FR2985520A1 - Procede pour capturer et concentrer un microorganisme dans un echantillon biologique - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne, de façon générale, le domaine de l'analyse par exemple l'analyse biologique. Plus spécifiquement, la présente invention concerne un procédé pour capturer et concentrer au moins un microorganisme ou au moins une protéine sécrétée d'un microorganisme susceptible d'être présent(e) dans échantillon placé dans un conteneur, le procédé comprenant les étapes suivantes : a) mettre en contact dans le conteneur ledit échantillon avec un milieu de culture et une éponge apte à capturer le(s) microorganisme(s) ou la (les) protéine(s) sécrétée(s) d'au moins un microorganisme à détecter, fonctionnalisée par un partenaire de liaison d'au moins un microorganisme ou d'au moins une protéine sécrétée b) placer le conteneur dans des conditions aptes à permettre la croissance du ou des microorganismes(s) c) presser et décompresser répétitivement l'éponge en restant en contact avec ledit milieu.

Description

PROCEDE POUR CAPTURER ET CONCENTRER UN MICROORGANISME DANS UN ECHANTILLON BIOLOGIQUE La présente invention concerne, de façon générale, le domaine de l'analyse par exemple l'analyse biologique. Plus spécifiquement, la présente invention concerne un procédé pour capturer et concentrer au moins un microorganisme ou au moins une protéine excrétée d'un microorganisme susceptible d'être présent dans un échantillon. Ce procédé est particulièrement applicable aux microorganismes pathogènes contenus dans les milieux complexes, en faible concentration. L'analyse microbiologique nécessite des techniques précises et dont le temps d'obtention du résultat doit être le plus court possible. Dans le domaine médical, il est nécessaire de prévoir et diagnostiquer le risque infectieux : plus le diagnostic est rapide et précis, plus la prise en charge des malades est efficace et le risque de transmission minimisé. L'approche est similaire pour la santé animale. Dans le domaine agroalimentaire, la problématique est identique. Elle distingue cependant : - les microorganismes pathogènes et leurs toxines dont la recherche s'applique aux matières premières, produits intermédiaires, produits finis commercialisés, - les microorganismes non pathogènes, utilisés comme indicateurs-qualité du processus de production, des matières premières aux produits finis, tout au long de la chaîne, et - les bactéries d'intérêt technologique telles que les ferments.

Dans le cadre de la présence de microorganismes pathogènes, la détection rapide et précise de contaminations présumées permet de les contrôler et d'engager ainsi des actions correctives. Pour pouvoir mettre en évidence la présence de ces microorganismes, il est nécessaire de réaliser des prélèvements suffisamment importants afin de s'assurer de récupérer une quantité minimale de microorganismes. Il faut ensuite augmenter leur concentration, les isoler et les identifier. L'analyse microbiologique nécessite donc une ou plusieurs phases de pré-enrichissement et/ou d'enrichissement, une ou plusieurs phases de détection, une ou plusieurs phases d'énumération des microorganismes. Pour des applications particulières telles le contrôle microbiologique agroalimentaire, une phase de confirmation peut également être requise, afin de répondre aux normes en vigueur dans ce domaine. A l'heure actuelle, il n'existe pas de méthode pour détecter directement un microorganisme cible dans une quantité d'échantillon initiale importante, sans faire appel à une étape d'enrichissement. La phase de pré-enrichissement et/ou d'enrichissement nécessite des milieux de culture, sélectifs ou non, qui ont pour but de promouvoir la croissance des microorganismes cibles dans les échantillons biologiques ou environnementaux, tout en limitant la croissance des flores non cibles. Ainsi, la population cible, qui est souvent présent à des niveaux bas par rapport à la flore annexe présente dans les aliments, est amplifié. L'enrichissement permet donc d'obtenir une concentration des microorganismes de 104 à 106 cellules/millilitre permettant leur détection. La culture peut également revitaliser les cellules microbiennes qui peuvent avoir été stressées lors des process industriels. Les milieux sont souvent utilisés dans des conteneurs du type sac en plastique stérile, dans lesquels ils sont mis en contact avec les échantillons alimentaires ou environnementaux, permettant une remise en suspension et un enrichissement des microorganismes recherchés. Cette phase est nécessaire afin de répondre aux besoins qui est de révéler la présence initiale potentielle d'au moins un microorganisme cible dans une quantité d'échantillon très variable et éventuellement très grande, e.g. 25 grammes (g) à 375 g dilué dans 225 à 3375 millilitres (mL) dans le milieu de culture. A l'issue de cette étape d'enrichissement, un aliquote (de 5 microlitres (pL) à 5 mL) est prélevé pour mettre en oeuvre l'étape de détection des microorganismes cibles. Or, dans cet aliquote, il est nécessaire de disposer d'une quantité suffisante de microorganismes cibles pour s'assurer de leur détection systématique. La phase de détection se base historiquement sur la culture des microorganismes sur milieux géloses, pour la mise en évidence des caractères métaboliques des microorganismes recherchés. On peut utiliser des substrats enzymatiques spécifiques. Ces substrats enzymatiques sont généralement composés de deux parties, une première partie spécifique de l'activité enzymatique à révéler, appelée également partie cible, et une seconde partie faisant office de marqueur, appelée partie marqueur, généralement constituée par un chromophore ou un fluorophore. Par le choix de ces substrats, selon qu'il y a réaction ou non, il est possible de caractériser la nature d'un microorganisme ou de discriminer différents groupes de microorganismes. Ainsi, l'apparition ou la disparition d'une coloration ou d'une fluorescence sera la signature d'un genre ou d'un type de microorganismes. A cet égard, l'utilisation de milieux chromogènes permet la détection et l'identification simultanées des germes recherchés. Elle simplifie le processus et diminue sensiblement le délai d'obtention du résultat. On citera à titre d'exemple concret les milieux ChromIDe de la demanderesse. Ces milieux chromogènes sont basés sur la détection de caractères métaboliques spécifiques des germes recherchés comme par exemple l'activité enzymatique beta-glucuronidase pour Escherichia Les immuno-essais constituent une autre des technologies utilisées pour le test de détection. Ils font appel aux caractéristiques immunogènes des microorganismes recherchés. De façon non exhaustive, on peut citer les techniques ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), par compétition ou de type sandwich.

Enfin, les techniques de biologie moléculaire, basées sur les caractères génomiques des microorganismes recherchés, sont également mises en oeuvre pour détecter et identifier les microorganismes cibles. On citera, à titre d'exemple, les techniques d'amplification classiques telles la PCR (Polymerase Chain Reaction) et la NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification), qui peuvent être couplées à des techniques de détection en temps réel connues de l'homme du métier. La phase de confirmation, quant à elle, est plus particulièrement attachée à l'analyse microbiologique dans le domaine agroalimentaire. En effet, lorsque le résultat des méthodes développées précédemment est positif, il est nécessaire de confirmer la présence du pathogène recherché. Ceci impose un test complémentaire et l'utilisation d'un principe de détection différent de celui utilisé lors de la première analyse. Les techniques décrites supra peuvent à nouveau être utilisées pour la confirmation. L'identification complète et précise d'un microorganisme dans un échantillon nécessite donc l'enchaînement de plusieurs étapes : enrichissement, détection et confirmation. La standardisation des tests utilisés en routine a permis l'automatisation des méthodes de détection. Les étapes préalables à la détection sont les plus chronophages, 6 à 24 heures sont classiquement nécessaires. Ces étapes nécessitent donc la mise en place de nouvelles solutions techniques pour obtenir rapidement les résultats à partir de l'échantillon initial. Des procédés de capture de microorganismes réalisés postérieurement à la phase d'enrichissement ont déjà été décrits. Ainsi les filtres sont largement utilisés. Ils sont néanmoins peu adaptés pour traiter des échantillons de grand volume. Ils sont utilisés davantage pour des échantillons contenant peu de matière alimentaire tels que l'eau ou les boissons. Leur efficacité est, en effet, largement diminuée dès lors que l'échantillon est complexe entrainant l'encombrement des pores des filtres. Des filtres plus sophistiqués ont été élaborés. Ainsi le document WO 2009/018544 décrit un filtre à plusieurs couches comprenant notamment une couche de microbilles poreuses. La centrifugation et la floculation sont également utilisés. Ces méthodes, bien que référencées, présentent plusieurs inconvénients majeurs. Elles sont traumatisantes pour les microorganismes à concentrer. Ainsi, à l'issue de ces traitements, plus de 50% des microorganismes disparaissent ou sont détruits. Elles sont également peu sélectives : les microorganismes centrifugés ou flocules se retrouvent en présence de contaminants qui inhiberont les méthodes d'analyses ultérieures telles que la Réaction de Polymérisation en Chaîne. Ces contaminants peuvent également fausser les analyses. Le document WO 2005/069005 décrit une méthode d'extraction des microorganismes par l'utilisation d'une éponge comprenant des étapes de compression/décompression de l'éponge dans un tampon de lavage pour faciliter le décrochage des substances non souhaitées et enfin une étape d' élution dans un nouveau récipient afin de récupérer l'analyte ciblé. Ce procédé ne prévoit pas une étape d'enrichissement simultanée à la capture des microorganismes cibles. Des systèmes plus complexes ont été également décrits. C'est le cas par exemple du système Pathatrix développé par la société Matrix MicroScience. Ce système est constitué d'une phase de capture, comprenant des anticorps immobilisés sur des billes magnétiques, et sur lesquelles l'échantillon circule. Ce procédé ne prévoit pas non plus une étape d'enrichissement simultanée à la capture des microorganismes cibles. Un autre inconvénient de ce système est que la surface de capture des billes magnétiques reste limitée. Il existe donc un réel besoin pour un nouveau procédé de préparation de l'échantillon permettant de diminuer le temps nécessaire à l'analyse de l'échantillon tout en permettant une détection rapide et efficace des microorganismes cibles. Un objectif de la présente invention est donc de fournir un procédé améliorant la capture et la concentration des microorganismes ou des protéines excrétées. Un autre objectif de la présente invention est de fournir un procédé permettant ainsi une meilleure détection des microorganismes cibles par une revitalisation et une croissance efficace de ces microorganismes. Un autre objectif est de proposer un procédé de capture et de concentration de microorganismes adapté à l'analyse d'échantillons de grand volume, issus de milieux complexes. Par milieux complexes, on entend les milieux contenant des matières biologiques, organiques et minérales en suspension, et notamment les microorganismes cibles.

Un autre objectif de la présente invention est de proposer un procédé de capture et de concentration de microorganismes qui puisse facilement être couplé avec les différentes techniques de détection et d'identification existantes.

A ce titre, l'invention concerne une procédé pour capturer et concentrer au moins un microorganisme ou au moins une protéine sécrétée d'au moins un microorganisme susceptible d'être présent(e) dans un échantillon placé dans un conteneur, le procédé comprenant les étapes suivantes : a) mettre en contact dans le conteneur ledit échantillon avec un milieu de culture et une éponge apte à capturer le(s) microorganisme(s) ou la (les) protéine(s) sécrétée(s) d'un microorganisme à détecter, fonctionnalisée par un partenaire de liaison d'au moins un microorganisme ou d'au moins une protéine excrétée, b) placer le conteneur dans des conditions aptes à permettre la croissance du ou des microorganismes(s) c) presser et décompresser répétitivement l'éponge en restant en contact avec ledit milieu. Au sens de la présente invention, le terme « microorganisme » recouvre les bactéries gram positif ou gram négatif, les levures, les moisissures et plus généralement, les organismes unicellulaires, invisibles à l'oeil nu, qui peuvent être manipulés et multipliés en laboratoire. La présente invention permet également de détecter les protéines sécrétées par les microorganismes. On citera par exemple la détection de toxines secrétées par Staphylococcus aureus. On entend par « échantillon » une petite partie ou petite quantité isolée d'une ou plusieurs entités pour l'analyse. Il peut avoir subi un traitement préalable, tels que le mélange, la dilution dans un milieu liquide ou encore le broyage notamment si l'entité est solide. Les échantillons peuvent être d'origine alimentaire, environnementale ou clinique. Parmi les échantillons d'origine alimentaire, on peut citer de façon non exhaustive un échantillon de produits lactés (yaourts, fromages...), de viande, de poisson, d'oeufs, de fruits, de légumes, d'eau, de boisson (lait, jus de fruits, soda, etc). Ces échantillons d'origine alimentaire peuvent aussi provenir de sauces ou de plats élaborés. Un échantillon alimentaire peut enfin être issu d'une alimentation destinée aux animaux, telle que notamment des farines animales.

On mentionnera aussi les échantillons liés à l'environnement tels les prélèvements de surface, d'eau, d'air. Les échantillons d'origine clinique peuvent correspondre à des prélèvements de fluides biologiques (sang total, sérum, plasma, urine, liquide céphalo-rachidien), de selles, des prélèvements de nez, de gorge, de peau, de plaie, d'organes, de tissus ou de cellules isolées etc. L'échantillon est mis en contact avec un milieu de culture permettant la croissance des microorganismes. Par « milieu de culture », on entend un milieu comprenant tous les éléments nécessaires à la survie et/ou à la croissance des microorganismes. Le milieu de culture peut contenir d'éventuels additifs comme par exemple : des peptones, un ou plusieurs facteurs de croissance, des hydrates de carbone, un ou plusieurs agents sélectifs, des tampons, un ou plusieurs gélifiants etc. Ce milieu de culture peut se présenter sous forme de liquide, de gel prêt à l'emploi, c'est-à-dire prêt à l'ensemencement en tube, flacon ou sur boite de Pétri.

Ainsi, un des aspects avantageux de l'invention est la croissance des microorganismes simultanément à leur capture. La croissance des microorganismes cibles a alors lieu directement sur l'éponge. Le microorganisme étant moins en contact avec la flore microbienne annexe potentiellement présente dans le mélange, la croissance du microorganisme est améliorée et sa localisation facilitée. La concentration du microorganisme ou de la protéine sécrétée est donc améliorée. On entend par « éponge », un support solide compressible formé d'un matériel poreux. Elle peut être d'origine naturelle, artificielle ou synthétique. La forme de l'éponge et la taille des pores peut varier en fonction des applications souhaitées. Dans un mode de réalisation particulier, l'éponge fonctionnalisée est immergée dans le milieu de culture. Dans un autre mode de réalisation, le milieu de culture circule à travers l'éponge. Selon le procédé de la présente invention, l'éponge est pressée et décompressée de façon répétitive. Le volume du milieu de culture mis en contact avec l'éponge est augmenté par l'action de pression / décompression. Ainsi cette étape permet une accélération de la capture de l'analyte dans un volume bien supérieur à celui de l'éponge même. La pression / décompression peut se faire manuellement ou mécaniquement par tout moyen connu de l'homme du métier.

Le partenaire de liaison reconnaissant le microorganisme ou la protéine sécrétée est immobilisé spécifiquement ou non-spécifiquement sur l'éponge. Préférentiellement le partenaire de liaison est choisi parmi les protéines, les anticorps, les antigènes, les aptamères, les phages, les protéines de phages, les acides nucléiques ou les carbohydrates. Il peut être également de nature polymérique (chitosan, poly-L-Lysine, poly-Aniline) de manière à permettre une capture non spécifique des cellules. Le terme antigène désigne un composé susceptible d'être reconnu par un anticorps dont il a induit la synthèse par une réponse immune. Le terme anticorps inclut les anticorps polyclonaux ou monoclonaux, les anticorps obtenus par recombinaison génétique et des fragments d'anticorps. Les phages, ou bactériophages, sont des virus n'infectant que des bactéries ; ils sont également appelés virus bactériens. La fixation sur l'éponge peut correspondre à une immobilisation directe ou indirecte : par immobilisation directe, on entend la fixation par covalence ou adsorption passive. Une immobilisation directe peut être effectuée au moyen d'un ligand fixé chimiquement sur l'éponge. Par immobilisation indirecte, on entend l'interaction ligand/antiligand entre un ligand fixé sur l'antigène, l'anticorps ou le phage (plus largement, le composé fonctionnel) et l'antiligand ou ligand complémentaire fixé sur l'éponge. Les couples ligand/antiligand sont bien connus de l'homme du métier, et on peut citer par exemple les couples suivants : biotine/streptavidine, haptène/anticorps, antigène/anticorps, peptide/anticorps, sucre/lectine, polynucléotide/complémentaire du polynucléotide. Un composé hydrosoluble dérivé d'un homopolymère ou copolymère d'anhydride maléique tels ceux développés par la demanderesse dans le brevet délivré EP 0 561 722 peut également être utilisé pour immobiliser une molécule biologique.

De façon avantageuse, le partenaire de liaison est lié à l'éponge via un polymère de dopamine. Selon un mode de réalisation, le procédé selon la présente invention comporte une étape supplémentaire consistant à transférer tout ou partie du mélange constitué par ledit échantillon, le milieu de culture, l'éponge et éventuellement un système de révélation, du conteneur, dit alors principal vers au moins un deuxième conteneur dit secondaire. Il est possible de réaliser dans le conteneur secondaire éventuellement un enrichissement secondaire, en ajoutant préalablement dans ledit conteneur secondaire, les éléments nutritifs et agents sélectifs ad hoc. Un tel enrichissement secondaire permet d'augmenter la population du ou des microorganisme(s) cible(s) par rapport à celle des microorganismes non cibles, ce qui améliore la spécificité. Préalablement à l'étape de détection et après l'étape c), une ou plusieurs étapes de lavage peuvent avoir lieu.

Selon un mode de réalisation, un système de révélation apte à permettre la détection est mis en contact dans le conteneur principal ou secondaire. On entend par « système de révélation », toute molécule capable de se coupler avec les microorganismes, les protéines sécrétées ou les partenaires de liaison desdits microorganismes et permettant par leurs propriétés de transduction (fluorescence, coloration, radioactivité notamment) de révéler la présence desdits microorganismes. L'étape de détection peut être réalisée en temps réel ou à l'issue de l'étape de croissance du ou desdits microorganismes. Ainsi, le procédé selon la présente invention, peut comprendre une étape supplémentaire de détection du microorganisme ou de la protéine sécrétée lié(e) au partenaire de liaison.

Selon un mode de réalisation, l'éponge est transférée dans un conteneur secondaire contenant un milieu de culture qui peut en sus contenir un substrat permettant la détection d'une activité enzymatique ou métabolique des microorganismes cibles grâce à un signal détectable directement ou indirectement. Pour une détection directe, ce substrat peut être lié à une partie faisant office de marqueur, fluorescent ou chromogène. Pour une détection indirecte, le milieu de culture selon l'invention peut comporter en sus un indicateur de pH, sensible à la variation de pH induite par la consommation du substrat et révélant la croissance des microorganismes cibles. Ledit indicateur de pH peut être un chromophore ou un fluorophore. On citera comme exemples de chromophores le rouge neutre, le bleu d'aniline, le bleu de bromocresol. Les fluorophores comprennent par exemple la 4-méthylumbelliferone, les dérivés de l'aminocoumarine ou les dérivés de la résorufine. Un autre exemple de détection indirecte peut consister en l'utilisation de latex sensibilisé spécifiquement avec un anticorps dirigé contre l'analyte recherché. Selon un mode de réalisation, le système de révélation est un substrat non spécifique internalisé du ou des microorganismes à détecter. Selon un exemple particulier, le système de révélation est basé sur la réduction du TTC par les microorganismes. Simultanément à la croissance, le TTC (incolore sous sa forme non réduite) est internalisé par lesdits microorganismes, puis réduit par ces derniers en triphényl-formazan (rouge) colorant ainsi lesdits microorganismes en rouge et permettant alors leur révélation sur l'éponge. Le procédé de détection directe et en temps réel de microorganismes dans un échantillon alimentaire, pendant la période d'incubation, est effectué par lecture optique de l'éponge, de manière automatisée ou non. L'incubation peut être réalisée à des températures comprises entre 25 et 44°C pendant 6 à 48h. Aussi une fois la capture effective d'une certaine quantité de microorganismes cibles colorés (cas d'un échantillon positif), il se produit un changement des propriétés optiques de l'éponge par apparition d'une coloration rouge sur celui-ci (i.e. transduction du signal biologique). Cette coloration du support de capture est alors détectable à l'oeil ou mesurable via l'utilisation d'un automate de lecture tel qu'une caméra. Pour faciliter la lecture, il est préférable que l'éponge ne soit plus en contact avec le milieu de culture. A cette fin, il peut être envisagé par exemple de pencher le sac d'homogénéisation.

Comme explicité supra, la lecture peut être faite en point final, en pointillés ou en temps réel. Selon un autre mode de réalisation, le système de révélation est un colorant cellulaire du ou des microorganismes à détecter. L'étape de détection peut être réalisée à l'aide d'un moyen choisi parmi les moyens de détection optiques, les moyens de détection magnétiques, les moyens de détection électrochimiques, les moyens de détection électriques, les moyens de détection acoustiques, les moyens de détection thermiques. Selon un mode de réalisation, l'étape de détection est réalisée directement sur l'éponge. Selon un mode de réalisation particulier, l'éponge est pressée au cours de l'étape de détection permettant ainsi une amplification du signal.

Dans un autre mode de réalisation, le procédé selon l'invention comprend une étape supplémentaire d'élution du microorganisme et/ou de la protéine sécrétée capturé(e) par l'éponge. Cette étape a lieu avant l'étape de détection. Cette étape est particulièrement avantageuse pour les méthodes de détection mettant en oeuvre des techniques immunochimiques, l'amplification des acides nucléiques, la spectroscopie de masse ou encore la spectroscopie RAMAN. Les exemples présentés ci-après ont pour but de présenter différents modes de réalisation du procédé selon l'invention et les résultats obtenus. Ils ne sont nullement limitatifs de l'invention.30 EXEMPLE Exemple 1: Elaboration d'un support de capture sensibilisé avec au moins un partenaire de liaison spécifique du microorganisme cible permettant la capture des microorganismes cibles Un support de capture, une éponge, constitué d'un cube de mousse en polyuréthane d'une contenance interne d'environ 2 ml est sensibilisé de la manière suivante : Le cube de mousse en polyuréthane (éponge) est « rempli » par des cycles de compréssion/décompréssion par une solution de 3,4 dihydoxyphénylalanine à 2 g/1 en tampon Tris-HC1 pH 8.5 puis reste immergé dans ladite solution à température ambiante pendant 1824h. L'éponge est ensuite rincée en eau déminéralisée stérile 3 fois par des cycles compression / décompression.

L'éponge est alors immergée pendant deux heures à température ambiante dans une solution de partenaires de liaison spécifiques (1 i.tg/mL à 401.1g/mL) en tampon PBS pH 7.2; L'éponge est enfin passivée dans une solution de BSA en tampon Tris-Maléate à pH 6.2, pendant 1 heure à température ambiante. L'éponge est ensuite rincée dans un tampon PBS pH 7.2, 3 fois par cycles de compression / 20 décompression. Le cube de mousse sensibilisé peut être utilisé pour la capture des microorganismes ou conservé à 2-8°C en vue d'une utilisation ultérieure. 25 Exemple 2 : Détection optique de la présence d'Escherichia coli 0157:117 dans un échantillon alimentaire via l'utilisation d'une éponge sensibilisés Le but de cette expérimentation est de détecter directement, via l'utilisation d'un support sensibilisé, tel que décrit supra, la présence de la bactérie cible E. coli 0157:H7 dans un 30 échantillon alimentaire en cours d'enrichissement. Comme détaillé ci-après, la détection s'effectue pendant la période d'incubation en immergeant le support de capture sensibilisé avec une protéine de phage recombinante anti-E. coli 0157:H7 dans un sac d'homogénéisation qui contient l'échantillon alimentaire, dilué au 1/10ème dans le milieu réactionnel.

Deux échantillons sont préparés comme suit : Echantillon A : Dans un sac d'homogénéisation, 25g de steak haché contaminés par 5 unités formant colonies (UFC) de E. coli 0157:H7 sont remis en suspension dans 225 mL d'EPT (bioMérieux, Réf. 42043) supplémentés par 0.01g/L de vancomycine (Sigma, Cat. No. 75423). Echantillon B : Dans un sac d'homogénéisation, 25g de steak haché non contaminés par E. coli 0157:H7 sont remis en suspension dans 225 ml d'EPT (eau peptonée tamponnée) supplémentés par 0.01g/L de vancomycine.

Pour chaque échantillon, les analyses sont faites en trois exemplaires. Les éponges sensibilisées sont immergées dans les sacs d'homogénéisation avant incubation. Les sacs sont ensuite refermés à l'aide d'une barrette de fermeture et incubés dans une étuve à 41.5°C pendant 16-24h.

Les sacs sont ensuite placés dans un système permettant la pression / décompression des éponges fonctionnalisées pendant toute la durée de l'incubation (fréquence : 1 cycle en 10 seconde). Au terme de la période d'incubation (20h à 41.5°C) les éponges sont retirées des sacs d'enrichissement et lavées dans un sac stomacher contenant 90 ml de tampon PBS (30 secondes de stomachage). Cette opération a pour but d'éliminer au maximum les éléments non cibles susceptibles d'être présents dans les alvéoles de l'éponge. La présence des microorganismes cibles est révélée sur les éponges sensibilisées : Les éponges sont mises en contact dans une seringue avec 500 pl d'une solution conjuguée d'anticorps anti- E.coli 0157 :H7 marqués à la PAL (phosphatase alcaline) pendant 10 minutes. Des étapes de lavages sont effectués en tampon PBS-Tween par plusieurs mouvements de piston des seringues. Mise en contact de 400 pl de substrat 4 methyl-umbelliferone phosphate afin de révélé la présence éventuelle de conjugué PAL si le test est positif. La vérification de la capture de E.coli 0157 :H7 sur les éponges fonctionnalisées est mise en évidence par l'apparition de la fluorescence due à l'action de la phosphatase alcaline (PAL) présente dans le conjugué sur le substrat.

Il s'agit ici d'un mode de réalisation afin de confirmer la capture de E.coli 0157 :H7 sur le support type éponge. La finalité est bien de concentrer l'analyte en cours de croissance sur l'éponge afin de diminuer le temps de la phase d'enrichissement et de procéder ensuite aux étapes d'élution et de détection du ou des microorganismes.

Claims (14)

1. REVENDICATIONS1. Procédé pour capturer et concentrer au moins un REVENDICATIONS1. Procédé pour capturer et concentrer au moins un microorganisme ou au moins une protéine sécrétée d'un microorganisme susceptible d'être présent(e) dans un échantillon placé 5 dans un conteneur, la procédé comprenant les étapes suivantes : a) mettre en contact dans le conteneur ledit échantillon avec un milieu de culture et une éponge apte à capturer le(s) microorganisme(s) ou la (les) protéine(s) sécrétée(s) d'au moins un microorganisme à détecter, fonctionnalisée par un partenaire de liaison d'au moins un microorganisme ou d'au moins une protéine sécrétée, 10 b) placer le conteneur dans des conditions aptes à permettre la croissance du ou des microorganismes(s), presser et décompresser répétitivement l'éponge en restant en contact avec ledit milieu.
2. 2. Procédé selon la revendication 1 dans laquelle l'éponge est immergée dans ledit milieu.
3. 3. Procédé selon la revendication 1 dans laquelle ledit milieu circule à travers l'éponge.
4. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, comportant une étape supplémentaire consistant à transférer tout ou partie du mélange constitué par ledit échantillon, le milieu de culture, l'éponge et éventuellement un système de révélation, du conteneur, dit alors principal vers au moins un deuxième conteneur dit secondaire.
5. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 comprenant une étape supplémentaire de détection d'au moins un microorganisme ou d'au moins une protéine sécrétée lié(e) à l'éponge.
6. 6. Procédé selon la revendication 5, dans lequel un système de révélation apte à 30 permettre la détection est mis en contact dans le conteneur principal ou secondaire préalablement à l'étape de détection.
7. 7. Procédé selon la revendication 6 dans laquelle l'étape de détection est réalisée à l'aide d'un moyen choisi parmi les moyens de détection optiques, les moyens .de détection 35 magnétiques, les moyens de détection électrochimiques, les moyens de détection électriques, les moyens de détection acoustiques, les moyens de détection thermiques.
8. 8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 7 dans lequel le système de révélation est un substrat non spécifique internalisé du ou des microorganismes à détecter.
9. 9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 7dans lequel le système de révélation est un colorant cellulaire du ou des microorganismes à détecter.
10. 10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 9 dans laquelle l'étape de détection est réalisée directement sur l'éponge.
11. 11. Procédé selon la revendication 10 dans lequel l'éponge est pressée.
12. 12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 comprenant une étape supplémentaire d'élution du microorganisme ou de la protéine sécrétée capturé(e) par 15 l'éponge.
13. 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6à 11 dans laquelle l'étape de détection est réalisée en temps réel. 20
14. 14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 6 à 12 dans laquelle l'étape de détection est réalisée à l'issue de l'étape de croissance du ou desdits microorganismes. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 14 dans laquelle un partenaire de liaison spécifique ou non spécifique d'au moins un microorganisme ou d'au moins une 25 protéine sécrétée est lié(e) à l'éponge. 16. Procédé selon la revendication 15 dans laquelle le partenaire de liaison spécifique est sélectionné dans un groupe comprenant les protéines, les anticorps, les antigènes, les phages, les protéines de phage, les aptamères, les acides nucléiques. 30 17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 15 ou 16 dans laquelle le partenaire de liaison est lié à l'éponge via un polymère de dopamine.