoir ladite population de microorganismes ; c) on introduit un milieu de culture déterminé à l'intérieur de ladite substance aqueuse liquide ; d) on promeut la multiplication des microorganismes de l'un desdits types, adaptés audit milieu de culture déterminé. On fournit en outre une autre substance liquide non miscible avec ladite une substance aqueuse liquide ; et entre l'étape c) et l'étape d), on injecte l'une dans l'autre, selon une étape c'), ladite une substance aqueuse liquide et ladite autre substance liquide de manière à disperser, dans ladite autre substance liquide, des gouttelettes de substance aqueuse contenant sensiblement en moyenne un seul microorganisme.

Description

032 6 9 1 Méthode de culture et de sélection de microorganismes et installation de mise en oeuvre La présente invention se rapporte à une méthode de culture et de sélection de microorganismes et à une installation permettant de la mettre en oeuvre. Un domaine d'application envisagé est notamment, mais non exclusivement, celui de la sélection de microorganismes aptes à transformer des matières végétales en composés directement utilisables à des fins énergétiques ou chimiques. On entend par microorganisme, un organisme vivant d'une taille inférieure à 1000 pm, généralement inférieure à 100 pm et plus précisément compris entre 1 pm et 10 pm. Relèvent de cette catégorie, par exemple, les bactéries, les archéobactéries, les cyanobactéries, les levures, les micro-algues, les champignons microscopiques et les protozoaires. Ces microorganismes peuvent présenter une seule cellule, ils sont qualifiés d'unicellulaires, ou un petit nombre de cellules et ils sont alors qualifiés de pluricellulaires. Les cultures de microorganismes dans des réacteurs industriels, ont pour objectif par exemple, de leur faire produire des composés ou des substances d'intérêt, tels des composés chimiques ou pharmaceutiques par exemple. Les cultures permettent également de sélectionner certains variants ou certains types de microorganismes au sein de populations comprenant une diversité de microorganismes, et ce dans un environnement donné. Pour ce faire, on choisit un milieu de culture que l'on souhaite voir transformer par la population de microorganismes, et on identifie les microorganismes les plus adaptés à cette transformation pour les récupérer et les utiliser ensuite à cette fin. La culture des microorganismes est bien connue. On pourra se référer au document : « La technique de la culture continue - Théorie et application » de Jacques Monod, 1950, Ann. Inst. Pasteur 79:390-410, dans lequel il est décrit la mise en oeuvre d'un bioréacteur, ou chemostat, pour mettre en oeuvre ce type de culture. Un chemostat comporte une cuve présentant une entrée et une sortie et à l'intérieur duquel on introduit une population de microorganismes. On introduit en continu à l'entrée de la cuve dans une phase aqueuse, le milieu de culture, tandis qu'en sortie, la phase aqueuse est évacuée de manière à conserver un volume constant à l'intérieur de la cuve. Les microorganismes évoluent ainsi dans un environnement chimique stationnaire. En effet, en ajustant les débits d'entrée et de sortie, des paramètres du milieu, tels les concentrations en oxygène et en dioxyde de carbone dissous, les concentrations en substrats et en produits métaboliques, les concentrations en oligo-éléments, le pH, la température, ou encore la densité cellulaire, peuvent être maintenus constants, malgré la modification continue dudit milieu due à l'activité du microorganisme. Partant, la vitesse de croissance du microorganisme peut être contrôlée. Grâce au chemostat, les microorganismes peuvent croitre à un état d'équilibre physiologique, dans lequel leur vitesse de reproduction est constante. Il est également possible en contrôlant le débit du chemostat de s'assurer que les seuls microorganismes conservés dans la culture sont ceux dont la vitesse de croissance est la plus rapide, et ainsi de les sélectionner. Les organismes présentant une vitesse de croissance plus lente sont alors évacués avec la phase aqueuse en sortie de cuve. Ainsi, la majorité des microorganismes cultivés, le sont dans une phase de croissance dite exponentielle, et par conséquent avec la meilleure productivité.

Toutefois, cette technique de culture présente certaines limitations. En effet, lorsque la période de culture est relativement longue, il se crée des biofilms à l'intérieur de la cuve, ce qui est préjudiciable à la multiplication des microorganismes. Une autre limitation est liée à la migration verticale des microorganismes au sein de la cuve, en réponse à des anisotropies de répartition des éléments du milieu de culture. Encore une autre limitation est liée aux phénomènes de diffusion au sein de la cuve. Ceci peut concerner de nombreux types de composé en fonction du type de microorganismes cultivés. Il en va notamment des molécules assurant une forme de communication entre les microorganismes, ou des molécules promouvant ou bien inhibant la croissance des cellules. Il en va également des molécules toxiques pouvant causer la mort des microorganismes ou encore des molécules issues de l'activité métabolique des cellules. Par exemple, s'agissant des composés aptes à promouvoir la croissance des microorganismes, lorsque ceux-ci sont portés dans un milieu comprenant de la cellulose, ils vont secréter des enzymes cellulases qui dépolymérisent la cellulose en glucose. Partant, les microorganismes qui ne secrètent pas de cellulases, ou très peu, vont bénéficier de l'activité métabolique de celles qui en fabriquent beaucoup grâce à la diffusion du glucose dans le milieu de culture. Ainsi, en l'absence d'autre source de carbone, il sera impossible de différencier et de sélectionner les microorganismes les plus performants pour la sécrétion de cellulases efficaces à la transformation de la cellulose. Aussi, un problème qui se pose et que vise à résoudre la présente invention est de proposer une méthode de sélection des microorganismes qui permette non seulement de s'affranchir de l'effet des biofilms et de l'anisotropie de répartition des éléments du milieu nutritif, mais aussi qui permette, de s'affranchir du phénomène d'alimentation croisée précité, ou « cross-feeding » en langue anglaise.

Dans ce but, et selon un premier objet, la présente invention propose une méthode de sélection de microorganismes du type comprenant les étapes suivantes : a) on fournit une population de microorganismes présentant une pluralité de types de microorganismes ; b) on fournit une substance aqueuse liquide pour recevoir ladite population de microorganismes ; c) on introduit un milieu de culture déterminé à l'intérieur de ladite substance aqueuse liquide ; d) on promeut la multiplication des microorganismes de l'un desdits types, adaptés audit milieu de culture déterminé ; et, selon l'invention on fournit en outre une autre substance liquide non miscible avec ladite une substance aqueuse liquide ; et entre l'étape c) et l'étape d), on injecte l'une dans l'autre, selon une étape c'), ladite une substance aqueuse liquide et ladite autre substance liquide de manière à disperser, dans ladite autre substance liquide, des gouttelettes de substance aqueuse contenant sensiblement en moyenne un seul microorganisme, pour pouvoir promouvoir la multiplication dudit seul microorganisme de chacune desdites gouttelettes contenant un microorganisme dudit un desdits types. Ainsi, une caractéristique de l'invention réside dans la mise en oeuvre de deux phases liquides non miscibles l'une dans l'autre, une substance aqueuse liquide et par exemple une substance huileuse, et en réalisant une émulsion inverse, eau dans l'huile, dans laquelle les gouttelettes de substance aqueuse liquide comprennent, en moyenne, un seul microorganisme. Pour ce faire les deux substances liquides sont injectées l'une dans l'autre. En outre, on incorpore avantageusement dans ladite autre substance liquide, des émulsifiants de manière à stabiliser l'émulsion. De la sorte, les gouttelettes sont stables et étanches les unes vis-à-vis des autres et le métabolisme du seul microorganisme emprisonné dans chaque gouttelette ne pourra pas interférer avec celui des gouttelettes voisines. En conséquence, si un type de microorganismes est mieux adapté au milieu de culture déterminé l'environnant dans la gouttelette, il va pouvoir se multiplier préférentiellement par rapport aux autres types de microorganismes moins adaptés au milieu, des autres gouttelettes. Au surplus, les phénomènes de biofilms et d'anisotropie des éléments de milieux de culture, n'apparaissent pas à l'intérieur de chacune des gouttelettes. On met en oeuvre une population de microorganismes présentant une pluralité de types de microorganismes, c'est-à-dire, aussi bien une population diversifiée de microorganismes incluant plusieurs espèces, qu'une population comportant une seule espèce présentant une diversité génétique. Celle-ci peut être d'origine naturelle ou provenir de microorganismes génétiquement modifiés. Parmi les microorganismes, on citera, les bactéries, levures champignons microscopiques et microalgues utilisables, et par exemple des recombinants d'Escherichia coli ou Saccharomyces cerevisiae, ainsi que de nombreuses autres espèces.

S'agissant du milieu de culture, il est choisi en fonction des microorganismes et du but recherché. Il peut par exemple contenir, comme seule source de carbone ou comme seule source d'azote, un composant dont on souhaite la dégradation par les microorganismes, tel qu'un polluant ou un polymère à décomposer. On citera par exemple la cellulose, l'hémicellulose, la lignine, un polymère synthétique comme le polyéthylène, le poly(téréphtalate d'éthylène) ou encore le polychlorure de vinyle. Ladite autre substance liquide non miscible avec ladite une substance aqueuse liquide est par exemple, une huile végétale ou bien une huile minérale, une huile perfluorocarbonée ou une huile silicone. Elle est en outre additionnée d'agents émulsifiants tels que, par exemple, des surfactants ou tensioactifs pour stabiliser l'émulsion inverse. Selon une caractéristique de l'invention particulièrement avantageuse, on récupère selon une étape e), les microorganismes de chacune desdites gouttelettes après l'étape d) pour fournir ladite population de microorganismes à ladite étape a). Ainsi, après un premier cycle d'enchaînement des étapes a) à d) incluant l'étape c'), on récupère l'ensemble des microorganismes logés à l'intérieur des gouttelettes. Parmi l'ensemble des gouttelettes, certaines gouttelettes pour lesquelles le type de microorganismes était peu ou pas adapté au milieu de culture, contiennent le seul microorganisme initialement inséré à l'intérieur, et qui n'a pas subi de division, tandis que d'autres gouttelettes contiennent une multiplication de microorganismes adaptés au milieu de culture. De la sorte, proportionnellement, les microorganismes récupérés dans les gouttelettes constituent une population enrichie en microorganismes adaptés au milieu de culture déterminé. Cette population de microorganismes enrichis en microorganismes dudit un desdits types, peut par conséquent être mise en oeuvre dans un deuxième cycle d'enchaînement des étapes b) à d) de manière à pouvoir l'enrichir plus encore. Ainsi, on répète n fois les étapes b), c), c'), d) et e) de manière à enrichir la population de microorganismes récupérés en microorganisme dudit un desdits types. De préférence n est supérieur à dix. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, on réalise, à l'issue d'un cycle, des opérations complémentaires sur les microorganismes ou leur matériel génétique. Par exemple, on fait pousser les microorganismes dans un milieu liquide ou sur un milieu solide, sélectif ou non. On peut également introduire des mutations, ou des recombinaisons génétiques au sein du matériel génétique des microorganismes afin d'augmenter la diversité génétique au sein de la population de microorganismes avant de la soumettre à un nouveau cycle. Préférentiellement, on trie les gouttelettes en fonction de leur taille selon une étape d') comprise entre l'étape d) et l'étape e). En effet, l'activité des microorganismes, si elle a lieu, tend à provoquer une variation, par exemple, une diminution de la taille des gouttelettes, notamment pour des raisons osmotiques. De la sorte, on peut trier les petites gouttelettes par rapport aux plus grosses, de manière à retenir les gouttelettes dans lesquelles les microorganismes sont les plus actifs vis-à-vis du milieu de culture déterminé.

On expliquera plus en détail dans la suite de la description, les modes de trie des gouttelettes par leur taille. En outre, selon un mode de mise en oeuvre particulier de l'invention, on centrifuge lesdites gouttelettes de substance aqueuse dispersées dans ladite autre substance liquide pour récupérer lesdits microorganismes. La centrifugation permet d'abord de séparer les phases liquides aqueuses et huileuses puis ensuite les microorganismes. Ce sont les microorganismes ainsi récupérés qui sont mis en oeuvre dans le cycle d'enchaînement des étapes b) à d). De plus, selon encore une autre caractéristique de l'invention particulièrement avantageuse, à l'étape c'), on injecte en continu l'une dans l'autre ladite une substance aqueuse liquide et ladite autre substance liquide. De la sorte, on produit en continu des gouttelettes, contenant chacune un microorganisme en moyenne et de la sorte, un grand nombre de types de microorganismes peut être traité simultanément ce qui permet d'augmenter les chances de sélection d'un microorganisme performant et adapté au milieu de culture déterminé. De préférence, à l'étape c'), on forme un premier écoulement de ladite substance aqueuse liquide et un second écoulement de ladite autre substance liquide, et en ce qu'on croise les premier et second écoulements pour injecter ladite une substance aqueuse liquide et ladite autre substance liquide l'une dans l'autre. Ainsi, les gouttelettes se forment naturellement au croisement des deux écoulements. On expliquera ci-après dans la description détaillée, quelles sont les conditions de pression et de débit des deux écoulements permettant d'obtenir des gouttelettes stables et ne renfermant en moyenne qu'un seul microorganisme. Selon une variante d'exécution particulièrement avantageuse on installe une paroi poreuse au croisement desdits premier et second écoulements. Ainsi, la paroi poreuse sépare les deux écoulements et on exerce une pression sur ladite une substance aqueuse liquide pour qu'elle traverse ladite paroi poreuse, de manière à former des gouttelettes de substance aqueuse liquide de l'autre côté de la paroi poreuse dans ladite autre substance liquide. On expliquera plus en détail dans la suite de la description le mode de mise en oeuvre de cette variante d'exécution. Selon une autre variante d'exécution particulièrement avantageuse, on divise ledit second écoulement de ladite autre substance liquide en deux demi-écoulements symétriques l'un de l'autre par rapport audit premier écoulement. Selon un autre objet, la présente invention propose une installation de sélection de microorganismes comprenant une chambre de maturation pour recevoir un milieu de culture déterminé et une substance aqueuse liquide contenant une population de microorganismes présentant une pluralité de types de microorganismes, de manière à pouvoir promouvoir la multiplication des microorganismes de l'un desdits types, adaptés audit milieu de culture déterminé. L'installation comprend en outre une chambre d'injection débouchant dans ladite chambre de maturation, pour pouvoir injecter simultanément, d'une part ledit milieu de culture déterminé et ladite substance aqueuse liquide, et d'autre part, une autre substance liquide non miscible avec ladite une substance aqueuse liquide, de manière à disperser dans ladite autre substance liquide, des gouttelettes de substance aqueuse contenant sensiblement en moyenne un seul microorganisme, pour pouvoir promouvoir la multiplication dudit seul microorganisme de chacune desdites gouttelettes contenant un microorganisme dudit un desdits types. Ainsi, une caractéristique de l'invention réside ici dans la mise en oeuvre d'une chambre d'injection en amont de la chambre de maturation de manière à pouvoir former les gouttelettes de substance aqueuse renfermant un seul microorganisme et du milieu du culture pour les faire cheminer ensuite à l'intérieur de la chambre de maturation. On observera que les gouttelettes sont formées dès après que le milieu de culture et la substance aqueuse liquide renfermant les microorganismes ont été mélangés de manière à ce que leur métabolisme vis-à-vis du milieu de culture ne démarre qu'une fois qu'ils ont été isolés.

Avantageusement, la chambre d'injection comprend un canal principal présentant une entrée et une sortie, et deux canaux d'entrée débouchant respectivement dans ladite entrée dudit canal principal pour former un premier écoulement dudit milieu de culture déterminé et de ladite substance aqueuse liquide et un second écoulement de ladite autre substance. Ainsi, les deux écoulements viennent de se croiser à l'entrée du canal principal pour former les gouttelettes, lesquels s'acheminent ensuite à travers le canal principal pour rejoindre la chambre de maturation. De préférence, l'un desdits canaux d'entrée formant ledit un premier écoulement débouche dans ladite entrée dudit canal principal à travers une paroi poreuse. Le canal d'entrée est équipé de la paroi poreuse à sa jonction avec l'entrée du canal principal. De la sorte, le premier écoulement dudit milieu de culture déterminé et de ladite substance aqueuse liquide est séparé de ladite autre substance par ladite paroi poreuse. Le premier écoulement est alors entraîné sous pression à traves la paroi poreuse pour former les gouttelettes dans l'autre substance. Selon une variante particulièrement avantageuse, l'un desdits canaux d'entrée est divisé en deux demi-canaux d'entrée pour diviser en deux demi-écoulements ledit second écoulement de ladite autre substance. En outre, les canaux d'entrée sont alimentés grâce à des dispositifs de pompage permettant de contrôler précisément les débits et/ou les pressions, et ainsi de régler les paramètres des gouttelettes et leur débit. Ce dernier est par exemple de 10 000 gouttelettes par seconde. D'autres particularités et avantages de l'invention ressortiront à la lecture de la description faite ci-après d'un mode de réalisation particulier de l'invention, donné à titre indicatif mais non limitatif, en référence aux dessins annexés sur lesquels : - la Figure 1 est un synoptique présentant schématiquement l'installation destinée à mettre oeuvre la méthode de sélection conforme à l'invention ; - la Figure 2 est une vue schématique de détail montrant un élément de l'installation selon un premier mode de mise en oeuvre ; et, - la Figure 3 est une vue schématique de détail montrant l'élément de l'installation selon un deuxième mode de mise en oeuvre de l'invention. - la Figure 4 est une vue schématique de détail montrant l'élément de l'installation selon un troisième mode de mise en oeuvre de l'invention. La Figure 1 illustre une installation 10 de culture et de sélection de microorganismes. L'installation se divise en trois modules : un premier module 12 de stockage, un deuxième module 14 de génération de gouttelettes et un troisième module 16 de traitement des gouttelettes. Le premier module 12 de stockage est porté à une température de 4°C et il comprend trois réservoirs. Un premier réservoir 18 reçoit une population de microorganismes. Un deuxième réservoir 20 reçoit un milieu de culture aqueux.

Et un troisième réservoir 22 reçoit une substance liquide non miscible avec le milieu de culture aqueux et en l'espèce une huile. Le premier réservoir 18 et le deuxième réservoir 20 sont respectivement reliés à un premier organe de pompage 24 et à un deuxième organe de pompage 26. Ces deux organes de pompage 24, 26 sont reliés ensemble par un conduit en T 28, lequel présente une première branche 30 rejoignant le premier organe de pompage 24, une seconde branche 32 rejoignant le deuxième organe de pompage 26 et une troisième branche 34 s'étendant à travers le deuxième module 14 pour rejoindre une chambre d'injection 36 permettant de former des gouttelettes comme on l'expliquera ci-après. À l'intersection des trois branches 30, 32, 34 du conduit en T 28 on vient mélanger grâce aux premier 24 et deuxième 26 organes de pompage le contenu du premier réservoir 18 et celui du deuxième réservoir 20. En outre, le troisième réservoir 22 est relié à un troisième organe de pompage 38, lequel est directement relié à son tour à la chambre d'injection 36 par un conduit d'admission 40. Ce troisième réservoir 22 est rempli d'une huile, végétale ou minérale. Elle peut être perfluorocarbonnée. Une huile silicone est également utilisable. Des tensioactifs lui sont additionnés. Par exemple des surfactant fluorés, ou des tensioactifs des marques Span©, Tween() ou encore Pluronic© peuvent être mis en oeuvre pour assurer la stabilité à long terme des gouttelettes en évitant les phénomènes de coalescence. L'huile peut être choisie de manière à autoriser les échanges de gaz, notamment le dioxygène et le dioxyde de carbone, ce qui est généralement préconisé pour les microorganismes aérobies ou au contraire, de manière à ne pas les autoriser, ce qui peut permettre de créer des conditions anaérobies. Préférentiellement, la chambre d'injection 36 est portée à l'intérieur du deuxième module 14 à une température voisine de 4°C également. On décrira plus en détail ci-après trois variantes de réalisation de la chambre d'injection 36, à l'intérieur desquelles on forme des gouttelettes de substance liquide aqueuse dispersées dans une phase huileuse continue, lesquelles gouttelettes contiennent un seul microorganisme en moyenne. La chambre d'injection 36 est reliée à une chambre de maturation 42 située à l'intérieur du troisième module 16 de traitement, par l'intermédiaire d'un conduit de transfert 44. La chambre de maturation 42 est destinée à promouvoir la multiplication des microorganismes et par conséquent, elle est portée à une température supérieure à 4 °C, par exemple 30 °C. La chambre de maturation 42 est elle-même reliée à une chambre de désémulsification 46, où l'on vient coalescer les gouttelettes et séparer la phase aqueuse de la face huileuse pour pouvoir récupérer les microorganismes multipliés. L'émulsion peut ainsi être déséquilibrée, par exemple, grâce à l'introduction d'un agent désémulsifiant, par centrifugation ou bien encore par électrocoagulation sous l'effet d'un champ électrique. Une fois la phase aqueuse contenant les microorganismes séparée de la phase huileuse, elle est, soit récupérée pour pouvoir utiliser les microorganismes qu'elle contient, soit utilisée dans un nouveau cycle de multiplication. Pour ce faire, elle est soit réintroduite dans le premier réservoir 18 de microorganismes par un conduit de retour 48, soit réinjectée directement dans la première branche 30 du conduit en T 28 au moyen d'un quatrième organe de pompage 50 et d'un conduit d'amenée 52, pour pouvoir être réinjecté dans la chambre d'injection 36. On se référera aux Figures 2 et 3, pour décrire plus en détail la chambre d'injection 36 permettant de générer des gouttelettes. La Figure 2 montre une chambre d'injection selon une première variante comprenant un premier canal principal 54 présentant une entrée 56 opposée à une sortie 58, et deux canaux d'entrée, un premier canal d'entrée axial 60 et un premier canal d'entrée transversale 62. Les deux premiers canaux d'entrée convergent l'un vers l'autre et débouchent à l'entrée 56 du canal principal 54. On observera que les diamètres du premier canal principal 54 et des premiers canaux d'entrée 60, 62 sont de l'ordre de la centaine de micromètres. En outre, la troisième branche 34 du conduit en T 28 débouche dans le premier canal d'entrée transversale 62, tandis que le conduit d'admission 40 débouche lui, dans le premier canal d'entrée axiale 60. En réglant d'une part, les débits relatifs des phases aqueuses contenant les microorganismes et le milieu nutritif, au moyen des deux organes de pompage 24, 26, et d'autre part le débit d'huile au moyen du troisième organe de pompage 38, les deux écoulements de phase aqueuse et de phase huileuse se croisent et interfèrent l'un avec l'autre à l'entrée 56 du premier canal principal 54 pour former les gouttelettes dont le diamètre est déterminé. Celui-ci peut alors être contrôlé et maintenu constant. Un contrôle des débits peut être réalisé par l'utilisation de systèmes de pousse-seringues. Dans un mode de réalisation préféré, le contrôle des écoulements entrants est réalisé par un système de contrôle en pression non représenté. Ce système peut être associé, et asservi, à un ou plusieurs systèmes de mesure des débits. Les systèmes de contrôle en pression assurent une durée minimale du régime transitoire, une commodité de mise en oeuvre et une monodispersité des gouttelettes. La monodispersité des gouttelettes est un paramètre important dans la mesure où il permet que chaque gouttelette, qui constitue pour le ou les microorganismes qui y sont cultivés, un microréacteur chimique indépendant, soient identiques et que les conditions de culture soient donc initialement les mêmes pour tous les microorganismes de la culture. Des débits de l'ordre de 10 000 gouttelettes par seconde ou plus peuvent être obtenus et avec des méthodes connues de l'homme de métier, il est possible d'adapter l'injection et la géométrie de la chambre d'injection 36 ou d'en utiliser plusieurs afin de multiplier par 10 à 100 environ ce débit en parallélisant le dispositif de génération des gouttelettes. La création des gouttelettes peut être suivie en temps réel par l'utilisation, au-dessus de la chambre d'injection 36, d'un microscope équipé d'une caméra et relié à un micro ordinateur. De préférence, on utilise une caméra rapide fournissant 1000 à 10000 images par seconde. Par ailleurs, on adapte la dilution de façon à avoir en moyenne un nombre de microorganismes par gouttelette compris entre 0.01 et 3, de préférence entre 0.1 et 1. Le nombre de microorganismes par gouttelette suit généralement une distribution de Poisson. Cependant, des méthodes sont mises en oeuvre pour obtenir une distribution beaucoup plus resserrée. Les gouttelettes ainsi formées s'acheminent alors à l'intérieur du premier canal principal 54 dont la sortie 58 est connectée à la chambre de maturation 42 par l'intermédiaire du conduit de transfert 44. Les phases aqueuses liquides contenant, l'une la population de microorganismes, l'autre le milieu de culture, sont ici mélangées en amont de la chambre d'injection 36 grâce au conduit en T 28. Selon un autre mode de réalisation non représenté, les deux organes de pompage 24, 26 sont directement reliés à la chambre d'injection 36. La concentration des microorganismes dans la phase aqueuse peut être déterminée et choisie avec une valeur suffisamment faible de façon à garantir que chaque gouttelette contienne au plus un seul microorganisme. On s'astreint de cette façon des phénomènes de diffusion de molécules comme les métabolites secrétés par le microorganisme. Chaque gouttelette devient ainsi un bioréacteur ne contenant qu'un seul type de microorganisme. Les gouttelettes ayant le même diamètre, la quantité de milieu de culture est la même dans chaque gouttelette.

La Figure 3 illustre un autre type de chambre d'injection comprenant un second canal principal 64 présentant une seconde entrée 66 et une seconde sortie opposée 68 ainsi qu'une paire deux seconds canaux d'entrée transversaux 70, 72, et un second canal d'entrée axial 74. Aussi, le conduit d'admission 40, permettant d'acheminer la phase huileuse, est dédoublé en deux demi-conduits d'admission débouchant respectivement dans les deux canaux d'entrée transversaux 70, 72, tandis que la troisième branche 34 acheminant la phase aqueuse débouche dans le canal d'entrée axial 74. Selon un troisième mode de mise en oeuvre représenté sur la Figure 4, on utilise une technique d'émulsification à travers une paroi poreuse 76, par exemple une membrane poreuse, et on force un écoulement 77 de ladite substance aqueuse liquide à travers des pores 78 de la membrane, directement au sein de ladite autre substance liquide 80. On forme ainsi des gouttelettes 82 de substance aqueuse liquide renfermant un microorganisme et du milieu de culture, dans l'autre substance liquide 80. On utilisera par exemple des membranes en verre, en polymère, en céramique ou en silicium et, parmi les produits commerciaux, les membranes « Microsieve© » produite par la société Nanomi au Pays-Bas. Plusieurs configurations sont possibles. Une première configuration, dite « cross-flow », selon laquelle l'écoulement 77 de ladite substance aqueuse liquide est forcée, par application d'une pression, à travers les pores 78 de la membrane 76 dans un canal où s'écoule tangentiellement ladite autre substance liquide en mouvement à une vitesse donnée. Une seconde configuration, dite « stirred cell », selon laquelle l'écoulement 77 de ladite substance aqueuse liquide est forcée, par application d'une pression, à travers les pores 78 de la membrane 76, dans une cuve de ladite autre substance liquide 80 agitée par un mélangeur auquel on imprime un mouvement de rotation. Cette variante permet d'assurer des débits particulièrement importants, pouvant atteindre ou dépasser un million de gouttelettes par seconde Les gouttelettes générées dans la chambre d'injection 36 représentée sur la Figure 1, sont ensuite acheminées et stockées dans la chambre de maturation 42 pour que les microorganismes qu'elles contiennent puissent être incubés a température et pour une durée permettant leur multiplications optimales. De préférence, la chambre de maturation 42 est entraînée en mouvements alternatifs lents pour éviter que les gouttelettes ne sédimentent. Il est ainsi possible de sélectionner les organismes les plus efficaces à se multiplier dans le milieu considéré. En utilisant une durée d'incubation courte on peut par exemple garantir que seuls les organismes très performants à se nourrir du milieu se multiplieront alors que les organismes moins performants n'auront pas le temps de se multiplier. De cette façon, la proportion d'organismes performants dans la population initiale va croitre et la proportion d'organismes moins efficaces va diminuer, ce qui permet l'enrichissement de la population en organismes efficaces. Les gouttelettes sont ensuite coalescées dans la chambre de désémulsification 46 et la population de microorganismes multipliés ainsi obtenue est réutilisée pour un autre cycle de formation de gouttelettes puis d'incubation. Ceci permet de renouveler le milieu de croissance pour s'assurer que les microorganismes restent en phase de croissance comme c'est le cas dans les chemostats traditionnels. Ainsi, après plusieurs cycles on obtient une population très enrichie en cellules efficaces ayant crû dans des conditions interdisant les phénomènes d'alimentation croisée. Selon un mode particulier de mise en oeuvre de l'invention, avant de coalescer les gouttelettes, on les trie pour ne retenir que celles dans lesquelles, les microorganismes se sont multipliés. Ce mode de mise en oeuvre permet de diminuer le nombre de cycles avant d'obtenir une population homogène.

En effet, l'activité des microorganismes au sein des gouttelettes a une incidence sur la taille des gouttelettes, pour des raisons notamment osmotiques. On peut ainsi séparer les gouttelettes en fonction de leur taille à l'aide d'un actionnement par un champ électrique ou un actionneur piézoélectrique dans un canal microscopique principal. Dans ce cas l'actionnement est déclenché par la détection, en amont de l'actionneur agissant sur une gouttelette, d'un signal corrélé à la taille de ladite gouttelette circulant dans ledit canal principal. La détection du signal peut être réalisée par un détecteur électrique, dans le cas d'un signal de résistance, de conductance, d'impédance ou de capacitance, ou bien par un détecteur optique comme un microscope optique associé à un système d'analyse d'image ou un photomultiplicateur. L'actionnement par un champ électrique ou l'actionnement piézoélectrique entraîne ladite gouttelette en mouvement dans ledit canal principal et la conduit à s'engager vers un canal plutôt qu'un autre au sein d'une bifurcation située immédiatement en aval dudit canal microscopique principal. On peut également séparer les gouttelettes de manière passive en les introduisant dans un circuit de canaux microscopiques adapté comprenant une bifurcation ayant une géométrie telle que lorsqu'on impose un ensemble de valeurs de pressions bien choisies, les gouttelettes ayant une taille supérieure à une taille donnée s'engagent spontanément vers l'un des canaux microscopiques secondaires constituant ladite bifurcation tandis que les gouttelettes ayant une taille inférieure à ladite taille donnée s'engagent spontanément vers un autres des dits canaux microscopiques secondaires constituant ladite bifurcation. Dans une variante avantageuse, on utilise une méthode en volume, de sédimentation ou de crémage, sans canaux microscopiques, pour séparer au sein d'une cuve les gouttelettes en fonction de leur taille.

Après avoir séparé les gouttelettes suivant leur taille, on n'en utilise qu'une fraction, par exemple les plus petites gouttelettes pour les cycles ultérieurs. Avant la séparation de phase, dans la chambre de désémulsification, on peut introduire un excès d'eau et/ou des agents « désémulsifiants ». Diverses techniques connues de l'homme du métier peuvent être utilisées pour cette opération, telle que la centrifugation, typiquement 5000 g, pendant 5 minutes à 4°C. Dans un mode de réalisation, la séparation de phase a lieu grâce à un dispositif automatique, en ligne, connecté à la chambre de maturation 42. Dans un autre mode de réalisation, la séparation de phase a lieu par électrocoalescence. Ce mode de réalisation permet à l'intégralité du procédé d'avoir lieu sans intervention humaine, tout en limitant au maximum les risques de contamination. On peut ainsi réaliser un certain nombre de cycles d'une durée totale comprise, suivant la vitesse de croissance des microorganismes utilisés, entre quelques dizaines de minutes et quelques heures ou dizaines d'heures. De préférence, on réalise au moins trois cycles, préférentiellement au moins vingt et jusqu'à cent ou plus. A l'issue de la méthode selon l'invention, la population de microorganismes obtenue dans la chambre de désémulsification 46 après le dernier cycle est différente de la population initiale. Les différences ainsi introduites sont non triviales, sont d'intérêt technique et sont distinctes de celles qui auraient pu être obtenues par l'utilisation de systèmes de culture connus. Puisque le nombre de microorganismes évolue d'un cycle à l'autre, en raison de la croissance de tout ou partie de la population initialement emprisonnée dans les gouttelettes, il peut-être utile d'ajuster le taux de dilution des microorganismes dans le premier module 12, ou bien d'ajuster la taille des gouttelettes dans la chambre d'injection 36 ou bien encore, d'ajuster le nombre moyen de microorganismes par gouttelette.

On a décrit ci-dessus, le mode de fonctionnement général de l'installation de culture et de sélection de microorganismes. On s'attachera dans la suite de la description à fournir des exemples d'application. Les choix des microorganismes et du milieu de culture sont bien évidemment liés. S'agissant des microorganismes, leur diversité génétique peut être d'origine naturelle ou bien provenir de microorganismes génétiquement modifiés à dessein. Dans le cas de microorganismes naturels, ils peuvent être extraits d'un environnement biologique ou industriel particulier, tel que le sol, le rumen des vaches ou d'autres ruminants, du système digestif des termites, des effluents de papeteries, des décharges de détritus, des pourritures, du plastique laissé à l'extérieur, de l'écorce des arbres, des feuilles de plantes, des sources chaudes sous-marines, de la jungle ou de la forêt. Dans le cas de microorganismes génétiquement modifiés, ils peuvent être créés, partant d'au moins un gène codant au moins une cellulase, par une des méthodes de mutagenèse aléatoire, mutagenèse dirigée, DNA shuffling ou toute autre méthode de recombinaison génétique connue de l'homme du métier. Alternativement, une source de microorganismes génétiquement modifiés peut être le metagénome, où l'on isole, au sein d'une banque de génome environnemental, des gènes codant des enzymes dans le génome de microorganismes puis on les clone au sein d'un autre microorganisme. L'avantage des méthodes du metagenome est d'avoir accès directement au génome d'une large diversité de microorganismes qui ne sont pas susceptibles d'être cultivés en laboratoire. On observera en effet, que 95 à 99 % des microorganismes naturels ne sont pas cultivables en laboratoire. Outre les bactéries et les levures utilisables comme micro-organismes, on citera des recombinants d'Escherichia coli ou Saccharomyces cerevisiae, ainsi que de nombreuses autres espèces telles que Acidothermus cellulolyticus, Pectobacterium chrysanthami, Thermobifida fusca Thermotoga maritime, Bacillus subtilis ou Clostridium cellulovorans, qui produisent des endoglucanases ; Agrobacterium, Paenibacillus polymyxa, Pyrococcus furiosus ou Thermotoga neapolitana, qui produisent des enzymes glucosidases ; Bacillus circulans, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Clostridium thermocellum, Thermobacillus xylanolyticus, Dictyoglomus thermophilum ou Streptomyces halstedii; qui produisent des xylanases ; Trichoderma reesei, qui produit différentes cellulases, certains Staphillococci, Bacilli et Pseudomonas, Comamonas acidovorans présentant des activités de dégradation du polyethylene, Alcaligenes faecalis présentant des activités de dégradation du polyuréthane. Les milieux de culture mis en oeuvre contiennent de préférence des polymères, lesquels sont aptes à être des polymérisés par les microorganismes sélectionnés. Dans un mode de réalisation préféré, le polymère à dépolymériser est la seule source de carbone présente dans le milieu de culture. Ainsi, les microorganismes capables de dépolymériser ledit polymère survivront, et éventuellement se diviseront, tandis que les autres microorganismes ne pourront pas survivre. La source de polymère à dépolymériser est un polymère naturel ou de synthèse. Dans un autre mode de réalisation préféré, le polymère subit un prétraitement. Le prétraitement peut être de nature chimique, physique ou mécanique. Parmi les méthodes utilisées, on citera par exemple : le broyage, l'utilisation de solutions acides ou basiques, l'utilisation de rayonnements tels que des ultraviolets, des rayons gamma, un faisceau d'électrons ou des microondes, l'explosion avec de la vapeur d'eau, l'utilisation de solvants organiques ou de liquides ioniques ou de dioxyde de carbone supercritique. Deux de ces méthodes ou plus peuvent être combinées simultanément ou successivement. Le prétraitement du polymère à dépolymériser permet d'obtenir une suspension de particules de taille plus petites que le polymère d'origine et de le rendre plus accessible aux enzymes.

On ajuste les conditions dudit prétraitement afin que les particules en question aient une taille caractéristique moyenne inférieure à 100 pm, de préférence inférieure à 20 pm, plus préférentiellement inférieure à 5 pm. Dans le cas de la cellulose, on peut également utiliser des produits commerciaux comme l'Avicel© ou la Sigmacell 20© produites par la société Sigma Aldrich, à Saint- Louis aux Etats-Unis. Dans le cas de la cellulose, le matériel à prétraiter peut être issu d'ensilage de tiges de maïs, de paille de blé, de paille de coton, de bagasse de canne à sucre, de peupliers, de granulés de bois, de déchets de l'industrie papetière ou forestière ou de déchets urbains. On peut également utiliser des cellules de xylème de Zinnia prétraitées par de l'acide à chaud. Grâce à la méthode de culture et de sélection, et également à l'installation, selon l'invention, des cultures d'un grand nombre de 5 microorganismes sans interactions entre les microorganismes pendant plusieurs générations sont rendues possibles. En séparant les microorganismes les uns des autres, grâce aux gouttelettes, le procédé règle le problème de la diffusion, qui n'avait pas été réglé auparavant. Les problèmes de populations adhérentes aux parois ou de 10 mouvement non aléatoire des bactéries, qui constituent des inconvénients dans la mise en oeuvre des systèmes de culture habituels sont également réglés. En outre, la méthode, en permettant d'agir de manière simple et directe sur plusieurs paramètres tels que la durée des cycles, la taille des gouttelettes, la pression sélective ou le nombre de microorganismes par gouttelettes, peut être 15 adaptée à de nombreuses finalités expérimentales ou de production industrielle. En opérant un grand nombre de cycles, le procédé permet d'augmenter progressivement, et à chaque cycle, la valeur sélective des individus les plus performants de la population cultivée. 20

Claims (12)

1. REVENDICATIONS1. Méthode de sélection de microorganismes du type comprenant les étapes suivantes : a) on fournit une population de microorganismes présentant une pluralité de types de microorganismes ; b) on fournit une substance aqueuse liquide pour recevoir ladite population de microorganismes ; c) on introduit un milieu de culture déterminé à l'intérieur de ladite substance aqueuse liquide ; d) on promeut la multiplication des microorganismes de l'un desdits types, adaptés audit milieu de culture déterminé ; caractérisée en ce qu'on fournit en outre une autre substance liquide non miscible avec ladite une substance aqueuse liquide ; et en ce qu'entre l'étape c) et l'étape d), on injecte l'une dans l'autre, selon une étape c'), ladite une substance aqueuse liquide et ladite autre substance liquide de manière à disperser, dans ladite autre substance liquide, des gouttelettes de substance aqueuse contenant sensiblement en moyenne un seul microorganisme, pour pouvoir promouvoir la multiplication dudit seul microorganisme de chacune desdites gouttelettes contenant un microorganisme dudit un desdits types.
2. 2. Méthode de sélection selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'on récupère selon une étape e) les microorganismes de chacune desdites gouttelettes après l'étape d) pour fournir ladite population de microorganismes à ladite étape a).
3. 3. Méthode de sélection selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'on répète n fois les étapes b), c), c'), d) et e) de manière à enrichir la population de microorganismes récupérés en microorganisme dudit un desdits types.
4. 4. Méthode de sélection selon la revendication 2 ou 3, caractérisée en ce qu'on centrifuge lesdites gouttelettes de substance aqueuse dispersées dans ladite autre substance liquide pour récupérer lesdits microorganismes.
5. 5. Méthode de sélection selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'à l'étape c'), on injecte en continu l'une dans l'autre ladite une substance aqueuse liquide et ladite autre substance liquide.
6. 6. Méthode de sélection selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu'à l'étape c'), on forme un premier écoulement de ladite substance aqueuse liquide et un second écoulement de ladite autre substance liquide, et en ce qu'on croise les premier et second écoulements pour injecter ladite une substance aqueuse liquide et ladite autre substance liquide l'une dans l'autre.
7. 7. Méthode de sélection selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'on installe une paroi poreuse au croisement desdits premier et second écoulements.
8. 8. Méthode de sélection selon la revendication 6 ou 7, caractérisée en ce qu'on divise ledit second écoulement de ladite autre substance liquide en deux demi-écoulements symétriques l'un de l'autre par rapport audit premier écoulement.
9. 9. Installation de sélection de microorganismes comprenant une chambre de maturation (42) pour recevoir un milieu de culture déterminé et une substance aqueuse liquide contenant une population de microorganismes présentant une pluralité de types de microorganismes, de manière à pouvoir promouvoir la multiplication des microorganismes de l'un desdits types, adaptés audit milieu de culture déterminé ; caractérisée en ce qu'elle comprend en outre une chambre d'injection (36) débouchant dans ladite chambre de maturation (42), pour pouvoir injecter simultanément, d'une part ledit milieu de culture déterminé et ladite substance aqueuse liquide et d'autre part, une autre substance liquide non miscible avec ladite une substance aqueuse liquide, de manière à disperser dans ladite autre substance liquide, des gouttelettes de substance aqueuse (82) contenant sensiblement en moyenne un seul microorganisme, pour pouvoir promouvoir la multiplication dudit seul microorganisme de chacune desdites gouttelettes (82) contenant un microorganisme dudit un desdits types.
10. 10. Installation de sélection selon la revendication 9, caractérisée en ce que la chambre d'injection (36) comprend un canal principal (54 ; 64)présentant une entrée (56 ; 66) et une sortie (58 ; 68), et deux canaux d'entrée (62, 60) débouchant respectivement dans ladite entrée (56) dudit canal principal pour former un premier écoulement dudit milieu de culture déterminé et de ladite substance aqueuse liquide et un second écoulement de ladite autre substance.
11. 11. Installation de sélection selon la revendication 10, caractérisée en ce que l'un desdits canaux d'entrée (62) formant ledit un premier écoulement débouche dans ladite entrée (56) dudit canal principal à travers une paroi poreuse (76).
12. 12. Installation de sélection selon la revendication 10 ou 11, caractérisée en ce que l'un desdits canaux d'entrée est divisé en deux demi-canaux d'entrée (70, 72) pour diviser en deux demi-écoulements ledit second écoulement de ladite autre substance.15