FR2969173A1

FR2969173A1 - Procede d'elimination d'un biofilm de microorganismes

Info

Publication number: FR2969173A1
Application number: FR1060945A
Authority: FR
Inventors: Romain Briandet; Alexandra Gruss; Stephane Aymerich; Michel Gohar; Julien Deschamps; Ali Houry
Original assignee: Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Current assignee: Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Priority date: 2010-12-21
Filing date: 2010-12-21
Publication date: 2012-06-22
Anticipated expiration: 2030-12-21
Also published as: EP2655670A1; WO2012084746A1; US20140065122A1; FR2969173B1

Abstract

L'invention porte sur un procédé d'élimination d'un biofilm de microorganismes préexistant sur une surface inerte, caractérisé en ce qu' on soumet ledit biofilm à un cocktail de microorganismes comportant au moins des souches dites « nageuses », aptes à traverser ledit biofilm dans le plan et dans l'épaisseur, et on soumet ledit biofilm à au moins un produit antimicrobien dirigé contre au moins un microorganisme du biofilm à éliminer.

Description

PROCÉDÉ D'ÉLIMINATION D'UN BIOFILM DE MICROORGANISMES

DOMAINE DE L'INVENTION L'invention concerne un procédé d'élimination d'un biofilm de microorganismes préexistant par utilisation de microorganismes spécifiques, dits nageurs, permettant du fait de leurs déplacements dans le biofilm, de créer des canaux et des trous à travers et dans les différentes couches du biofilm. Plus particulièrement, le procédé selon l'invention permet une destruction tant mécanique que biologique du biofilm, les microorganismes nageurs pouvant être associés pour cela à un agent antimicrobien. L'invention trouve des applications dans tous les domaines où la présence de microorganismes doit être supprimée, que ce soit dans le domaine agro-alimentaire, le domaine médical, le domaine industriel etc.

ETAT DE LA TECHNIQUE Les microorganismes, tels que les bactéries, les levures, les champignons, les microalgues etc. s'organisent le plus souvent en biofilms lorsqu'ils colonisent une surface, notamment inerte (acier inoxydable, verre etc.). Dans un biofilm, les microorganismes sont organisés en couches successives formant un édifice tridimensionnel. Les microorganismes y sont liés entre eux et à la surface colonisée. Les microorganismes baignent dans une matrice extracellulaire, synthétisée au moins en partie par ces mêmes microorganismes. Les microorganismes d'un biofilm présentent des résistances accrues aux traitements antimicrobiens. Cela s'explique notamment par l'organisation même du biofilm en couches superposées, rendant les couches les plus profondes difficilement accessibles aux agents antimicrobiens. De même, la matrice extracellulaire tend à bloquer la pénétration des agents antimicrobiens dans l'épaisseur du biofilm. Par ailleurs, on a découvert que des gradients de pH, d'oxygène, nutritionnel etc. se créent dans l'épaisseur du biofilm. Aussi, on observe que dans certaines couches du biofilm, les microorganismes sont dans un état de sénescence, augmentant ainsi le phénomène de résistance aux antimicrobiens.

Les biofilms étant susceptibles de coloniser toutes les surfaces, ils peuvent être à l'origine de nombreuses intoxications alimentaires, maladies nosocomiales etc. C'est pourquoi on cherche à empêcher leur formation ou à les éradiquer, que se soit par des méthodes physiques, chimiques ou biologiques. Ainsi, par exemple, on sait déstabiliser et éliminer au moins partiellement des biofilms par des traitements chimiques (détergents et/ou désinfectants). Bien entendu, l'utilisation de ces composés chimiques peut être incompatible avec certaines applications, notamment du fait de la nature des milieux colonisés. De plus, ces agents ne permettent pas toujours de supprimer les biofilms dans toute leur épaisseur et de nombreux biofilms présentent une forte résistance à leur action. Dans certains cas, des procédés physiques tels que la température, les ultrasons, les plasmas gazeux, la lumière pulsée ou la thérapie photodynamique etc. peuvent être utilisés mais leur mise en oeuvre industrielle n'est pas toujours possible. Pour certaines applications, il est connu d'utiliser des bactériophages à même d'éradiquer certains microorganismes du biofilm. Cependant, leur spectre étroit de spécificité, la présence de la matrice extracellulaire, l'organisation en couches successives et le phénomène de sénescence observé dans certaines couches favorisent la persistance au moins partielle des biofilms. Il existe donc un réel besoin de trouver de nouveaux moyens d'éradiquer les biofilms de microorganismes, de manière fiable.

EXPOSE DE L'INVENTION L'observation et l'analyse de différents biofilms de microorganismes ont permis aux inventeurs de découvrir au sein d'un biofilm déjà établi de Bad/lus thuringiensis sur une surface inerte, l'existence d'une sous-population de microorganismes appelés par la suite « microorganismes nageurs », en ce sens que ces microorganismes sont capables de se déplacer dans le plan du biofilm et dans son épaisseur, alors même que le biofilm est déjà créé. En se déplaçant, ces microorganismes nageurs créent localement et temporairement des trous et des canaux à travers les différentes couches du biofilm. Il semblerait que ces trous et canaux permettent le transfert de microorganismes d'une couche à une autre au sein du biofilm, l'irrigation et l'oxygénation du biofilm etc. Ainsi, certaines souches de microorganismes ont une capacité de nage quand ils sont en solution, qu'elles conservent partiellement lorsqu'elles sont organisées en biofilm. Par ailleurs, ces souches présentent le plus souvent, lorsqu'elles sont en solution, une capacité de nage bien supérieure à la capacité de nage habituellement observée chez les microorganismes. Les inventeurs ont ainsi eu l'idée avantageuse de tirer profit de ce phénomène de nage pour éliminer des biofilms préexistants de microorganismes, quels qu'ils soient. L'invention a donc pour objet un procédé d'élimination d'un biofilm de microorganismes déjà créé sur une surface inerte, caractérisé en ce que : - on soumet ledit biofilm à un cocktail de microorganismes comportant au moins une population de microorganismes dits « nageurs », aptes à traverser ledit biofilm dans le plan et dans l'épaisseur, et - on soumet ledit biofilm à au moins un produit antimicrobien dirigé contre au moins un microorganisme du biofilm à éliminer. L'étape de traitement du biofilm par le produit antimicrobien peut être simultanée ou ultérieure à l'étape de traitement dudit biofilm par le cocktail de microorganismes contenant les microorganismes nageurs. Par biofilm de microorganismes déjà créé, ou préexistant, on entend un ensemble de microorganismes, hétérogènes ou homogènes, organisés en plusieurs couches successives, liés entre eux et/ou à la surface colonisée, et entourés d'une matrice extracellulaire. Le biofilm à éliminer peut aussi bien être un biofilm composé uniquement de bactéries, ou de champignons, ou de levures, ou de protozoaires etc., ces microorganismes pouvant par ailleurs être d'une même espèce ou de différentes espèces, qu'un biofilm composé d'au moins deux microorganismes de natures différentes. Par surface inerte, on entend notamment les surfaces en acier inoxydable, verre, polymères, bois, carrelage etc., et plus généralement toute surface autre qu'une surface biologique, du corps humain, animal ou végétal. Ainsi, le procédé selon l'invention peut être utilisé tout le long de la chaîne de fabrication d'aliments (élevage et transformation), notamment pour le traitement des surfaces avec lesquelles lesdits aliments sont susceptibles d'être en contact, afin d'éliminer tout risque d'intoxication alimentaire. De même, le procédé selon l'invention permet d'éliminer des biofilms présents sur des dispositifs médicaux afin de limiter les risques d'infection nosocomiale suite à leur utilisation. L'étape de soumission du biofilm au cocktail de microorganismes consiste par exemple à mettre en contact ledit biofilm avec ledit cocktail. Par exemple, on dépose la quantité souhaitée de cocktail de microorganismes sur la surface inerte à traiter. Le cocktail de microorganismes est de préférence un cocktail de bactéries. Par microorganismes nageurs, on entend des microorganismes mobiles, maintenus en solution dans le cocktail, dont l'énergie cinétique est telle qu'ils sont capables de se déplacer tant dans le plan d'un biofilm que dans toute son épaisseur, c'est-à-dire de traverser toutes les couches successives dudit biofilm, et ce malgré la forte cohésion des microorganismes entre eux et la présence de la matrice extracellulaire, dont la viscosité tend à immobiliser les microorganismes. Préférentiellement, on choisit comme microorganismes nageurs pour le cocktail de microorganismes utilisé, des microorganismes présentant un disque de mobilité après 24h d'incubation à 37°C de diamètre supérieur à 30 mm dans le test de mobilité en agar à 0.25 % tel que décrit par la suite. De tels microorganismes présentent en générale une vitesse de déplacement en milieu de culture au moins égale à 10 pm/s. Préférentiellement, les microorganismes nageurs sont des bactéries nageuses. L'utilisation de microorganismes nageurs, capables non seulement de se déplacer au sein d'une même couche, mais également de traverser de part en part toutes les couches du biofilm à éliminer, c'est-à-dire toute l'épaisseur dudit biofilm, permet de déstabiliser et de fluidifier la structure tridimensionnelle dudit biofilm. Préférentiellement, on soumet le biofilm à éliminer au cocktail de microorganismes nageurs pendant un temps compris entre 30 minutes et 10 heures. Lorsque le cocktail de microorganismes est retiré de la surface inerte, un nombre important de microorganismes nageurs reste à l'intérieur du biofilm dans lequel ils se sont infiltrés, et continue de le déstabiliser.

Le cocktail de microorganismes utilisé peut en outre comporter au moins un produit antimicrobien dirigé contre au moins un microorganisme du biofilm à éliminer. Ledit produit antimicrobien peut s'immiscer dans l'ensemble du biofilm, et atteindre toutes les couches, même les plus profondes et normalement inaccessibles. Le composé antimicrobien agissant sur les microorganismes cibles de toutes les couches du biofilm, il est ainsi possible de l'éliminer dans son intégralité. Autrement, le biofilm peut être traité à l'aide d'un produit antimicrobien, une fois le cocktail de microorganismes nageurs retiré. Ledit composé antimicrobien est par exemple déposé sur la surface inerte préalablement traitée par le cocktail de microorganismes. Le composé antimicrobien peut ainsi s'infiltrer dans l'ensemble des couches du biofilm et agir sur chacune d'elles. L'action du composé antimicrobien contre ne serait-ce qu'une seule sorte de microorganismes, dans le cas d'un biofilm composé de différents microorganismes, permet de déstabiliser le biofilm dans toute son épaisseur, et de conduire à son élimination. Selon un exemple de mise en oeuvre de l'invention, on prévoit d'utiliser des microorganismes nageurs aptes à synthétiser au moins un produit antimicrobien dirigé contre au moins un microorganisme du biofilm à éliminer. Ainsi, on utilise dans le cocktail de microorganismes des souches dites nageuses aptes à synthétiser au moins un tel produit antimicrobien. Alors, le composé antimicrobien synthétisé est libéré localement au sein du biofilm, au niveau de toutes les couches du biofilm. Même les couches les plus profondes peuvent être atteintes, alors qu'elles sont autrement inaccessibles aux composés antimicrobiens. Le composé antimicrobien agit ainsi sur les microorganismes cibles de toutes les couches du biofilm. Bien entendu, il est possible d'utiliser un microorganisme nageur synthétisant plusieurs composés antimicrobiens différents, et/ou plusieurs sortes de microorganismes nageurs synthétisant des composés antimicrobiens différents. Il est aisément possible d'adapter le panel de microorganismes nageurs et de composés antimicrobiens produits, en fonction des microorganismes à éliminer.

De tels microorganismes peuvent être des microorganismes synthétisant naturellement un produit antimicrobien dirigé contre tout ou partie des microorganismes ciblés. Autrement, ces microorganismes peuvent être des microorganismes recombinants, dans lesquelles un gène d'intérêt, codant le composé antimicrobien souhaité, est intégré. De plus, il est possible d'associer aux microorganismes nageurs du cocktail de microorganismes, des microorganismes dits « non nageurs », par exemple des bactéries dites « non nageuses », ou tout autre microorganisme, aptes à synthétiser au moins un produit antimicrobien dirigé contre au moins un microorganisme du biofilm à éliminer. Dans des modes de mise en oeuvre préférés de l'invention, le cocktail de microorganismes utilisé comporte en outre des souches dites non nageuses, aptes à synthétiser au moins un tel produit antimicrobien. Les microorganismes non nageurs synthétisant le/les composé(s) antimicrobien(s) peuvent autrement être utilisés ultérieurement, c'est-à-dire après prétraitement de la surface inerte par le cocktail de microorganismes comportant des microorganismes nageurs. Par exemple, on soumet la surface inerte ainsi prétraitée, à un second cocktail de microorganismes comportant quant à lui des microorganismes non nageurs synthétisant les composés antimicrobiens. Le prétraitement s'entend de la mise en contact avec le cocktail de microorganismes nageurs, suivi après un temps choisi, du rinçage de la surface afin d'éliminer ledit cocktail de microorganismes nageurs. Ainsi, selon des modes de mise en oeuvre préférés de l'invention, on soumet le biofilm, préalablement traité par le cocktail de microorganismes, à un second cocktail de microorganismes comportant au moins des souches dites « non nageuses » aptes à synthétiser au moins un produit antimicrobien dirigé contre au moins un microorganisme du biofilm à éliminer.

Par microorganismes non nageurs, on entend des microorganismes qui ne sont pas aptes à se déplacer dans le plan et/ou dans l'épaisseur du biofilm de manière à y créer des trous et canaux. Dans ce cas, les microorganismes nageurs peuvent avantageusement synthétiser un produit antimicrobien différent, mais peuvent également synthétiser le même produit antimicrobien, voire aucun produit antimicrobien.

Les microorganismes nageurs, produisant ou non eux-mêmes des composés antimicrobiens, créent des trous et des canaux dans le biofilm, favorisant la pénétration et la répartition des microorganismes non nageurs producteurs de composés antimicrobiens, dans tout le biofilm. On permet ainsi une action du ou des composé(s) antimicrobiens(s) dans toutes les couches du biofilm. Par ailleurs, le cocktail de microorganismes peut comporter, en plus des microorganismes nageurs, un antimicrobien exogène, dirigé contre au moins un microorganisme du biofilm à éliminer.

Tout antimicrobien, qui n'est pas nuisible aux microorganismes nageurs du cocktail de microorganismes, peut être utilisé. La surface inerte peut autrement être traitée par l'antimicrobien, exogène, après prétraitement de ladite surface par le cocktail de microorganismes. Par exemple, on soumet la surface inerte prétraitée à une solution comportant l'antimicrobien désiré. Dans des modes de mise en oeuvre préférés de l'invention, on soumet ainsi le biofilm, préalablement traité par le cocktail de microorganismes comportant des souches nageuses, à au moins un antimicrobien biologique ou chimique dirigé contre au moins un microorganisme du biofilm à éliminer.

Avantageusement, les microorganismes nageurs du cocktail de microorganismes utilisé sont choisis parmi les bactéries Bacillus thuringiensis, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus cereus, Serpens flexibilis, qui présentent un disque de mobilité de diamètre supérieur à 30 mm dans le test de mobilité en agar 0.25% décrit ci-dessous.

La concentration en microorganismes nageurs dans le cocktail de microorganismes utilisé est à ajuster en fonction des souches utilisées.

BREVE DESCRIPTION DES FIGURES Les figures 1A et 1B montrent des vues obtenues a l'aide d'un microscope laser confocale à balayage (MLCB) d'un biofilm de Bacillus thuringiensis marqués génétiquement avec la protéine fluorescente GFP (protéine à fluorescence verte), sur lesquelles on peut voir des canaux (figure 1A), et des trous (figures 1B), formés dans le biofilm par des sous populations de Bacillus thuringiensis nageuses au sein du biofilm ; Les figures 1C et 1 D représentent chacune schématiquement la trajectoire effectuée en 80 secondes par une bactérie Bacillus thuringiensis nageuse, dans deux biofilms de Bacillus thuringiensis de 48 heures différents ; Les figures 2A, 2B et 2C montrent le disque de mobilité de souches mobiles de Bacillus subtilis 168 pWG200 (figure 2A), Bacillus thuringiensis 407 (figure 2B) et Bacillus thuringiensis 407 pHT50 (figure 2C) dans un test de mobilité en agar 0.25% et les figures 2D, 2E et 2F montrent le disque de mobilité de souches non mobiles de Bacillus subtilis 168 fia pWG200 (figure 2D), Bacillus thuringiensis 407 fia (figure 2E) et Bacillus thuringiensis 407 fia pHT50 (figure 2F) dans ce même test de mobilité. Les figures 3A à 3E montrent des vues au microscope confocale d'un biofilm de Staphylococcus aureus en présence ou non d'un cocktail de bactéries nageuses, produisant ou non un produit antimicrobien ; ainsi la figure 3A montre un biofilm de Staphylococcus aureus marqué génétiquement à la GFP seule ; la figure 3B montre un biofilm de Staphylococcus aureus marqué à la GFP auquel on a ajouté un cocktail de microorganismes contenant des bactéries nageuses Bacillus thuringiensis ; la figure 3C montre un biofilm de Staphylococcus aureus marqué à la GFP auquel on a seulement ajouté le filtrat du cocktail de microorganismes contenant des bactéries de Bacillus thuringiensis génétiquement modifiées de manière à produire de la lysostaphine ; la figure 3D montre un biofilm de Staphylococcus aureus marqué à la GFP auquel on a ajouté un cocktail de microorganismes contenant des bactéries mobiles de Bacillus thuringiensis génétiquement modifiées de manière à produire de la lysostaphine ; la figure 3E montre un biofilm de Staphylococcus aureus marqué à la GFP auquel on a ajouté un cocktail de microorganismes contenant des bactéries Bacillus thuringiensis génétiquement modifiées de manière à ne pas être nageuses et à produire de la lysostaphine.

La figure 4 est un graphe présentant la quantification du biovolume en pm3 d'un biofilm résiduel de Staphylococcus aureus en l'absence de cocktail de microorganismes nageurs (Biofilm cible St), en présence d'un cocktail de microorganismes nageurs Bacillus thuringiensis (Bt), d'un cocktail de microorganismes non nageurs Bacillus thuringiensis 407 fia (Bt fia), d'un cocktail de microorganismes nageurs produisant de la lysostaphine Bacillus thuringiensis 407 pHT50 (Bt Lys) et d'un cocktail de microorganismes non nageurs produisant de la lysostaphine Bacillus thuringiensis 407 fia pHT50 (Bt fla Lys). La figure 5 est un graphe montrant en parallèle l'effet d'un traitement d'un biofilm de Staphylococcus aureus par un cocktail de microorganismes comportant des bactéries nageuses Bacillus thuringiensis ne produisant aucun produit antimicrobien, en association avec un composé antimicrobien, la lysostaphine (utilisée ici dans la gamme de 0 à 0.5 pg/ml), et l'effet d'un traitement d'un même biofilm de Staphylococcus aureus avec seulement un composé antimicrobien, la lysostaphine (utilisée dans la même gamme de 0 à 0.5pg/ml). La figure 6 est un graphe montrant en parallèle l'effet d'un traitement d'un biofilm de Staphylococcus aureus par un cocktail de microorganismes comportant des bactéries nageuses Bacillus thuringiensis ne produisant aucun produit antimicrobien, en association avec un microorganisme non nageur producteur de composés antimicrobiens, la souche Bacillus thuringiensis 407 fia pHT50 (utilisée ici dans une gamme de concentration de 6 à 8 unités logarithmiques par ml), et l'effet d'un traitement d'un même biofilm de Staphylococcus aureus avec seulement un microorganisme non nageur producteur de composés antimicrobiens, la souche Bacillus thuringiensis 407 fia pHT50 (utilisée ici dans la même gamme de concentration).

EXPERIMENTATIONS 1- Test d'identification in vitro de microorqanismes naqeurs

Il est possible de déterminer si un microorganisme est un microorganisme nageur au sens de l'invention, par exemple via un test de 30 mobilité microbienne en agar dont un exemple détaillé est décrit ci-dessous. Le principe du test consiste à inoculer au centre d'une boite de Pétri remplie de gélose semi-liquide (agar 0.25%) une faible quantité de microorganismes (-106 cellules) et de mesurer après une période d'incubation la taille du disque formé dans la boite de Pétri. 35 Matériel et méthode Le test est ici présenté pour une série de Bacillus subtilis et Bacillus thuringiensis et leurs mutants non mobiles (souches décrites dans le tableau I ci-dessous). La capacité de nage des souches est déterminée sur des boites de Pétri de diamètre 9 cm, remplies de milieu de culture Luria-Bertani (LB, Difco, référence 244620) supplémenté avec 0,25% d'agar. Six souches différentes sont testées ici, trois souches de nageuses à savoir Bacillus subtilis 168 pWG200 (figure 2A), Bacillus thuringiensis 407 (figure 2B), Bacillus thuringiensis 407 pHT50 (figure 2C), et trois souches non nageuses à savoir Bacillus subtilis 168 fia pWG200 (figure 2D), Bacillus thuringiensis 407 fia (figure 2E) et Bacillus thuringiensis 407 fia pHT50 (figure 2F). Les souches sont préalablement cultivées en milieu LB (sans addition d'agar) à 37 °C pendant 15h.

Un dépôt de 5pL de culture à environ 2.108 UFC/ml est alors réalisé au centre de chaque boite de Pétri, soit environ 106 UFC. Les boites sont ensuite incubées 24h à 37°C, puis le diamètre du disque microbien obtenu est mesuré à l'aide d'un décimètre.

Résultats et interprétation Les disques microbiens obtenus sont présentés aux figures 2A à 2F. Dans ces conditions expérimentales et pour les microorganismes testés, un disque avec un diamètre supérieur à 30 mm indique une forte capacité de nage en milieu visqueux (un cercle de 30 mm est représenté en pointillés sur les figures). Ainsi, on observe que la propagation du tapis microbien pour certaines souches est bien au moins égale à 30mm (figure 2A, 2B et 2C), tandis que pour d'autres souches la propagation du tapis microbien est très inférieure à 30mm (figures 2D, 2E et 2F) dans les conditions du test.

Le test est ici présenté pour des Bacillus, mais il peut aisément être adapté à d'autres microorganismes en jouant sur la nature du milieu de culture, la concentration en agar, le temps et la température d'incubation.

2- Identification de microorqanismes naqeurs au sein d'un biofilm 35 de Bacillus thuringiensis Un biofilm Bacillus thurinqiensis a été observé par microscopie confocale à balayage laser. Cette méthode permet de conserver l'intégrité du biofilm, et d'observer d'éventuels changements structuraux et physiologiques dans toutes les dimensions dudit biofilm.

Matériel et méthode La souche utilisée pour ce protocole est Bacillus thuringiensis, naturellement dotée de capacité de nage et génétiquement marquée avec la GFP (Green Fluorescent Protein) fluorescente. La souche est stockée en cryotubes à -80°C dans du glycérol 20%. Après deux précultures, la souche est ensemencée au millième dans 10 mL de milieu de culture Luria-Bertani (LB, Difco, référence 244620) et incubée à 30°C 15h sous agitation (180 rpm ). Les biofilms ont été cultivés à 30°C dans des chambres à flux dédiées FC81 (Biosurface Technologies Corporation, Bozeman, États-Unis). Pour lancer la croissance du biofilm, 2 ml de culture en phase exponentielle diluée à une DO600 de 0,01 sont injectés dans la chambre à flux. Après une heure d'adhésion, un flux constant de milieu de culture LB à 27m1/h est appliqué dans la chambre à l'aide d'une pompe péristaltique (Watson-Marlow 205S Watson-Marlow Ltd, Falmouth, Angleterre). Le biofilm est ainsi cultivé à 30°C pendant 48h, à l'issue desquelles les mouvements cellulaires individuels sont observés par Microscopie Confocale Laser à Balayage (Leica SP2 AOBS, plateforme d'imagerie MIMA2). La fluorescence de la GFP est générée sous excitation d'un laser à 488 nm à travers un objectif x63 à immersion et elle est collectée dans la gamme 500-600 nm sur un photomultiplicateur. La nage des cellules est détectée par l'acquisition de séquences d'images dans le temps (une image toutes les 1,6s pendant quelques dizaines de secondes).

Résultats et interprétation L'observation de ce biofilm permet de mettre en évidence parmi l'ensemble des bactéries formant ce biofilm, la présence de bactéries mobiles à fort pouvoir de déplacement, ou bactéries nageuses. Ainsi, ces bactéries présentent une vitesse de déplacement d'environ 57000 pm.h-1, et peuvent se déplacer, de manière aléatoire, à travers tout le biofilm, en le traversant de part en part.

Ces bactéries forment transitoirement des canaux (figure 1A) et des trous (figure 1 B), macroscopiques, à travers plusieurs couches, et qui ne se referment pas immédiatement. Ces déplacements sont liés à la force propulsive des flagelles desdites bactéries. En effet, un biofilm de mutants de Bacillus thuringiensis sans flagelles ou à flagelles paralysés, ne présente pas de tels mouvements. Ces bactéries à très forte mobilité changent de trajectoire dès lors qu'elles rencontrent un obstacle, ce qui laisse présager de leur potentiel à explorer l'ensemble du biofilm.

Sur les figures 1C et 1 D, on a représenté la trajectoire d'une telle bactérie à fort pouvoir de déplacement dans un biofilm de 48h, sur une période de 80 secondes seulement. Ces représentations illustrent bien le fort potentiel de déplacement de telles bactéries dans un biofilm. Par ailleurs, on a testé le potentiel de déplacement de ces bactéries Bacillus thuringiensis à fort pouvoir de déplacement dans des biofilms composés d'autres microorganismes. On a ainsi pu constater que ces bactéries gardaient leur capacité de déplacement dans de nombreux biofilms de bactéries Gram-positives (Staphylococcus aureus, Entereococcus faecalis, Listeria monocytogenes etc.) et de bactéries Gram-négatives (Yersinia enteritidis). Cette même capacité de déplacement a été observée entre autre chez Bacillus subtilis.

EXEMPLES DE MISE EN OEUVRE DU PROCEDE SELON 25 L'INVENTION

1- Premier exemple : élimination d'un biofilm de Staphylococcus aureus par un cocktail de microorqanismes comportant des bactéries naqeuses Bacillus thuringiensis produisant de la lysostaphine 30 Dans cet exemple, on a voulu mettre en évidence l'effet d'une bactérie nageuse productrice d'un composé toxique sur un biofilm indésirable. Le modèle d'interaction présenté est celui de la dissolution de biofilms de 24h de Staphylococcus aureus RN4220 génétiquement marqué à la GFP 35 fluorescente par des souches mobiles de Bacillus thuringiensis productrices de lysostaphine, une autolysine spécifique de Staphylococcus aureus. La souche Bacillus thuringiensis 407 pHT50 et son mutant non mobile ont été construits pour les besoins de ces expérimentations. Matériel et méthode A- Souches et conditions de culture Les souches de bactéries utilisées dans cette expérimentation sont listées dans le tableau I ci-dessous. Les souches sont conservées à -80°C dans une solution de glycérol à 20%. Tableau I : Souches utilisées.

Souches Code Propriétés Référence Staphylococcus St Pathogène cible formant Malone et al. 2009 aureus des biofilms et exprimant RN4220 GFP la protéine fluorescente GFP, résistance à l'érythromycine à 10 pg/ml Bacillus Bt Nageuse ; non production Salamitou et al. thuringiensis de composés toxiques 2000 ; Houry et al, 407 2010 Bacillus Bt fia Inactivation génétique de Houry et al, 2010 thuringiensis la capacité de nage, non 407 fia production de composés toxiques Bacillus Bt Lys Nageuse productrice de Protocole thuringiensis lysostaphine, résistance à d'obtention ci- 407 pHT50 la tetracycline à 10 pg/ml dessous Bacillus Bt fia Lys Inactivation génétique de Protocole thuringiensis la capacité de nage et d'obtention ci- 407 fia pHT50 production de dessous lysostaphine, résistance à la tetracycline à 10 pg/ml Construction qénétique des souches productrices de lysostaphine (Bacillus thurinqiensis 407 fia pHT50 et Bacillus thurinqiensis 407 fia pHT50) : Le gène codant pour la lysostaphine a été amplifié par PCR à partir du plasmide pWG200 (Gaier et al., 1992) en introduisant les sites de restriction Xhol en 5' et Xbal en 3'. Le promoteur papha3 du gène apha3 a été amplifié par PCR à partir du plasmide pDG783 (Guerout-Fleury et al., 1995) en introduisant les sites de restriction EcoRl en 5' et Xhol en 3'. Les fragments obtenus ont étés digérés par Xhol et Xbal ou par EcoRl et Xhol et ligaturés dans le plasmide pHT1618 (Lereclus et al., 1992) ouvert par EcoRl et Xbal.

Le plasmide obtenu, résistant à la tétracycline et portant le gène de la lysostaphine sous le contrôle du promoteur papha3, est appelé pHT50. Les souches Bad/lus thuringiensis 407 sauvage et 0-fia (Houry et al., 2010) ont été transformées par électroporation par le plasmide pHT50 et sélectionnées sur boîte de Pétri.

B- Formation des biofilms cibles de Staphylococcus aureus GFP.

Le protocole utilisé pour la formation des biofilms cibles est inspiré de celui décrit dans l'article Bridier et al. 2010.

Une préculture de Staphylococcus aureus RN4220 GFP est réalisée en inoculant 1 cryotube de 1 mL de la souche dans 9 mL de TSB (Biomérieux, réf : 51019), à 37°C, avec agitation à 180rpm pendant 8h. La culture est réalisée par inoculation de 10pL de préculture dans 10 mL de milieu de culture, à 37°C, avec agitation à 180 rpm, pendant 15h.

La concentration bactérienne est alors ajustée à environ 10' cellules/mL en ajustant la densité optique à 600nm de la suspension à 0,01 dans du TSB. Dans une microplaque de 96 puits (GreinerBioOne, pClear, référence 655090) on inocule 250pL de la suspension de Staphylococcus aureus GFP ajustée dans chaque puits et on incube la microplaque pendant 1h à 37°C pour permettre l'adhésion initiale des cellules. Les cellules non adhérentes sont alors éliminées par un renouvellement du milieu de culture dans chaque puits par 250pL de TSB stérile.

La microplaque est alors incubée à 37°C pendant 24h, ce qui permet la formation de 96 biofilms de Staphylococcus aureus GFP présentant une épaisseur au moins égale à 30 pm.

C- Mise en interaction avec un cocktail de microorganismes comportant Bacillus thuringiensis. Une première préculture des deux souches de Bacillus thuringiensis (Bacillus thuringiensis 407 pHT50, Bacillus thuringiensis 407 fia pHT50) se fait en inoculant 1 cryotube de 1 mL dans 9mL de milieu LB (Difco, réf : 244620) que l'on incube 15h à 37°C, avec agitation à 180rpm. Une seconde préculture est réalisée en mettant 10pL de la première préculture dans 10mL de milieu de culture, pendant 8h, à 37°C, avec agitation à 180rpm. La culture est alors obtenue en inoculant 10pL de la seconde préculture dans 10mL de milieu de culture à 37°C avec agitation à 180rpm durant 15h.

La concentration cellulaire des suspensions de Bacillus thuringiensis (Bacillus thuringiensis 407 pHT50, Bacillus thuringiensis 407 fia pHT50) est ajustée en LB au spectrophotomètre à DO600n, = 0.02 (soit environ 2.106 cellules/mL). 5mL des suspensions sont stérilisés par filtration avec des filtres 0,22 pm (Syringe Filter Nalgene®, Cat n°190-2520) afin de récolter les surnageants stériles des cultures qui serviront de contrôle ultérieurement.

Sur la microplaque contenant les 96 biofilms de Staphylococcus aureus Rn4220 GFP de 24h d'une épaisseur supérieure à 30pm, les surnageants de chaque puits sont prélevés délicatement (en prélevant 250pL avec une micropipette). 250 pL de suspensions calibrées de Bacillus thuringiensis 407 pHT50 sont ajoutés dans 18 puits. 250 pL de suspensions calibrées de surnageants stériles de Bacillus thuringiensis 407 pHT50 sont ajoutés dans 18 autres puits. 250 pL de suspensions calibrées de Bacillus thuringiensis 407 fia pHT50 sont ajoutés dans 18 autres puits. 250 pL de suspensions calibrées de surnageants stériles de Bacillus thuringiensis 407 fia pHT50 sont ajoutés dans 18 autres puits. Les 24 puits restants sont simplement renouvelés en milieu de culture stérile et servent de contrôle des biofilms cibles sans traitement.

La microplaque est ensuite incubée pendant 1 heure à 37°C pour permettre l'interaction initiale entre les préparations et les biofilms cibles. Un renouvellement du milieu de culture de l'ensemble des puits est alors réalisé avec 250 pL de milieu de LB. Après 24h d'incubation à 37°C sans agitation de la plaque, les biofilms résiduels de Staphylococcus aureus GFP sont analysés à l'aide d'un Microscope Confocale Laser à Balayage (MCLB) selon le protocole décrit par Bridier et al. 2010. Il est possible de visualiser et de quantifier le biovolume de cellules pathogènes du biofilm résiduel en présence ou non du traitement biologique, et ainsi d'évaluer quantitativement l'efficacité du procédé à éliminer le biofilm cible. Par exemple, on construit des projections 3D de la structure des biofilms à l'aide de la fonction easy 3D du logiciel Imaris 7.0 (Bitplane, Suisse). Puis, on détermine le biovolume des biofilms cibles résiduels à partir des séries d'images confocales obtenues par l'outil Matlab PHLIP comme décrit dans l'article Bridier et al. 2010.

Interprétation des résultats Seul les résultats obtenus avec Bacillus thuringiensis 407 pHT50 sont montrés (figures 3A à 3E et figure 4), mais des résultats similaires sont obtenus avec Bacillus subtilis. Afin de montrer la stabilité/répétabilité des résultats obtenus, les figures 3A à 3E montrent, pour chaque expérimentation, les résultats obtenus pour trois puits de Staphylococcus aureus.

La figure 4 présente la quantification (biovolume en pm3) du biofilm résiduel de Staphylococcus aureus en présence ou non d'un cocktail de microorganismes nageurs, produisant ou non un produit antimicrobien. La figure 3A montre un biofilm de Staphylococcus aureus GFP de 24h. Le biofilm présente une épaisseur de 30 pm, et une homogénéité visuelle et structurelle dans toutes ses dimensions.

Sur la figure 3B, le même biofilm de Staphylococcus aureus GFP de 24h a été soumis à un cocktail de bactéries comportant uniquement des Bacillus thuringiensis 407. La figure 3C montre que l'on n'observe aucune action sur ce même biofilm de Staphylococcus aureus GFP de 24h d'un filtrat de Bacillus thuringiensis 407 pHT50. Ainsi, la quantité de lysostaphine contenue dans le surnageant du cocktail n'est pas suffisante pour déstructurer le biofilm cible. Il en est de même avec le filtrat de la souche Bacillus thuringiensis 407 fla pHT50 qui ne présente aucune activité sur le biofilm cible.

De même, l'interaction du biofilm avec un cocktail de bactéries non nageuses produisant la lysostaphine (Bacillus thuringiensis 407 fia pHT50) n'induit pas d'effet visible sur le biofilm, qui après 24h continue de persister (figure 3E). L'effet le plus spectaculaire observé est celui obtenu par interaction, toujours de 24h, avec Bacillus thuringiensis 407 pHT50 (figure 3D). La production et la libération de lysostaphine par les bactéries nageuses permet d'éradiquer l'ensemble du biofilm dans un temps court. Les résultats quantitatifs de la figure 4 confirment clairement les résultats des figures 3A à 3E, à savoir que les bactéries mobiles produisant de la lysostaphine permettent une destruction rapide du biofilm. L'étoile indique une différence de biovolume statistiquement différente de celle du biofilm non traité (P<0.05). Le biovolume du biofilm de Staphylococcus aureus traité par les souches productrices de lysostaphine mobile est environ 6 fois plus faible que le biovolume du biofilm de Staphylococcus aureus traité par les souches productrices de lysostaphine, mais non mobiles, démontrant l'apport de la nage dans le traitement du biofilm cible.

2- Deuxième exemple : élimination d'un biofilm de Staphylococcus aureus par un cocktail de microorqanismes comportant des bactéries naqeuses Bacillus thuringiensis ne produisant aucun produit antimicrobien, en association avec un composé antimicrobien exoqène

Le composé actif peut être un composé antimicrobien (désinfectants chimiques, biomolécules actives) ou un agent dispersant (tensio-actifs, enzymes...).

Dans l'exemple qui suit, le composé actif est la lysostaphine, une autolysine spécifique de Staphylococcus aureus dont l'efficacité est améliorée par un pré-traitement des biofilms cibles avec un cocktail de bactéries nageuses non productrices de composé antimicrobien.

Matériel et méthode Les souches de bactéries utilisées pour ces expérimentations correspondent aux souches de Staphylococcus aureus RN4220 GFP et de Bacillus thuringiensis 407 décrites dans le tableau I.

Les biofilms cibles de Staphylococcus aureus RN4220 GFP cultivés en microplaques et les cultures de Bacillus thuringiensis 407 utilisées sont obtenues selon le protocole décrit précédemment. Sur une microplaque contenant des biofilms de 24h de Staphylococcus aureus RN42220 GFP de plus de 30pm d'épaisseur, on prélève délicatement 250 pL de surnageant dans chaque puits. 250pL de milieu de culture (contrôle) ou de suspension de Bacillus thuringiensis 407 calibrée à 10$ cellules/mL sont alors ajoutés dans chaque puits. Les biofilms de Staphylococcus aureus en présence ou non de bactéries nageuses sont ensuite incubés à 37°C pendant 4h.

Ces biofilms cibles, sensibilisés ou non durant 4h par un cocktail de bactéries nageuses, sont alors traités par ajout dans les puits de 250 pL de lysostaphine dans la gamme de concentration 0 à 0.5 pg/ml.

Interprétation des résultats Le même dispositif expérimental que celui décrit dans la première expérimentation a été utilisé pour quantifier l'efficacité du traitement (comparaison du biovolume résiduel du biofilm cible lors de l'action de la lysostaphine avec ou sans pré-traitement avec un cocktail de bactéries nageuses).

Les résultats présentés à la figure 5 montrent que, lorsque le composé antimicrobien seul ne permet pas l'éradication du biofilm cible (concentration en lysostaphine < 0.5 pg/ml), son efficacité sur le biofilm cible est améliorée par le pré-traitement avec un cocktail de bactéries nageuses (l'étoile indique un effet du prétraitement statistiquement significatif, P<0.05).35 3- Troisième exemple : élimination d'un biofilm de Staphylococcus aureus par un cocktail de bactéries comportant des bactéries naqeuses Bacillus thuringiensis ne produisant aucun produit antimicrobien, en association avec un microorqanisme non naqeur producteur de composés antimicrobiens

D'une manière générale, le protocole décrit ici permet de mettre en évidence l'effet sur un biofilm indésirable, d'un microorganisme nageur (non producteur de composés antimicrobiens) en association avec un (ou plusieurs) microorganismes non nageurs mais producteur de composé(s) antimicrobien(s). Le microorganisme non doté de capacité de nage peut produire des bactériocines (exemple : Lactococcus lactis producteur de nisin), des acides (bactéries lactiques), d'autres biomolécules actives....

L'exemple d'interaction présenté est celui de la dissolution de biofilms de 24h de Staphylococcus aureus RN4220 GFP par des souches mobiles de Bacillus thuringiensis en association avec des souches non nageuses productrices de lysostaphine.

Matériel et méthode Les souches de microorganismes utilisés pour ces expérimentations correspondent aux souches de bactéries Staphylococcus aureus RN4220 GFP, de Bacillus thuringiensis 407 (bactéries nageuses) et Bacillus thuringiensis 407 fia pHT50 (bactéries non nageuses productrices de composés antimicrobiens) décrites dans le tableau I. Les biofilms cibles de Staphylococcus aureus RN4220 GFP cultivés en microplaques et les cultures de Bacillus thuringiensis 407 et Bacillus thuringiensis 407 fia pHT50 utilisées sont obtenus selon les protocoles décrits précédemment. Sur la microplaque contenant les biofilms de 24h de Staphylococcus aureus RN42220 GFP de plus de 30pm d'épaisseur, on prélève délicatement 250 pL de surnageant dans chaque puits. 250pL de milieu de culture (contrôle, indiqué « Sans Bt fla » à la figure 6) ou de suspension de Bacillus thuringiensis 407 calibrée à 108 cellules/mL sont alors ajoutés dans chaque puits. Les biofilms de Staphylococcus aureus en présence ou non de bactéries nageuses sont alors incubés à 37°C pendant 4h. Ces biofilms cibles, sensibilisés ou non par un cocktail de bactéries nageuses, sont ensuite mis en contact avec 250 pL d'une suspension contenant 6, 7 ou 8 log/ml de bactéries non mobiles produisant un agent antimicrobien spécifique, la lysostaphine (souche Bacillus thuringiensis 407 fla pHT50 indiquée « Bt fla Lys 6 log », « Bt fla Lys 7 log », ou « Bt fla Lys 8 log » à la figure 6). Après une heure d'interaction, le surnageant des biofilms est remplacé par 250 pL de milieu de culture stérile, et les biofilms incubés à 37°C pendant 15h.

Comme précédemment, les biofilms résiduels du pathogène cible sont alors quantifiés par calcul du biovolume à partir de séries d'images obtenues en MCLB.

Interprétation des résultats Le même dispositif expérimental que celui décrit dans la première expérimentation a été utilisé pour quantifier l'efficacité du traitement (comparaison du biovolume résiduel du biofilm cible lors de l'action du cocktail de microorganismes non nageurs produisant de la lysostaphine, avec ou sans pré-traitement avec un cocktail de microorganismes nageurs).

Les résultats présentés à la figure 6 montrent que, lorsque le biofilm cible n'est pas éradiqué par le cocktail de bactéries non nageuses mais produisant de la lysostaphine (concentration < 8 log/ml de Bacillus thuringiensis 407 fla pHT50), le prétraitement du biofilm par un cocktail de bactéries nageuses a permis d'améliorer l'efficacité du traitement (l'étoile indique un effet significatif du prétraitement sur la déconstruction du biofilm cible, p<0,05).

BIBLIOGRAPHIE

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2000 Nov;146:2825-32. 25

Claims

REVENDICATIONS1- Procédé d'élimination d'un biofilm de micro-organismes préexistant sur une surface inerte, caractérisé en ce que : - on soumet ledit biofilm à un cocktail de microorganismes comportant au moins une population de microorganismes dits « nageurs », aptes à traverser ledit biofilm dans le plan et dans l'épaisseur, et - on soumet ledit biofilm à au moins un produit antimicrobien dirigé contre au moins un microorganisme du biofilm à éliminer.
2- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise dans le cocktail de microorganismes des souches nageuses aptes à synthétiser au moins un produit antimicrobien dirigé contre au moins un microorganisme du biofilm à éliminer.
3- Procédé selon l'une des revendications 1 et/ou 2, caractérisé en ce que le cocktail de microorganismes utilisé comporte en outre des souches dites « non nageuses » aptes à synthétiser au moins un produit antimicrobien dirigé contre au moins un microorganisme du biofilm à éliminer.
4- Procédé selon l'une des revendications 1 et/ou 2, caractérisé en ce qu'on soumet le biofilm, préalablement traité par le cocktail de microorganismes, à un second cocktail de microorganismes comportant au moins des souches dites « non nageuses » aptes à synthétiser au moins un produit antimicrobien dirigé contre au moins un microorganisme du biofilm à éliminer.
5- Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le cocktail de microorganismes utilisé comporte en outre au moins un antimicrobien dirigé contre au moins un microorganisme du biofilm à éliminer.
6- Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'on soumet le biofilm, préalablement traité par le cocktail de microorganismes, à au moins un antimicrobien biologique ou chimique dirigé contre au moins un microorganisme du biofilm à éliminer.
7- Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que les microorganismes nageurs du cocktail de microorganismes utilisé sontchoisis parmi les bactéries Bacillus thuringiensis, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Serpens flexibilis.