FR2982859A1 - Epitope hla-dr7 hy et methode de traitement de la leucemie - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne des polypeptides épitopiques HY spécifiquement présentés par la molécule HLA-DR7, un procédé de préparation de ces polypeptides épitopiques, des lymphocytes T isolés capables de reconnaître spécifiquement un épitope issu de ces polypeptides ou d'un polypeptide comprenant la séquence complète de la protéine codée par le gène RPS4Y et présenté par la molécule HLA-DR7 exprimée à la surface de cellules présentatrices d'antigène, un procédé de préparation de ces lymphocytes T, ainsi que l'utilisation de ces polypeptides épitopiques et de ces lymphocytes T comme médicaments, en particulier pour le traitement d'un cancer des cellules immunitaires.
Description
Epitope HLA-DR7 HY et méthode de traitement de la leucémie La présente invention concerne des polypeptides épitopiques HY spécifiquement présentés par la molécule HLA-DR7, un procédé de préparation de ces polypeptides épitopiques, des lymphocytes T isolés capables de reconnaître spécifiquement ces polypeptides épitopiques, un procédé de préparation de ces lymphocytes T, ainsi que l'utilisation de ces polypeptides épitopiques et de ces lymphocytes T comme médicaments, en particulier pour le traitement d'un cancer des cellules immunitaires.
Les antigènes d'histocompatibilité mineure (mHAg) sont des peptides présentés par les molécules HLA et codés par des gènes autosomiques ou présents sur les chromosomes sexuels (Simpson et Roopenian (1997) Curr. Opin. Immunol. 9:655-661). Leur disparité entre des paires de donneur/receveur présentant par ailleurs le même typage HLA est associée à un risque augmenté d'échec de la greffe et/ou de maladie de greffon contre l'hôte (GVHD), après une greffe de moelle osseuse (Hambach et Goulmy (2005) Curr. Opin. Immunol. 17:202-210; Falkenburg et al. (2003) Exp. Hematol. 31:743751). L'antigène HY fait partie de ces mHAg. Codé par des gènes situés sur le chromosome Y, il sera ciblé par des lymphocytes T issus de donneurs féminins après une greffe de moelle osseuse entre sexes différents dans une paire de membres de la même fratrie par ailleurs HLA-identique (Vogt et al. (2002) Blood 99:3027-3032). Cependant, cette non-correspondance de mHAg entre donneur et receveur peut également avoir des avantages. En effet, elle peut induire un effet greffon contre leucémie (GVL) ou greffon contre tumeur (GVT), en fonction de la distribution tissulaire de ces mHAg. Ainsi, l'expression de mHAg exclusivement sur des cellules malignes ou des cellules hématopoïétiques peut conduire de façon préférentielle à un effet GVL ou GVT, tandis qu'un mHAg exprimé de façon ubiquitaire conduira plutôt à un effet GVHD (Ferrara et al. (2009) Lancet. 373:1550-1561). Par exemple, il a été démontré que les deux mHAg HA-1 et HA-2, restreints aux HLA de classe I et dont l'expression est limitée aux cellules hématopoïétiques, induisent un effet GVL en stimulant les lymphocytes T CD8+ cytotoxiques provenant du donneur qui reconnaissent les cellules malignes du receveur (Marijt et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:2742-2747; Hambach et al. (2006) Leukemia 20:371-374). Une autre façon de cibler spécifiquement les cellules malignes du receveur pour obtenir un effet GVL est associée au fait que l'épitope du mHAg est présenté par un type spécifique de molécule HLA. Alors que les molécules HLA de classe I sont exprimées de façon ubiquitaire, les molécules HLA de classe II sont exprimées principalement sur les cellules présentatrices de l'antigène, les lymphocytes B, les lymphocytes T activés et les cellules endothéliales. Des cellules de leucémie, de myélome et d'autres cellules de tumeur exprimant les molécules HLA de classe II peuvent ainsi être ciblées par des lymphocytes T reconnaissant spécifiquement un mHAg présenté par une molécule HLA de classe II, sans conduire à des effets délétères sur les tissus normaux (Rutten et al. (2008) Leukemia 22:1387-1394). Il est donc particulièrement utile de pouvoir identifier des mHAg restreints aux molécules HLA de classe II, en vue de traitement de cancers par immunothérapie.
Plusieurs mHAg restreints aux molécules HLA de classe I ont été identifiés chez l'homme, en utilisant différents procédés, tels qu'un criblage de banques d'ADNc plasmidique, l'élution de peptides liés au HLA, et l'analyse de liaison génétique. Très récemment, une nouvelle stratégie utilisant le balayage d'association de génome total, a été rapportée comme conduisant à la caractérisation efficace de 10 nouveaux mHAg restreints aux molécules HLA de classe I. Cependant, l'identification de mHAg restreints aux molécules HLA de classe II est plus difficile à effectuer. Chez l'homme, parmi les gènes candidats qui pourraient coder un antigène HY, il a été démontré que seulement six, RPS4Y, UPS9Y, DDX3Y, UTY, TMSB4Y et SMCY, codaient des épitopes HY cliniquement pertinents. Cependant, la plupart d'entre eux sont restreints au HLA de classe I. Seuls deux, DDX3Y et RPS4Y, codent pour des mHAg restreints au HLA de classe II. De plus, à ce jour, très peu de peptides ont été caractérisés. Or, du fait du polymorphisme important des molécules HLA de classe II, il est particulièrement important d'identifier de nouveaux peptides épitopiques des mHAg de manière à pouvoir traiter un plus grand nombre de patients.
Les présents inventeurs ont ici identifié de manière inattendue, à partir d'un patient masculin souffrant d'une GVHD modérée après greffe de moelle osseuse issue de sa soeur HLA-identique, un peptide épitopique HY restreint à la molécule HLA de classe II HLA-DR7 et codé par le gène RPS4Y. Ce peptide a été identifié comme étant reconnu par une population de lymphocytes T CD4+ présentant à la fois des fonctions auxiliaires et cytotoxiques contre les cellules présentant le peptide restreint par HLA-DR7. Cette population de lymphocytes T CD4+ a été isolée par les inventeurs après plusieurs cycles de stimulation de lymphocytes T CD4±/CD8+ doubles positifs, provenant de biopsies de peau de ce patient greffé, avec des cellules présentatrices de l'antigène issues de ce même patient.35 La présente invention concerne donc un polypeptide isolé comprenant : a) la séquence TGKIINFIKFDTGNL (SEQ ID NO: 1), ou b) un fragment peptidique d'au moins 9 acides aminés consécutifs de la séquence SEQ ID NO: 1, ou c) un variant de la séquence SEQ ID NO: 1 ou du fragment selon b) différant de la séquence SEQ ID NO: 1 ou du fragment selon b) par substitution conservative d'un, deux ou trois acides aminés; ou d) un peptidomimétique de la séquence SEQ ID NO: 1, du fragment selon b) ou du variant selon c), ledit fragment peptidique, ledit peptidomimétique et ledit variant ayant la capacité d'activer des lymphocytes T lorsqu'il est présenté par la molécule HLA-DR7; ledit polypeptide ne comprenant ni la séquence complète de la protéine codée par le gène RPS4Y, ni la séquence TIRYPDPVI (SEQ ID NO: 2), ni la séquence VIKVNDTCQI (SEQ ID NO: 3).
Elle concerne également un acide nucléique comprenant ou consistant en une séquence codant ce polypeptide, ainsi qu'un vecteur comprenant cet acide nucléique lié de manière opérante à un ou des élément(s) permettant l'expression du polypeptide. Un autre objet de la présente demande est relatif à un procédé de production du polypeptide selon l'invention, comprenant les étapes consistant à : a) synthétiser ledit polypeptide par voie chimique ou faire exprimer ledit polypeptide par une cellule comprenant l'acide nucléique ou le vecteur selon l'invention; et b) récupérer ledit polypeptide obtenu à l'étape a). La présente invention a par ailleurs pour objet un lymphocyte T isolé capable de reconnaître spécifiquement un épitope issu du polypeptide selon l'invention ou d'un polypeptide comprenant la séquence complète de la protéine codée par le gène RPS4Y et présenté par la molécule HLA-DR7 exprimée à la surface de cellules présentatrices d'antigène, ainsi qu'une méthode de préparation in vitro d'un tel lymphocyte T, comprenant les étapes de : - co-culture de lymphocytes T avec des cellules présentatrices d'antigène exprimant à leur surface la molécule HLA-DR7 à laquelle est liée un épitope issu du polypeptide selon l'invention ou d'un polypeptide comprenant la séquence complète de la protéine codée par le gène RPS4Y; et - récupération des lymphocytes T à partir de ladite co-culture. Elle concerne également une composition pharmaceutique comprenant (i) le polypeptide selon l'invention ou un lymphocyte T selon l'invention et (ii) un véhicule pharmaceutiquement acceptable, ainsi qu'un médicament comprenant le polypeptide selon l'invention ou un lymphocyte T selon l'invention. La présente invention est également dirigée vers le polypeptide isolé selon l'invention, ou un polypeptide comprenant la séquence complète de la protéine codée par le gène RPS4Y, ou le lymphocyte T isolé selon l'invention, pour son utilisation pour le traitement d'un cancer des cellules immunitaires.
Description détaillée de l'invention Polypeptide La présente invention concerne un polypeptide isolé comprenant ou consistant en: a) la séquence TGKIINFIKFDTGNL (SEQ ID NO: 1), ou b) un fragment peptidique d'au moins 9 acides aminés consécutifs de la séquence SEQ ID NO: 1, ou c) un variant de la séquence SEQ ID NO: 1 ou du fragment selon b) différant de la séquence SEQ ID NO: 1 ou du fragment selon b) par substitution conservative d'un, deux ou trois acides aminés, ou d) un peptidomimétique de la séquence SEQ ID NO: 1, du fragment selon b) ou du variant selon c), ledit fragment peptidique ayant la capacité d'activer des lymphocytes T lorsqu'il est présenté par la molécule HLA-DR7; ledit polypeptide ne comprenant ni la séquence complète de la protéine codée par le gène RPS4Y, ni la séquence TIRYPDPVI (SEQ ID NO: 2), ni la séquence VIKVNDTCQI (SEQ ID NO: 3). Dans le contexte de l'invention, le terme "HLA" ou "antigène des leucocytes humains" ("human leucocyte antigen") désigne une protéine du Complexe Majeur d'Histocompatibilité (CMH) de classe I ou de classe II humain, un cluster de gènes localisé sur le bras court du chromosome 6. Le CMH est divisé en trois régions : la région de classe I qui contient les gènes principaux HLA-A, HLA-B et HLA-C; la région de classe Il qui contient les gènes HLA de classe II DR, DQ et DP; et la région de classe III qui contient des gènes codant pour d'autres produits intervenant dans la réponse immunitaire. Les molécules HLA de classe II sont des dimères constitués d'une chaîne lourde a et d'une chaîne légère (3, toutes les deux codées dans la région CMH de classe II. Chaque chaîne est organisée en domaines : deux domaines externes N-terminaux (a1, a2 et (31, lu respectivement), un domaine hydrophobe transmembranaire et un domaine intracytoplasmique C-terminal. Il existe à chaque locus du CMH de classe Il - DR, DQ et DP - deux gènes A et B codant pour les chaînes a et (3 correspondantes. La chaîne DR(3 a la particularité d'être codée par quatre loci (HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4 et HLA- DRB5). Cependant, pas plus de trois loci fonctionnels sont présents chez un individu, et pas plus de deux sur un chromosome. Selon l'haplotype HLA, une ou deux molécules DR sont exprimées : la molécule 41, codée par les loci DRA et DRB1, est toujours présente. Les individus exprimant l'haplotype DR3, DR17, DR18, DR5 (DR11, DR12), DR6 (DR13 ou DR14) portent et expriment le gène DRB3. Les individus DR4, DR7 ou DR9 portent et expriment le gène DRB4, alors que les individus DR2 (DR15 ou DR16) portent et expriment le gène DRB5. Les individus DR1, DR10 ou DR8 n'expriment que le gène DRB1. Comme il est bien connu de l'homme du métier, la nomenclature des allèles des HLA de classe Il, et en particulier les allèles HLA-DR est variable. Le tableau 1 ci-dessous rappelle la correspondance entre la nomenclature ancienne et la nomenclature actuelle des allèles HLA-DR. Dans la nouvelle nomenclature, l'identification du gène de classe Il est suivie d'un astérisque, puis du numéro de l'allèle et enfin du sous-allèle. Ainsi, l'allèle "HLA-DRB1*0701" correspond au locus DRB1, allèle 07, sous-type 01.
Tableau 1: Correspondance entre la nomenclature ancienne et la nomenclature actuelle des allèles HLA-DR. Nomenclature actuelle Nomenclature ancienne DRB1*0101 DR1, Dw1 DRB1*0102 DR1, Dw20 DRB1*0103 DR'BR', Dw'BON' DRB11501 DR2, DRw15, Dw2 DRB1*1502 DR2, DRw15, Dw12 DRB11601 DR2, DRw16, Dw21 DRB1*1602 DR2, DRw16, Dw22 DRB1*0301 DR3, DRw17, Dw3 DRB1*0302 DR3, DRw18 DRB1*0401 DR4, Dw4 DRB1*0402 DR4, Dw10 DRB1*0403 DR4, Dw13, 13.1 DRB1*0404 DR4, Dw14, 14.1 DRB1*0405 DR4, Dw15 DRB1*0406 DR4, Dw'KT2' DRB1*0407 DR4, Dw13, 13.2 DRB1*0408 DR4, Dw14, Dw14.2 DRB1*0409 DR4 DRB1*0410 DR4 DRB1*0411 DR4 DRB11101 DR5, DRw11, Dw5, DRw11.1 DRB11102 DR5, DRw11, DRw11.2 Nomenclature actuelle Nomenclature ancienne DRB1*1103 DR5, DRw11, DRw11.3 DRB1*1104 DR5, DRw11 DRB1*1201 DR5, DRw12, Dw'DB6' DRB1*1202 DR5, DRw12, DRw12b DRB1*1301 DRw6, DRw13, Dw18, DRw6a DRB1*1302 DRw6, DRw13, Dw19, DRw6c DRB1*1303 DRw6, DRw13, Dw'HAG' DRB1*1304 DRw6, DRw13 DRB1*1305 DRw6, DRw13 DRB1*1401 DRw6, DRw14, Dw9, Drw6b DRB1*1402 DRw6, DRw14, Dw16 DRB1*1403 DRw6, DRw14 DRB1*1404 DRw6, DRw6b.2 DRB1*1405 DRw6, DRw14 DRB1*0701 DR7, Dw17 DRB1*0801 DRw8, Dw8.1 DRB1*08021 DRw8, Dw8.2 DRB1 *08022 DRw8, Dw8.2 DRB1*08031 DRw8, Dw8.3 DRB1 *08032 DRw8, Dw8.3 DRB1*0804 DRw8 DRB1*09011 DR9, Dw23 DRB1*09012 DR9, Dw23 DRB1*1001 DRw10 DRB3*0101 DRw52a, Dw24 DRB3*0201 DRw52b, Dw25 DRB3*0202 DRw52b, Dw25 DRB3*0301 DRw52c, Dw26 DRB4*0101 DRw53 DRB5*0101 DR2, DRw15, Dw2 DRB5*0102 DR2, DRw15, Dw12 DRB5*0201 DR2, DRw16, Dw21 DRB5*0202 DR2, DRw16, Dw22 Le sérotype HLA-DR7 correspond ainsi à un sérotype HLA-DR qui reconnait les produits géniques issus des allèles DRB1*0701 à DRB1 *0705. Les domaines externes les plus polymorphes de la molécule HLA de classe Il (al et (31) forment une cavité ouverte sur les côtés, permettant de loger un peptide d'environ 15 à 25 acides aminés. Le peptide interagirait plus particulièrement au niveau de la cavité par l'intermédiaire de trois ou quatre résidus ancrés situés dans la partie centrale du peptide, dont les chaînes latérales plongeraient dans des poches du fond du sillon. Ainsi un peptide de séquence optimale se lie et est présenté par une molécule HLA de classe Il spécifique qui lui correspond. Dans le contexte de l'invention, le terme "peptide" est utilisé de manière interchangeable avec "polypeptide" pour désigner une série de résidus, typiquement des acides L-aminés, connectés les uns aux autres par des liaisons peptidiques entre les groupements a-aminé et carboxyles des acides aminés adjacents. Dans certains modes de réalisation, le polypeptide selon l'invention est constitué de moins de 50 acides aminés, de préférence de moins de 45 acides aminés, moins de 40 acides aminés, moins de 35 acides aminés, moins de 30 acides aminés, moins de 25 acides aminés, moins de 20 acides aminés, et de préférence entre toutes, moins de 15 acides aminés. De manière davantage préférée, le polypeptide selon l'invention est constitué de 9 à 40 acides aminés, de préférence de 10 à 39 acides aminés, de 11 à 38 acides aminés, de 12 à 37 acides aminés, de 13 à 36 acides aminés, de 14 à 35 acides aminés, de 15 à 34 acides aminés, de 16 à 33 acides aminés, de 17 à 32 acides aminés, de 18 à 31 acides aminés, de 19 à 30 acides aminés, de 20 à 29 acides aminés , de 21 à 28 acides aminés, de 22 à 27 acides aminés, de 23 à 26 acides aminés, ou de 24 à 25 acides aminés. Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, le polypeptide est constitué de 40 acides aminés. Dans un autre mode de réalisation préféré, le polypeptide selon l'invention est constitué de 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 ou 9 acides aminés. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, le polypeptide selon l'invention est constitué de 15 acides aminés. Dans un mode de réalisation particulier, le polypeptide selon l'invention comprend ou consiste en la séquence SEQ ID NO: 4.
Par "peptidomimétique" d'un peptide de référence, on entend ici un polypeptide modifié chimiquement ou enzymatiquement par rapport au peptide de référence, par exemple pour améliorer sa stabilité ou sa biodisponibilité. Les peptidomimétiques selon l'invention peuvent en particulier être obtenus par modification structurale du peptide de référence, de préférence en utilisant des acides aminés non naturels, tels que des acides D-aminés au lieu d'acides L-aminés induisant ainsi un changement de chiralité, des restrictions conformationnelles, des remplacements isostériques, une cyclisation ou d'autres modifications. D'autres modifications préférées incluent celles dans lesquelles une ou plusieurs liaison(s) amide est(sont) remplacée(s) par une liaison non-amide ou est(sont) modifiée(s) par exemple par acylation (de préférence acétylation) ou alkylation au niveau de l'azote ou du carbone a; et/ou une ou plusieurs chaîne(s) latérale(s) d'acide aminé est(sont) remplacée(s) par un groupement chimique différent; ou un ou plusieurs parmi l'extrémité N-terminale, l'extrémité C-terminale et une ou plusieurs chaîne(s) latérale(s) est(sont) protégé(s) par un groupement protecteur; et/ou des doubles liaisons et/ou une cyclisation et/ou une stéréospécificité est introduite dans la chaîne de l'acide aminé pour augmenter la rigidité et/ou l'affinité de liaison. Sont également envisagées des modifications de l'extrémité C-terminale ou N-terminale des polypeptides tels que la désamination ou l'acylation N-terminale (de préférence l'acétylation), ou tels que l'amidation ou l'estérification C-terminale; des changements en azapeptides, dans lesquels un ou plusieurs carbone(s) a est(sont) remplacé(s) par des atomes azote; des changements en (3-peptides, dans lesquels on ajoute un ou plusieurs carbone(s) du coté N-a ou du côté C-a de la chaîne principale. A ce titre, on peut modifier un ou plusieurs des acides aminés lysine (K) des peptides, notamment par amidation, amination, ou par formation des groupements N-oxyde, N-nitroso, N-dialkyl phosphoryle, N-sulfényle, ou N-glycoside.
On peut par ailleurs aussi ou alternativement modifier un ou plusieurs acide(s) aminé(s) thréonine (T) et/ou sérine (S) des polypeptides, notamment en introduisant au niveau du groupe OH de la chaîne latérale de la thréonine et/ou de la sérine, un groupement ester ou éther. L'estérification peut être réalisée à l'aide d'un acide carboxylique, d'un anhydride, par pontages, etc, pour former par exemple des acétates ou des benzoates. L'éthérification, qui donne des composés plus stables, peut être effectuée à l'aide d'un alcool, d'un halogénure, etc, pour former par exemple un méthyl éther ou un 0-glycoside. On peut par ailleurs aussi ou alternativement modifier un ou plusieurs acide(s) aminé(s) glutamine (Q) par exemple par amidation, en formant des amines secondaires ou tertiaires, notamment avec des groupements de type méthyl, éthyl, fonctionnalisés ou non. On peut par ailleurs aussi ou alternativement modifier un ou plusieurs acide(s) aminé(s) glutamate (E) et/ou aspartate (D), par exemple par estérification, pour former des méthyl esters substitués ou non, des éthyl esters, benzyl esters, des thiols (esters activés) ; et par amidation, notamment pour former des groupements N,N-diméthyle, nitroanilides, pyrrolidinyles. En revanche, il est préférable de ne pas modifier les acides aminés proline, qui participent à la structure secondaire des peptides, sachant en outre que les acides aminés G, A et M n'offrent généralement pas de possibilités de modifications qui seraient manifestement intéressantes. Par "substitution conservative" d'un acide aminé, on entend ici le remplacement d'un acide aminé par un autre ayant des propriétés similaires (par exemple polarité, potentiel de liaison hydrogène, acidité, basicité, hydrophobicité, présence d'un groupe aromatique, etc). Les acides aminés ayant des propriétés similaires sont bien connus de l'homme du métier. Par exemple, l'arginine, l'histidine et la lysine, des acides aminés hydrophiles-basiques, peuvent être interchangeables. De manière similaire, l'isoleucine, un acide aminé hydrophobe, peut être remplacé par la leucine, la méthionine ou la valine. Des exemples de substitutions conservatives sont présentés dans le tableau 2 ci-dessous.
Tableau 2: Substitutions conservatives I Caractéristique de la chaîne latérale Acide aminé Non polaire G A P I L V Polaire non chargé C S T M N Q Polaire chargé D E K R Aromatique H F W Y Autre NQDE Alternativement, les acides amines conservatifs peuvent être groupés comme décrit dans Lehninger (1975, Biochemistry, 2nde Edition, Worth Publishers, Inc. New-York: NY., p. 71-77), comme montré dans le tableau 3 ci-dessous.
Tableau 3: Substitutions conservatives II Caractéristique de la chaîne latérale Acide aminé Non polaire Aliphatique A L I V P Aromatique F W Contenant du souffre M Frontière G Polaire non chargé Hydroxyle S T Y Amides N Q Sulfhydrile C Frontière G Chargé positivement (basique) K R H Chargé négativement (acide) D E Selon une autre alternative, des exemples de substitutions conservatives sont présentés dans le tableau 4 ci-dessous. Tableau 4: Substitutions conservatives III Résidu d'origine Exemple de substitution A VLI R K Q N N QHKR D E C S G N E D H NQKR I LVMAF L IVMAF K R Q N M LFI F LVIA Résidu d'origine Exemple de substitution P G S T T S W Y Y WFTS V ILMFA Par polypeptide "isolé", on entend ici un polypeptide isolé du corps humain ou de l'organisme d'un mammifère non humain. En particulier, un polypeptide isolé selon l'invention est de préférence substantiellement ou essentiellement débarrassé des composants qui l'accompagnent habituellement lorsqu'il est trouvé dans son état natif. Ainsi, les peptides selon l'invention ne comprennent pas de matériels qui leurs sont normalement associés dans leur environnement in situ, tels que les molécules HLA de classe II sur les cellules présentatrices de l'antigène. Cependant, le polypeptide isolé peut par exemple être présent dans une composition pharmaceutique ou dans un kit. De manière préférée, le polypeptide est présent dans une des compositions pharmaceutiques décrites ci-dessous. Ce polypeptide est de préférence sous forme purifiée. Par "fragment" d'une séquence de référence, on entend ici une séquence qui a une taille inférieure à la séquence de référence. Dans le cadre de cette invention, les fragments peptidiques ont une longueur d'au moins 9 acides aminés. Ils peuvent par exemple avoir une taille de 9, 10, 11, 12, 13, ou 14 acides aminés. Par "fragment peptidique d'au moins x acides aminés", on entend ici que le fragment peptidique consiste en une séquence d'au moins x acides aminés. Les polypeptides selon l'invention ont la capacité d'activer des lymphocytes T lorsqu'ils sont présentés par la molécule HLA-DR7.
Par "polypeptide présenté par la molécule HLA-DR7", on entend ici que le polypeptide est lié à la molécule HLA-DR7 de telle sorte qu'il peut également être reconnu par un récepteur présent à la surface des lymphocytes T. Les techniques permettant de mettre en évidence la liaison entre un peptide et une molécule HLA sont bien connues de l'homme du métier. Elles peuvent par exemple mettre en oeuvre des cellules vivantes, comme décrit dans Ceppellini et al. (1989) Nature 339:392; Christinck et aL (1991) Nature 352:67; Busch et al. (1990) Int. Immunol. 2:443; Hill et al. (1991) J. Immunol. 147:189 ou del Guercio et al. (1995) J. Immunol. 154:685; des systèmes acellulaires utilisant des lysats obtenus avec des détergents, comme décrit dans Cerundolo et al. (1991) J. Immunol. 21:2069; des molécules HLA purifiées immobilisées comme décrit dans Hill et al. (1994) J. Immunol. 152:2890 ou Marshall et al. (1994) J. Immunol. 152:4946; des systèmes ELISA comme décrit dans Reay et al. (1992) EMBO J. 11:2829; la résonnance plasmonique de surface comme décrit dans Khilko et al. (1993) J. BioL Chem. 268:15425; ou des tests en phase soluble à haut flux (Hammer et al. (1994) J. Exp. Med. 180:2353). La liaison entre un peptide et une molécule HLA-DR est typiquement détectée en utilisant le protocole consistant à induire la reconnaissance du complexe HLA-peptide par des lymphocytes T exprimant un récepteur T spécifique de ce complexe. Cette reconnaissance peut être mesurée par des techniques bien connues de l'homme du métier, telles que des techniques de mesure de prolifération cellulaire dans le cas où le lymphocyte T exerce une fonction auxiliaire; de mesure de lyse des cellules présentatrices d'antigène dans le cas où le lymphocyte T est cytotoxique; de mesure de sécrétion d'interleukines, de mesure du niveau des ARNm codant ces interleukines, ou de mesure de l'activation de la cascade biochimique conduisant à l'activation des facteurs de transcription. Par "capable d'activer les lymphocytes T", on entend ici que le polypeptide est capable, lorsqu'il est présenté par la molécule HLA-DR7, de se lier au TCR des lymphocytes T sous la forme de complexe trimoléculaire impliquant les chaînes a et 13 du HLA, puis d'induire, via une cascade de signalisation, l'expression, par le lymphocyte, de gènes immédiats (tels que c-fos, NFAT-1, c-myc et/ou NF-KB), précoces (tels que les cytokines IFN-y, IL-2, TGF-(3, IL-10, FoxP3, IL-4, IL-5, IL13 et/ou GM-CSF, les récepteurs insuline R, IL-2R et/ou transferrine R, les molécules d'activation CD69 ou CD25, et/ou les protéines intracellulaires ODC, actine, cycline, transferrine et/ou histones) et/ou tardifs (tels que le CMH HLA-DR, la cytokine Rantes, et/ou les protéines d'activation VLA-4 et/ou VLA-1), et/ou des récepteurs de chimiokines, et/ou des ligands de sélectine tels que le CD62L. Les techniques permettant de mettre en évidence l'activation des lymphocytes T par un polypeptide sont bien connues de l'homme du métier et incluent par exemple les tests de réaction mixte lymphocytaire (MLR) comme décrit dans l'exemple ci-dessous; la détermination de la sécrétion de cytokines par les lymphocytes T, en particulier des cytokines IL-4, IL-10, IL-2 et/ou IFNy, par exemple en utilisant des tests ELISA, ou la mesure des ARN messagers codant ces cytokines; ou le suivi des divisions cellulaires grâce à un marqueur intracellulaire tel que le CFSE. Les polypeptides selon l'invention ne comprennent ni la séquence complète de la protéine codée par le gène RPS4Y, ni la séquence SEQ ID NO: 2, ni la séquence SEQ ID NO: 3. Par gène "RPS4Y" ou "ribosomal protein S4 Y-linked", on entend ici un gène codant la petite sous-unité 4 de la protéine ribosomale, une protéine impliquée dans la liaison de l'ARNm et localisée à l'interface des sous-unités 40S/60S de la petite sous- unité ribosomale. Le gène RPS4Y est situé sur le chromosome Y. Dans le contexte de l'invention, le gène RSP4Y est le gène RPS4Y humain. Typiquement, la séquence complète de la protéine codée par le gène RPS4Y est constituée de 263 acides aminés et est représentée de préférence par la séquence SEQ ID NO: 5.
La séquence SEQ ID NO: 2 est un fragment de la protéine RPS4Y, décrit dans lvanov et al. (2005) Clin. Cancer Res. 11:1694-1703, identifié comme étant présenté par la molécule HLA de classe I HLA-B*5201, qui est un allèle HLA très peu fréquent dans la population générale. La séquence SEQ ID NO: 3 est un fragment de la protéine RPS4Y, décrit dans Spierings et al. (2003) Lancet 362:610-615, identifié comme étant présenté par la molécule HLA de classe II HLA-DRB3*0301. De manière préférée, le polypeptide selon l'invention consiste en la séquence TGKIINFIKFDTGNL (SEQ ID NO: 1). Le polypeptide selon l'invention peut également consister en une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de la séquence TGKIINFIK (SEQ ID NO: 6), la séquence GKIINFIKF (SEQ ID NO: 7), la séquence KIINFIKFD (SEQ ID NO: 8), la séquence IINFIKFDT (SEQ ID NO: 9), la séquence INFIKFDTG (SEQ ID NO: 10), la séquence NFIKFDTGN (SEQ ID NO: 11) et la séquence FIKFDTGNL (SEQ ID NO: 12).
Acide nucléique et vecteur La présente invention concerne également un acide nucléique comprenant ou consistant en une séquence codant un polypeptide tel que défini ci-dessus. Un tel acide nucléique peut aisément être obtenu par clonage de fragments de l'ADNc codant pour la protéine RPS4Y.
Cet acide nucléique peut être inséré dans un vecteur d'expression, dans lequel il est lié de manière opérante à un ou des élément(s) permettant son expression ou la régulation de son expression, tels que notamment des promoteurs, activateurs et/ou terminateurs de transcription. Les signaux contrôlant l'expression des séquences nucléotidiques (promoteurs, activateurs, séquences de terminaison...) sont choisis en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. A cet effet, les acides nucléiques selon l'invention peuvent être insérés dans des vecteurs à réplication autonome au sein de l'hôte choisi, ou des vecteurs intégratifs de l'hôte choisi. De tels vecteurs seront préparés selon les méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones en résultant peuvent être introduits dans un hôte approprié par des méthodes standard, telles que par exemple l'électroporation ou la précipitation au phosphate de calcium.
Les vecteurs de clonage et/ou d'expression tels que décrits ci-dessus, contenant un acide nucléique défini selon l'invention font également partie de la présente invention. L'invention vise en outre les cellules hôtes transfectées, de manière transitoire ou stable, par ces vecteurs d'expression. Ces cellules peuvent être obtenues par l'introduction dans des cellules hôtes, procaryotes ou eucaryotes, d'une séquence nucléotidique insérée dans un vecteur tel que défini ci-dessus, puis la mise en culture desdites cellules dans des conditions permettant la réplication et/ou l'expression de la séquence nucléotidique transfectée. Des exemples de cellules hôtes incluent notamment des cellules humaines telles que HEK293, PER.C6, des cellules de mammifères non humains telles que CHO, COS, MDCK, des cellules d'insectes telles que les cellules SF9, des bactéries telles que Escherichia coli, des souches de champignon et/ou de levures telles que L40 et Y90.
Procédé de production du polypeptide La présente invention concerne également un procédé de production d'un polypeptide tel que défini ci-dessus, comprenant les étapes consistant à : a) synthétiser ledit polypeptide par voie chimique ou par voie enzymatique ou faire exprimer ledit polypeptide par une cellule comprenant l'acide nucléique ou le vecteur tels que définis ci-dessus; et b) récupérer ledit polypeptide obtenu à l'étape a). Plus généralement, les polypeptides utiles dans la présente invention peuvent être synthétisés par n'importe quelle méthode bien connue de l'homme du métier. De telles méthodes incluent notamment la synthèse chimique classique (en phase solide ou en phase homogène liquide), la synthèse enzymatique à partir d'acides aminés constitutifs ou de leurs dérivés, ainsi que des procédés de production biologiques par des cellules hôtes recombinantes. La synthèse par voie chimique est particulièrement avantageuse pour des raisons de pureté, de spécificité antigénique, d'absence de produits secondaires non désirés et pour sa facilité de production. Un objet de l'invention est donc un procédé de production d'un polypeptide selon l'invention comprenant la synthèse dudit polypeptide par voie chimique. Le polypeptide obtenu peut ensuite éventuellement être purifié selon n'importe quelle méthode bien connue de l'homme du métier. Le procédé de production peut également comprendre une ou des étapes de modification chimique ou enzymatique du polypeptide pour améliorer sa stabilité ou sa biodisponibilité, ainsi qu'une ou des étapes pour lier le polypeptide à un composé thérapeutique.
La synthèse par voie chimique inclut, entre autres méthodes, la synthèse de type Merrifield et la méthodologie de synthèse peptidique en phase solide Fmoc (voir par exemple «Fmoc solid Phase peptide synthesis, a practical approach», publié par W.C. Chan et P. D. White, Oxford University Press, 2000).
Le procédé de production du polypeptide selon l'invention peut en outre comprendre une étape de formulation du polypeptide obtenu en une composition pharmaceutique, par exemple l'une des compositions décrites dans le paragraphe ci-dessous. Un autre objet de l'invention est un procédé de production biologique d'un polypeptide selon l'invention par une cellule hôte recombinante. Dans un tel procédé, un vecteur contenant un acide nucléique codant pour un polypeptide selon l'invention est transféré dans une cellule hôte qui est mise en culture dans des conditions permettant l'expression du polypeptide correspondant. Le polypeptide produit peut ensuite être récupéré et purifié.
Les procédés de purification utilisés sont connus de l'homme du métier. Le polypeptide recombinant obtenu peut être purifié à partir de lysats et extraits cellulaires, du surnageant du milieu de culture, par des méthodes utilisées individuellement ou en combinaison, telles que le fractionnement, les méthodes de chromatographie, les techniques d'immunoaffinité à l'aide d'anticorps mono- ou polyclonaux spécifiques, etc.
Lymphocyte T La présente invention concerne par ailleurs un lymphocyte T isolé capable de reconnaître spécifiquement un épitope issu du polypeptide tel que défini ci-dessus ou d'un polypeptide comprenant la séquence complète de la protéine codée par le gène RPS4Y et présenté par la molécule HLA-DR7 exprimée à la surface de cellules présentatrices d'antigène. Par "lymphocyte T", on entend ici une cellule du système immunitaire présentant à sa surface le récepteur CD3, et qui est impliquée dans l'immunité cellulaire. Comme il est bien connu de l'homme du métier, les lymphocytes T englobent les lymphocytes T cytotoxiques, les lymphocytes T auxiliaires, les lymphocytes T régulateurs, les lymphocytes NKT et les lymphocytes Ty8. Les lymphocytes T cytotoxiques, CTL ou lymphocytes T CD8+ détruisent les cellules infectées présentant un antigène spécifique qu'elles reconnaissent. Les lymphocytes T auxiliaires, T helper ou Th sont des lymphocytes T présentant à leur surface le récepteur CD4 qui prolifèrent de manière à activer d'autres types de cellules immunitaires.
Les lymphocytes T régulateurs ou Treg sont des lymphocytes T présentant à la fois les récepteurs CD4 et CD25 à leur surface et exprimant dans leur cytosol la protéine FOXP3 lorsqu'ils sont à l'état basal. Ils répriment l'activité des cellules immunitaires, soit auto-immune, soit en fin de réaction immunitaire.
Les lymphocytes NKT sont des lymphocytes présentant à la fois le marqueur CD3 et les marqueurs des cellules NK. Ils reconnaissent un glycolipide présenté par la molécule CD1d, permettant ainsi de les activer. Les lymphocytes Ty8 sont des lymphocytes T possédant un TCR constitué d'une chaîne y et d'une chaîne 8, et présents en grande quantité dans la muqueuse intestinale.
De préférence, le lymphocyte T isolé selon l'invention est un lymphocyte T CD8+ et/ou CD4±. Plus préférablement, le lymphocyte T isolé selon l'invention est un lymphocyte T CD4±. Dans le contexte de l'invention, l'expression "lymphocyte T capable de reconnaître spécifiquement" signifie que le lymphocyte T est capable de lier la séquence d'acides aminés d'un épitope issu du polypeptide selon l'invention ou d'un polypeptide comprenant la séquence complète de la protéine codée par le gène RPS4Y et présenté par la molécule HLA-DR7 exprimée à la surface de cellules présentatrices d'antigène, mais est incapable de lier un épitope d'une autre séquence d'acides aminés qui est présenté par une molécule HLA autre que la molécule HLA-DR7 à la surface de cellules présentatrices d'antigène. Le terme "spécifiquement", quand il se réfère à une reconnaissance ou une liaison spécifique d'un lymphocyte T pour un antigène, signifie que le lymphocyte T interagit avec l'antigène sans interaction substantielle avec d'autres antigènes, ou si l'on parle de reconnaissance "spécifique" avec un épitope, par reconnaissance quasi-exclusive de cet épitope. Comme il est bien connu de l'homme du métier, les épitopes présentés par les molécules HLA de classe II proviennent de polypeptides qui sont internalisés et dégradés avant d'être liés au site de fixation des peptides des molécules HLA, ceci afin que les lymphocytes T puissent les reconnaître. Plus particulièrement, les polypeptides sont internalisés par endocytose ou après fixation à un récepteur de surface, puis dégradés par des protéases du compartiment endolysosomal acide en peptides épitopiques d'une vingtaine d'acides aminés. En parallèle, les molécules HLA de classe II (chaînes a et (3) néosynthétisées s'associent dans le réticulum endoplasmique où elles sont stabilisées en présence de la chaîne invariante li. Des complexes nonamériques (3 chaînes li, 3 chaînes a et 3 chaînes (3) migrent à travers le Golgi et sont dirigés vers le compartiment endosomal MIIC. Lors de cette migration, le site de fixation peptidique des molécules HLA de classe II est constamment occupé par la séquence CLIP de la chaîne li qui maintient la cavité dans sa bonne conformation. Une fois dans le compartiment endolysosomal acide, la chaîne li est dégradée et le peptide CLIP est libéré. Les molécules HLA de classe II se lient alors à des peptides issus de la protéolyse endosomale, et les molécules de classe II présentant ces peptides migrent ensuite à la surface cellulaire. Par conséquent, par "épitope issu d'un polypeptide et présenté par la molécule HLA-DR7 exprimée à la surface de cellules présentatrices d'antigène", on entend ici un peptide produit après internalisation et dégradation dudit polypeptide par des protéases dans une cellule présentatrice d'antigène, et capable de se lier, dans le compartiment endolysosomal acide de ladite cellule présentatrice d'antigène, à une molécule HLA-DR7 dont le site de fixation peptidique est libre. De préférence, l'épitope selon l'invention consiste en une séquence de 9 à 25 acides aminés, de préférence de 10 à 24 acides aminés, de préférence de 11 à 23 acides aminés, de préférence de 12 à 22 acides aminés, de préférence de 13 à 21 acides aminés, de préférence de 14 à 20 acides aminés. De manière davantage préférée, l'épitope selon l'invention consiste en une séquence de 15 acides aminés. De manière également préférée, l'épitope selon l'invention consiste en une séquence de 9 acides aminés. Les inventeurs ont en effet montré que le polypeptide selon l'invention se liait spécifiquement aux lymphocytes T lorsqu'il était présenté par la molécule HLA-DR7.
Par conséquent, de préférence, le lymphocyte T isolé selon l'invention est capable de reconnaître spécifiquement ou reconnait spécifiquement un épitope issu du polypeptide consistant en la séquence SEQ ID NO: 1 lorsque celui-ci est présenté par la molécule HLA-DR7.
Méthode de préparation de lymphocytes T La présente invention concerne également une méthode de préparation in vitro de lymphocytes T capables de reconnaître spécifiquement un épitope issu d'un polypeptide selon l'invention ou d'un polypeptide comprenant la séquence complète de la protéine codée par le gène RPS4Y et présenté par la molécule HLA-DR7 exprimée à la surface de cellules présentatrices d'antigène, comprenant les étapes de : - co-culture de lymphocytes T avec des cellules présentatrices d'antigène exprimant à leur surface la molécule HLA-DR7 à laquelle est liée un épitope issu du polypeptide selon l'invention ou d'un polypeptide comprenant la séquence complète de la protéine codée par le gène RPS4Y; et - récupération des lymphocytes T à partir de ladite co-culture.
Le terme "cellule présentatrice d'antigène" ou "APC" désigne ici une cellule exprimant typiquement à sa surface une molécule HLA de classe I ou II. De préférence, la cellule présentatrice d'antigène selon l'invention exprime à sa surface une molécule HLA de classe II, de manière davantage préférée une molécule HLA-DR, de manière préférée entre toutes la molécule HLA-DR7. Les cellules présentatrices d'antigène peuvent être de type monocyte ou macrophage, lymphocyte B, et cellule dendritique. De préférence, la cellule présentatrice d'antigène selon l'invention est une cellule dendritique. De manière davantage préférée, la cellule présentatrice d'antigène selon l'invention provient d'un sujet de sexe féminin. De préférence, la cellule présentatrice d'antigène selon l'invention et le lymphocyte T avec lequel elle est co-cultivée sont HLA-identiques. Les cellules présentatrices d'antigène utilisées dans la méthode selon l'invention expriment à leur surface la molécule HLA-DR7 à laquelle est liée un épitope issu du polypeptide selon l'invention ou d'un polypeptide comprenant la séquence complète de la protéine codée par le gène RPS4Y. De telles cellules présentatrices d'antigène peuvent être obtenues en chargeant les cellules avec le polypeptide selon l'invention ou avec un polypeptide comprenant la séquence complète de la protéine codée par le gène RPS4Y, comme décrit dans Mutis et al. (1999) Blood 93:2336-2341. Typiquement, les cellules présentatrices d'antigène sont pulsées avec le polypeptide selon l'invention ou avec un polypeptide comprenant la séquence complète de la protéine codée par le gène RPS4Y, de préférence à une concentration d'environ 10 pg/ml, pendant par exemple 90 minutes à une température de 37°C dans un milieu de culture dépourvu de sérum. Ces cellules présentatrices d'antigène peuvent également être obtenues par transfection ou transduction avec un vecteur comprenant un acide nucléique codant un polypeptide selon l'invention ou codant un polypeptide comprenant la séquence complète de la protéine codée par le gène RPS4Y, comme décrit par exemple dans Mutis et al. (2002) BioL Blood Marrow Transplant. 8:412-419. L'épitope issu du polypeptide selon l'invention ou d'un polypeptide comprenant la séquence complète de la protéine codée par le gène RPS4Y et présenté par la molécule HLA-DR7, sera alors produit par dégradation protéasique, dans le compartiment endolysosomal acide de la cellule présentatrice d'antigène, puis liaison, dans ce compartiment, avec ladite molécule HLA-DR7 dont le site de fixation peptidique aura été libéré.
De préférence, l'épitope selon l'invention consiste en une séquence de 9 à 25 acides aminés, de préférence de 10 à 24 acides aminés, de préférence de 11 à 23 acides aminés, de préférence de 12 à 22 acides aminés, de préférence de 13 à 21 acides aminés, de préférence de 14 à 20 acides aminés. De manière davantage préférée, l'épitope selon l'invention consiste en une séquence de 15 acides aminés. De manière également préférée, l'épitope selon l'invention consiste en une séquence de 9 acides aminés. L'étape de co-culture des lymphocytes T avec les cellules présentatrices d'antigène se déroule de préférence dans un milieu de culture approprié supplémenté en sérum humain AB, typiquement en milieu RPMI supplémenté en sérum, et en présence d'IL-2, de préférence à une température d'environ 37°C. Les lymphocytes T peuvent en outre être remis en culture avec de nouvelles cellules présentatrices d'antigène telles que définies ci-dessus à plusieurs reprises, de préférence tous les 10 à 14 jours. Composition pharmaceutique et applications thérapeutiques La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant (i) un polypeptide tel que défini ci-dessus ou un lymphocyte T tel que défini ci-dessus et (ii) un véhicule pharmaceutiquement acceptable. La présente invention a également pour objet un médicament comprenant un polypeptide tel que défini ci-dessus ou un lymphocyte T tel que défini ci-dessus. Elle concerne également une méthode de traitement d'un sujet dans laquelle on administre audit sujet qui en a besoin une quantité thérapeutiquement efficace du polypeptide selon l'invention ou du lymphocyte T selon l'invention. Elle concerne aussi l'utilisation du polypeptide ou du lymphocyte T selon l'invention pour la fabrication d'un médicament. Par "traitement", on entend traitement à titre curatif (visant à au moins soulager, freiner ou stopper le développement de la pathologie).
Par "excipient" ou "véhicule pharmaceutiquement acceptable", on entend tout solvant, milieu de dispersion, agent retardant l'absorption etc, qui ne produit pas de réaction secondaire, par exemple allergique, chez l'humain ou l'animal. Dans le cas de l'utilisation des lymphocytes T selon l'invention, des exemples non limitatifs de véhicules pharmaceutiquement acceptables incluent notamment une solution physiologique, c'est-à-dire ayant la même osmolarité que le sang, et qui peut être une solution d'eau double distillée contenant 0,9 g/L de NaCI, ou une solution de Ringer ou solution de Ringer lactate. Les lymphocytes T selon l'invention peuvent être mis en suspension par exemple dans un volume total de solution physiologique de 10, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, ou 500 mL.
Les compositions pharmaceutiques et médicaments de l'invention peuvent être formulés de manière à être administrés au patient par une unique voie ou par des voies différentes. Lorsque l'administration par voie parentérale est envisagée, plus particulièrement par injection, les compositions de l'invention se trouvent sous la forme de solutés et suspensions injectables conditionnées en ampoules ou flacons pour perfusion lente. L'injection peut notamment être réalisée par voie sous-cutanée, intramusculaire ou intraveineuse. Dans le cas d'une administration par voie orale, les compositions de l'invention se trouvent sous la forme de gélules, comprimés effervescents, comprimés nus ou enrobés, sachets, dragées, ampoules ou solutés buvables, microgranules ou formes à libération prolongée. Les formes pour l'administration parentérale sont obtenues de façon conventionnelle par mélange du ou des principe(s) actif (s) avec des tampons, des agents stabilisants, des conservateurs, des agents solubilisants, des agents isotoniques et des agents de mise en suspension. Conformément aux techniques connues, ces mélanges sont ensuite stérilisés puis conditionnés sous la forme d'injections intraveineuses. A titre de tampon, l'homme du métier pourra utiliser des tampons à base de sels de phosphate organique.
Des exemples d'agents de mise en suspension englobent la méthylcellulose, l'hydroxyéthylcellulose, l'hydroxypropylcellulose, l'acacia et la carboxyméthylcellulose sodique. En outre, des stabilisants utiles selon l'invention sont le sulfite de sodium et le métasulfite de sodium, tandis que l'on peut citer le p-hydroxybenzoate de sodium, l'acide sorbique, le crésol et le chlorocrésol en tant que conservateurs. Pour la préparation de solution ou de suspension orale, les principes actifs sont dissous ou mis en suspension dans un véhicule approprié avec un agent dispersant, un agent humectant, un agent de mise en suspension (par exemple la polyvinylpyrrolidone), un conservateur (tel que le méthylparaben ou le propylparaben), un agent correcteur de goût ou un colorant.
Pour la préparation de microcapsules, les principes actifs sont combinés à des diluants appropriés, des stabilisants appropriés, des agents favorisant la libération prolongée des substances actives ou tout autre type d'additif pour la formation d'un noyau central qui est ensuite revêtu d'un polymère approprié (par exemple une résine hydrosoluble ou une résine insoluble dans l'eau). Les techniques connues de l'homme du métier seront utilisées à cet effet.
Les microcapsules ainsi obtenues sont ensuite éventuellement formulées dans des unités de dosage appropriées. Les peptides selon l'invention peuvent également être formulés sous la forme de liposomes. Les liposomes sont formés à partir de phospholipides qui sont dispersés dans un milieu aqueux et forment spontanément des vésicules bicouches concentriques multilamellaires. Ces vésicules ont généralement un diamètre de 25 nm à 4 lm et peuvent être soniquées, conduisant à la formation de vésicules plus petites unilamellaires, de diamètre de 200 à 500 Â, contenant une solution aqueuse en leur coeur. Les liposomes peuvent être particulièrement avantageux pour administrer le médicament à une cible cellulaire ou tissulaire précise. Pour cela, les lipides peuvent être couplés chimiquement à des molécules de ciblage ou ligands, tels que des peptides de ciblage (par exemple hormones) ou des anticorps. En particulier, pour cibler les cellules immunitaires, un ligand à incorporer au liposome peut être par exemple, un anticorps ou fragment d'anticorps spécifique des déterminants de surface cellulaire des cellules du système immunitaire visées. La présente invention concerne également plus particulièrement un polypeptide isolé tel que défini ci-dessus, ou un lymphocyte T isolé tel que défini ci-dessus, ou un polypeptide comprenant la séquence complète de la protéine codée par le gène RPS4Y, pour son utilisation pour le traitement d'un cancer des cellules immunitaires. Elle concerne également l'utilisation d'un polypeptide isolé tel que défini ci-dessus, ou d'un lymphocyte T isolé tel que défini ci-dessus, ou d'un polypeptide comprenant la séquence complète de la protéine codée par le gène RPS4Y, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement d'un cancer des cellules immunitaires.
Elle concerne aussi une méthode de traitement d'un cancer des cellules immunitaires dans laquelle on administre à un patient qui en a besoin une quantité thérapeutiquement efficace d'un polypeptide isolé tel que défini ci-dessus, ou d'un lymphocyte T isolé tel que défini ci-dessus, ou d'un polypeptide comprenant la séquence complète de la protéine codée par le gène RPS4Y.
Les cancers des cellules immunitaires sont bien connus de l'homme du métier et incluent en particulier les leucémies et les lymphomes. Le cancer des cellules immunitaires peut ainsi être choisi parmi la leucémie aigüe lymphoblastique (LAL), la leucémie aigüe myéloblastique (LAM), la leucémie lymphoïde chronique (LLC) et la leucémie myéloïde chronique (LMC). Le cancer des cellules immunitaires peut également être choisi parmi un lymphome de Hodgkin et un lymphome non-hodgkinien. Le cancer des cellules immunitaires peut également être une rechute d'un précédent cancer, en particulier une rechute leucémique. De préférence, le sujet traité est un sujet humain masculin. De préférence, le sujet traité exprime la molécule HLA-DR7. De manière davantage préférée, le sujet traité présente l'allèle HLA-DRB1*0701. De manière particulièrement préférée, la présente invention concerne ainsi un polypeptide isolé tel que défini ci-dessus, ou un lymphocyte T isolé tel que défini ci-dessus, ou un polypeptide comprenant la séquence complète de la protéine codée par le gène RPS4Y, pour son utilisation pour le traitement d'un cancer des cellules immunitaires chez un sujet exprimant la molécule HLA-DR7. De préférence, le sujet a été préalablement traité par une chimiothérapie et/ou une radiothérapie. De préférence, la moelle osseuse du sujet traité a également été irradiée. Sans vouloir être lié par un mécanisme d'action, le polypeptide administré permettra alors d'induire la lyse ou d'activer une réponse immunitaire vis-à-vis des cellules du sujet à traiter, en particulier vis-à-vis des cellules mâles exprimant la molécule HLA-DR7. En effet, après traitement par chimiothérapie et/ou irradiation, ces cellules seront presque exclusivement des cellules cancéreuses car les cellules non-cancéreuses exprimant les molécules HLA-DR7 sont principalement des cellules hématopoïétiques qui auront été éliminées par le traitement par chimiothérapie et/ou irradiation.
De préférence lorsque le polypeptide selon l'invention ou un polypeptide comprenant la séquence complète de la protéine codée par le gène RPS4Y est administré, le sujet peut aussi subir ou avoir subi en outre une greffe de moelle osseuse, de préférence une greffe de moelle osseuse provenant d'un donneur de sexe féminin et/ou HLA-identique. En effet, sans vouloir être lié par un mécanisme d'action, cette greffe permettra de reconstituer la moelle osseuse du sujet traité, tout en permettant la reconnaissance spécifique des cellules cancéreuses résiduelles ou réapparaissant, ceci grâce au polypeptide selon l'invention ciblant les cellules exprimant la molécule HLA-DR7. De manière similaire, lorsque des lymphocytes T selon l'invention sont administrés, le sujet, en particulier le sujet souffrant d'une rechute leucémique, peut subir ou avoir subi une greffe de moelle osseuse, de préférence une greffe de moelle osseuse provenant d'un donneur de sexe féminin et/ou HLA-identique. En particulier, dans ce cas, la moelle osseuse du sujet peut ne pas avoir été irradiée. En effet, sans vouloir être lié par la théorie, dans ce cas, les cellules hématopoïétiques du patient étant de sexe féminin suite à la greffe de moelle osseuse, seules les cellules mâles exprimant les molécules HLA-DR7, c'est-à-dire les cellules cancéreuses, seront ciblées par les lymphocytes T administrés.
Par "donneur HLA-identique", on entend ici un sujet portant les mêmes allèles des gènes HLA de classe I et HLA de classe II, codant les antigènes HLA majeurs, que le sujet à traiter. De préférence, le lymphocyte T utilisé dans les méthodes de traitement définies ci- dessus est un lymphocyte T hétérologue, c'est-à-dire un lymphocyte T ne provenant pas du sujet à traiter, mais est de préférence HLA-identique par rapport au sujet à traiter. Le lymphocyte T utilisé dans les méthodes de traitement définies ci-dessus peut également être un lymphocyte T hétérologue non HLA-identique mais exprimant la molécule HLADR7. De préférence, dans ce cas, le lymphocyte T est de type clonai et reconnait spécifiquement le complexe peptidique RPS4Y-HLA-DR7. Ceci est en particulier très utile en cas d'urgence pour le sujet à traiter puisqu'il ne nécessite pas l'identification immédiate d'un donneur HLA-identique. Par "quantité thérapeutiquement efficace", on entend ici une quantité permettant de soulager, freiner ou stopper le développement de la pathologie chez le sujet auquel cette quantité est administrée. Une quantité efficace pour obtenir un effet thérapeutique dépendra par exemple de la composition peptidique, de la voie d'administration, du stade et de la gravité de la maladie à traiter, du poids et de l'état de santé général du patient et du jugement du médecin traitant. Typiquement, le polypeptide ou fragment peptidique selon l'invention est administré à une dose d'environ 1,0 pg à environ 5000 pg pour un patient de 70 kg. Les exemples et figures suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée.
Brève description des figures La Figure 1 présente des histogrammes montrant le niveau de prolifération (représenté par l'incorporation de 3HT en c.p.m x 10-3 au jour 3) des lymphocytes T CD4/CD8 DP (barres noires) ou CD4+ simples positifs (barres blanches) après stimulation avec des EBV-B-LCL de donneur (D), de receveur (R) ou HLA-B*1401 (B*1401) ou HLADRB1*0701 (DRB1*0701). La Figure 2 présente des histogrammes montrant le rapport de (A) l'expression de l'ARNm de IFNy sur celle de CD3, (B) l'expression de l'ARNm de FoxP3 sur celle de CD3, (C) l'expression de l'ARNm de IL-4 sur celle de CD3, (D) l'expression de l'ARNm d'IL-10 sur celle de PPIB, (E) l'expression de l'ARNm de TGF8 sur celle de PPIB, par les lymphocytes T CD4/CD8 DP (CD4/CD8) ou les lymphocytes T CD4+ simples positifs (CD4) après 24 heures de stimulation avec des EBV-B-LCL de donneur (barres à hachures diagonales dans le sens descendant vers la droite), HLA-B*1401 (barres à hachures diagonales serrées dans le sens ascendant vers la droite) ou HLA-DRB1*0701 (barres à hachures diagonales dans le sens ascendant vers la droite). La Figure 3 présente des histogrammes montrant le niveau de prolifération (représenté par l'incorporation de BRDu) du clone de lymphocytes T CD4+ après stimulation avec des EBV-B-LCL femelles exprimant HLA-DRB1*0701 (DR7 y) et le cas échéant transfectés avec les gènes DDX3Y (DDX3Y) ou RPS4Y (RSPAY) ou avec des EBV-B-LCL mâles exprimant HLA-DRB1*0701 (DR7 La Figure 4 présente des histogrammes montrant le niveau de sécrétion d'IFNy (en pg/mL) par le clone de lymphocytes T CD4+, non stimulé (-) ou après 24 heures de stimulation avec des EBV-B-LCL femelles exprimant HLA-DRB1*0701 (DR7 y) et le cas échéant transfectés avec les gènes DDX3Y (DDX3Y) ou RPS4Y (RSPAY) ou avec des EBV-B-LCL mâles exprimant HLA-DRB1*0701 (DR7 La Figure 5 présente des histogrammes montrant le niveau de sécrétion d'IFNy (en petl) par le clone de lymphocytes T CD4+ après stimulation avec des EBV-B-LCL femelles exprimant HLA-DRB1*0701 (DR7 y) et le cas échéant transfectés avec le gène RPSA4Y (RPS4Y) ou exprimant les peptides SK-31 (SK-31), KM-25 (KM-25), DA-32 (DA-32), EV- 44 (EV-44), QR-40 (QR-40) ou SG-41 (SG-41) ou avec des EBV-B-LCL mâles exprimant HLA-DRB1*0701 (DR7 La Figure 6 présente des histogrammes montrant le niveau de sécrétion d'IFNy (en pg4.11) par le clone de lymphocytes T CD4+ non stimulé (CD4) ou après stimulation des EBV-BLCL femelles exprimant HLA-DRB1*0701 (DR7) en présence ou non des peptides QR-40 ou TL15) la concentration indiquée. Description des séquences SEQ ID NO: description 1 Peptide de séquence TGKIINFIKFDTGNL (aussi appelé peptide TL15) 2 Peptide de séquence TIRYPDPVI exclu de l'invention 3 Peptide de séquence VIKVNDTCQI exclu de l'invention 4 Peptide QR-40 5 Protéine codée par le gène RPS4 Y 6 Premier fragment de 9 acides aminés consécutifs de SEQ ID NO: 1 7 Deuxième fragment de 9 acides aminés consécutifs de SEQ ID NO: 1 8 Troisième fragment de 9 acides aminés consécutifs de SEQ ID NO: 1 9 Quatrième fragment de 9 acides aminés consécutifs de SEQ ID NO: 1 Cinquième fragment de 9 acides aminés consécutifs de SEQ ID NO: 1 11 Sixième fragment de 9 acides aminés consécutifs de SEQ ID NO: 1 12 Septième fragment de 9 acides aminés consécutifs de SEQ ID NO: 1 13 Peptide SK-31 14 Peptide KM-25 Peptide DA-32 16 Peptide EV-44 17 Motif coeur de la base Hotspot dont est issu le peptide SK-31 18 Motif coeur de la base Net MHC dont est issu le peptide SK-31 19 Motif coeur de la base Propred dont est issu le peptide SK-31 Motif coeur de la base Hotspot dont est issu le peptide KM-25 21 Motif coeur de la base Hotspot dont est issu le peptide DA-32 22 Deuxième motif coeur de la base Hotspot dont est issu le peptide DA-32 23 Motif coeur de la base Hotspot dont est issu le peptide EV-44 24 Motif coeur de la base Net MHC dont est issu le peptide EV-44 Motif coeur de la base Propred dont est issu le peptide EV-44 26 Deuxième motif coeur de la base Propred sont est issu le peptide EV-44 27 Motif coeur de la base Hotspot dont est issu le peptide QR-40 28 Deuxième motif coeur de la base Hotspot dont est issu le peptide QR-40 29 Motif coeur de la base Net MHC dont est issu le peptide QR-40 Motif coeur de la base Propred dont est issu le peptide QR-40 31 Peptide GV17 32 Peptide TG17-1 33 Peptide TG17-2 Exemple Cet exemple présente l'identification par les inventeurs du polypeptide selon l'invention Matériel et méthodes Milieu et réactifs. Du milieu RPMI-1640 (Life Technologies, Eggenstein, Allemagne) a été supplémenté avec de la L-glutamine (2 mM), de la pénicilline (100 Ul/ml), de la streptomycine (100 µg/ml), du NaHCO3 (1,5 mg/ml) et 10 % de sérum AB humain inactivé par la chaleur poolé. Les GM-CSF, rhlL-2, rhlL-4 and rhTNF-a humains recombinants ont été achetés chez R&D Systems (Abingdon, Royaume-Uni). Le typage HLA a été évalué par sérologie et caractérisé de façon approfondie par typage oligonucléotidique. Les anticorps anti-HLA de classe I (W632), anti-HLA-DR (L243) et anti-HLA-DP (B7-21) ont été gracieusement fournis par J. Chopin (Hôpital Cochin, ICGM, France), l'anticorps anti- HLA-DQ (SPVL3) a été acheté chez lmmunotech (Marseille, France). Génération de lignées et clones de lymphocytes T spécifiques de l'antigène H mineur. Une biopsie de peau prélevée sur un patient souffrant de GVHD, 1 mois post- transplantation, a été cultivée pendant 2 semaines en présence de 20 Ul/ml d'IL-2 dans du milieu RPMI complet. Ce patient a été greffé avec de la moelle osseuse de sa soeur HLA-identique. Son typage HLA était le suivant : A*0205/*6801; B*1401/*4403; C*0802:*1601; DRB1*0701; DQB1*0202; DPB1*0401/1101. Les lymphocytes T de peau ont été phénotypés et propagés par plusieurs cycles de stimulation avec des APC du receveur, et cultivés pendant 2 semaines en présence de 20 Ul/ml d'IL-2. Les APC utilisées initialement étaient des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) du receveur irradiés avec 30 Gy, puis, après le troisième cycle, des lymphocytes B immortalisés par le virus d'Epstein-Barr (EBV-B-LCL) du receveur ont été utilisés. Ils ont été irradiés avec 50 Gy. Ce protocole a conduit à des lignées de lymphocytes T. Des clones ont été dérivés de ces lignées, comme précédemment décrit.
Brièvement, les lymphocytes T spécifiques ont été clonés par dilution limite à des concentrations de cellules de 4, 1, ou 0,4 cellule/puits, dans des plaques de microtitrage à fond rond de 96 puits (Falcon ; Becton Dickinson, Mountain View, CA, États-Unis) en présence de 2,5 x 105/ml de PBMC irradiés (30 Gy) plus 0,5 x 105/ml d'EBV-B LCL irradiés (50 Gy) dérivés du receveur et 10 U/ml de rIL-2. Les clones de lymphocytes T générés ont été propagés en présence de 0,5 x 105 EBV-B LCL du receveur irradiés et de rIL-2. Le phénotype des clones générés a été analysé par FACScan en utilisant des anticorps (CD4 et CD8) marqués par PE/FITC (BD Biosciences, Le Pont de Claix, France). Tests de réaction mixte lymphocytaire (ML R) lx 104 lignées ou clones de lymphocytes T ont été incubés en triplicat avec 3 x 104 EBV-B LCL irradiés par 50 Gy dans un volume final de 200 pl dans des plaques de microtitrage à fond rond de 96 puits. Après 3 jours de culture, 1 pCi/puits de 3H-[méthylthymidine] a été ajouté pendant les dernières 16-18 h. Les cellules ont été collectées en utilisant un collecteur multiple Filtermate 196 (Packard Inc. Prospect, CT, États-Unis) et l'incorporation de thymidine a été mesurée dans un compteur de scintillation liquide TopCount (Packard, Inc.). Test modifié de fréquence de précurseur de lymphocytes T auxiliaires (HTLP). Des nombres en gradient de PBMC répondeurs ont été stimulés avec 3x104 EBV- BLCL du receveur irradiés par 50 Gy. Les cellules ont été cultivées dans des plaques de microtitrage à fond rond de 96 puits dans un volume final de 200 pl de milieu de culture et 10% de sérum AB humain inactivé par la chaleur. 16 réplicats et 4 dilutions (104, 5 x 103, 2,5 x 103, 1,5 x 103) ont été effectués. Des lymphocytes T CD4/CD8 DP ont été ajoutés ou non à deux rapports Treg/effecteur différents : 1:4 ou 1:1. 24 h plus tard, les surnageants ont été collectés et utilisés pour cultiver la lignée cellulaire CTLL2, qui est dépendante d'IL-2 humain, pendant 24 heures. L'incorporation de 3HT a ensuite été mesurée, comme décrit ci-dessus. Les puits ont été définis comme étant positifs si les c.p.m. étaient supérieurs à la moyenne de c.p.m. plus 3 écarts-types des puits avec des cellules du receveur seules. Les résultats ont été exprimés en nombre de puits négatifs.
Protocoles d'amplification par RT-PCR et de séquençage L'ARN total des clones ou lignées a été isolé à partir de 1 x 106 cellules en utilisant le kit Rnagent (Promega, Madison, WI, États-Unis). L'ARN total a été converti en ADNc simple brin en utilisant une amorce oligo(dT) (Amersham Pharmacia Biotech, Orsay, France) et la transcriptase inverse de virus de myéloblastose aviaire, conformément aux spécifications du fabricant (Promega). L'amplification par PCR (30 cycles) a été conduite en utilisant des amorces sens 5' spécifiques de la séquence de la région 25 V pour les familles TCR-V8 et une amorce 08 antisens 3' comme décrit dans Iwatani et al. (1993) Clin. Exp. lmmunol. 93:430-436. En tant que témoin interne positif, des amorces de région C sens 5' et antisens 3' ont été incluses. Les cycles ont consisté en des étapes de dénaturation à 95°C, hybridation d'amorce à 57°C, et extension à 72°C, de 1 min chacune. La PCR a été effectuée dans un Biomed Thermocycler 60 (Biomed Instruments, Fullerton, CA) en utilisant 2,5 U d'ADN polymérase Taq (Cetus, Emeryville, CA) dans une solution contenant 4 pmoles/pl d'amorces, 0,5 mM de chaque dNTP ; KCI 50 mM ; Tris-HCI 10 mM (pH 8,4) ; MgCI 4 mM et 5 pg d'échantillon. Les produits de PCR ont été séquences par Genoscreen (Lille, France). Les séquences TCR obtenues ont été analysées en utilisant la base de données IMGT sur Internet (http//:imgt.cines.fr:8104). Tests ELISA. 1,5 x 105/ml de lignées ou clones de lymphocytes T ont été stimulés avec 3 x 105/ml EBV-B LCL irradiés avec 50 Gy dans du milieu X-VIVO-20 (Cambrex, Emerainville, France) sans sérum. Le surnageant a été éliminé après 24 h. Les concentrations de cytokine ont été évaluées par ELISA standard disponible commercialement conformément aux instructions du fabricant. (IL-4, IL-10, IL-2 et IFN-y (Biosource, Nivells, Belgique), TGF-(3 (R&D Systems)). Caractérisation d'épitopes de lymphocyte T Trois gènes codés par le chromosome Y (DDX3Y, SMCY et RPS4Y) ont été transfectés dans des EBV-B LCL HLA-DR7 mâles comme décrit dans Kinsella et Nolan (1996) Human Gene Therapy 7:1405-1413. Brièvement, les deux genes codant pour DDX3Y et RPS4Y, connus pour induire la production de peptides HY restreints par les molécules HLA de classe II, ont été clonés dans le vecteur d'expression rétroviral pMIGR1 et transfectés dans la lignée amphotropique Phoenix-Ampho, qui exprime le marqueur membranaire IRES-CD8, celui- ci ayant été introduit en amont de la construction gag-pol grâce à la lipofectamine. Le surnageant contenant les particules virales a alors été extrait à partir des cellules exprimant la molécule CD8 à forte concentration, filtré, et concentré par une centrifugation très rapide. Il a alors été utilisé pour transduire des lignées lymphoblastoïdes EBV HLADR7 de sexe féminin, par infection. De façon plus brève, 8 ml de surnageant viral a été mélangé à 8 pl de polybrène (Sigma-Aldrich, Gillingham, Dorset, UK) et rajouté à 15 x 106 HLA-DR7 EBV-B LCLs. Les cellules ont été mises en culture dans des plaques de culture 24 puits (BD Falcon, BD Biosciences, Oxford Science Park, Oxford, UK) dans un milieu contenant du RPMI-1640, (Life Technologies, BRL, Paisley, UK) et 10% de sérum de veau foetal (FCS, AutogenBioclear, Calne, UK) pendant 3 jours. Les cellules ont alors été isolées en fonction de leur fort taux d'expression de la molécule CD8 et les niveaux d'expression des gènes codant pour DDX3Y and RPS4Y ont été confirmés par PCR.
Des lymphocytes T CD4+ HY-spécifiques ont été stimulés avec chacun des EBV-B LCL femelles transduits avec le gène HY. La prolifération et la production d'IFN-y ont été mesurées par incorporation de 3H-[méthyl-thymidine] au jour 3, et ELISA au jour 1. Pour cartographier l'épitope exact de lymphocyte T restreint au CMH de classe 11, les inventeurs ont synthétisé plusieurs peptides longs avec liaison potentielle à DRB1*0701 codés dans les régions de RPS4Y qui diffèrent de RPS4X, sur la base de plusieurs bases de données de liaison de peptide CMH, telles que SYFPEITHI, Net-MHC, Propred, HotSpot Hunter. Ces peptides ont été testés à diverses concentrations : de 100 1..1M à 10 nM, en utilisant des EBV-B-LCL femelles exprimant la molécule HLA-DRB1*0701 sous forme d'APC. Le peptide court en question a été identifié en utilisant une série de peptides de 15 acides aminés également identifiés à partir de ces bases de données qui sont présents dans le peptide long qui induit une réponse positive.
Résultats Isolement de lymphocytes T doubles positifs CD4/CD8 et CD8+ à partir de la peau d'un patient souffrant de GVHD Un mois après la greffe de moelle osseuse entre la fratrie HLA-identique, où le receveur était de sexe masculin et le donneur de sexe féminin, le patient/receveur a été diagnostiqué avec une GVHD de la peau. Des lymphocytes T ont été isolés à partir de la biopsie de la peau, par culture en présence de 20 U/ml d'IL-2. Après 14 jours de culture, l'analyse phénotypique a mis en évidence deux populations de cellules, l'une CD4/CD8 double positive (DP), et l'autre CD8+. Le nombre de lymphocytes T doubles positifs CD4/CD8 DP était très élevé, étant donné qu'il représentait près de 55 % des cellules.
Les cellules isolées étaient CD3+, mais CD56-, et 95,9% exprimaient TCRa/[3. Lorsque lès lymphocytes T CD4/CD8 DP de peau ont été triés à l'aide de billes magnétiques antiCD4+, stimulés avec des APC du receveur et cultivés sans IL-2 pendant 1 semaine, les inventeurs ont observé que l'expression de CD25 était maintenue à 84 %, CD69 à 58 (3/0 et CD62L à 61 `Vo. Par conséquent, les inventeurs ont pu isoler deux populations de lymphocytes T à partir de la peau d'un patient atteint de GVHD ; l'une CD4/CD8 DP, et exprimant des niveaux élevés de CD25, l'autre CD8 simple positif. Apparition de cellules CD4 simples positives après plusieurs cycles de stimulation avec des PBMC du receveur Alors que ces deux populations étaient observées à des temps précoces de culture, après plusieurs cycles de stimulation des lymphocytes T CD4/CD8 DP triés avec des PBMC du receveur, une nouvelle population exprimant uniquement CD4 est apparue. Cette nouvelle population a ensuite été purifiée en utilisant des billes magnétiques antiCD8. Par conséquent, après plusieurs cycles de stimulation avec des PBMC du receveur, trois populations différentes ont été obtenues à partir de la même biopsie de peau GVHD : des cellules CD8 simples positives, des cellules CD4/CD8 DP et des cellules CD4 simples positives. Typage de spectre VfiTCR des trois populations Les trois sous-populations de cellules triées ont ensuite été analysées en utilisant un immunoscope. L'analyse de lymphocytes T de peau GVHD après 14 jours de culture, a mis en évidence un répertoire Vi3TCR limité/asymétrique avec expression oligoclonale. Après plusieurs cycles de stimulation avec des PBMC du receveur, le répertoire Vi3TCR des trois populations était encore plus asymétrique. Six Vi3TCR de moins étaient représentés dans les populations CD8+ ou CD4+ simples, comparés à ceux des cellules CD4/CD8 DP. De plus, seulement deux ou un nouveaux Vi3TCR sont apparus dans chaque population, respectivement. Les inventeurs ont noté de manière intéressante que, en comparant des cultures à long terme de cellules CD4/CD8 DP à des lymphocytes T de peau non triés au jour 14, la population CD4/CD8 DP présentait une perte d'un seul Vi3TCR. Celui-ci était probablement associé au profil CD8 étant donné qu'il a été observé dans les cellules simples positives CD8+, mais pas CD4+. L'apparition d'un nouveau Vi3TCR a également été observée dans les cellules CD4/CD8 DP et ce nouveau Vi3TCR a également été trouvé dans le profil immunoscope des cellules CD4+. L'observation de si faibles modifications du profil de Vi3TCR au moment du criblage initial de cellules CD4/CD8 DP suggère que les lymphocytes T de peau GVHD isolés dans une culture de 14 jours étaient oligoclonaux et pourraient être très spécifiques d'un ou plusieurs antigènes H mineur. Des lymphocytes T CD4+ exercent des fonctions prolifératives et cytotoxiques après reconnaissance d'un antigène/épitope HY restreint à HLA-DR7.
Les inventeurs ont analysé la fonction des lymphocytes T CD4+ en les stimulant avec des APC du receveur en présence d'anticorps monoclonaux (mAb) dirigés contre des molécules HLA. Un mAb anti-HLA-DR, mais pas anti-HLA-DQ ou HLA-DP a inhibé significativement la réponse proliférative (tableau 5).35 Tableau 5 : Caractérisation fonctionnelle de la lignée de ymphocytes T CD4+ (I) 3HT _ + anticorps a- + anticorps + anticorps + anticorps (c.p.m x 10-3) HLA classe I a-HLA-DR a-HLA-DQ a-HLA-DP Donneur 615 ND ND ND ND Receveur 11188 12562 886 14662 9711 HLA-mismatch 1559 ND ND ND ND ND : non déterminé Étant donné que le receveur était homozygote pour HLA-DRB1*0701, les inventeurs ont ensuite stimulé les cellules CD4+ avec plusieurs APC mâles et femelles différents exprimant HLA-DRB1*0701 et observé une réponse anti-HY restreinte à DR7 nette, étant donné que les lymphocytes T répondaient à toutes les cellules HLADRB1*0701 mâles, mais pas femelles (tableau 6).
Tableau 6 : Caractérisation fonctionnelle de la lignée de lymphocytes T CD4+ (Il) 3HT (c.p.m x 10-3) APC du receveur APC de sujet masculin APC de sujet féminin APC HLA- 12875 4552 9254 9478 1170 1274 838 DR7B1*0701 Les inventeurs ont ensuite testé l'activité cytotoxique (CTL) des lymphocytes T CD4+, et observé que ces cellules présentaient une activité cytotoxique contre les cellules cibles du receveur. À nouveau, il est apparu que l'élément limitant était la molécule HLA- DRB1 , étant donné que la cytotoxicité était bloquée par un mAb anti-HLA-DR, mais pas un mAb anti-HLA de classe I, et deuxièmement des cellules exprimant DR[31*0701 d'un donneur mâle non apparenté ont été lysées par le sous-ensemble de lymphocytes T CD4+ (tableau 7).
Tableau 7 : Caractérisation fonctionnelle de la lignée de lymphocytes T CD4+ (III) - + anticorps a-HLA classe I + anticorps a-HLA-DR Rapport effecteur/cellule 10/1 3/1 1/1 0,3/1 0,1/1 10/1 10/1 cible % libération de b1Cr Donneur cible 0 0 0 0 0 ND ND Receveur cible 12 12 10 7 4 14 6 PBMC cible partageant le HLA classe I 0 0 0 0 0 ND ND PBMC cible partageant le HLA classe II 28 24 17 10 4 ND ND ND : non déterminé Profils différentiels de reconnaissance d'antigène H mineur et expression d'ARNm de cytokine par des lymphocytes T CD4/CD8 DP et des lymphocytes T CD4+ de peau.
Le profil différentiel de reconnaissance d'antigène H mineur par les lymphocytes T CD4/CD8 DP, et les lymphocytes T CD4+ a été confirmé en utilisant un test prolifératif, dans lequel des PBMC exprimant HLA-B*1401/C*0802 ou HLA-DRB1*0701 ont été utilisés pour stimuler les deux sous-ensembles. Comme montré sur la Figure 1, les premiers PBMC ont activé spécifiquement les lymphocytes T CD4/CD8 DP de peau, tandis que les deuxièmes ont activé les lymphocytes T CD4±. De plus, après activation par leurs APC spécifiques, le profil d'ARNm de ces deux populations était très différent. Les lymphocytes T CD4+ exprimaient des niveaux plus élevés d'IFNy, IL-2 et FoxP3, mais des niveaux plus faibles d'ARNm d'IL-10, tandis que les cellules CD4/CD8 DP exprimaient des niveaux plus élevés d'ILI 0, mais des niveaux plus faibles d'ARNm de FoxP3, IL-2, et IFNy (Figure 2). Bien qu'exprimés à des niveaux plus faibles par les lymphocytes T CD4/CD8 DP, les ARNm d'IL-4 et TGF(3 n'étaient pas exprimés de façon clairement différentielle.
L'épitope HY reconnu par les lymphocytes T CD4+ restreints à HLA-DRB1*0701 est codé par RPS4Y. Afin de définir plus précisément lequel des gènes HY codait l'antigène H mineur reconnu par les lymphocytes T CD4+, les inventeurs ont transduit des lignées cellulaires EBV femelles avec les gènes RPS4Y ou DDX3Y. En parallèle, ils ont cloné la lignée de lymphocytes T CD4+, et utilisé la production d'IFNy et la prolifération pour mesurer les réponses de lymphocytes T. Les résultats ont montré que RPS4Y, mais pas DDX3Y, était capable d'induire spécifiquement la prolifération des lymphocytes T CD4+ (Figure 3), ainsi que la production d'IFNy (Figure 4). En utilisant des bases de données de peptides de liaison au CMH, les inventeurs ont conçu des peptides d'environ 25-40 acides aminés de longueur, qui couvraient des régions englobant un ou plusieurs des motifs de liaison peptidique 15-mère au HLADRB1*0701 candidats, (tableau 8) et utilisé ceux-ci pour pulser des APC de cellules EBV HLA-DR7 femelles. Tableau 8 : Séquences des cinq peptides longs utilisés pour stimuler le clone de lymphocytes T CD4+ en présence de EBV-BLCL femelles exprimant HLA-DRB1*0701 Peptides Séquence Coeur longs SK 31 STGPHKLRECLPLIVFLRNRLKYALTGDEVK (SEQ ID NO: 13) ECLPLIVFLRNRLKYALTGDEVKKICMQRFIKIDG KVRVDVT (SEQ ID NO: 17) (Hotspot) KLRECLPLIVFLRNRLKYAL (SEQ ID NO: 18) (Net MHC) LIVFLRNRLKYAL (SEQ ID NO: 19) (PROPRED) KM-25 KICMQRFIKIDGKVRVDVTYPAGFM (SEQ ID NO: KICMQRFIKIDGKVRVDVT (SEQ ID NO: 20) Peptides Séquence Coeur longs 14) (Hotspot) DA-32 DVISIEKTGEHFRLVYDTKGRFAVHRITVEEA (SEQ FRLVYDTKGRFAVHRIT (SEQ ID NO: 21) (Hotspot) ID NO: 15) TKGRFAVHRITV (SEQ ID NO: 22) (Hotspot) EV-44 EEAKYKLCKVRKITVGVKGIPHLVTHDARTIRYPDP KYKLCKVRKITVGVKG (SEQ ID NO: 23) (Hotspot) (SEQ ID NO: 16) KYKLCKVRKITVGVKGIPH (SEQ ID NO: 24) (Net MHC) YKLCKVRKI (SEQ ID NO: 25) (PROPRED) LVTHDARTI (SEQ ID NO: 26) (PROPRED) QR-40 QIDLGTGKIINFIKFDTGNLCMVIGGANLGRVGVITNRE GKIINFIKFDTGNLCM (SEQ ID NO: 27) (Hotspot) TGNVCMVIAGANLGRVG (SEQ ID NO: 28) (Hotspot) GGANLGRVGV (SEQ ID NO: 29) (Net MHC) FIKFDTGNL (SEQ ID NO: 30) (PROPRED) R (SEQ ID NO: 4) Un seul des peptides 40-mère, QR-40, a été capable de stimuler la production d'IFNy par les lymphocytes T CD4+ (Figure 5). Les inventeurs ensuite testé plusieurs peptides 15-mères putatifs dans QR-40, et seul le peptide TL15 a stimulé les cellules (Tableau 9).
Tableau 9 : Profil d'expression d'ARNm de cytokines après stimulation des lymphocytes T CD4+ avec différents peptides courts issus du peptide QR-40. Peptide TL15 GV17 TG17-1 TG17-2 TGKIINFIKDTGNL GKIINFIKFDTGNLC MV TGNLCMVIGGANL GRVG TGNVCMVIAGA NLGRVG (SEQ ID NO: 1) (SEQ ID NO: 31) (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 32) 33) Concentration 10 giV1 1 giV1 10 giV1 1 giV1 10 giV1 1 giV1 10 giV1 1 giV1 Rapport ARNm 0,004 0,23 0,06 0,02 0,02 0,02 0,006 0,01 0,004 ' 7 IL2/CD3e Rapport ARNm 0,15 12,63 9,91 0,82 0,12 0,11 0,11 0,5 0,009 I FNy/CD3e Rapport ARNm 0,009 0,44 0,42 0,27 0,12 0,32 0,12 0,3 0,23 Fox P3/CD3e Les inventeurs ont ainsi été capables d'identifier TGKIINFIKFDTGNL (SEQ ID NO: 1) comme l'épitope peptidique HY reconnu par les lymphocytes T CD4+ (Figure 6). Le profil d'ARNm de cytokines a montré une induction spécifique d'IFNy, et une faible expression d'ARNm d'IL-2, après activation des lymphocytes T CD4+ par des cellules EBV HLA-DR7 femelles pulsées avec TL15 (Tableau 9), tandis que FoxP3 a été régulé à la hausse en présence de chaque peptide, démontrant ainsi son induction non-spécifique. Cependant, à 1 pM, TL15 a induit la réponse d'ARNm de FoxP3 la plus élevée. Il est intéressant de noter que les lymphocytes T clonés ont présenté le même profil de cytokines que la lignée de lymphocytes T.
Des lymphocytes T CD4+ spécifiques de RPS4Y expriment TCRVB19*01 Afin d'identifier ensuite le TCRVi3 exprimé par les lymphocytes T CD4+, les inventeurs ont séquence leur Vi3TCR. Les résultats ont montré que la lignée de lymphocytes T CD4+ initiale était déjà clonale, étant donné qu'un seul réarrangement de CDR3 était présent dans la lignée et le clone de lymphocytes T. Après séquençage, il a été observé que les régions TCRVB/JB/DB de la lignée et du clone de lymphocytes T CD4+ étaient identiques, et homologues à TRBV19*01 et TRBJ2-3*01 de la base de données IMGT.
Discussion Dans cette étude, les inventeurs ont isolé et caractérisé une population de lymphocytes T DP CD4+ élevé/CD8+ élevé à partir de la peau d'un patient souffrant d'une maladie GVHD de grade II, qui s'est résorbé rapidement. Il est intéressant de noter que la paire donneur/receveur était HLA-identique, mais sexe-non-correspondante, dans la direction qui favorise l'activation de lymphocytes T du donneur femelle HY-spécifiques par les APC mâles du receveur. Cette population CD4/CD8 DP a été co-isolée avec une population de lymphocytes T CD8+ unique. Le sous-ensemble de lymphocytes T CD4/CD8 DP a été observé uniquement dans la peau du patient, pas dans le sang périphérique. Ce sous-ensemble proliférait spécifiquement en réponse à des antigènes exprimés par les cellules du receveur. De manière intéressante, après des cycles répétés de stimulation avec des APC du receveur, les inventeurs ont également isolé à partir des mêmes cultures, un sous-ensemble de lymphocytes T CD4±. Ces cellules étaient capables de produire de l'IL-2 et de l'IFNy et d'exercer des fonctions cytotoxiques (Figure 2 et tableaux 5 à 7). Une caractérisation supplémentaire des lymphocytes T CD4 simples positifs a démontré que l'antigène H mineur qu'ils reconnaissaient était différent de celui reconnu par les lymphocytes T CD4/CD8 DP. En effet, les inventeurs ont formellement exclu la reconnaissance possible d'un antigène HY par les lymphocytes T CD4/CD8 DP, tandis que les lymphocytes T CD4+ étaient clairement spécifiques pour HY (tableau 6). De plus, les lymphocytes T CD4/CD8 DP étaient restreints au HLA de classe I, tandis que les lymphocytes T CD4+ étaient restreints au HLA de classe II, ce qui rend improbable que les lymphocytes T CD4+ fussent directement dérivés des lymphocytes T CD4/CD8 DP, mais plutôt, qu'ils ont été amplifiés pendant la culture in vitro répétée. Leur profil de cytokines était également différent ; les lymphocytes T CD4/CD8 doubles exprimaient de façon prépondérante des transcrits pour IL-10 et TGF[3, tandis que les lymphocytes T CD4+ induisaient de façon préférentielle l'ARNm d'IFNy et FoxP3, après activation (Figures 1 et 2). Enfin, les inventeurs ont observé que le profil de TCR vp de ces deux populations était distinct, étant donné que certains TCR vp étaient perdus dans la population CD4 simple positive, par rapport aux lymphocytes T CD4/CD8 DP. Il est intéressant de noter que seul TCRVB7 est apparu dans la population CD4±. Étant donné qu'il a été observé que les lymphocytes T CD4+ étaient HY- spécifiques et restreints au HLA-DR7, les inventeurs ont ensuite tenté d'identifier le gène et le peptide codant cet épitope HY, en utilisant une approche de gène candidat similaire à celle précédemment utilisée pour identifier les épitopes HY restreints au CMH de classe Il murins. Ils ont transduit à l'aide d'un rétrovirus des cellules DR7-EBV femelles avec les gènes candidats DDX3Y et RPS4Y. En utilisant le clone ou lignée de lymphocyte T CD4 simple positif isolé, ils ont identifié RPS4Y comme le gène qui exprimait l'épitope HY restreint à DR7. Afin d'identifier l'épitope peptidique lui-même, ils ont dans un premier temps utilisé des peptides longs de 25 à 40 acides aminés, conçus pour incorporer des peptides de liaison à DR7 candidats qui ont été identifiés dans plusieurs bases de données, telles que SYFPEITHI, Net-MHC, Propred, HotSpot Hunter. Cela leur a permis de définir un peptide, QR40, comme exprimant l'épitope (tableau 8), et les a conduits à identifier le peptide 15-mère spécifique, TGKIINFIKFDTGNL (SEQ ID NO: 1) comme étant l'épitope peptidique HY reconnu par les lymphocytes T CD4±. Cependant, en comparant la réponse du clone de lymphocyte T CD4+ aux peptides long et court, ils ont observé que le peptide plus court, ne nécessitant pas de traitement, induisait des réponses plus élevées (Figure 4). Cet épitope est clairement nouveau. Bien qu'il ait déjà été démontré que RPS4Y code un épitope HY restreint au HLA de classe II, et induit une activité auxiliaire et cytotoxique, dans cette étude l'épitope était restreint à HLA-DRB3. En conclusion, cet exemple décrit un nouvel antigène H mineur HY restreint au HLA de classe II, sa séquence d'acides aminés, sa restriction HLA, et la région CDR3 du Vi3TCR par laquelle il est reconnue. Étant donné que les antigènes H mineur HLA de classe II ont été décrits comme une cible putative de cellules leucémiques in vivo, en raison de leur expression prépondérante par des cellules souches hématopoïétiques, ces observations devraient contribuer à cibler spécifiquement des cellules leucémiques mâles HLA-DR7, dans des programmes de thérapie cellulaire.
Claims (11)
- REVENDICATIONS1. Polypeptide isolé comprenant : a) la séquence TGKIINFIKFDTGNL (SEQ ID NO: 1), ou b) un fragment peptidique d'au moins 9 acides aminés consécutifs de la séquence SEQ ID NO: 1 ou c) un variant de la séquence SEQ ID NO: 1 ou d'un fragment selon b) différant de la séquence SEQ ID NO: 1 ou du fragment selon b) par substitution conservative d'un, deux ou trois acides aminés, ou d) un peptidomimétique de la séquence SEQ ID NO: 1 ou du fragment selon b) ou du variant selon c), ledit peptidomimétique étant obtenu par modification structurale en utilisant des acides aminés non naturels, ledit fragment peptidique, ledit peptidomimétique et ledit variant ayant la capacité d'activer des lymphocytes T lorsqu'il est présenté par la molécule HLA-DR7; ledit polypeptide ne comprenant ni la séquence complète de la protéine codée par le gène RPS4Y, ni la séquence TIRYPDPVI (SEQ ID NO:
- 2), ni la séquence VIKVNDTCQI (SEQ ID NO:
- 3). 2. Polypeptide selon la revendication 1, ledit polypeptide consistant en la séquence TGKIINFIKFDTGNL (SEQ ID NO: 1). 3. Acide nucléique comprenant ou consistant en une séquence codant un polypeptide tel que défini à la revendication 1 ou 2.
- 4. Vecteur comprenant un acide nucléique selon la revendication 3, dans lequel ledit acide nucléique est lié de manière opérante à un ou des élément(s) permettant l'expression du polypeptide.
- 5. Procédé de production d'un polypeptide tel que défini dans la revendication 1 ou 2, comprenant les étapes consistant à : a) synthétiser ledit polypeptide par voie chimique ou enzymatique ou faire exprimer ledit polypeptide par une cellule comprenant l'acide nucléique selon la revendication 3 ou le vecteur selon la revendication 4; et b) récupérer ledit polypeptide obtenu à l'étape a). 2 982 85 9 36
- 6. Méthode de préparation in vitro de. lymphocytes T capables de reconnaître spécifiquement un épitope issu d'un polypeptide tel que défini dans la revendication 1 ou 2 ou d'un polypeptide comprenant la séquence complète de la protéine codée par le gène RPS4Y et présenté par la molécule HLA-DR7 exprimée à la surface de cellules 5 présentatrices d'antigène, comprenant les étapes de : - co-culture de lymphocytes T avec des cellules présentatrices d'antigène exprimant à leur surface la molécule HLA-DR7 à laquelle est liée un épitope issu du polypeptide tel que défini à la revendication 1 ou 2 ou d'un polypeptide comprenant la séquence complète de la protéine codée par le gène RPS4Y; et 10 - récupération des lymphocytes T à partir de ladite co-culture.
- 7. Lymphocyte T isolé reconnaissant spécifiquement un épitope issu du polypeptide tel que défini dans la revendication 1 ou 2 ou d'un polypeptide comprenant la séquence complète de la protéine codée par le gène RPS4Y et présenté par la molécule HLA-DR7 15 exprimée à la surface de cellules présentatrices d'antigène, ledit lymphocyte T étant susceptible d'être obtenu par la méthode de préparation selon la revendication 6.
- 8. Composition pharmaceutique comprenant (i) un polypeptide tel que défini dans la revendication 1 ou 2 ou un lymphocyte T tel que défini dans la revendication 7 et (ii) un 20 véhicule pharmaceutiquement acceptable.
- 9. Médicament comprenant un polypeptide tel que défini dans la revendication 1 ou 2 ou un lymphocyte T tel que défini dans la revendication 7. 25
- 10. Polypeptide isolé tel que défini dans la revendication 1 ou 2, ou lymphocyte T isolé tel que défini dans la revendication 7, pour son utilisation pour le traitement d'un cancer des cellules immunitaires.
- 11. Polypeptide isolé tel que défini dans la revendication 1 ou 2, ou lymphocyte T isolé 30 tel que défini dans la revendication 7, ou polypeptide comprenant la séquence complète de la protéine codée par le gène RPS4Y, pour son utilisation pour le traitement d'un cancer des cellules immunitaires chez un sujet exprimant la molécule HLA-DR7.
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| SPIERINGS ERIC ET AL: "Identification of HLA class II-restricted H-Y-specific T-helper epitope evoking CD4+ T-helper cells in H-Y-mismatched transplantation.", LANCET (NORTH AMERICAN EDITION), vol. 362, no. 9384, 23 August 2003 (2003-08-23), pages 610 - 615, XP002679639, ISSN: 0099-5355 * |
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