FR2978964A1 - Composition vaccinale anti-il-6 - Google Patents

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Abstract

La présente invention concerne une composition pharmaceutique comprenant, à titre de substance active au moins un polypeptide comprenant, ou constitué d'une séquence constituée d'au moins 8 acides aminés contigus et d'au plus 30 acides aminés contigus choisis au sein de la séquence l'interleukine-6 et d'au plus 30 acides aminés contigus choisis au sein de la séquence complète de l'IL-6.

Description

COMPOSITION VACCINALE ANTI-IL-6 Domaine de l'invention La présente invention concerne une composition vaccinale anti-IL-6, ainsi que les 5 anticorps susceptibles d'être obtenus à l'aide de cette composition.
Arrière plan technique L'interleukine-6 (IL-6) est secrétée par de nombreuses cellules sanguines. C'est une protéine de 26 kDa composée de 183 acides aminés chez l'homme (référence Swissprot 10 P05231). Elle peut exercer ses effets biologiques sur de nombreux types cellulaires via des récepteurs spécifiques, membranaires et solubles. L'IL-6 est une des trois cytokines majeures de l'inflammation avec l'IL-1 et le TNF (Woo (1993) Clin. Exp. Rheumatol. 11 Suppl. 9:S29-32), en induisant notamment la production des protéines de la phase aiguë par le foie (Nijsten et al. (1986) Lancet 2:921.16). 15 L'IL-6 joue également un rôle important dans la dégradation osseuse et cartilagineuse (Jilka et al. (1992) Science 257:88-91, 1992), ainsi que sur la qualité du cartilage et la prolifération des fibroblastes synoviaux. Chez l'homme, il a été montré qu'une surproduction d'IL-6 est associée à la polyarthrite rhumatoïde (Robak et al. (1998) Mediators Inflamm. 7: 347-53,) et il a été montré dans plusieurs modèles murins d'arthrite induite par le collagène qu'IL-6 était 20 nécessaire au développement de la maladie, les souris dans lesquelles l'expression d'IL-6 était abolie étant totalement protégées (Alonzi et al. (1998) J Exp. Med 187:461-8). De la même manière, un rôle promoteur de l'IL-6 a été mis en évidence dans d'autres maladies arthritiques, telles que l'arthrite juvénile idiopathique, et également dans les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI) chez l'homme (Mitsuyama et al. 25 (1995) Gut 36:45-49,), ainsi que dans le lupus érythémateux disséminé, pour lequel une augmentation d'IL-6 dans le sérum et une expression anormale du récepteur IL-6Ra ont été constatées dans un modèle murin. En outre, l'addition d'IL-6 exogène entraine une production accrue d'auto-anticorps et une progression plus rapide de la glomérulonéphrite (Ryffel et al. (1994) Am. J. Pathol. 144:927-37). 30 De manière générale, les cytokines pro-inflammatoires comme l'IL-6, le TNF, et 1'IL-1 peuvent intervenir dans le développement de l'ensemble des maladies inflammatoires chroniques, comme - les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, telles que la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique ou colite ulcéreuse, - les maladies arthritiques, notamment la polyarthrite rhumatoïde, la polyarthrite rhumatoïde juvénile, l'arthrite psoriasique, l'arthrose, la polyarthrite rhumatoïde réfractaire, l'arthrite chronique non rhumatoïde, ou la spondylarthrite ankylosante, - les maladies osseuses inflammatoires chroniques ou liées à l'IL-6, notamment un trouble 5 de la résorption osseuse ou l'ostéoporose, - les maladies inflammatoires chroniques ou liées à l'IL-6 en liaison avec une infection, telle que le choc septique, le choc endotoxinique, la septicémie, l'hépatite à VHC, le paludisme, les méningites, le SIDA ou les infections à VIH, - les maladies inflammatoires chroniques ou liées à l'IL-6 du système cardiovasculaire, telle 10 que l'athérosclérose, les lésions d'ischémie-reperfusion, les maladies coronariennes, et la vascularite, telle que la maladie de Behçet ou la granulomatose de Wegener, - les maladies auto-immunes, telles que le lupus érythémateux, notamment disséminé, la sclérose en plaques, ou le psoriasis, les maladies liées à une greffe, telle que les réactions du greffon contre l'hôte et les 15 traumatismes et rejets de greffe, - les allergies, notamment l'asthme allergique et les troubles de la peau dus à des réactions d'hypersensibilité retardée, - les déficits immunitaires, tels que le déficit immunitaire commun variable (DICV), les maladies inflammatoires chroniques ou liées à l'IL-6 du système respiratoire, 20 notamment le syndrome de détresse respiratoire ou la fibrose pulmonaire, - les cancers ayant une composante inflammatoire chronique ou liés à l'IL-6, tels que le plasmocytome, le cancer colorectal, le cancer de l'ovaire récurrent, le syndrome lymphoprolifératif, le myélome multiple, notamment réfractaire, ou le syndrome myéloprolifératif, 25 le diabète, notamment le diabète juvénile, - les amyloïdoses, notamment la maladie d'Alzheimer, - l'uvéite, notamment sous sa forme récurrente chronique, - la cachexie, ou - l'endométriose. 30 Plusieurs stratégies ont été envisagées afin de tenter de limiter les effets délétères de l'IL-6. Ainsi, un anticorps monoclonal humanisé, le Tocilizumab, dirigé contre le récepteur IL-6Ra, est efficace cliniquement dans le traitement de la polyarthrite rhumatoïde chez l'adulte (Patel & Moreland (2010) Drug Design, Development and Therapy 4:263-278).
Par ailleurs, des anticorps monoclonaux ciblant directement la cytokine IL-6 sont actuellement en développement dans le cadre du traitement de maladies auto-immunes, tels que les anticorps CNTO328 (US2008/0081041) et CNTO136 (US 2010/0138945), mais il ne semble pas que leur efficacité clinique ait été établie pour le moment.
Toutefois, les approches faisant appel à des anticorps monoclonaux, si elles peuvent s'avérer efficaces, sont souvent coûteuses à mettre en oeuvre, notamment car elles nécessitent des administrations régulières de ces anticorps. De fait, une méthode de vaccination pour lutter contre les dérèglements immunitaires liés à l'IL-6 à l'aide d'une mutéine de l'IL-6 humaine, Santl (De Benedetti et al. (2001) J. Immunol. 166:4334-4340 ; US 6,706,261) a été décrite, mais ces travaux ne semblent pas avoir donné lieu à un développement clinique. Par ailleurs, la vaccination de souris à l'aide de mutants de l'IL-6 de souris (mIL-6) permet d'obtenir une réponse immunitaire protectrice vis-à-vis de l'arthrite induite par le collagène ou de l'encéphalite allergique expérimentale (Galle et al. (2007) Int. Immunopharmacol. 7:1704-1713). Toutefois, là encore, ces travaux ne semblent pas avoir donné lieu à un développement clinique.
Description de l'invention La présente invention découle de la mise en évidence inattendue, par les inventeurs, que des peptides dérivés de certaines parties de l'IL-6 permettaient de générer une réponse 20 immunitaire protectrice vis-à-vis de l'IL-6. La présente invention concerne donc une composition pharmaceutique, notamment vaccinale, comprenant, à titre de substance active : - au moins un polypeptide comprenant, ou constitué de : une première séquence constituée (i) d'une première portion d'au moins 8 acides 25 aminés contigus choisis au sein de la séquence s'étendant des acides aminés 58 à 78 de l'IL-6 et d'au plus 30 acides aminés contigus choisis au sein de la séquence complète de l'IL-6, ou (ii) d'une séquence variante présentant au moins 75% d'identité avec la première portion ; et/ou - une deuxième séquence constituée (i) d'une deuxième portion d'au moins 8 acides 30 aminés contigus choisis au sein de la séquence s'étendant des acides aminés 73 à 94 de l'IL-6 et d'au plus 30 acides aminés contigus choisis au sein de la séquence complète de l'IL-6, ou (ii) d'une séquence variante présentant au moins 75% d'identité avec la deuxième portion ; et/ou une troisième séquence constituée (i) d'une troisième portion d'au moins 8 acides aminés contigus choisis au sein de la séquence s'étendant des acides aminés 96 à 111 de l'IL-6 et d'au plus 30 acides aminés contigus choisis au sein de la séquence complète de l'IL-6, ou (ii) d'une séquence variante présentant au moins 75% d'identité avec la troisième portion ; et/ou une quatrième séquence constituée (i) d'une quatrième portion d'au moins 8 acides aminés contigus choisis au sein de la séquence s'étendant des acides aminés 122 à 141 de l'IL-6 et d'au plus 30 acides aminés contigus choisis au sein de la séquence complète de l'IL-6, ou (ii) d'une séquence variante présentant au moins 75% d'identité avec la quatrième portion ; et/ou une cinquième séquence constituée (i) d'une cinquième portion d'au moins 8 acides aminés contigus choisis au sein de la séquence s'étendant des acides aminés 172 à 189 de l'IL-6 et d'au plus 30 acides aminés contigus choisis au sein de la séquence complète de l'IL-6, ou (ii) d'une séquence variante présentant au moins 75% d'identité avec la cinquième portion ; ou - au moins un polynucléotide codant pour le polypeptide ci-dessus, éventuellement en association avec au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable, sous réserve qu'un polypeptide constitué des séquences variantes permette d'éliciter une réponse immunitaire dirigée contre l'IL-6 et sous réserve que le polypeptide soit différent de l'IL-6 et qu'il ne soit pas constitué d'une portion de plus de 30 acides aminés contigus de l'IL-6. Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne également la composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus pour son utilisation dans la prévention ou le traitement des maladies liées à l'IL-6 ou des maladies inflammatoire chroniques.
La présente invention concerne également un polypeptide tel que défini ci-dessus, ainsi qu'un polynucléotide codant pour un polypeptide tel que défini ci-dessus. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne également le polypeptide tel que défini ci-dessus, et l'acide nucléique tel que définit ci-dessus, pour son utilisation à titre de médicament, notamment dans la prévention ou le traitement des maladies liées à l'IL-30 6 ou des maladies inflammatoire chroniques. Par ailleurs, la présente invention concerne également une méthode de prévention ou de traitement des maladies liées à l'IL-6 ou des maladies inflammatoires chroniques chez un individu, dans laquelle on administre à l'individu une quantité prophylactiquement ou thérapeutiquement efficace d'une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus, d'un polypeptide tel que défini ci-dessus, ou d'un polynucléotide tel que défini ci-dessus. L'interleukine 6 (IL-6), également parfois nommée facteur de stimulation des lymphocytes B 2 (B-cell stimulatory factor 2, BSF-2), facteur de différentiation des lymphocytes T cytotoxiques (CTL différentiation factor, CDF), facteur de croissance des hybridomes, ou interferon f3-2 (IFN-(3-2) est bien connue de l'homme du métier. De nombreuses séquences d'IL-6 provenant de diverses espèces animales sont disponibles dans les bases de données de séquence. A titre d'exemple, une IL-6 de souris (mIL-6) est décrite dans la base de données UniProt/Swissprot sous la référence P08505 (SEQ ID NO : 55) et une IL-6 humaine est décrite dans la base de données UniProt/Swissprot sous la référence P05231 (SEQ ID NO : 54). Comme on l'entend ici, la numérotation des acides aminés de l'IL-6 commence sur le premier acide aminé formant l'extrémité N-terminale de l'IL-6 complète codée par le cadre ouvert de lecture du gène de l'IL-6, c'est-à-dire incluant son peptide signal. De préférence, la première portion, la deuxième portion, la troisième portion, la quatrième portion et la cinquième portion selon l'invention sont constituées d'au moins 9, 10, 11, 12 acides aminés contigus respectivement choisis au sein de la séquence s'étendant des acides aminés 58 à 78, 73 à 94, 96 à 111, 122 à 141, et 172 à 189 de l'IL-6 ou sont constituées respectivement au moins de la séquence s'étendant des acides aminés 58 à 78, 73 à 94, 96 à 111, 122 à 141, et 172 à 189 de l'IL-6.
De préférence également, la première portion, la deuxième portion, la troisième portion, la quatrième portion et la cinquième portion selon l'invention sont constitués respectivement au plus de 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20 acides aminés contigus choisis au sein de la séquence complète de l'IL-6, ou sont constituées respectivement au plus des acides aminés 58 à 78, 73 à 94, 96 à l 11, 122 à 141, et 172 à 189 de l'IL-6.
De préférence, l'IL-6 selon l'invention est sélectionnée dans le groupe constitué de l'IL-6 humaine, l'IL-6 de souris, l'IL-6 de singe, notamment de macaque, l'IL-6 cheval, l'IL-6 de chien et l'IL-6 de chat, et de manière particulièrement préférée l'IL-6 selon l'invention est l'IL-6 humaine. A titre d'exemple, l'IL-6 de macaque est représentée par la référence de la base de données SwissProt P51494 (SEQ ID NO: 58), l'IL-6 de cheval est représentée par la référence de la base de données SwissProt Q95181 (SEQ ID NO : 59), l'IL-6 de chien est représentée par la référence de la base de données SwissProt P41323 (SEQ ID NO : 60) et l'IL-6 de chat est représentée par la référence de la base de données SwissProt P41683 (SEQ ID NO : 61).
De préférence, lorsqu'il l'IL-6 selon l'invention est l'IL-6 humaine alors, de préférence, la première portion, la deuxième portion, la troisième portion, la quatrième portion et la cinquième portion selon l'invention sont constituées d'au moins 8, 9, 10, 11, 12 acides aminés contigus respectivement choisis au sein de la séquence s'étendant des acides aminés 63 à 78, 78 à 94, 101 à 111, 127 à 141 et 177 à 198 de l'IL-6 humaine ou sont constituées respectivement au moins de la séquence s'étendant des acides aminés 63 à 78, 78 à 94, 101 à 111, 127 à 141 et 177 à 198 de l'IL-6 humaine. De même, de préférence également, la première portion, la deuxième portion, la troisième portion, la quatrième portion et la cinquième portion selon l'invention sont constitués respectivement au plus de 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20 acides aminés contigus choisis au sein de la séquence complète de l'IL-6 humaine, ou sont constituées respectivement au plus des acides aminés 63 à 78, 78 à 94, 101 à 111, 127 à 141 et 177 à 198 de l'IL-6 humaine. Une séquence variante selon l'invention, qui présente au moins 75% d'identité avec l'une des première, deuxième, troisième, quatrième, et cinquième portions ci-dessus, présente de manière préférée au moins 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% d'identité avec l'une des première, deuxième, troisième, quatrième, et cinquième portions ci-dessus. Comme on l'entend ici, le pourcentage d'identité entre deux séquences peptidiques peut être déterminé en réalisant un alignement optimal sur toute la longueur des séquences, en déterminant le nombre de position alignées pour lesquelles les acides aminés sont identiques dans chaque séquence et en divisant ce nombre par le nombre total d'acides aminés dans la plus longue des deux séquences. L'alignement optimal est celui qui donne le pourcentage d'identité le plus élevé entre les deux séquences. De manière préférée, la première, la deuxième, la troisième, la quatrième et la cinquième portions selon l'invention sont respectivement constituées de SEQ NO : 1, SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4 et SEQ ID NO : 5. SEQ ID NO : 1 à 5 représentent respectivement les portions 63 à 78, 78 à 94, 101 à 111, 127 à 141 et 177 à 198 de l'IL-6 humaine représentée par SEQ ID NO : 54. GISALRKETCNKSNMC SEQ ID NO : 1 CESSKEALAENNLNLPK SEQ ID NO : 2 CFQSGFNEETC SEQ ID NO : 3 EYLQNRFESSEEQAR SEQ ID NO : 4 TKLQAQNQWLQDM SEQ ID NO : 5 Ainsi, de manière préférée également, une séquence variante selon l'invention présente au moins 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% d'identité avec SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 4 ou SEQ ID NO : 5. A titre d'exemple, une séquence variante selon l'invention est sélectionnée dans le groupe constitué de : SEQ ID NO : 8 pour la première séquence, SEQ ID NO : 9 pour la deuxième séquence, SEQ ID NO : 10 pour la troisième séquence, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO : 56 pour la quatrième séquence, et SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 12 pour la cinquième séquence. SEQ ID NO : 8 est une séquence variante de SEQ ID NO : 1 ; SEQ ID NO : 9 est une séquence variante de SEQ ID NO : 2 ; SEQ ID NO : 10 est une séquence variante de SEQ ID NO : 3 ; SEQ ID NO : 6, 11 et 56 sont des séquences variantes de SEQ ID NO : 4 ; et SEQ ID NO : 7 et 12 sont des séquences variantes de SEQ ID NO : 5. GISALRKETCNKSNMC SEQ ID NO : 1 GISAVRKDTCNKSQMC SEQ ID NO : 8 CESSKEALAENNLNLPK SEQ ID NO : 2 CESSKDAIAENQLNLPK SEQ ID NO : 9 CFQSGFNEETC SEQ ID NO : 3 CFNSGFNEDTC SEQ ID NO : 10 EYLQNRFESSEEQAR SEQ ID NO : 4 EFLQNRFESSEEQAR SEQ ID NO : 6 EFLQNRFDSSDENAR SEQ ID NO: 11 DFLQNRFDSSDENAR SEQ ID NO: 56 TKLQAQNQWLQDM SEQ ID NO : 5 TKCQAQNQWLQDM SEQ ID NO : 7 TKCQANQQWLQEM SE QID NO : 12 De manière particulièrement préférée, la première séquence selon l'invention est constituée d'une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 24, SEQ ID NO : 34, SEQ ID NO : 39, SEQ ID NO : 44 et SEQ ID NO : 49. De manière particulièrement préférée, la deuxième séquence selon l'invention est 20 constituée d'une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 25, SEQ ID NO : 35, SEQ ID NO : 40, SEQ ID NO : 45 et SEQ ID NO : 50. De manière particulièrement préférée, la troisième séquence selon l'invention est constituée d'une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 26, SEQ ID NO : 36, SEQ ID NO : 41, SEQ ID NO : 46, et SEQ ID NO : 51. De manière particulièrement préférée, la quatrième séquence selon l'invention est constituée d'une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO : 56, SEQ ID NO : 27, SEQ ID NO : 37, SEQ ID NO : 42, SEQ ID NO : 47 et SEQ ID NO : 52. De manière particulièrement préférée, la cinquième séquence selon l'invention est constituée d'une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 28 SEQ ID NO : 25, SEQ ID NO : 38, SEQ ID NO : 43, SEQ ID NO : 48 et SEQ ID NO : 53.
SEQ ID NO : 24 à 28 représentent des portions ou des séquences variantes d'IL-6 de souris. SEQ ID NO : 34 à 38 représentent des portions d'IL-6 de singe, notamment de macaque. SEQ ID NO : 39 à 43 représentent des portions d'IL-6 de cheval.
SEQ ID NO : 44 à 48 représentent des portions d'IL-6 de chien. SEQ ID NO : 49 à 53 représentent des portions d'IL-6 de chat. De manière tout particulièrement préférée, la première séquence, la deuxième séquence, la troisième séquence, la quatrième séquence et la cinquième séquence selon l'invention sont respectivement constituées de SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 6 et SEQ ID NO : 7. La séquence variante selon l'invention est telle qu'un polypeptide constitué de la séquence variante doit permettre d'éliciter une réponse immunitaire dirigée contre l'IL-6 ; c'est-à-dire que l'administration d'un tel peptide, éventuellement cyclisé par formation d'au moins un pont disuflure inter-cystéines, si nécessaire après adjonction d'une ou deux cystéines au sein du peptide, et/ou à son l'extrémité N-terminale et/ou à son extrémité C-terminale, le peptide étant éventuellement couplé une molécule porteuse, notamment une protéine porteuse, telle que la KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin), à un animal, tel qu'une souris, un rat ou un lapin, provoque la production d'anticorps dirigés contre une IL-6, notamment une IL-6 de la même espèce que celle à laquelle appartient la séquence avec laquelle la séquence variante présente le pourcentage d'identité le plus élevé. L'homme du métier sait bien comment déterminer si un anticorps est dirigé contre l'IL-6, notamment en mettant en oeuvre un test ELISA. De manière préférée, les anticorps élicités par administration du peptide sont bloquants, c'est-à-dire qu'ils empêchent l'IL-6 d'exercer tout ou partie, notamment au moins 10%, 25%, 50%, 75%, de son activité, par exemple mesurée in vitro comme cela est indiqué dans l'Exemple 5 ci-après. Le polypeptide selon l'invention comprend de préférence au plus 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40 ou 30 acides aminés. Il est différent de l'IL-6 et n'est pas constitué d'une portion de plus de 30 acides aminés contigus de l'IL-6. Comme l'homme du métier le comprend bien cela n'exclut pas qu'il puisse être constitué de deux ou plus portions de l'IL-6 d'au plus 30 acides aminés contigus, dans la mesure où ces portions ne sont pas agencées de manière à reconstituer une portion de l'IL-6 de plus de 30 acides aminés contigus. Par ailleurs, le polypeptide selon l'invention peut également comprendre des séquences ne provenant par de l'IL-6, et notamment des séquences comprenant des épitopes appartenant à d'autres protéines. Le polypeptide selon l'invention est de préférence cyclisé. Cette cyclisation peut être de tout type connue de l'homme du métier, toutefois, on préfère ici que le polypeptide soit cyclisé par formation d'un pont disulfure inter-cystéine, c'est-à-dire entre les radicaux -SH de deux cystéines. Les cystéines peuvent être déjà présentes dans la séquence variante selon l'invention ou dans les première, deuxième, troisième, quatrième, et cinquième portions selon l'invention, ou bien être ajoutées au sein de ces séquences, ainsi qu'à leur extrémité N-terminale et/ou C-terminale. Ainsi, de manière préférée, le polypeptide selon l'invention est constitué d'une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 13, SEQ ID 25 NO : 3, SEQ ID NO : 14 et SEQ ID NO : 15, et est de préférence cyclisé par formation d'un pont disulfure entre les radicaux -SH de cystéines. SEQ ID NO : 13 représente une séquence SEQ ID NO : 2 à laquelle une cystéine a été ajoutée à l'extrémité C terminale. SEQ ID NO : 14 représente une séquence SEQ ID NO : 6 à laquelle une cystéine a été 30 ajoutée à l'extrémité N-terminale et une cystéine a été ajoutée à l'extrémité C-terminale. SEQ ID NO : 15 représente une séquence SEQ ID NO : 7 à laquelle une cystéine a été ajoutée à l'extrémité C-terminale. Par ailleurs, SEQ ID NO : 7 représente une séquence SEQ ID NO : 5 dans laquelle la leucine en troisième position a été substituée par une cystéine.
En outre, le polypeptide selon l'invention peut comprendre des modifications posttraductionnelles, telles que des glycosylations, des méthylations, des acylations, notamment par des acides gras, ou des phosphorylations. En particulier, l'extrémité N-terminale du polypeptide selon l'invention peut être acétylée et l'extrémité C-terminale peut être modifiée par amidation. Le polypeptide selon l'invention peut également comprendre un ou plusieurs analogues ou dérivés d'acides aminés, dont les acides aminés non naturels ou non standards. De manière préférée également, le polypeptide selon l'invention est fixé, notamment par liaison covalente, sur une macromolécule, notamment une protéine, porteuse, en particulier la protéine KLH pour Keyhole Limpet Hemocyanin, une métalloprotéine extraite de Megathura crenulata bien connue de l'homme du métier. D'autres protéines porteuses susceptibles d'être utilises selon l'invention englobent, notamment, l'antigène de surface de l'hépatite B (HBsAg), l'albumine sérique bovine (BSA), le toxoïde de la diphtérie (DT) et le toxoïde du tétanos (TT).
La fixation du polypeptide selon l'invention sur une macromolécule, notamment une protéine porteuse, peut être réalisée à l'aide d'un agent de couplage, tel que le bisdiazoniumbenzidine (BDB) ou le glutaraldéhyde. D'autres agents de couplage, tel que les carbodiimides et l'ester de m-maléimidobenzoyl-n-hydroxysuccinimide (MBS) peuvent également être utilisés. Lorsque le BDB est utilisé, il est de préférence fixé sur une tyrosine, qui si elle n'est pas présente dans le polypeptide selon l'invention, peut être ajoutée, notamment à son extrémité N-terminale ou C-terminale. Par ailleurs, lorsqu'une tyrosine est présente dans une portion selon l'invention à une position non souhaitée, il est possible de mettre en oeuvre, à la place, une séquence variante dans laquelle la tyrosine est substituée par un autre acide aminé, tel qu'une phénylalanine. Cette possibilité est notamment illustrée par les séquences SEQ ID NO : 6, 11 et 56 par rapport à la portion de séquence SEQ ID NO : 4. Ainsi, de manière tout particulièrement préférée, le polypeptide selon l'invention est fixé sur la protéine porteuse KLH pour former une construction représentée par une formule sélectionnée dans le groupe constitué des formules suivantes : KLH - [BDB - Y - GISALRKETCNKSNMC+Amide] (SEQ ID NO : 16), [Acétyl+CESSKEALAENNLNLPKC - Y - BDB] - KLH (SEQ ID NO : 17), KLH - [Gluta - CFQSGFNEETC+Amide] (SEQ ID NO : 3), KLH - [BDB- Y - CEFLQNRFESSEEQARC+ Amide] (SEQ ID NO : 18), et [Acétyl +TKCQAQNQWLQDMC - Y - BDB] - KLH (SEQ ID NO : 19), où KLH désigne la protéine porteuse Keyhole Limpet Hemocyanin, BDB désigne le bisdiazonium-benzidine, Gluta désigne le glutaraldéhyde, Acétyl+ indique que l'extrémité N-terminale est acétylée, Amide+ indique le l'extrémité C-terminale est modifiée par amidation, les crochets indiquent que un ou plusieurs polypeptides sont fixés sur la protéine porteuse et la partie soulignée représente le polypeptide selon l'invention. Le polypeptide selon l'invention peut être préparé par toute méthode connue dans l'état de la technique et notamment par synthèse chimique. Il est également possible le préparer par expression du polynucléotide selon l'invention. Dans ce cas, le polypeptide selon l'invention pourra alors être exprimé en fusion avec une particule de type virale (VLP) qui jouera alors le rôle de protéine porteuse, comme cela est décrit dans la demande internationale WO 05/117983 pour le TNF par exemple. Le polynucléotide selon l'invention est de l'ARN ou de l'ADN, de préférence de l'ADN. On préfère que le polynucléotide selon l'invention soit lié de manière opératoire à une séquence promotrice prokaryote et/ou eucaryote, notamment de mammifère ou de virus. Par ailleurs, le polynucléotide selon l'invention peut être inclus dans un vecteur, tel qu'un plasmide ou un virus. La présente invention concerne également un anticorps ou un aptamère anti-IL-6 spécifiquement dirigé contre polypeptide comprenant, ou constitué de : - une première séquence constituée (i) d'une première portion d'au moins 8 acides aminés contigus choisis au sein de la séquence s'étendant des acides aminés 58 à 78 de l'IL-6 et d'au plus 30 acides aminés contigus choisis au sein de la séquence complète de l'IL-6, ou (ii) d'une séquence variante présentant au moins 75% d'identité avec la première portion ; et/ou une deuxième séquence constituée (i) d'une deuxième portion d'au moins 8 acides aminés contigus choisis au sein de la séquence s'étendant des acides aminés 73 à 94 de l'IL-6 et d'au plus 30 acides aminés contigus choisis au sein de la séquence complète de l'IL-6, ou (ii) d'une séquence variante présentant au moins 75% d'identité avec la deuxième portion ; et/ou - une troisième séquence constituée (i) d'une troisième portion d'au moins 8 acides aminés contigus choisis au sein de la séquence s'étendant des acides aminés 96 à 111 de l'IL-6 et d'au plus 30 acides aminés contigus choisis au sein de la séquence complète de l'IL-6, ou (ii) d'une séquence variante présentant au moins 75% d'identité avec la troisième portion ; et/ou une quatrième séquence constituée (i) d'une quatrième portion d'au moins 8 acides aminés contigus choisis au sein de la séquence s'étendant des acides aminés 122 à 141 de l'IL-6 et d'au plus 30 acides aminés contigus choisis au sein de la séquence complète de l'IL-6, ou (ii) d'une séquence variante présentant au moins 75% d'identité avec la quatrième portion ; et/ou une cinquième séquence constituée (i) d'une cinquième portion d'au moins 8 acides aminés contigus choisis au sein de la séquence s'étendant des acides aminés 172 à 189 de l'IL-6 et d'au plus 30 acides aminés contigus choisis au sein de la séquence complète de l'IL-6, ou (ii) d'une séquence variante présentant au moins 75% d'identité avec la cinquième portion ;sous réserve qu'un polypeptide constitué des séquences variantes permette d'éliciter une réponse immunitaire dirigée contre l'IL-6 et sous réserve que le polypeptide ne comprenne pas plus de 2 acides aminés en plus de la première, de la deuxième, de la troisième, de la quatrième et de la cinquième séquence. Les anticorps et aptamère selon l'invention sont dits être spécifiquement dirigés contre un polypeptide tel que défini ci-dessus lorsqu'ils ne présentent essentiellement pas de liaison à un autre polypeptide, qui ne comprend pas le polypeptide défini ci-dessus, dans des conditions permettant la liaison des anticorps et aptamère selon l'invention aux polypeptides contre lesquels ils sont spécifiquement dirigés. L'anticorps selon l'invention peut être polyclonal ou monoclonal, de préférence monoclonal. Par ailleurs, comme on l'entend ici, le terme « anticorps » englobe les anticorps en entier ainsi que les fragments d'anticorps comprenant au moins une partie de liaison à l'antigène, tels que les fragments Fab, F(ab')2, et scFv. Les anticorps peuvent être de toute espèce, notamment de souris, de rat, de lapin ou de camélidé. Par ailleurs, ils peuvent également être humanisés. Les anticorps selon l'invention peuvent être obtenus par immunisation d'un animal à l'aide d'un polypeptide selon l'invention. Comme on l'entend ici, les aptamères sont des acides nucléiques, en particulier des ARN, capables de se lier spécifiquement à une cible moléculaire, telle qu'une protéine. Les aptamères peuvent notamment être obtenus par mise en oeuvre de la technique SELEX bien connue de l'homme du métier, à partir des polypeptides selon l'invention. De manière préférée, la première, la deuxième, la troisième, la quatrième et la cinquième séquence, ainsi que la séquence variante, du polypeptide contre lequel sont spécifiquement dirigés l'anticorps et l'aptamère selon l'invention sont telles que définies ci-dessus pour le polypeptide et la composition pharmaceutique selon l'invention.
Par ailleurs, on préfère que le polypeptide contre lequel sont spécifiquement dirigés l'anticorps et l'aptamère selon l'invention soit cyclisé, en particulier par formation d'un pont disulfure inter-cystéine, c'est-à-dire entre les radicaux -SH de deux cystéines. Les cystéines peuvent être déjà présentes dans la séquence variante selon l'invention ou dans les première, deuxième, troisième, quatrième, et cinquième séquences selon l'invention, ou bien être ajoutées au sein de ses séquence, ainsi qu'à leur extrémité N-terminale et/ou C-terminale. Ainsi, de manière préférée, le polypeptide contre lequel sont spécifiquement dirigés l'anticorps et l'aptamère selon l'invention est constitué d'une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 14 et SEQ ID NO : 15, et est de préférence cyclisé par formation d'un pont disulfure entre les radicaux -SH de cystéines. Dans un mode de réalisation préféré, l'invention concerne également un anticorps ou un aptamère tel que défini ci-dessus pour son utilisation à titre de médicament. L'invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant, à titre de substance active, au moins un anticorps tel que défini ci-dessus, éventuellement en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Dans un autre mode de réalisation préféré, l'invention concerne également un anticorps tel que défini ci-dessus, ou une composition pharmaceutique comprenant un anticorps selon l'invention telle que définie ci-dessus, pour son utilisation dans la prévention ou le traitement des maladies liées à IL-6 ou des maladies inflammatoires chroniques. La présente invention concerne également une méthode de prévention ou de traitement des maladies liées à IL-6 ou des maladies inflammatoires chroniques chez un individu, dans laquelle on administre à l'individu une quantité prophylactiquement ou thérapeutiquement efficace d'un anticorps tel que défini ci-dessus ou d'une composition pharmaceutique comprenant un anticorps selon l'invention telle que définie ci-dessus. Les maladies liées à l'IL-6 ou les maladies inflammatoires chroniques selon l'invention sont de préférence sélectionnées dans le groupe constitué : des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, telles que la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique ou colite ulcéreuse, - d'une maladie arthritique, notamment la polyarthrite rhumatoïde, la polyarthrite rhumatoïde juvénile, l'arthrite psoriasique, l'arthrose, la polyarthrite rhumatoïde réfractaire, l'arthrite chronique non rhumatoïde, ou la spondylarthrite ankylosante, d'une maladie osseuse inflammatoire chronique ou liée à l'IL-6, notamment un trouble de la résorption osseuse ou l'ostéoporose, - d'une maladie inflammatoire chronique ou liée à l'IL-6 en liaison avec une infection, telle que le choc septique, le choc endotoxinique, la septicémie, l'hépatite à VHC, le paludisme, les méningites, le SIDA ou les infections à VIH, d'une maladie inflammatoire chronique ou liée à l'IL-6 du système cardiovasculaire, telle que l'athérosclérose, les lésions d'ischémie-reperfusion, les maladies coronariennes, et la vascularite, telle que la maladie de Behçet ou la granulomatose de Wegener, - des maladies auto-immunes, telles que le lupus érythémateux, notamment disséminé, la sclérose en plaques, ou le psoriasis, des maladies liées à une greffe, telle que les réactions du greffon contre l'hôte et les traumatismes et rejets de greffe, des allergies, notamment l'asthme allergique et les troubles de la peau dus à des réactions d'hypersensibilité retardée, - des déficits immunitaires, tels que le déficit immunitaire commun variable (DICV), - d'une maladie inflammatoire chronique ou liée à l'IL-6 du système respiratoire, notamment le syndrome de détresse respiratoire ou la fibrose pulmonaire, - des cancers ayant une composante inflammatoire chronique ou liés à l'IL-6, tels que le plasmocytome, le cancer colorectal, le cancer de l'ovaire récurrent, le syndrome lymphoprolifératif, le myélome multiple, notamment réfractaire, ou le syndrome myéloprolifératif, - du diabète, notamment le diabète juvénile, - d'une amyloïdose, notamment la maladie d'Alzheimer, - de l'uvéite, notamment sous sa forme récurrente chronique, - d'une cachexie, et - de l'endométriose.
En particulier, les maladies liées à l'IL-6 ou les maladies inflammatoires chroniques sont plus préférablement sélectionnées dans le groupe constitué de la polyarthrite rhumatoïde, des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, telles que la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique, du lupus érythémateux, du psoriasis, du myélome multiple, et du cancer colorectal.
Les individus destinés à être vaccinés ou traités selon l'invention sont des animaux ou des humains. Lorsqu'ils sont utilisés dans un cadre prophylactique ou thérapeutique le polypeptide et l'anticorps selon l'invention peuvent être associés à un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Comme on l'entend ici, un « véhicule pharmaceutiquement acceptable » regroupe l'ensemble des composés, notamment les excipients, pouvant être administrés à un individu en conjonction avec un principe actif pharmacologique. Par ailleurs, lorsqu'il est utilisé dans un cadre vaccinal ou prophylactique le polypeptide selon l'invention peut être associé à un adjuvant. L'adjuvant peut être de tout type adapté à augmenter la réponse immunitaire d'un individu, animal ou humain, à l'administration d'un polypeptide. Il peut ainsi s'agir d'adjuvant complet ou incomplet de Freund, d'ISA51, d'alun ou de phosphate de calcium par exemple, l'ISA51 et l'alun étant préférés. L'adjuvant peut être associé au polypeptide selon l'invention en réalisant un mélange 1/1 en volume d'une solution d'adjuvant et d'une solution comprenant le polypeptide. Dans le cadre de l'invention, le polypeptide selon l'invention peut être administré à des doses allant par exemple de ing à 1g, de préférence de 1µg à 1 mg. Le polypeptide sera de préférence administré par voie intraveineuse, intradermique, sous-cutanée, ou intramusculaire. Le régime de d'administration peut, par exemple, consister en 1 administration tous les 15 jours pendant 2 mois, puis 1 administration tous les 3 à 6 mois, aussi longtemps que l'on souhaite obtenir un effet prophylactique ou thérapeutique.
L'invention est davantage illustrée à l'aide des figures et des Exemples, non limitatifs, 20 qui suivent.
Description des figures
Figure 1 La figure 1 représente la quantité d'anticorps anti-mIL-6 présent dans le sérum dilué au 1/500ème de souris OF1 immunisées avec les peptides mPl, mP2, mP3, mP4, mP5 et mP6 mesurée par ELISA (axe des ordonnées, densité optique (OD) à 450nm). Le trait horizontal à 0,3 OD représente le seuil de significativité.
Figure 2 La figure 2 représente le score clinique ou index d'activité de la maladie (DAI, axe des ordonnées) de souris C57BL/6 non traitées (eau) ou traitées au Dextran Sulfate Sodium (DSS) et vaccinées avec les peptides mPl, mP2, mP3, mP4 et mP6, ou avec les vaccins témoins sans peptide et comprenant du tampon (PBS) ou la protéine porteuse KLH.
Figure 3 La figure 3 représente le score histologique de colite (axe des ordonnées) de souris C57BL/6 non traitées (témoins) ou traitées au DSS et vaccinées avec les peptides mPl, mP2, mP3, mP4 et mP6, ou avec les vaccins témoins sans peptide et comprenant du tampon (PBS) ou la protéine porteuse KLH.
Figure 4 La figure 4 représente la longueur du colon (axe des ordonnées, en cm) de souris C57BL/6 non traitées (témoins) ou traitées au DSS et vaccinées avec les peptides mPl, mP2, mP3, mP4 et mP6, ou avec les vaccins témoins sans peptide et comprenant du tampon (PBS) ou la protéine porteuse KLH.
Figure 5 La figure 5 représente la quantité d'anticorps anti-hIL-6 présent dans le sérum dilué au 1/500ème de souris OF1 immunisées avec les peptides hPl, hP2, hP3, hP4 et hP6 mesurée par ELISA (axe des ordonnées, densité optique (OD) à 450nm). Le trait horizontal à 0,3 OD représente le seuil de significativité. 16 Figure 6 La figure 6 représente la quantité d'anticorps anti-hIL-6 présent dans le sérum dilué au 1/500ème de souris OF1 immunisées avec les peptides hPl', hP2', hP3', hP4' et hP6' mesurée par ELISA (axe des ordonnées, densité optique (OD) à 450nm). Le trait horizontal à 0,3 OD représente le seuil de significativité.
EXEMPLES
Exemple 1 : Reconnaissance de la cytokine entière IL-6 murine (mIL-6) et réactivité croisée contre la cytokine IL-6 humaine (hW-6) par des sérums de souris immunisées avec des peptides dérivés de la mIL-6
Six peptides dérivés de l'IL-6 murine ont été synthétisés chimiquement et couplés à une protéine porteuse, la KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin), dont cinq à l'aide de l'agent couplant bisdiazonium-benzidine (BDB) et un avec la glutaraldéhyde. Ces peptides ont ensuite été cyclisés par formation de ponts disulfure entre cystéines (ajoutées ou déjà présentes). Pour chaque peptide, des souris Oncins France 1 (OF1, Charles River Laboratories, L'Arbresle, France) exemptes d'organismes pathogènes spécifiques ont été immunisées en intra-musculaire avec 100µg de peptides dérivés de l'IL-6 murine mPl, mP2, mP3, mP4, mP5, et mP6 (voir le Tableau 1) en adjuvant complet de Freund (CFA) au début de l'expérience (JO) (n=4 par peptide).
Tableau 1 : Peptides dérivés de mIL-6 (soulignés) utilisés pour l'immunisation Peptide Zone de l'IL6 Séquence SEQ ID NO mPl 61-75 BDB - Y - E61IVEMRKELCNGNSD75C+A,niae 29 mP2 76-92 Aeetyt+Ç76MNNDDALAENNLKLPE92C - Y - BDB 30 mP3 99-109 Gluta - C99YQTGYNQEIC109+Amide 26 mP4 125-140 BDB - Y - CE125FMKNNLKDNKKDKAR140C+Amide 32 mP5 154-168 Aeetyl+CN154QEVKDLHKIVLPTP168C- Y - BDB 34 mP6 176-188 Aeety1+D176KCESQKEWLRTKI88C - Y - BDB 33 Les acides aminés sont annotés à partir de la séquence Swissprot P08505 (mIL-6) Des rappels en adjuvant incomplet de Freund (IFA) sont ensuite effectués tous les 15 jours, à J15, J30 et J45. Les sérums de souris à J54 sont testés par ELISA avec une dilution au 1/500ème des sérums sur des plaques recouverte par de l'IL-6 murine, ou de l'IL-6 humaine pour évaluer leur réactivité croisée. 25 On observe que l'ensemble des peptides testés à l'exception du peptide mP5 engendrent des anticorps reconnaissant la cytokine murine (Figure 1). Par ailleurs, hormis les 1820 anticorps dirigés contre le peptide mP2, les anticorps produits à l'aide des peptides murins ne montrent qu'une faible réaction croisée avec la cytokine humaine.
Exemple 2 : Neutralisation de l'activité biologique de l'IL-6 murine par des anticorps purifiés 5 à partir du sérum de lapins immunisés par les peptides dérivés de l'IL-6 murine La capacité neutralisante des IgG purifiées à partir du sérum des lapins respectivement immunisés par les peptides mPl, mP2, mP3, mP4, mP5 et mP6, a été testée dans un test de neutralisation de l'IL-6 murine. Ce test est basé sur le fait que des hybridomes murins B9 10 prolifèrent d'une manière dose-dépendante en réponse à l'IL-6 murine (Brakenhoff et al. (1987) J. Immunol. 139:4116-21). Descriptif de l'expérience réalisée : Mise en plaque (JO) : ensemencer une plaque 96 puits à fond plat, traitée pour la 15 culture cellulaire avec 5000 cellules par puits dans 50µL de milieu de neutralisation. (RPMI 1640 sans rouge de phénol, 5% v/v Serum de Veau Foetal (SVF), 2mM L-Glutamine, 100U/mL Penicilline/Streptomycine, 50µm de Ç3-Mercaptoéthanol) En parallèle une plaque dite de pré-incubation est réalisée avec la concentration voulue d'IL-6 murine, d'échantillons et d'anticorps commercial anti-mIL-6 utilisé comme 20 contrôle positif, le tout dans un volume final de 100µL de milieu de neutralisation. La plaque de pré-incubation est laissée 2h à 37°C. 50µL par puits sont ensuite transférés dans les puits correspondants de la plaque contenant les cellules, puis cette dernière est mise à incuber 96h à 37°C avec 5% CO2. Révélation (J4) : Ajouter dans chaque puits 50µL d'une solution de XTT (pour 2,3- 25 bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide) -0,5% electron coupling reagent. Laisser incuber 7h à 37°C. Lecture de la densité optique sur un spectrophotomètre réglé à 450nm.
On observe que les IgG des lapins immunisés avec les peptides mPl, mP2, mP3, mP4 30 et mP6 neutralisent l'activité biologique de l'IL-6 murine d'une manière dose dépendante. En revanche les IgG du lapin immunisé avec le peptide mP5 ne neutralisent pas l'activité de l'IL- 6 murine.
Exemple 3 : Protection clinique et histologique après vaccination contre un peptide dérivé de l'IL-6 murine dans un modèle murin de colite chronique au DSS
La colite chronique au Dextran Sulfate Sodium (DSS) est un modèle bien connu de 5 maladie chronique inflammatoire reproduisant les principales caractéristiques des maladies humaines (Alex et al. (2009) Inflamm. Bowel Dis. 15:341-352). Brièvement, des groupes de 6 souris C57BL/6 (Charles River Laboratories, L'Arbresle, France) ont été constitués. Les souris ont été immunisées 4 fois (une fois en CFA et trois fois en IFA) tous les 15 jours avec différentes préparations vaccinales. Les souris ont 10 été respectivement immunisées avec du PBS (groupe DSS/PBS), 50µg par souris de KLH (groupe DSS/KLH), et 100µg par souris de peptide mPl, mP2, mP3, mP4, mP5 et mP6 couplés avec la KLH (groupe DSS/peptide mIL-6). Un groupe témoins H2O a également été inclus. Quatre jours après le premier rappel, la colite a été induite par absorption de Dextran Sulfate Sodium (DSS) dans de l'eau (2%) pendant 7 jours suivie de 7 jours d'eau. Trois 15 cycles DSS/eau ont été ainsi réalisés et après cela, les souris ont reçu de l'eau jusqu'à la fin du protocole, Les signes cliniques de la maladie apparaissent environ au cinquième jour après le début de traitement au DSS (J26 du protocole). L'évolution de la maladie est mesurée dès le commencement du premier cycle de DSS jusqu'à la fin du protocole par un index d'activité de la maladie (DAI) incluant la perte de poids, la présence de sang dans les selles et la texture 20 des selles. Les scores cliniques sont déterminés de la façon suivante : pour la texture des selles un score de 0 (selles dures) à 4 (diarrhée), pour la présence de sang dans les selles un score de 0 (absence) à 4 (sang macroscopique), et perte de poids un score de 0 «1%) à 4 (>20%). Chaque souris se voit ainsi attribuer un score clinique avec un score maximal de 12. On observe que les souris immunisées avec les peptides mPl, mP2, mP3, mP4 et mP6 25 présentent un index d'activité de la maladie significativement réduit par rapport aux groupes témoins (Figure 2) Ensuite, à J67, les souris sont tuées par dislocation cervicale. Les coupes histologiques de biopsies de colon distal sont notées, en aveugle, selon la sévérité de l'inflammation (0 : absence, 1 : légère, 2 : modérée, 3 : sévère), l'étendue de l'inflammation (0 : absence, 1 : 30 muqueuse, 2 : muqueuse et sous-muqueuse, 3 : transmurale), l'endommagement des cryptes (0 : absence, 1 : endommagées au tiers, 2 : endommagées au 2/3, 3 : seulement la surface de l'épithélium intacte, 4 : destruction totale des cryptes et de l'épithélium). Chaque souris se voit ainsi attribuer un score histologique avec un score maximal de 10.
On observe que les souris immunisées avec les peptides mPl, mP2, mP3, mP4 et mP6 présentent un score histologique significativement réduit par rapport aux souris témoins traitées par du PBS ou de la KLH seule (Figure 3). L'absorption de DSS réduit de façon significative la longueur du colon. De manière 5 intéressante, les souris immunisées avec les peptides mPl, mP2, mP3, mP4 et mP6 présentent une réduction du colon significativement moins sévère que les souris témoins (Figure 4). En revanche, les immunisations avec la KLH n'ont pas d'effet sur la réduction de la longueur du colon induite par le DSS.
10 Exemple 4: Reconnaissance de la cytokine entière hIL-6 par les anticorps de souris immunisées avec des peptides de l'IL-6 humaine
De manière similaire à ce qui a été fait dans l'Exemple 1, cinq peptides dérivés de l'IL-6 humaine, hPl, hP2, hP3, hP4 et hP6 ont été couplés à la KLH, dont quatre à l'aide de 15 l'agent couplant BDB et un avec le glutaraldéhyde (voir le Tableau 2). Ces peptides ont été cyclisés à l'aide de deux cystéines (ajoutées ou déjà présentes). Pour chaque peptide, des souris OF1 exemptes d'organismes pathogènes spécifiques (n=4 par peptide) ont été immunisées en intra-musculaire avec 100µg de peptides dérivés de l'IL-6 humaine en CFA à J0. Des rappels en IFA sont ensuite effectués tous les 15 jours, à 20 J15, J30 et J45. Le sérum est récupéré après les rappels à J35 et J54 et est testé par ELISA avec une dilution au 1/500ème des sérums sur des plaques recouvertes avec de l'IL-6 humaine (Figure 5).
Tableau 2 : Peptides dérivés de hIL-6 (soulignés) utilisés pour l'immunisation Peptide Zone de Séquence SEQ ID NO l'IL6 hPl 63-78 BDB - Y - G63ISALRKETCNKSNMC78+Amide 16 hP2 78-94 Aeétyi+Ç78ESSKEALAENNLNLPK94C - Y - BDB 17 hP3 101-111 Gluta - C101FQSGFNEETC111 +Amide 3 hP4 127-141 BDB- Y - CE127FLQNRFESSEEQAR141C+ Amide 18 hP6 177-189 Aeetyi+T177KCQAQNQWLODM189C - Y - BDB 19 25 Les acides aminés sont annotés à partir de la séquence Swissprot P05231 (hIL-6) Exemple 5 : Neutralisation de l'activité biologique de l'IL-6 humaine par des anticorps purifiés à partir de sérum de lapins immunisés avec des peptides dérivés de l'IL-6 humaine
Des lapins New Zealand exempts d'organismes pathogènes spécifiques (n=1 par peptide) ont été immunisés avec 100µg de peptides hPl, hP2, hP3, hP4 et hP6 dérivés de l'IL-6 humaine par cinq immunisations en CFA/IFA à JO, J14, J28, J56 et J70. La capacité neutralisante des IgG purifiées, dérivées du sérum de chaque lapin, a été testée dans un test de neutralisation de l'IL-6 humaine. Ce test est réalisé sur des cellules HEK293 (Human Embryonic Kidney tells) transfectées avec le gène codant pour le récepteur à l'IL-6 humaine et le gène rapporteur de la phosphatase alcaline embryonnaire sécrétée (SEAP) (Fournisseur : Invivogen). Cette dernière est alors secrétée de manière dose dépendante en réponse à l'IL-6 humaine. Brièvement, les inventeurs ont procédé de la manière suivante : Mise en plaque (JO) : ensemencer une plaque 96 puits à fond plat, traitée pour la culture cellulaire avec 50000 cellules par puits dans 1001.tL de milieu de neutralisation. (DMEM 4,5g/L glucose, 10% v/v SVF, 2mM L-Glutamine, 100U/mL Penicilline/Streptomycine, 100µg/mL de Normocin). En parallèle une plaque dite de pré-incubation est réalisée avec la concentration voulue d'IL-6 humaine, d'anticorps de lapin et d'anticorps commercial anti-hIL-6 utilisé comme témoin positif, le tout dans un volume final de 200µL de milieu de neutralisation. La plaque de pré-incubation est laissée 2h à 37°C. 10011L par puits sont ensuite transférés dans les puits correspondants de la plaque contenant les cellules, puis cette dernière est mise à incuber 24h à 37°C avec 5% CO2. Révélation (JI) : Remplir une plaque 96 puits à fond plat avec 1801.iL par puits de QUANTI-Blue (InVivoGen, CA, Etats-Unis). Ajouter 201A de surnageant de la plaque traitée à l'IL-6. Incuber 3h à 37°C, 5% CO2. Déterminer la quantité de phosphatase alcaline sécrétée à l'aide d'un spectrophotomètre réglé à 620nm.
On observe que les IgG des lapins immunisés avec les peptides hPl, hP2, hP3, hP4 et hP6 dérivés de l'IL-6 humaine neutralisent l'activité biologique de l'IL-6 humaine d'une manière dose dépendante.
Exemple 6 : Production d'anticorps monoclonaux ciblant les peptides hP2 et hP6, reconnaissant la cytokine humaine hIL-6 et neutralisant son activité biologique
1) Production 2 groupes de trois souris SWISS sont immunisés contre les 2 peptides hP2 et hP6 de l'IL-6 humaine (6 souris en tout) avec le protocole suivant : une primo-immunisation à 100µg de peptide suivie de 3 rappels à J20, J40, J60. Le titre de la réponse est mesuré pour chaque souris, et pour chaque peptide, la souris présentant le meilleur titre est utilisée pour la production d'anticorps monoclonaux.
Pour cela, la technique des hybridomes est utilisée. Les lymphocytes B de rate sont purifiés, puis fusionnés avec des cellules transformées de myélome afin d'obtenir des lignées immortelles. Ces cellules fusionnées appelées hybridomes sont maintenues en milieu sélectif, en présence d'aminoptérine et d'hypoxanthine, de sorte que les cellules non fusionnées meurent : les cellules de myélome car elles n'ont pas la thymidine kinase, et les lymphocytes B car ils ne sont pas transformés. Seules les cellules fusionnées peuvent survivre et on utilise alors la technique des dilutions limites pour isoler des clones ne produisant qu'une seule espèce d'anticorps. A ce stade, il est possible de tester les anticorps produits dans le surnageant par ces clones grâce à des tests in vitro : ELISA contre la cytokine recombinante et tests de neutralisation de l'activité biologique de la cytokine. 2) Criblage Dans une première étape, pour chaque peptide, 6 plaques de dilution limite sont réalisées. Les dilutions sont vérifiées dans chaque puits par analyse au microscope inversé. Un premier criblage est fait en regroupant les surnageants 12 puits par 12 puits et en testant ces regroupements par ELISA contre la cytokine recombinante. Les puits dont le contenu présente un signal positif sont testés individuellement : pour les puits positifs, une deuxième dilution limite est réalisée sur une plaque. Pour le deuxième criblage, les puits sont aussi suivis par microscopie inversée. On regroupe les surnageants des puits 8 par 8, on teste par ELISA, et pour les pools positifs, on 30 analyse à nouveau les réponses des puits individuels par ELISA. Après la deuxième étape de criblage, on peut raisonnablement considérer que les hybridomes présents dans le puits sont bien issus d'un même clone. Ces hybridomes sont alors cultivés massivement pour produire des quantités plus importantes d'anticorps.
Trois hybridomes sont sélectionnés pour chaque peptide. Pour cela, on injecte ces cellules dans l'abdomen de souris où elles prolifèrent sous forme d'ascites. Les anticorps sont ensuite récupérés en prélevant le liquide ascitique dans la cavité péritonéale et ils sont purifiés par chromatographie d'affinité à l'aide de la protéine G. 3) Neutralisation de l'activité biologique de l'IL-6 humaine par les anticorps monoclonaux purifiés anti-hIL-6 A partir du test de neutralisation de l'activité biologique de l'IL-6 humaine décrit dans l'Exemple 5, la capacité neutralisante des anticorps monoclonaux est évaluée à des dilutions variables afin d'étudier la dose-dépendance des propriétés neutralisantes de l'activité biologique de l'IL-6 humaine.
Exemple 7 : Reconnaissance de la cytokine entière hIL-6 par des anticorps dérivés du sérum de souris immunisées avec des variants des peptides hPl, hP2, hP3, hP4 et hP6 Cinq variants hPl', hP2', hP3', hP4' et hP6', respectivement dérivés de hPl, hP2, hP3, hP4, et hP6 (voir le Tableau 3) ont été couplés à la KLH, dont quatre à l'aide de l'agent couplant BDB et un avec la glutaraldéhyde. Ces peptides ont été cyclisés à l'aide de deux cystéines situées aux extrémités (ajoutées ou déjà présentes dans la séquence native).
Tableau 3 : Peptides dérivés de hIL-6 utilisés pour l'immunisation Peptide Séquence SEQ ID NO % identité hPl BDB - Y - GISALRKETCNKSNM C+Amide 16 81.25% hPl' BDB - Y - GISAVRKDTCNKSQM - C+Amide 20 hP2 CESSKEALAENNLNLPK C - Y - BDB 17 84,21% hP2' CESSKDAIAENQLNLPK C - Y - BDB 21 hP3 Gluta - CFQSGFNEETC +Amide 3 81,81% hP3' Gluta - CFNSGFNEDTC +Amide 10 hP4 BDB - Y - C EFLQNRFESSEEQAR - C +Amide 18 82,35% hP4' BDB - Y - C - EFLQNRFDSSDENAR - C+Amide 22 hP4 BDB - Y - C - EFLQNRFESSEEQAR - C +Amide 18 76,47% hP4" BDB - Y - C - DFLQNRFDSSDENAR - C +Amide 57 hP6 Acétyl + TKCQAQNQWLQDM - C - Y - BDB 19 80,00% hP6' Acétyl + TKCQANQQWLQEM - C - Y - BDB 23 Les parties variantes sont soulignées Pour chaque peptide, des souris OF1 exemptes d'organismes pathogènes spécifiques (n=4 par peptide) sont immunisées en intra-musculaire avec 100µg de variants hP1', hP2', hP3', hP4' et hP6' en CFA à J0. Des rappels en IFA sont ensuite effectués tous les 15j, à J15, J30 et J45. Les sérums de souris à J54 sont testés par ELISA avec une dilution au 1/500ème sur des plaques recouvertes par de l'IL-6 humaine. On observe que les variants peptidiques génèrent des anticorps reconnaissant la cytokine humaine par ELISA (Figure 6). Enfin, des segments plus larges de taille 30 acides aminés, contenant hPl, hP2, hP3, hP4 et hP6 sont également testés. Ces segments sont aussi capables de générer des anticorps neutralisant la cytokine humaine.

Claims (20)

  1. REVENDICATIONS1. Composition pharmaceutique comprenant, à titre de substance active : - au moins un polypeptide comprenant, ou constitué d'une séquence constituée (i) d'une portion d'au moins 8 acides aminés contigus choisis au sein de la séquence s'étendant des acides aminés 73 à 94 de l'IL-6 et d'au plus 30 acides aminés contigus choisis au sein de la séquence complète de l'IL-6, ou (ii) d'une séquence variante présentant au moins 75% d'identité avec la portion ; ou - au moins un polynucléotide codant pour le polypeptide ci-dessus, éventuellement en association avec au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable, sous réserve qu'un polypeptide constitué des séquences variantes permette d'éliciter une réponse immunitaire dirigée contre l'IL-6 et sous réserve que le polypeptide soit différent de l'IL-6 et qu'il ne soit pas constitué d'une portion de plus de 30 acides aminés contigus de l'IL-6.
  2. 2. Composition pharmaceutique selon la revendication 1, dans laquelle la séquence, est constituée d'une portion d'au moins 12 acides aminés contigus choisis au sein de la séquence s'étendant des acides aminés 73 à 94 de l'IL-6.
  3. 3. Composition pharmaceutique selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle la portion est constituée au plus des acides aminés 73 à 94 de l'IL-6.
  4. 4. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 1 à 3, dans laquelle l'IL-6 est sélectionnée dans le groupe constitué de l'IL-6 humaine, l'IL-6 de souris, l'IL-6 de singe, l'IL-6 cheval, l'IL-6 de chien et l'IL-6 de chat.
  5. 5. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 1 à 4, dans laquelle les au moins 8 ou au moins 12 acides aminés contigus de la portion choisis au sein de la séquence s'étendant des acides aminés 73 à 94 de l'IL-6, sont choisis au sein de la séquence s'étendant des acides aminés 78 à 94 de l'IL-6 humaine.
  6. 6. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 1 à 5, dans laquelle la séquence est constituée de SEQ ID NO : 2.
  7. 7. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 1 à 6, dans laquelle le polypeptide est constitué d'une séquence SEQ ID NO : 13 et est cyclisé par formation d'un pont disulfure entre les radicaux -SH de cystéines.
  8. 8. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 1 à 7, dans laquelle le polypeptide est fixé sur une macromolécule porteuse.
  9. 9. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 1 à 8, pour son utilisation dans la prévention ou le traitement de maladies liées à l'IL-6 ou de maladies inflammatoires chroniques.
  10. 10. Composition pharmaceutique pour son utilisation selon la revendication 9, dans laquelle les maladies liées à l'IL-6 ou les maladies inflammatoires chroniques sont sélectionnées dans le groupe constitué : des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, telles que la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique ou colite ulcéreuse, d'une maladie arthritique, notamment la polyarthrite rhumatoïde, la polyarthrite rhumatoïde juvénile, l'arthrite psoriasique, l'arthrose, la polyarthrite rhumatoïde réfractaire, l'arthrite chronique non rhumatoïde, ou la spondylarthrite ankylosante, d'une maladie osseuse inflammatoire chronique ou liée à l'IL-6, notamment un trouble de la résorption osseuse ou l'ostéoporose, d'une maladie inflammatoire chronique ou liée à l'IL-6 en liaison avec une infection, telle que le choc septique, le choc endotoxinique, la septicémie, l'hépatite à VHC, le paludisme, les méningites, le SIDA ou les infections à VIH, d'une maladie inflammatoire chronique ou liée à l'IL-6 du système cardiovasculaire, telle que l'athérosclérose, les lésions d'ischémie-reperfusion, les maladies coronariennes, et la vascularite, telle que la maladie de Behçet ou la granulomatose de Wegener, des maladies auto-immunes, telles que le lupus érythémateux, notamment disséminé, la sclérose en plaques, ou le psoriasis, des maladies liées à une greffe, telle que les réactions du greffon contre l'hôte et les traumatismes et rejets de greffe, des allergies, notamment l'asthme allergique et les troubles de la peau dus à des réactions d'hypersensibilité retardée, des déficits immunitaires, tels que le déficit immunitaire commun variable (DICV),d'une maladie inflammatoire chronique ou liée à l'IL-6 du système respiratoire, notamment le syndrome de détresse respiratoire ou la fibrose pulmonaire, des cancers ayant une composante inflammatoire chronique ou liés à l'IL-6, tels que le plasmocytome, le cancer colorectal, le cancer de l'ovaire récurrent, le syndrome lymphoprolifératif, le myélome multiple, notamment réfractaire, ou le syndrome myéloprolifératif, du diabète, notamment le diabète juvénile, d'une amyloïdose, notamment la maladie d'Alzheimer, de l'uvéite, notamment sous sa forme récurrente chronique, d'une cachexie, et de l'endométriose.
  11. 11. Anticorps anti-IL-6 spécifiquement dirigé contre polypeptide comprenant, ou constitué d'une séquence constituée (i) d'une portion d'au moins 8 acides aminés contigus choisis au sein de la séquence s'étendant des acides aminés 73 à 94 de l'IL-6 et d'au plus 30 acides aminés contigus choisis au sein de la séquence complète de l'IL-6, ou (ii) d'une séquence variante présentant au moins 75% d'identité avec la portion, sous réserve qu'un polypeptide constitué de la séquence variante permette d'éliciter une réponse immunitaire dirigée contre l'IL-6 et sous réserve que le polypeptide ne comprenne 20 pas plus de 2 acides aminés en plus de la séquence.
  12. 12. Anticorps selon la revendication 11, pour son utilisation à titre de médicament.
  13. 13. Anticorps selon la revendication 11, pour son utilisation à titre de médicament dans la 25 prévention ou le traitement des maladies liées à IL-6 ou des maladies inflammatoires chroniques.
  14. 14. Anticorps pour son utilisation selon la revendication 13, dans laquelle les maladies liées à l'IL-6 ou les maladies inflammatoires chroniques sont choisies dans le groupe constitué : 30 des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, telles que la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique ou colite ulcéreuse, d'une maladie arthritique, notamment la polyarthrite rhumatoïde, la polyarthrite rhumatoïde juvénile, l'arthrite psoriasique, l'arthrose, la polyarthrite rhumatoïde réfractaire, l'arthrite chronique non rhumatoïde, ou la spondylarthrite ankylosante,d'une maladie osseuse inflammatoire chronique ou liée à l'IL-6, notamment un trouble de la résorption osseuse ou l'ostéoporose, d'une maladie inflammatoire chronique ou liée à l'IL-6 en liaison avec une infection, telle que le choc septique, le choc endotoxinique, la septicémie, l'hépatite à VHC, le paludisme, 5 les méningites, le SIDA ou les infections à VIH, d'une maladie inflammatoire chronique ou liée à l'IL-6 du système cardiovasculaire, telle que l'athérosclérose, les lésions d'ischémie-reperfusion, les maladies coronariennes, et la vascularite, telle que la maladie de Behçet ou la granulomatose de Wegener, des maladies auto-immunes, telles que le lupus érythémateux, notamment disséminé, la 10 sclérose en plaques, ou le psoriasis, des maladies liées à une greffe, telle que les réactions du greffon contre l'hôte et les traumatismes et rejets de greffe, des allergies, notamment l'asthme allergique et les troubles de la peau dus à des réactions d'hypersensibilité retardée, 15 des déficits immunitaires, tels que le déficit immunitaire commun variable (DICV), d'une maladie inflammatoire chronique ou liée à l'IL-6 du système respiratoire, notamment le syndrome de détresse respiratoire ou la fibrose pulmonaire, des cancers ayant une composante inflammatoire chronique ou liés à l'IL-6, tels que le plasmocytome, le cancer colorectal, le cancer de l'ovaire récurrent, le syndrome 20 lymphoprolifératif, le myélome multiple, notamment réfractaire, ou le syndrome myéloprolifératif, du diabète, notamment le diabète juvénile, d'une amyloïdose, notamment la maladie d'Alzheimer, de l'uvéite, notamment sous sa forme récurrente chronique, 25 d'une cachexie, et de l'endométriose.
  15. 15. Polypeptide comprenant, ou constitué d'une séquence constituée (i) d'une portion d'au moins 8 acides aminés contigus choisis au sein de la séquence s'étendant des acides aminés 30 73 à 94 de l'IL-6 et d'au plus 30 acides aminés contigus choisis au sein de la séquence complète de l'IL-6, ou (ii) d'une séquence variante présentant au moins 75% d'identité avec la portion, sous réserve qu'un polypeptide constitué des séquences variantes permette d'éliciter une réponse immunitaire dirigée contre l'IL-6 et sous réserve que le polypeptide soit différent del'IL-6 et qu'il ne soit pas constitué d'une portion de plus de 30 acides aminés contigus de l'IL-6.
  16. 16. Polynucléotide codant pour un polypeptide tel que défini dans la revendication 15. 5
  17. 17. Aptamère anti-IL-6 spécifiquement dirigé contre polypeptide comprenant, ou constitué d'une séquence constituée (i) d'une portion d'au moins 8 acides aminés contigus choisis au sein de la séquence s'étendant des acides aminés 73 à 94 de l'IL-6 et d'au plus 30 acides aminés contigus choisis au sein de la séquence complète de l'IL-6, ou (ii) d'une séquence 10 variante présentant au moins 75% d'identité avec la portion, sous réserve qu'un polypeptide constitué de la séquence variante permette d'éliciter une réponse immunitaire dirigée contre l'IL-6 et sous réserve que le polypeptide ne comprenne pas plus de 2 acides aminés en plus de la séquence. 15
  18. 18. Aptamère selon la revendication 17, pour son utilisation à titre de médicament.
  19. 19. Anticorps selon la revendication 17, pour son utilisation à titre de médicament dans la prévention ou le traitement des maladies liées à IL-6 ou des maladies inflammatoires chroniques. 20
  20. 20. Anticorps pour son utilisation selon la revendication 19, dans laquelle les maladies liées à l'IL-6 ou les maladies inflammatoires chroniques sont choisies dans le groupe constitué : des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, telles que la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique ou colite ulcéreuse, 25 d'une maladie arthritique, notamment la polyarthrite rhumatoïde, la polyarthrite rhumatoïde juvénile, l'arthrite psoriasique, l'arthrose, la polyarthrite rhumatoïde réfractaire, l'arthrite chronique non rhumatoïde, ou la spondylarthrite ankylosante, d'une maladie osseuse inflammatoire chronique ou liée à l'IL-6, notamment un trouble de la résorption osseuse ou l'ostéoporose, 30 d'une maladie inflammatoire chronique ou liée à l'IL-6 en liaison avec une infection, telle que le choc septique, le choc endotoxinique, la septicémie, l'hépatite à VHC, le paludisme, les méningites, le SIDA ou les infections à VIH,d'une maladie inflammatoire chronique ou liée à l'IL-6 du système cardiovasculaire, telle que l'athérosclérose, les lésions d'ischémie-reperfusion, les maladies coronariennes, et la vascularite, telle que la maladie de Behçet ou la granulomatose de Wegener, des maladies auto-immunes, telles que le lupus érythémateux, notamment disséminé, la sclérose en plaques, ou le psoriasis, des maladies liées à une greffe, telle que les réactions du greffon contre l'hôte et les traumatismes et rejets de greffe, des allergies, notamment l'asthme allergique et les troubles de la peau dus à des réactions d'hypersensibilité retardée, des déficits immunitaires, tels que le déficit immunitaire commun variable (DICV), d'une maladie inflammatoire chronique ou liée à l'IL-6 du système respiratoire, notamment le syndrome de détresse respiratoire ou la fibrose pulmonaire, des cancers ayant une composante inflammatoire chronique ou liés à l'IL-6, tels que le plasmocytome, le cancer colorectal, le cancer de l'ovaire récurrent, le syndrome lymphoprolifératif, le myélome multiple, notamment réfractaire, ou le syndrome myéloprolifératif, du diabète, notamment le diabète juvénile, d'une amyloïdose, notamment la maladie d'Alzheimer, de l'uvéite, notamment sous sa forme récurrente chronique, d'une cachexie, et de l'endométriose.
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