FR2994845A1

FR2994845A1 - Effet d'un edulcorant sur le microbiome

Info

Publication number: FR2994845A1
Application number: FR1202337A
Authority: FR
Inventors: David Bravo; Soraya P Shirazi-Beechey
Original assignee: Pancosma SA
Current assignee: Pancosma SA; University of Liverpool
Priority date: 2012-08-30
Filing date: 2012-08-30
Publication date: 2014-03-07
Anticipated expiration: 2032-08-30
Also published as: WO2014033218A1; FR2994845B1; EP2890249A1

Abstract

Utilisation d'au moins un édulcorant intense pour modifier la flore et/ou la fermentation dans le tractus digestif d'un animal monogastrique, ledit au moins un édulcorant intense étant choisi dans le groupe comportant : . un mélange de NHDC et de saccharine, et . du stévia.

Description

EFFET CHEZ LE PORC D'UN CHANGEMENT DE RÉGIME ALIMENTAIRE SUR LE MICROBIOTE DU GROS INTESTIN ET L'EXPRESSION GÉNIQUE TISSULAIRE DURANT LE DÉVELOPPEMENT, LORS DU SEVRAGE ET EN RÉPONSE À UNE SUPPLÉMENTATION EN ÉDULCORANT.

BRÈVE DESCRIPTION Nous avons utilisé le pyroséquençage, une méthode récente de séquençage de l'ADN, ce qui nous a permis de déterminer les changements de la diversité et de la structure de la communauté bactérienne dans le gros intestin de porcelets. Abondance de la population lactobacillaire coecale z ro R1 L'addition de SUCRAM (R2) ou de lactose (R7) au régime témoin (RI.) accroît la population lactobacillaire cmcale (exprimée en pourcentage du nombre total d'OTU identifiées à l'aide du pyroséquençage 454). 7:3 e " ---- 10 D ro o 2 R2 R7 Nos données montrent (voir figure ci-dessus) qu'après l'incorporation de SUCRAM® dans l'alimentation des porcelets (R2), la population lactobacillaire du coecum (première partie du gros intestin) augmente significativement par rapport à celle observée dans des échantillons de contenu coecal prélevés sur des porcelets recevant le même régime alimentaire sans SUCRAM® (R1).

L'incorporation de lactose dans le régime a de même causé une élévation significative de la population lactobacillaire coecale (R7). La figure ci-dessous montre que l'augmentation de la population lactobacillaire coecale constatée lors de l'addition de SUCRAM® ou de lactose est due exclusivement à une plus grande abondance d'0TU9641, une espèce de Lactobacillus spécifique du porc. - 2 - Abréviations employées : à la mamelle = animaux de 2 semaines nourris au lait de truie ; HCH = régime alimentaire composé d'hydrates de carbone hydrolysables sans supplémentation ; HCH + S = même régime + Sucram ; HCH + Lac = même régime + lactose. Nbre de séquences Proportions relatives d'OTU de Lactobacillus . L'augmentation de la population lactobacillaire coecale observée en cas d'ajout de Sucram ou de lactose est due presque exclusivement à l'augmentation du nombre d'OTU9641 (souche représentée en bleu). A mamelle HCH HCH.S HCH.Ue _ On sait que les lactobacilles jouent un rôle important dans l'immunité, la croissance et la lutte contre les agents pathogènes intestinaux. Le lactose, un substrat pour la production d'acide lactique par les lactobacilles, est quant à lui connu pour augmenter la population lactobacillaire. Le lactose est absorbé par les lactobacilles et constitue la source d'énergie qui permet à ce genre de se multiplier. La saccharine n'est par contre ni absorbée ni métabolisée. Nous avons mesuré la concentration en saccharine dans le contenu coecal de porcelets recevant SUCRAM® ; elle est identique à celle présente dans l'aliment. Nous concluons que la saccharine doit être détectée par un récepteur membranaire (récepteur bactérien au sucré) activant une voie descendante, qui à son tour cause une élévation du taux de la protéine de transport responsable de l'absorption des nutriments disponibles tels que le propionate ou le butyrate, sources d'énergie pour la croissance et la propagation de cette espèce. Il s'agit du tout premier indice de l'existence d'un récepteur bactérien au sucré.

Le brevet protégerait l'utilisation d'un édulcorant puissant comme technologie permettant de cibler l'écosystème intestinal et d'accroître la population de bactéries bénéfiques. Le brevet servira en outre à protéger le fait que, pour la première fois, un récepteur bactérien au sucré a été identifié et peut faire l'objet de manipulations.30 - 3 - MÉTHODE ET MATÉRIEL L'objectif général était de caractériser le microbiote du gros intestin de porcelets sevrés passant à un régime contenant des hydrates de carbone fermentescibles ou digestibles solubles et de porcelets sevrés passant à un régime supplémenté en édulcorants naturels ou artificiels.

Au total, 15 groupes de 8 porcelets (1 groupe de porcelets à la mamelle ; 14 groupes de porcelets sevrés ; nombre total de porcelets : 120) recevant des régimes alimentaires différents ont été sacrifiés afin de prélever des échantillons de contenu coecal et de tissu dans diverses régions de l'intestin grêle et du gros intestin.

L'ADN a été extrait du contenu coecal et fécal dans plusieurs groupes de porcelets de l'étude : [1] : Porcelets à la mamelle de 28 jours ne recevant que du lait de truie. [2] : Porcelets de 41 jours sevrés passant à un régime composé d'hydrates de carbone hydrolysables (Régime 1), et principalement de blé moulu (30 % p/p). [3] : Porcelets de 41 jours sevrés passant à un régime composé d'hydrates de carbone hydrolysables + SUCRAM® (Régime 2), et principalement de blé moulu (30 % p/p) et de NHDC + saccharine (SUCRAM°). [4] : Porcelets de 41 jours sevrés passant à un régime composé d'hydrates de carbone fermentescibles (Régime 13), et principalement de pulpe de betterave sans mélasse (5 % p/p), d'inuline (0,75 % p/p) et de dextrine de blé (3 % p/p). [5] : Porcelets de 41 jours sevrés passant au Régime 1 (hydrates de carbone hydrolysables), avec ajout de stévia dans l'eau de boisson (Régime 15). L'ADN extrait a servi de matrice pour l'amplification par PCR des séquences de gènes d'ARNr 16S en utilisant des amorces universelles ciblant la région V1-V3 de l'ADNr 16S eubactérien. Les séquences générées comptaient environ 500 pb. Cette longueur de séquence permet de classer phylogénétiquement plus de 99 % des séquences. - 4 - Chaque bibliothèque d'amplicons était composée de 16 échantillons différents prélevés dans chaque groupe de l'étude (8 échantillons coecaux/8 échantillons fécaux) identifiables par des marqueurs Multiplex Identifier (MID) inclus dans chaque jeu d'amorces. Les bibliothèques d'amplicons ont été séquencées sur une plateforme de séquençage GS-FLX Titanium produisant en moyenne plus de 20 000 lectures de séquence par échantillon. L'analyse bio-informatique des séquences est en cours. Les séquences sont regroupées et alignées à l'aide de l'outil Pyrosequencing Pipeline du projet Ribosomal Database Project (RDP) en utilisant un seuil de similarité de 97 % pour définir chaque unité taxonomique opérationnelle (OTU). Les attributions taxonomiques sont ensuite réalisées en comparant directement les OTU aux bases de données de référence du RDP. Plusieurs méthodes statistiques, notamment l'analyse UniFrac, sont utilisées pour effectuer la comparaison de la structure et de la diversité de la communauté entre les échantillons. L'analyse UniFrac permet de créer des tracés 3D représentant spatialement la structure et le profil de la communauté en regroupant les échantillons contenant des OTU communes et en séparant ceux dont les OTU sont différentes. L'analyse et la classification phylogénétiques des OTU permettent d'identifier les groupes bactériens qui sont altérés par la modification du régime alimentaire. L'analyse quantitative de ces altérations peut être effectuée en dénombrant les OTU appartenant à des taxons particuliers et en déterminant leur pourcentage par rapport au nombre total d'OTU. La concentration en acides monocarboxyliques (acides gras à courte chaîne ; AGCC) est également mesurée dans les échantillons de contenu du côlon prélevés dans ces 4 groupes de porcelets de l'étude ; ces acides sont les produits métaboliques de la fermentation microbienne des hydrates de carbone alimentaires. La proportion d'AGCC produits par la fermentation microbienne est souvent altérée par une modification du régime alimentaire, ce qui peut être bénéfique ou nocif pour l'animal hôte.35 - 5 - RÉSULTATS SUR LA STRUCTURE ET LA CLASSIFICATION PHYLOGÉNIQUE DE LA COMMUNAUTÉ MICROBIENNE, TÉMOIN versus TÉMOIN + SUCRAM@ versus TÉMOIN + FIBRES FERMENTESCIBLES L'analyse UniFrac a mis en évidence des différences significatives de la structure de la communauté microbienne entre les porcelets à la mamelle et sevrés ; entre les porcelets sevrés recevant des régimes à base de différents types d'hydrates de carbone ; entre les porcelets sevrés recevant des régimes identiques avec ou sans SUCRAM®. Voir illustration ci-après. 3D UniFrac À la mamelle (en vert) Hydrates de carbone hydrolysables (en rouge) LiReprésentation Hydrates de carbone hydrolysables + Sucram (en bleu) Hydrates de carbone fermentescibles (en orange) L'analyse UniFrac a également mis en évidence des différences significatives de structure de la communauté microbienne entre les différentes régions du côlon (échantillons coecaux [droite] vs fécaux [gauche]).

L'analyse de séquence et la classification phylogénétique ultérieure ont permis d'identifier les principaux taxons microbiens présents dans le côlon des porcelets et révélé des variations de l'abondance de la population de certains groupes microbiens en réponse à une modification du régime alimentaire. Les résultats montrent que 3 taxons principaux dominent le microbiote du côlon des porcs : Bacteroides, Clostridium et Lactobacillus. Les résultats fournis par les échantillons coecaux indiquent que la population de Bacteroides tendait à être moins nombreuse chez les - 6 - porcelets sevrés que chez les porcelets à la mamelle. La population du groupe Clostridium avait par contre tendance à être supérieure chez les porcelets sevrés que chez ceux à la mamelle. Les résultats montrent une diminution de la population de Clostridium avec SUCRAM®. L'abondance de la population lactobacillaire coecale était très similaire dans 3 des 4 groupes de l'étude (à la mamelle, hydrates de carbone hydrolysables et hydrates de carbone fermentescibles). La population 10 coecale des porcelets recevant le régime hydrates de carbone hydrolysables + SUCRAM® était toutefois jusqu'à 4 fois plus nombreuse que celle des animaux recevant le même régime sans SUCRAM®. OTU (% du total) 30 20 À la mamelle (en vert) Hydrates de carbone hydrolysables + Sucram (en bleu) Hydrates de carbone Hydrates de carbone fermentescibles (en orange) hydrolysables (en rouge) 15 L'augmentation de la population lactobacillaire coecale pourrait être cruciale, en raison des effets positifs que ce groupe de bactéries exercerait sur la santé intestinale. L'abondance de lactobacilles est par ailleurs 75- Bacteroides o À la mamelle (en vert) Hydrates de carbone hydrolysables + Sucram (en bleu) Hydrates de carbone hydrolysables (en rouge) Hydrates de carbone fermentescibles (en orange) 50- 5. Clostridium - 7 - considérablement inférieure dans les matières fécales que dans le coecum chez les porcelets recevant le régime hydrates de carbone hydrolysables + SUCRAM®. L'examen des seules matières fécales pour évaluer le microbiote ne permettrait pas de détecter la multiplication des lactobacilles causée par le régime contenant SUCRAM®. Il s'agit d'une découverte d'autant plus importante qu'elle est inattendue. D'autres résultats corroboraient fortement cette augmentation observée de la population lactobacillaire avec SUCRAM®. La figure suivante illustre par exemple que la concentration en lactate était significativement supérieure dans le coecum des porcelets à la mamelle que dans celui des porcelets sevrés. Concentration _ a- 6- 4- 2- 0 À la mamelle R1 R2 R13 Il est important de remarquer que l'analyse de la concentration en acide lactique (le principal produit métabolique des lactobacilles) dans le coecum a montré une élévation de cette concentration chez les porcelets recevant le régime hydrates de carbone hydrolysables + SUCRAM® par rapport à ceux ne recevant que des hydrates de carbone hydrolysables. Ceci est cohérent avec l'augmentation observée des lactobacilles chez les porcelets nourris avec des hydrates de carbone hydrolysables + SUCRAM®. Concentration (mM) 4 2 1 0 R1 R2 - 8 - RÉSULTATS SUR LA STRUCTURE ET LA CLASSIFICATION PHYLOGÉNIQUE DE LA COMMUNAUTÉ MICROBIENNE, TÉMOIN versus TÉMOIN + SUCRAM@ versus TÉMOIN + LACTOSE L'analyse UniFrac des données de pyroséquençage obtenues à partir d'échantillons coecaux de porcelets sevrés passant au Régime 1 (HCH), au Régime 2 (HCH + SUCRAM®) ou au Régime 7 (HCH + Lactose) a révélé des différences significatives des profils de la communauté microbienne, en particulier entre le Régime 1 (non supplémenté) et les Régimes 2 et 7 (supplémentés avec SUCRAM® et du lactose, respectivement) : Représentation 3D UniFrac Régime 1 (HCH) (en vert) Régime 2 (HCH + Sucram) (en orange) Régime 7 (HCH + Lactose) (en bleu) L'analyse du microbiote caecal des porcelets recevant le Régime 7 (HCH + Lactose) a mis en évidence une augmentation spectaculaire de la population lactobacillaire - similaire à celle observée chez les porcelets nourris au moyen du Régime 2 (HCH + SUCRAM®) - par rapport aux porcelets recevant le Régime 1 (HCH). Les lactobacilles représentaient 23,8 % de l'ensemble du microbiote chez les porcelets recevant le Régime 7 (contre 8,3 % chez ceux recevant le Régime 1). OTU (% du total) Abondance de la population lactobacillaire coecale 40 30 20 10 M R1 R2 R7 - 9 - L'analyse détaillée de la population lactobacillaire dans le contenu coecal des porcelets à la mamelle (M) et des porcelets sevrés recevant le Régime 1 (HCH) montre que la population lactobacillaire est dominée par une souche particulière (appelée 0TU9641 et apparentée à L. amylovorus), qui compte pour plus de 70 % des lactobacilles chez les porcelets à la mamelle et plus de 50 % chez les porcelets sevrés recevant le Régime 1 (HCH). 0TU9641 est en outre le principal responsable de l'augmentation de la population lactobacillaire totale observée chez les porcelets recevant SUCRAM® (Régime 2; HCH + S) ou du lactose (Régime 7; HCH + Lac), chez qui 0TU9641 représente plus de 80 % de l'ensemble des lactobacilles. Les deux figures ci-dessous montrent la population lactobacillaire totale chez les porcelets nourris au moyen de ces régimes ainsi que les proportions des différentes OTU de lactobacilles : 20000 15000 10000 5000 o À la mamelle HCH HCH + HCH + S Lac La souche 0TU9641 est représentée en bleu. HCH = hydrates de carbone hydrolysables, S= SUCRAM®, Lac = lactose RÉSULTATS SUR LA STRUCTURE ET LA CLASSIFICATION PHYLOGÉNIQUE DE LA COMMUNAUTÉ MICROBIENNE, TÉMOIN versus TÉMOIN + LACTOSE versus TÉMOIN + FIBRES FERMENTESCIBLES À l'aide d'UniFrac, nous avons analysé les profils de la communauté microbienne coecale de porcelets sevrés passant à des régimes contenant deux sources différentes d'hydrates de carbone fermentescibles : pellicules de soja (Régime 11) et pulpe de betterave sans mélasse (Régime 13) (ces - 10 - deux régimes contenaient également de l'inuline et de la dextrine de blé). Nous avons ensuite comparé ces profils de communauté avec les profils obtenus à partir des échantillons caecaux de porcelets recevant le Régime 7 (HCH + Lactose), parce que les deux régimes à base d'hydrates de carbone fermentescibles (11 et 13) contiennent également la même quantité de lactose que le Régime 7. Représentation 3D UniFrac Régime 7 (HCH + Lactose) (en bleu) Régime 11 (Pellicules de soja) (en orange) Régime 13 (Pulpe de betterave) (en rose) Les résultats obtenus à partir des échantillons de coecum de porcelets recevant les Régimes 11 et 13 présentent une particularité intéressante : bien que ces régimes contiennent la même quantité de lactose que le Régime 7, ils ne provoquent pas l'augmentation de la population lactobacillaire (par rapport au Régime 1) observée avec le Régime 7. OTU (% du total) 40 Abondance population lactobacillaire coecale 20 de la 10- o R1 R7 R11 R13 Nous avons déjà signalé une élévation de la concentration en lactate dans le coecum des porcelets recevant le Régime 2 (HCH + SUCRAM ® ; 3,2 mM) par rapport aux porcelets recevant le Régime 1 (HCH; 1,5 mM), qui s'accompagne d'une augmentation de la population lactobacillaire (8,3 % Régime 1; 20,5% Régime 2). Nous observons à présent en outre une augmentation de la concentration en lactate dans le caecum des porcelets recevant le Régime 7 (HCH + Lactose ; 15,2 mM) et le Régime 15 (HCH + Stévia ; 8,8 mM). L'élévation de la concentration en lactate observée chez les porcelets recevant le Régime 7 coïncide également avec une augmentation de la population lactobacillaire (voir plus haut). L'analyse du microbiote pour le Régime 15 est en cours.

Il est important de noter la différence de concentration en lactate entre le Régime 2 (HCH + SUCRAM) (3,2 mM) et le Régime 7 (HCH + Lactose) (15,2 mM), en dépit d'une population lactobacillaire de taille similaire (20,5 % Régime 2; 23,8 % Régime 7). Cette différence pourrait être due au fait que, contrairement à SUCRAM®, le lactose constitue une source d'énergie métabolisable pour les lactobacilles. Ceci pourrait également être vrai pour le Régime 15 (HCH + Stévia), la stévia étant elle aussi métabolisable par le microbiote du côlon. Il convient par ailleurs de remarquer que l'augmentation de la concentration en lactate dans le contenu coecal des porcelets recevant les Régimes 2, 7 et 15 s'accompagne d'une réduction de la concentration en propionate.

Claims

REVENDICATIONS1. Utilisation d'au moins un édulcorant intense pour modifier la flore et/ou la fermentation dans le tractus digestif d'un animal monogastrique, ledit au moins un édulcorant intense étant choisi dans le groupe comportant : - un mélange de NHDC et de saccharine, et - du stévia.
2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'animal est un porc.
3. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'animal est un porcelet.
4. Utilisation selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'édulcorant intense agit dans le colon et/ou dans le caecum de l'animal.
5. Utilisation selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle a pour effet d'être détectée par un récepteur bactérien au sucré.
6. Utilisation selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle accroît la population de lactobacilles.
7. Utilisation selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle accroît la population de lactobacilles de type L. amylovorus.
8. Utilisation selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle accroît la population de lactobacilles OTU 9641.
9. Utilisation selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle réduit la population de clostridies.
10.Utilisation selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle augmente la production de lactate et/ou d'acide lactique.
11.Utilisation selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle réduit la production de propionate..Utilisation selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle agit sur l'immunité de l'animal. 13.Utilisation selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle agit sur la croissance de l'animal.