WO2012084746A1 - Procédé d'élimination d'un biofilm de microorganismes - Google Patents

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WO2012084746A1
WO2012084746A1 PCT/EP2011/073139 EP2011073139W WO2012084746A1 WO 2012084746 A1 WO2012084746 A1 WO 2012084746A1 EP 2011073139 W EP2011073139 W EP 2011073139W WO 2012084746 A1 WO2012084746 A1 WO 2012084746A1
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WO
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biofilm
microorganisms
swimming
cocktail
strain
Prior art date
Application number
PCT/EP2011/073139
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English (en)
Inventor
Romain BRIANDET
Alexandra Gruss
Stéphane Aymerich
Michel Gohar
Julien DESCHAMPS
Ali HOURY
Original Assignee
Institut National De La Recherche Agronomique
Inst Sciences Ind Vivant Environnement
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/381—Microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/39—Organic or inorganic per-compounds
    • C11D3/3945—Organic per-compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor

Definitions

  • the invention relates to a method for eliminating a biofilm of pre-existing microorganisms using specific microorganisms, so-called swimmers, allowing because of their displacements in the biofilm, to create channels and holes through and in the different layers of the biofilm. More particularly, the method according to the invention allows both mechanical and biological destruction of the biofilm, the swimming microorganisms may be associated for this purpose with an antimicrobial agent.
  • the invention has applications in all areas where the presence of microorganisms must be eliminated, whether in the agri-food field, the medical field, the industrial field etc.
  • Microorganisms such as bacteria, yeasts, fungi, microalgae etc. most often organized in biofilms when they colonize a surface, especially inert (stainless steel, glass, etc.).
  • microorganisms are organized in successive layers forming a three-dimensional building.
  • the microorganisms are linked to each other and to the colonized surface.
  • the microorganisms are embedded in an extracellular matrix, synthesized at least in part by these same microorganisms.
  • Microorganisms in a biofilm exhibit increased resistance to antimicrobial treatments. This can be explained by the very organization of the biofilm in superimposed layers, making the deepest layers difficult to access for antimicrobial agents. Likewise, the extracellular matrix tends to block the penetration of antimicrobial agents into the thickness of the biofilm. In addition, it has been discovered that gradients of pH, oxygen, nutritional etc. are created in the thickness of the biofilm. Also, it is observed that in certain layers of the biofilm, the microorganisms are in a state of senescence, thus increasing the phenomenon of antimicrobial resistance. Biofilms are likely to colonize all surfaces, they can be at the origin of many food poisoning, nosocomial diseases etc.
  • biofilms by chemical treatments (detergents and / or disinfectants).
  • these chemical compounds may be incompatible with certain applications, particularly because of the nature of the colonized environments.
  • these agents do not always allow the removal of biofilms throughout their thickness and many biofilms have a high resistance to their action.
  • microorganismsswimmers a sub-population of microorganisms called thereafter ""microorganismsswimmers", in the sense that these microorganisms whose kinetic energy is such that they are able to move in the plane of the biofilm and in its thickness, even though the biofilm is already created. As they move, these swimming microorganisms create holes and channels through the different layers of the biofilm. It seems that these holes and channels allow the transfer of microorganisms from one layer to another within the biofilm, the irrigation and oxygenation of the biofilm, etc.
  • strains of microorganisms have a swimming capacity when they are in solution, they partially retain when organized in biofilm. Moreover, these strains most often present, when in solution, a swimming capacity much higher than the swimming capacity usually observed in microorganisms.
  • the inventors thus had the advantageous idea of taking advantage of this swimming phenomenon to eliminate pre-existing biofilms of microorganisms, whatever they are.
  • the subject of the invention is therefore a process for eliminating a biofilm of microorganisms already created on an inert surface, characterized in that:
  • biofilm is subjected to a cocktail of microorganisms comprising at least one population of microorganisms called “swimmers” whose kinetic energy is such that they are able to cross said biofilm in the plane and in the thickness, and
  • said biofilm is subjected to at least one antimicrobial product directed against at least one microorganism of the biofilm to be eliminated.
  • the step of treatment of the biofilm with the antimicrobial product may be simultaneous or subsequent to the treatment step of said biofilm by the cocktail of microorganisms containing the swimming microorganisms.
  • biofilm of microorganisms already created, or pre-existing is meant a set of microorganisms, heterogeneous or homogeneous, organized in several successive layers, linked together and / or to the colonized surface, and surrounded by an extracellular matrix.
  • the biofilm to be eliminated may also be a biofilm composed solely of bacteria, or fungi, or yeasts, or protozoa, etc., these microorganisms may also be of the same species or different species, a compound biofilm at least two microorganisms of different natures.
  • Inert surface means in particular the surfaces of stainless steel, glass, polymers, wood, tiles etc., and more generally any surface other than a biological surface, the human body, animal or plant.
  • the method according to the invention can be used all along the food production line (breeding and processing), in particular for the treatment of the surfaces with which said food is likely to be in contact, in order to eliminate any risk of food poisoning.
  • the method according to the invention makes it possible to eliminate biofilms present on medical devices in order to limit the risks of nosocomial infection following their use.
  • the step of subjecting the biofilm to the cocktail of microorganisms consists, for example, in bringing said biofilm into contact with said cocktail.
  • the desired amount of microorganism cocktail is deposited on the inert surface to be treated.
  • the cocktail of microorganisms is preferably a cocktail of bacteria.
  • swimming microorganisms By swimming microorganisms is meant moving microorganisms, kept in suspension in the cocktail, whose kinetic energy is such that they are able to move both in the plane of said biofilm and in all its thickness, that is to say say to cross all the successive layers of said biofilm, and this despite the strong cohesion of microorganisms between them and the presence of the extracellular matrix, whose viscosity tends to immobilize microorganisms.
  • the kinetic energy that the microorganism must at least exhibit to be able to move in a biofilm in all directions depends on the particular characteristics of this biofilm.
  • the microorganisms having a swimming capacity within the meaning of the present invention that is to say able to move in the plane and in the thickness, in said biofilm, can be identified in a manner experimental. This can notably be achieved by confocal microscopic observations of the possible displacements of various microorganisms placed in contact with the biofilm, and the selection of the strains for which the formation of holes and channels in the layers of the biofilm is observed, testifying to a swimming ability of the microorganism in the latter.
  • microorganisms having a mobility disk after 24 hours of incubation at 37 ° C. of diameter greater than 30 mm in the 0.25% agar mobility test as described below possess an energy sufficient kinetics to present a swimming capacity, within the meaning of the present invention, in the biofilm.
  • Such microorganisms generally have a displacement speed in culture medium at least equal to 10 ⁇ / s.
  • the swimming microorganisms are swimming bacteria.
  • swimming microorganisms able not only to move within the same layer, but also to cross through all the layers of the biofilm to eliminate, that is to say the entire thickness of said biofilm , makes it possible to destabilize and fluidify the three-dimensional structure of said biofilm.
  • the biofilm is to be removed with the cocktail of swimming microorganisms for a time of between 30 minutes and 10 hours.
  • the cocktail of microorganisms is removed from the inert surface, a significant number of swimming microorganisms remain inside the biofilm in which they have infiltrated, and continues to destabilize it.
  • the cocktail of microorganisms used may also comprise at least one antimicrobial product directed against at least one microorganism of the biofilm to be eliminated.
  • the antimicrobial product can intrude into the entire biofilm, and reach all layers, even the deepest and normally inaccessible.
  • the antimicrobial compound acting on the target microorganisms of all layers of the biofilm it is possible to eliminate it in its entirety.
  • the biofilm can be treated with an antimicrobial product once the swimming microorganism cocktail is removed.
  • Said antimicrobial compound is for example deposited on the inert surface previously treated with the cocktail of microorganisms. The antimicrobial compound can thus infiltrate all the layers of the biofilm and act on each of them.
  • the action of the antimicrobial compound against even one kind of microorganisms in the case of a biofilm composed of different microorganisms, can destabilize the biofilm throughout its thickness, and lead to its elimination.
  • swimming microorganisms capable of synthesizing at least one antimicrobial product directed against at least one microorganism of the biofilm to be removed.
  • swimmers strains capable of synthesizing at least one such antimicrobial product.
  • the synthesized antimicrobial compound is released locally within the biofilm, at all layers of the biofilm. Even the deepest layers can be reached while they are otherwise inaccessible to antimicrobial compounds.
  • the antimicrobial compound thus acts on target microorganisms of all layers of the biofilm.
  • microorganisms may be microorganisms naturally synthesizing an antimicrobial product directed against all or part of the targeted microorganisms. Otherwise, these microorganisms may be recombinant microorganisms, in which a gene of interest encoding the desired antimicrobial compound is integrated.
  • non-swimmers for example so-called “non-swimmers” bacteria, or any other microorganism, able to synthesize at least one antimicrobial product directed against at least one microorganism of the biofilm to be eliminated.
  • the cocktail of microorganisms used further comprises so-called non-swimmable strains, capable of synthesizing at least one such antimicrobial product.
  • the non-swimmable microorganisms synthesizing the antimicrobial compound (s) may otherwise be used later, that is to say after pretreatment of the inert surface by the cocktail of microorganisms comprising swimming microorganisms.
  • the inert surface thus pretreated is subjected to a second cocktail of microorganisms comprising, in turn, non-swimmable microorganisms synthesizing the antimicrobial compounds.
  • Pretreatment means contacting with the cocktail of swimming microorganisms, followed after a selected time, rinsing the surface to eliminate said cocktail of swimming microorganisms.
  • the biofilm previously treated with the cocktail of microorganisms, is subjected to a second cocktail of microorganisms comprising at least so-called “non-swimmable” strains capable of synthesizing at least an antimicrobial product directed against at least one microorganism of the biofilm to be removed.
  • non-swimmable microorganisms microorganisms whose kinetic energy is not sufficient to be able to move in the plane and / or in the thickness of the biofilm so as to create holes and channels.
  • the swimming microorganisms can advantageously synthesize a different antimicrobial product, but can also synthesize the same antimicrobial product, or even no antimicrobial product.
  • the cocktail of microorganisms may comprise, in addition to swimming microorganisms, an exogenous antimicrobial directed against at least one microorganism of the biofilm to be eliminated.
  • Any antimicrobial that is not harmful to swimming microorganisms of the microorganism cocktail may be used.
  • the inert surface may otherwise be treated with the exogenous antimicrobial, after pretreatment of said surface by the cocktail of microorganisms.
  • the pretreated inert surface is subjected to a solution having the desired antimicrobial.
  • the biofilm previously treated with the cocktail of microorganisms comprising swimming strains, is thus subjected to at least one biological or chemical antimicrobial directed against at least one microorganism of the biofilm to be eliminated.
  • the swimming microorganisms of the cocktail of microorganisms used are chosen from bacteria Bacillus thuringiensis, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus cereus, Serpens flexibilis. Strains which have a mobility disk diameter greater than 30 mm in the 0.25% agar mobility test described below have a swimming capacity, within the meaning of the present invention, in most commonly encountered biofilms.
  • the concentration of swimming microorganisms in the cocktail of microorganisms used is to be adjusted according to the strains used.
  • the cocktail of microorganisms comprises at least a first strain of larger swimming microorganisms and lower movement velocity in the biofilm; and a second strain of smaller swimming microorganisms with greater movement velocity in the biofilm.
  • microorganisms of the first strain have a larger size, and a lower movement speed in the biofilm, than the microorganisms of the second strain.
  • the ratio of the size of the swimming microorganisms of the first strain, to the size of the swimming microorganisms of the second strain is greater than or equal to 1, 5. It is preferably approximately equal to 2.
  • the ratio of the speed of displacement in the biofilm of the swimming microorganisms of the second strain on the speed of displacement in the biofilm of the swimming microorganisms of the first strain is preferably greater than or equal to 1, 5, and preferably about 2.
  • the first swimming strain and the second swimming strain may belong to the same species, or to different species.
  • the first strain belongs to the species Bacillus thuhngiensis and the second strain belongs to the species Bacillus licheniformis.
  • the cocktail of microorganisms may also include more than two swimming strains, from the same species or from different species.
  • the first strain of swimming microorganisms and the second strain of swimming microorganisms are used successively, that is to say placed in contact with the biofilm to eliminate the one after the other, preferably a few minutes apart.
  • said biofilm is first subjected to a cocktail of microorganisms comprising one of these swimming strains, and then the biofilm is subjected to the other of these swimming strains.
  • FIGS. 1A and 1B show views obtained using a confocal laser scanning microscope (MLCB) of a biofilm of Bacillus thuhngiensis genetically labeled with the fluorescent protein GFP (green fluorescent protein), on which can see channels ( Figure 1A), and holes (Figure 1B), formed in the biofilm by subpopulations of Bacillus thuhngiensis swimmers within the biofilm;
  • FIGS. 1C and 1D each schematically represent the trajectory carried out in 80 seconds by a Bacillus thuringiensis swimmer bacterium, in two Bacillus thuringiensis biofilms of 48 different hours;
  • FIGS. 2A, 2B and 2C show the mobile mobility disc of Bacillus subtilis 168 pWG200 (FIG. 2A), Bacillus thuringiensis 407 (FIG. 2B) and Bacillus thuringiensis 407 pHT50 (FIG. 2C) in a mobility test in agar 0.25% and FIGS. 2D, 2E and 2F show the mobility disk of non-motile strains of Bacillus subtilis 168 Ma pWG200 (FIG. 2D), Bacillus thuringiensis 407 Ma (FIG. 2E) and Bacillus thuringiensis 407 Mla pHT50 (FIG. 2F) in this same test. mobility.
  • FIGS. 3A to 3E show confocal microscope views of a Staphylococcus aureus biofilm in the presence or absence of a swimming bacteria cocktail, whether or not producing an antimicrobial product; thus Figure 3A shows a biofilm of Staphylococcus aureus genetically labeled with GFP alone; Figure 3B shows a GFP labeled Staphylococcus aureus biofilm to which a cocktail of microorganisms containing Bacillus thuringiensis swimming bacteria was added; Figure 3C shows a GFP labeled Staphylococcus aureus biofilm to which only the filtrate of the microorganism cocktail containing Bacillus thuringiensis bacteria genetically modified to produce lysostaphin was added; Figure 3D shows a GFP labeled Staphylococcus aureus biofilm to which a cocktail of microorganisms containing Bacillus thuringiensis motile bacteria genetically modified to produce lysostaphin has been added; Figure 3E shows
  • FIG. 4 is a graph showing the quantification of biovolume in ⁇ 3 of a residual Staphylococcus aureus biofilm in the absence of a cocktail of swimming microorganisms (target Biofilm St), in the presence of a cocktail of swimming microorganisms Bacillus thuringiensis (Bt ), a cocktail of non-swimmable microorganisms Bacillus thuringiensis 407 Mla ⁇ Bt Mla), a cocktail of swimming microorganisms producing lysostaphin Bacillus thuringiensis 407 pHT50 (Bt Lys) and a non-swimming microorganism cocktail producing lysostaphin Bacillus thuhngiensis 407 My pHT50 (Bt Mla Lys).
  • FIG. 5 is a graph showing in parallel the effect of a treatment of a Staphylococcus aureus biofilm by a cocktail of microorganisms comprising Bacillus thuhngiensis swimming bacteria that do not produce any antimicrobial product, in association with an antimicrobial compound, lysostaphin ( used here in the range of 0 to 0.5 ⁇ g / ml), and the effect of a treatment of the same biofilm of Staphylococcus aureus with only one antimicrobial compound, lysostaphine (used in the same range of 0 to 0.5 ⁇ g / ml).
  • lysostaphin used here in the range of 0 to 0.5 ⁇ g / ml
  • FIG. 6 is a graph showing in parallel the effect of a treatment of a Staphylococcus aureus biofilm by a cocktail of microorganisms comprising Bacillus thuringiensis swimming bacteria that do not produce any antimicrobial product, in association with a non-swimmer microorganism producing compounds.
  • antimicrobial Bacillus thuringiensis 407 Ma pHT50 strain (used here in a concentration range of 6 to 8 log units per ml), and the effect of treating a single Staphylococcus aureus biofilm with only one non-sweeping microorganism producing of antimicrobial compounds, the strain Bacillus thuringiensis 407 Mla pHT50 (used here in the same concentration range).
  • FIG. 7 is a graph showing the log reduction of an untreated Staphylococcus aureus biofilm, or treated with a strain of non-swimmable bacteria Bacillus thuringiensis 407 Mla (BiMIa, negative control), or with a strain of swimmers bacteria Bacillus thuringiensis 407 (Bt), or by a strain of swimming bacteria Bacillus licheniformis LMG7560 (Bl), or by a mixture of the two swimming strains Bt and Bl at equal concentrations, this pretreatment being followed by a treatment with the benzalkonium chloride biocide. a concentration of 750 ppm.
  • the principle of the test is to inoculate a small amount of microorganisms ( ⁇ 10 6 cells) in the center of a petri dish filled with semi-liquid agar (0.25% agar) and to measure the size of the disc after an incubation period. formed in the petri dish.
  • the test is presented here for a series of Bacillus subtilis and Bacillus thuhngiensis and their non-motile mutants (strains described in Table I below).
  • the swimming capacity of the strains is determined on 9 cm diameter petri dishes, filled with Luria-Bertani culture medium (LB, Difco, reference 244620) supplemented with 0.25% agar.
  • the strains are previously cultured in LB medium (without the addition of agar) at 37 ° C. for 15 hours.
  • a deposit of 5 .mu.l of culture at about 2.10 8 CFU / ml is then produced in the center of each Petri dish, ie approximately 10 6 CFU.
  • the dishes are then incubated 24h at 37 ° C., and the diameter of the microbial disc obtained is measured using a decimetre.
  • the microbial disks obtained are shown in FIGS. 2A to 2F.
  • a disc with a diameter greater than 30 mm indicates a high displacement capacity in a viscous medium (a circle of 30 mm is shown in dashed lines in the figures).
  • the propagation of the microbial carpet for certain strains is at least equal to 30 mm (FIGS. 2A, 2B and 2C), while for other strains, the propagation of the microbial carpet is much less than 30 mm (FIGS. 2D, 2E and 2F) under the conditions of the test.
  • test is presented here for Bacillus, but it can easily be adapted to other microorganisms by varying the nature of the culture medium, the agar concentration, the time and the incubation temperature.
  • a biofilm Bacillus thuringiensis was observed by confocal laser scanning microscopy. This method preserves the integrity of the biofilm, and to observe possible structural and physiological changes in all dimensions of said biofilm.
  • the strain used for this protocol is Bacillus thuringiensis, naturally endowed with swimming capacity and genetically labeled with fluorescent GFP (Green Fluorescent Protein).
  • the strain is stored in cryovials at -80 ° C in 20% glycerol. After two precultures, the strain is seeded to the thousandth in 10 ml of Luria-Bertani culture medium (LB, Difco, reference 244620) and incubated at 30 ° C. for 15 hours with shaking (180 rpm).
  • the biofilms were grown at 30 ° C in FC81 dedicated flow chambers (Biosurface Technologies Corporation, Bozeman, USA). To initiate the growth of the biofilm, 2 ml of exponential phase culture diluted to an OD 6 of 0.01 are injected into the flow chamber. After one hour of adhesion, a constant flow of LB culture medium at 27 ml / h is applied in the chamber using a peristaltic pump (Watson Marlow 205S Watson-Marlow Ltd, Falmouth, England). The biofilm is thus cultured at 30 ° C. for 48 hours, at the end of which the individual cell motions are observed by Confocal Laser Scanning Microscopy (Leica SP2 AOBS, MIMA2 imaging platform).
  • the fluorescence of the GFP is generated under excitation of a 488 nm laser through an x63 immersion objective and is collected in the 500-600 nm range on a photomultiplier.
  • the swimming of the cells is detected by the acquisition of sequences of images in the time (one image every 1, 6s for a few tens of seconds). Results and interpretation
  • this biofilm makes it possible to highlight, among all the bacteria forming this biofilm, the presence of mobile bacteria with high displacement power, or swimming bacteria.
  • these bacteria have a movement speed of about 57000 ⁇ . ⁇ "1 , and can move randomly through the entire biofilm, passing through it from one side to the other.
  • FIGS. 1C and 1D show the trajectory of such a bacterium with high displacement power in a 48h biofilm over a period of only 80 seconds. These representations illustrate the high potential of displacement of such bacteria in a biofilm.
  • the interaction model presented is the dissolution of 24h biofilms of Staphylococcus aureus RN4220 genetically labeled with fluorescent GFP by mobile strains of Bacillus thuringiensis producing lysostaphin, an autolysin specific for Staphylococcus aureus.
  • the strain Bacillus thuringiensis 407 pHT50 and its non-mobile mutant were constructed for the purposes of these experiments.
  • lysostaphin-producing strains Bacillus thuringiensis 407 Mla pHT50 and Bacillus thuringiensis 407 Mla PHT50.
  • the gene coding for lysostaphin was amplified by PCR from plasmid pWG200 (Gaier et al., 1992) by introducing the XhoI restriction sites at 5 'and XbaI at 3'.
  • the papha3 promoter of the apha3 gene was amplified by PCR from plasmid pDG783 (Guerout-Fleury et al., 1995) by introducing the EcoRI restriction sites at 5 'and XhoI at 3'.
  • the fragments obtained were digested with XhoI and XbaI or with EcoRI and XhoI and ligated into the plasmid pHT1618 (Lereclus et al., 1992) opened with EcoRI and XbaI.
  • the resulting tetracycline-resistant plasmid carrying the lysostaphin gene under the control of the papha3 promoter is called pHT50.
  • the Bacillus thuringiensis 407 wild-type and Afla strains (Houry et al., 2010) were transformed by electroporation with the plasmid pHT50 and selected on a petri dish.
  • a preculture of Staphylococcus aureus RN4220 GFP is carried out by inoculating 1 cryotube of 1 ml of the strain in 9 ml of TSB (Biomérieux, ref: 51019), at 37 ° C., with stirring at 180 rpm for 8 h.
  • TSB Biomérieux, ref: 51019
  • the culture is carried out by inoculation of ⁇ ⁇ 0 ⁇ 1 of preculture in 10 ml of culture medium, at 37 ° C, with stirring at 180 rpm for 15h.
  • the bacterial concentration is then adjusted to approximately
  • a 96-well microplate (GreinerBioOne, ⁇ 3 ⁇ , reference 655090) is inoculated 250 ⁇ of the suspension of Staphylococcus aureus GFP adjusted in each well and the microplate is incubated for 1 h at 37 ° C to allow initial adhesion of the cells.
  • the non-adherent cells are then removed by a renewal of the culture medium in each well with 250 ⁇ l of sterile TSB.
  • the microplate is then incubated at 37 ° C. for 24 hours, which allows the formation of 96 biofilms of Staphylococcus aureus GFP having a thickness of at least 30 ⁇ .
  • a first preculture of the two Bacillus thuhngiensis strains (Bacillus thuringiensis 407 pHT50, Bacillus thuringiensis 407 Ma pHT50) is carried out by inoculating 1 ml of cryotube into 9 ml of LB medium (Difco, ref: 244620) which is incubated for 15 hours. 37 ° C, with stirring at 180 rpm.
  • a second preculture is carried out by placing 10 ⁇ l of the first preculture in 10 ml of culture medium for 8 h at 37 ° C., with shaking at 180 rpm.
  • the culture is then obtained by inoculating 10 ⁇ l of the second preculture in 10 ml of culture medium at 37 ° C. with shaking at 180 rpm for 15 hours.
  • 250 ⁇ l of calibrated Bacillus thuringiensis 407 My pHT50 suspensions are added to 18 other wells.
  • 250 ⁇ l of calibrated suspensions of Bacillus thuhngiensis 407 Ma pHT50 sterile supernatants are added to a further 18 wells.
  • the remaining 24 wells are simply replenished in sterile culture medium and serve as control of target biofilms without treatment.
  • microplate is then incubated for 1 hour at 37 ° C to allow the initial interaction between the preparations and target biofilms.
  • a renewal of the culture medium of all the wells is then carried out with 250 ⁇ of LB medium.
  • 3D projections of the structure of biofilms are constructed using the easy 3D function of the Imaris 7.0 software (Bitplane, Switzerland). Then, the biovolume of the residual target biofilms is determined from the series of confocal images obtained by the Matlab PHLIP tool as described in the article Bridier et al. 2010.
  • FIGS. 3A to 3E show, for each experiment, the results obtained for three wells of Staphylococcus aureus.
  • Figure 4 presents the quantification (biovolume in ⁇ 3 ) of the residual biofilm of Staphylococcus aureus in the presence or absence of a cocktail of swimming microorganisms, producing or not an antimicrobial product.
  • FIG. 3A shows a 24 hour Staphylococcus aureus GFP biofilm.
  • the biofilm has a thickness of 30 ⁇ , and a visual and structural homogeneity in all its dimensions.
  • FIG. 3B the same 24h Staphylococcus aureus GFP biofilm was subjected to a bacteria cocktail comprising only Bacillus thuringiensis 407.
  • FIG. 3C shows that no action is observed on this same 24 hour Staphylococcus aureus GFP biofilm of a Bacillus thuringiensis 407 pHT50 filtrate.
  • the amount of lysostaphin contained in the supernatant of the cocktail is not sufficient to destructure the target biofilm. It is the same with the filtrate of the strain Bacillus thuringiensis 407 Afla pHT50 which has no activity on the target biofilm.
  • FIG. 4 clearly confirm the results of FIGS. 3A-3E, namely that mobile bacteria producing lysostaphin allow rapid destruction of the biofilm.
  • the star indicates a biovolume difference statistically different from that of the untreated biofilm (P ⁇ 0.05).
  • the biovolume of Staphylococcus aureus biofilm treated with mobile lysostaphin-producing strains is about 6-fold lower than biovolume of Staphylococcus aureus biofilm treated with lysostaphin-producing but non-mobile strains, demonstrating the contribution of swimming to the treatment of the target biofilm.
  • the active compound may be an antimicrobial compound (chemical disinfectants, active biomolecules) or a dispersing agent (surfactants, enzymes, etc.).
  • the active compound is lysostaphine, an autolysin specific for Staphylococcus aureus whose effectiveness is improved by pre-treatment of the target biofilms with a cocktail of non-producing antimicrobial compound swimmer bacteria.
  • the bacterial strains used for these experiments correspond to strains of Staphylococcus aureus RN4220 GFP and
  • the target biofilms of Staphylococcus aureus RN4220 GFP grown in microplates and the cultures of Bacillus thuhngiensis 407 used are obtained according to the protocol described above.
  • Staphylococcus aureus RN4220 GFP more than 30 ⁇ thick 250 ⁇ of supernatant is gently withdrawn from each well. 250 ⁇ l of culture medium (control) or suspension of Bacillus thuhngiensis 407 calibrated at 10 8 cells / ml are then added to each well.
  • biofilms of Staphylococcus aureus with or without swimming bacteria are then incubated at 37 ° C for 4h.
  • target biofilms sensitized or not for 4 hours by a cocktail of swimming bacteria, are then treated by adding 250 ⁇ l of lysostaphin to the wells in the 0 to 0.5 ⁇ g / ml concentration range.
  • the protocol described here makes it possible to demonstrate the effect on an undesirable biofilm of a swimming microorganism (non-producer of antimicrobial compounds) in association with one (or more) non-swimming microorganisms but producing a compound (s) antimicrobial (s).
  • the microorganism not endowed with swimming capacity can produce bacteriocins (example: Lactococcus lactis producer of nisin), acids (lactic acid bacteria), other active biomolecules ....
  • bacteriocins example: Lactococcus lactis producer of nisin
  • acids lactic acid bacteria
  • other active biomolecules ....
  • the example of interaction presented is that of the dissolution of 24h biofilms of Staphylococcus aureus RN4220 GFP by mobile strains of Bacillus thuringiensis in association with non-sweeping lysostaphin-producing strains.
  • microorganism strains used for these experiments correspond to strains of bacteria Staphylococcus aureus RN4220 GFP, Bacillus thuringiensis 407 (swimming bacteria) and Bacillus thuringiensis 407 Ma pHT50 (non-swimmers producing antimicrobial compounds) described in Table I.
  • the target biofilms of Staphylococcus aureus RN4220 GFP grown in microplates and the cultures of Bacillus thuringiensis 407 and Bacillus thuringiensis 407 Ma pHT50 used are obtained according to the protocols described above.
  • target biofilms sensitized or not by a swimmers bacteria cocktail
  • thuringiensis 407 Afla pHT50 indicated “Bt Afla Lys 6 log”, “Bt Afla Lys 7 log”, or "Bt Ma Lys 8 log” in Figure 6).
  • the supernatant of the biofilms is replaced by 250 ⁇ of sterile culture medium, and the biofilms incubated at 37 ° C. for 15 h.
  • the residual biofilms of the target pathogen are then quantified by calculation of the biovolume from series of images obtained in MCLB.
  • results presented in FIG. 6 show that, when the target biofilm is not eradicated by the cocktail of non-swimmable bacteria but producing lysostaphin (concentration ⁇ 8 log / ml of Bacillus thuringiensis 407 Afla pHT50), the pretreatment of the biofilm by a cocktail of swimming bacteria has improved the effectiveness of the treatment (the star indicates a significant effect of pretreatment on the deconstruction of the target biofilm, P ⁇ 0.05).
  • Bacillus thuhngiensis bacteria strain 407 (Bt), as well as the corresponding mutant non-swimming strain 407Afla (Bt afla, negative control) described in Table 1 above. These bacteria have a diameter of approximately 1.5 ⁇ .
  • the target biofilms of Staphylococcus aureus RN4220 GFP grown in microplates and the bacilli cultures used are obtained according to the protocol described previously for Bacillus thuhngiensis 407.
  • biofilms of Staphylococcus aureus with or without bacteria are then incubated at 37 ° C for 4 hours to allow the infiltration of swimming bacteria. Supernatants are removed prior to contact with the biocide.
  • target biofilms are then treated by adding to the wells 200 ⁇ of benzaikonium chloride C14 (BAC, Fluka, Buchs, Switzerland) at a concentration of 750 ppm, or 200 ⁇ l of sodium chloride (NaCl) 150 M (biofilm " untreated ".
  • 200 ⁇ l of a neutralizing solution 3 g / l L -phosphatidylcholine, 30 g / l Tween 80, 5 g / l sodium thiosulfate, 1 g / l L-histidine, 30 g / l saponin
  • a neutralizing solution 3 g / l L -phosphatidylcholine, 30 g / l Tween 80, 5 g / l sodium thiosulfate, 1 g / l L-histidine, 30 g / l saponin
  • biofilms are then mechanically disintegrated using a micropipette cone and the collected suspension immediately dispersed in 5 ml of neutralizing solution.
  • the Iog10 reductions of S. aureus bacteria are calculated by comparing the survivor ratio in disinfected biofilms with the untreated biofilm population.
  • Negative controls ie, those treated with non-swimmable strain BtMa, or no treatment with benzalkonium chloride, gave comparable results.
  • Figure 7 shows the results obtained, in terms of log reduction of biofilms.
  • the bars represent the standard errors from 16 values obtained in 5 independent experiments.
  • Example 4 The experiment of Example 4 above was reproduced using two different strains of Bacillus licheniformis: the strain LMG 7560, described above, designated in this example by the code BI1, and the also swimmer strain LMG 7559, designated BI2 (also available in the collection www.belspo.be/bcm).

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Abstract

L'invention porte sur un procédé d'élimination d'un biofilm de microorganismes préexistant sur une surface inerte, caractérisé en ce qu'on soumet ledit biofilm à un cocktail de microorganismes comportant au moins des souches dites « nageuses », aptes à traverser ledit biofilm dans le plan et dans l'épaisseur, et on soumet ledit biofilm à au moins un produit antimicrobien dirigé contre au moins un microorganisme du biofilm à éliminer.

Description

PROCÉDÉ D'ÉLIMINATION D'UN BIOFILM DE MICROORGANISMES
DOMAINE DE L'INVENTION
L'invention concerne un procédé d'élimination d'un biofilm de microorganismes préexistant par utilisation de microorganismes spécifiques, dits nageurs, permettant du fait de leurs déplacements dans le biofilm, de créer des canaux et des trous à travers et dans les différentes couches du biofilm. Plus particulièrement, le procédé selon l'invention permet une destruction tant mécanique que biologique du biofilm, les microorganismes nageurs pouvant être associés pour cela à un agent antimicrobien.
L'invention trouve des applications dans tous les domaines où la présence de microorganismes doit être supprimée, que ce soit dans le domaine agro-alimentaire, le domaine médical, le domaine industriel etc.
ETAT DE LA TECHNIQUE
Les microorganismes, tels que les bactéries, les levures, les champignons, les microalgues etc. s'organisent le plus souvent en biofilms lorsqu'ils colonisent une surface, notamment inerte (acier inoxydable, verre etc.).
Dans un biofilm, les microorganismes sont organisés en couches successives formant un édifice tridimensionnel. Les microorganismes y sont liés entre eux et à la surface colonisée. Les microorganismes baignent dans une matrice extracellulaire, synthétisée au moins en partie par ces mêmes microorganismes.
Les microorganismes d'un biofilm présentent des résistances accrues aux traitements antimicrobiens. Cela s'explique notamment par l'organisation même du biofilm en couches superposées, rendant les couches les plus profondes difficilement accessibles aux agents antimicrobiens. De même, la matrice extracellulaire tend à bloquer la pénétration des agents antimicrobiens dans l'épaisseur du biofilm. Par ailleurs, on a découvert que des gradients de pH, d'oxygène, nutritionnel etc. se créent dans l'épaisseur du biofilm. Aussi, on observe que dans certaines couches du biofilm, les microorganismes sont dans un état de sénescence, augmentant ainsi le phénomène de résistance aux antimicrobiens. Les biofilms étant susceptibles de coloniser toutes les surfaces, ils peuvent être à l'origine de nombreuses intoxications alimentaires, maladies nosocomiales etc.
C'est pourquoi on cherche à empêcher leur formation ou à les éradiquer, que se soit par des méthodes physiques, chimiques ou biologiques.
Ainsi, par exemple, on sait déstabiliser et éliminer au moins partiellement des biofilms par des traitements chimiques (détergents et/ou désinfectants). Bien entendu, l'utilisation de ces composés chimiques peut être incompatible avec certaines applications, notamment du fait de la nature des milieux colonisés. De plus, ces agents ne permettent pas toujours de supprimer les biofilms dans toute leur épaisseur et de nombreux biofilms présentent une forte résistance à leur action.
Dans certains cas, des procédés physiques tels que la température, les ultrasons, les plasmas gazeux, la lumière puisée ou la thérapie photodynamique etc. peuvent être utilisés mais leur mise en œuvre industrielle n'est pas toujours possible.
Pour certaines applications, il est connu d'utiliser des bactériophages à même d'éradiquer certains microorganismes du biofilm. Cependant, leur spectre étroit de spécificité, la présence de la matrice extracellulaire, l'organisation en couches successives et le phénomène de sénescence observé dans certaines couches favorisent la persistance au moins partielle des biofilms.
Il existe donc un réel besoin de trouver de nouveaux moyens d'éradiquer les biofilms de microorganismes, de manière fiable.
EXPOSE DE L'INVENTION
L'observation et l'analyse de différents biofilms de microorganismes ont permis aux inventeurs de découvrir au sein d'un biofilm déjà établi de Bacillus thuhngiensis sur une surface inerte, l'existence d'une sous- population de microorganismes appelés par la suite « microorganismes nageurs », en ce sens que ces microorganismes dont l'énergie cinétique est telle qu'ils sont capables de se déplacer dans le plan du biofilm et dans son épaisseur, alors même que le biofilm est déjà créé. En se déplaçant, ces microorganismes nageurs créent localement et temporairement des trous et des canaux à travers les différentes couches du biofilm. Il semblerait que ces trous et canaux permettent le transfert de microorganismes d'une couche à une autre au sein du biofilm, l'irrigation et l'oxygénation du biofilm, etc. Ainsi, certaines souches de microorganismes ont une capacité de nage quand elles sont en solution, qu'elles conservent partiellement lorsqu'elles sont organisées en biofilm. Par ailleurs, ces souches présentent le plus souvent, lorsqu'elles sont en solution, une capacité de nage bien supérieure à la capacité de nage habituellement observée chez les microorganismes.
Les inventeurs ont ainsi eu l'idée avantageuse de tirer profit de ce phénomène de nage pour éliminer des biofilms préexistants de microorganismes, quels qu'ils soient.
L'invention a donc pour objet un procédé d'élimination d'un biofilm de microorganismes déjà créé sur une surface inerte, caractérisé en ce que :
- on soumet ledit biofilm à un cocktail de microorganismes comportant au moins une population de microorganismes dits « nageurs >> dont l'énergie cinétique est telle qu'ils sont aptes à traverser ledit biofilm dans le plan et dans l'épaisseur, et
- on soumet ledit biofilm à au moins un produit antimicrobien dirigé contre au moins un microorganisme du biofilm à éliminer. L'étape de traitement du biofilm par le produit antimicrobien peut être simultanée ou ultérieure à l'étape de traitement dudit biofilm par le cocktail de microorganismes contenant les microorganismes nageurs.
Par biofilm de microorganismes déjà créé, ou préexistant, on entend un ensemble de microorganismes, hétérogènes ou homogènes, organisés en plusieurs couches successives, liés entre eux et/ou à la surface colonisée, et entourés d'une matrice extracellulaire. Le biofilm à éliminer peut aussi bien être un biofilm composé uniquement de bactéries, ou de champignons, ou de levures, ou de protozoaires etc., ces microorganismes pouvant par ailleurs être d'une même espèce ou de différentes espèces, qu'un biofilm composé d'au moins deux microorganismes de natures différentes.
Par surface inerte, on entend notamment les surfaces en acier inoxydable, verre, polymères, bois, carrelage etc., et plus généralement toute surface autre qu'une surface biologique, du corps humain, animal ou végétal. Ainsi, le procédé selon l'invention peut être utilisé tout le long de la chaîne de fabrication d'aliments (élevage et transformation), notamment pour le traitement des surfaces avec lesquelles lesdits aliments sont susceptibles d'être en contact, afin d'éliminer tout risque d'intoxication alimentaire. De même, le procédé selon l'invention permet d'éliminer des biofilms présents sur des dispositifs médicaux afin de limiter les risques d'infection nosocomiale suite à leur utilisation.
L'étape de soumission du biofilm au cocktail de microorganismes consiste par exemple à mettre en contact ledit biofilm avec ledit cocktail. Par exemple, on dépose la quantité souhaitée de cocktail de microorganismes sur la surface inerte à traiter. Le cocktail de microorganismes est de préférence un cocktail de bactéries.
Par microorganismes nageurs, on entend des microorganismes mobiles, maintenus en suspension dans le cocktail, dont l'énergie cinétique est telle qu'ils sont capables de se déplacer tant dans le plan dudit biofilm que dans toute son épaisseur, c'est-à-dire de traverser toutes les couches successives dudit biofilm, et ce malgré la forte cohésion des microorganismes entre eux et la présence de la matrice extracellulaire, dont la viscosité tend à immobiliser les microorganismes.
L'énergie cinétique que doit au moins présenter le microorganisme pour être capable de se déplacer dans un biofilm dans toutes les directions dépend des caractéristiques particulières de ce biofilm. Pour chaque biofilm de caractéristiques données, les microorganismes présentant une capacité de nage au sens de la présente invention, c'est-à-dire aptes à se déplacer dans le plan et dans l'épaisseur, dans ledit biofilm, peuvent être identifiés de manière expérimentale. Ceci peut notamment être réalisé par des observations au microscope confocal des déplacements éventuels de différents microorganismes mis en contact avec le biofilm, et la sélection des souches pour lesquelles on observe la formation de trous et de canaux dans les couches du biofilm, témoignant d'une capacité de nage du microorganisme dans ce dernier.
Pour la plupart des biofilms de microorganismes couramment rencontrés, des microorganismes présentant un disque de mobilité après 24h d'incubation à 37°C de diamètre supérieur à 30 mm dans le test de mobilité en agar à 0.25 % tel que décrit par la suite, possèdent une énergie cinétique suffisante pour présenter une capacité de nage, au sens de la présente invention, dans le biofilm. De tels microorganismes présentent en général une vitesse de déplacement en milieu de culture au moins égale à 10 μιη/s.
Préférentiellement, les microorganismes nageurs sont des bactéries nageuses.
L'utilisation de microorganismes nageurs, capables non seulement de se déplacer au sein d'une même couche, mais également de traverser de part en part toutes les couches du biofilm à éliminer, c'est-à-dire toute l'épaisseur dudit biofilm, permet de déstabiliser et de fluidifier la structure tridimensionnelle dudit biofilm.
Préférentiellement, on soumet le biofilm à éliminer au cocktail de microorganismes nageurs pendant un temps compris entre 30 minutes et 10 heures. Lorsque le cocktail de microorganismes est retiré de la surface inerte, un nombre important de microorganismes nageurs reste à l'intérieur du biofilm dans lequel ils se sont infiltrés, et continue de le déstabiliser.
Le cocktail de microorganismes utilisé peut en outre comporter au moins un produit antimicrobien dirigé contre au moins un microorganisme du biofilm à éliminer. Ledit produit antimicrobien peut s'immiscer dans l'ensemble du biofilm, et atteindre toutes les couches, même les plus profondes et normalement inaccessibles. Le composé antimicrobien agissant sur les microorganismes cibles de toutes les couches du biofilm, il est ainsi possible de l'éliminer dans son intégralité.
Autrement, le biofilm peut être traité à l'aide d'un produit antimicrobien, une fois le cocktail de microorganismes nageurs retiré. Ledit composé antimicrobien est par exemple déposé sur la surface inerte préalablement traitée par le cocktail de microorganismes. Le composé antimicrobien peut ainsi s'infiltrer dans l'ensemble des couches du biofilm et agir sur chacune d'elles.
L'action du composé antimicrobien contre ne serait-ce qu'une seule sorte de microorganismes, dans le cas d'un biofilm composé de différents microorganismes, permet de déstabiliser le biofilm dans toute son épaisseur, et de conduire à son élimination.
Selon un exemple de mise en œuvre de l'invention, on prévoit d'utiliser des microorganismes nageurs aptes à synthétiser au moins un produit antimicrobien dirigé contre au moins un microorganisme du biofilm à éliminer. Ainsi, on utilise dans le cocktail de microorganismes des souches dites nageuses aptes à synthétiser au moins un tel produit antimicrobien.
Alors, le composé antimicrobien synthétisé est libéré localement au sein du biofilm, au niveau de toutes les couches du biofilm. Même les couches les plus profondes peuvent être atteintes, alors qu'elles sont autrement inaccessibles aux composés antimicrobiens. Le composé antimicrobien agit ainsi sur les microorganismes cibles de toutes les couches du biofilm.
Bien entendu, il est possible d'utiliser un microorganisme nageur synthétisant plusieurs composés antimicrobiens différents, et/ou plusieurs sortes de microorganismes nageurs synthétisant des composés antimicrobiens différents. Il est aisément possible d'adapter le panel de microorganismes nageurs et de composés antimicrobiens produits, en fonction des microorganismes à éliminer.
De tels microorganismes peuvent être des microorganismes synthétisant naturellement un produit antimicrobien dirigé contre tout ou partie des microorganismes ciblés. Autrement, ces microorganismes peuvent être des microorganismes recombinants, dans lesquelles un gène d'intérêt, codant le composé antimicrobien souhaité, est intégré.
De plus, il est possible d'associer aux microorganismes nageurs du cocktail de microorganismes, des microorganismes dits « non nageurs », par exemple des bactéries dites « non nageuses », ou tout autre microorganisme, aptes à synthétiser au moins un produit antimicrobien dirigé contre au moins un microorganisme du biofilm à éliminer. Dans des modes de mise en œuvre préférés de l'invention, le cocktail de microorganismes utilisé comporte en outre des souches dites non nageuses, aptes à synthétiser au moins un tel produit antimicrobien.
Les microorganismes non nageurs synthétisant le/les composé(s) antimicrobien(s) peuvent autrement être utilisés ultérieurement, c'est-à-dire après prétraitement de la surface inerte par le cocktail de microorganismes comportant des microorganismes nageurs. Par exemple, on soumet la surface inerte ainsi prétraitée, à un second cocktail de microorganismes comportant quant à lui des microorganismes non nageurs synthétisant les composés antimicrobiens. Le prétraitement s'entend de la mise en contact avec le cocktail de microorganismes nageurs, suivi après un temps choisi, du rinçage de la surface afin d'éliminer ledit cocktail de microorganismes nageurs.
Ainsi, selon des modes de mise en œuvre préférés de l'invention, on soumet le biofilm, préalablement traité par le cocktail de microorganismes, à un second cocktail de microorganismes comportant au moins des souches dites « non nageuses >> aptes à synthétiser au moins un produit antimicrobien dirigé contre au moins un microorganisme du biofilm à éliminer.
Par microorganismes non nageurs, on entend des microorganismes dont l'énergie cinétique n'est pas suffisante pour qu'ils soient aptes à se déplacer dans le plan et/ou dans l'épaisseur du biofilm de manière à y créer des trous et canaux.
Dans ce cas, les microorganismes nageurs peuvent avantageusement synthétiser un produit antimicrobien différent, mais peuvent également synthétiser le même produit antimicrobien, voire aucun produit antimicrobien.
Les microorganismes nageurs, produisant ou non eux-mêmes des composés antimicrobiens, créent des trous et des canaux dans le biofilm, favorisant la pénétration et la répartition des microorganismes non nageurs producteurs de composés antimicrobiens, dans tout le biofilm. On permet ainsi une action du ou des composé(s) antimicrobiens(s) dans toutes les couches du biofilm.
Par ailleurs, le cocktail de microorganismes peut comporter, en plus des microorganismes nageurs, un antimicrobien exogène, dirigé contre au moins un microorganisme du biofilm à éliminer.
Tout antimicrobien, qui n'est pas nuisible aux microorganismes nageurs du cocktail de microorganismes, peut être utilisé.
La surface inerte peut autrement être traitée par l'antimicrobien, exogène, après prétraitement de ladite surface par le cocktail de microorganismes. Par exemple, on soumet la surface inerte prétraitée à une solution comportant l'antimicrobien désiré.
Dans des modes de mise en œuvre préférés de l'invention, on soumet ainsi le biofilm, préalablement traité par le cocktail de microorganismes comportant des souches nageuses, à au moins un antimicrobien biologique ou chimique dirigé contre au moins un microorganisme du biofilm à éliminer. Avantageusement, les microorganismes nageurs du cocktail de microorganismes utilisé sont choisis parmi les bactéries Bacillus thuringiensis, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus cereus, Serpens flexibilis. Les souches qui présentent un disque de mobilité de diamètre supérieur à 30 mm dans le test de mobilité en agar 0.25% décrit ci- dessous présentent une capacité de nage, au sens de la présente invention, dans la plupart des biofilms couramment rencontrés.
La concentration en microorganismes nageurs dans le cocktail de microorganismes utilisé est à ajuster en fonction des souches utilisées.
Dans des modes de mise en œuvre particulièrement préférés de l'invention, en termes d'efficacité d'élimination des biofilms de microorganismes préexistant sur une surface inerte, le cocktail de microorganismes comporte au moins une première souche de microorganismes nageurs de plus grande taille et de plus faible vitesse de déplacement dans le biofilm, et une deuxième souche de microorganismes nageurs de plus petite taille et de plus grande vitesse de déplacement dans le biofilm.
On entend par là que les microorganismes de la première souche présentent une taille plus importante, et une vitesse de déplacement dans le biofilm moins importante, que les microorganismes de la deuxième souche.
Il a été découvert par les présents inventeurs que la mise en œuvre combinée de deux souches de microorganismes nageurs présentant de telles différences de propriétés permettait d'obtenir un effet synergique pour l'élimination du biofilm, avec pour effet une élimination plus complète et plus rapide de celui-ci.
On ne préjugera pas ici des mécanismes sous-tendant un tel résultat avantageux. On peut cependant supposer que les microorganismes de plus grande taille créent de larges canaux dans le biofilm, ces larges canaux facilitant le déplacement dans le biofilm des microorganismes plus rapides, qui ont quant à eux pour effet d'accélérer et d'intensifier la déstabilisation mécanique du biofilm, et par conséquent de favoriser l'irrigation et la diffusion du produit antimicrobien dans tout le volume du biofilm.
Dans des modes de mise en œuvre avantageux de l'invention, le rapport de la taille des microorganismes nageurs de la première souche, sur la taille des microorganismes nageurs de la deuxième souche, est supérieur ou égal à 1 ,5. Il est préférentiellement environ égal à 2.
Le rapport de la vitesse de déplacement dans le biofilm des microorganismes nageurs de la deuxième souche, sur la vitesse de déplacement dans le biofilm des microorganismes nageurs de la première souche, est de préférence quant à lui supérieur ou égal à 1 ,5, et préférentiellement environ égal à 2.
Le choix de telles caractéristiques permet avantageusement d'obtenir une efficacité encore supérieure d'élimination du biofilm.
La première souche nageuse et la seconde souche nageuse peuvent appartenir à la même espèce, ou à des espèces différentes.
En particulier, dans des modes de mise en œuvre de l'invention, la première souche appartient à l'espèce Bacillus thuhngiensis et la deuxième souche appartient à l'espèce Bacillus licheniformis.
Le cocktail de microorganismes peut également comporter plus de deux souches nageuses, issues de la même espèce ou d'espèces différentes.
Dans d'autres modes de mise en œuvre de l'invention, la première souche de microorganismes nageurs et la deuxième souche de microorganismes nageurs sont mises en œuvre successivement, c'est-à-dire mises en contact avec le biofilm à éliminer l'une après l'autre, de préférence à quelques minutes d'intervalle. Ainsi, on soumet tout d'abord ledit biofilm à un cocktail de microorganismes comportant une de ces souches nageuses, puis on soumet le biofilm à l'autre de ces souches nageuses. Dans un tel mode de mise en œuvre, il est tout à fait avantageux de mettre en œuvre la première souche, de plus grande taille, avant la deuxième souche, de plus grande vitesse de déplacement dans le biofilm.
BREVE DESCRIPTION DES FIGURES
Les figures 1 A et 1 B montrent des vues obtenues a l'aide d'un microscope laser confocale à balayage (MLCB) d'un biofilm de Bacillus thuhngiensis marqués génétiquement avec la protéine fluorescente GFP (protéine à fluorescence verte), sur lesquelles on peut voir des canaux (figure 1 A), et des trous (figures 1 B), formés dans le biofilm par des sous populations de Bacillus thuhngiensis nageuses au sein du biofilm ; Les figures 1 C et 1 D représentent chacune schématiquement la trajectoire effectuée en 80 secondes par une bactérie Bacillus thuringiensis nageuse, dans deux biofilms de Bacillus thuringiensis de 48 heures différents ;
Les figures 2A, 2B et 2C montrent le disque de mobilité de souches mobiles de Bacillus subtilis 168 pWG200 (figure 2A), Bacillus thuringiensis 407 (figure 2B) et Bacillus thuringiensis 407 pHT50 (figure 2C) dans un test de mobilité en agar 0.25% et les figures 2D, 2E et 2F montrent le disque de mobilité de souches non mobiles de Bacillus subtilis 168 Ma pWG200 (figure 2D), Bacillus thuringiensis 407 Ma (figure 2E) et Bacillus thuringiensis 407 Mla pHT50 (figure 2F) dans ce même test de mobilité.
Les figures 3A à 3E montrent des vues au microscope confocale d'un biofilm de Staphylococcus aureus en présence ou non d'un cocktail de bactéries nageuses, produisant ou non un produit antimicrobien ; ainsi la figure 3A montre un biofilm de Staphylococcus aureus marqué génétiquement à la GFP seule ; la figure 3B montre un biofilm de Staphylococcus aureus marqué à la GFP auquel on a ajouté un cocktail de microorganismes contenant des bactéries nageuses Bacillus thuringiensis ; la figure 3C montre un biofilm de Staphylococcus aureus marqué à la GFP auquel on a seulement ajouté le filtrat du cocktail de microorganismes contenant des bactéries de Bacillus thuringiensis génétiquement modifiées de manière à produire de la lysostaphine ; la figure 3D montre un biofilm de Staphylococcus aureus marqué à la GFP auquel on a ajouté un cocktail de microorganismes contenant des bactéries mobiles de Bacillus thuringiensis génétiquement modifiées de manière à produire de la lysostaphine ; la figure 3E montre un biofilm de Staphylococcus aureus marqué à la GFP auquel on a ajouté un cocktail de microorganismes contenant des bactéries Bacillus thuringiensis génétiquement modifiées de manière à ne pas être nageuses et à produire de la lysostaphine.
La figure 4 est un graphe présentant la quantification du biovolume en μιη3 d'un biofilm résiduel de Staphylococcus aureus en l'absence de cocktail de microorganismes nageurs (Biofilm cible St), en présence d'un cocktail de microorganismes nageurs Bacillus thuringiensis (Bt), d'un cocktail de microorganismes non nageurs Bacillus thuringiensis 407 Mla {Bt Mla), d'un cocktail de microorganismes nageurs produisant de la lysostaphine Bacillus thuringiensis 407 pHT50 (Bt Lys) et d'un cocktail de microorganismes non nageurs produisant de la lysostaphine Bacillus thuhngiensis 407 Ma pHT50 (Bt Mla Lys).
La figure 5 est un graphe montrant en parallèle l'effet d'un traitement d'un biofilm de Staphylococcus aureus par un cocktail de microorganismes comportant des bactéries nageuses Bacillus thuhngiensis ne produisant aucun produit antimicrobien, en association avec un composé antimicrobien, la lysostaphine (utilisée ici dans la gamme de 0 à 0.5 μg/ml), et l'effet d'un traitement d'un même biofilm de Staphylococcus aureus avec seulement un composé antimicrobien, la lysostaphine (utilisée dans la même gamme de 0 à 0.5 μg/ml) .
La figure 6 est un graphe montrant en parallèle l'effet d'un traitement d'un biofilm de Staphylococcus aureus par un cocktail de microorganismes comportant des bactéries nageuses Bacillus thuringiensis ne produisant aucun produit antimicrobien, en association avec un microorganisme non nageur producteur de composés antimicrobiens, la souche Bacillus thuringiensis 407 Ma pHT50 (utilisée ici dans une gamme de concentration de 6 à 8 unités logarithmiques par ml), et l'effet d'un traitement d'un même biofilm de Staphylococcus aureus avec seulement un microorganisme non nageur producteur de composés antimicrobiens, la souche Bacillus thuringiensis 407 Mla pHT50 (utilisée ici dans la même gamme de concentration).
La figure 7 est un graphe présentant la réduction log d'un biofilm de Staphylococcus aureus non-traité, ou traité par une souche de bactéries non nageuses Bacillus thuringiensis 407 Mla (BiMIa, témoin négatif), ou par une souche de bactéries nageuses Bacillus thuringiensis 407 (Bt), ou par une souche de bactéries nageuses Bacillus licheniformis LMG7560 (Bl), ou par un mélange des deux souches nageuses Bt et Bl à des concentrations égales, ce prétraitement étant suivi d'un traitement par le biocide chlorure de benzalkonium à une concentration de 750 ppm.
EXPERIMENTATIONS
1- Test d'identification in vitro de microorqanismes nageurs Pour la plupart des biofilms, il est possible de déterminer si un microorganisme est un microorganisme nageur au sens de l'invention, par exemple via un test de mobilité microbienne en agar dont un exemple détaillé est décrit ci-dessous.
Le principe du test consiste à inoculer au centre d'une boite de Pétri remplie de gélose semi-liquide (agar 0.25%) une faible quantité de microorganismes (~106 cellules) et de mesurer après une période d'incubation la taille du disque formé dans la boite de Pétri.
Matériel et méthode
Le test est ici présenté pour une série de Bacillus subtilis et Bacillus thuhngiensis et leurs mutants non mobiles (souches décrites dans le tableau I ci-dessous). La capacité de nage des souches est déterminée sur des boites de Pétri de diamètre 9 cm, remplies de milieu de culture Luria- Bertani (LB, Difco, référence 244620) supplémenté avec 0,25% d'agar.
Six souches différentes sont testées ici, trois souches de nageuses à savoir Bacillus subtilis 168 pWG200 (figure 2A), Bacillus thuringiensis 407 (figure 2B), Bacillus thuringiensis 407 pHT50 (figure 2C), et trois souches non nageuses à savoir Bacillus subtilis 168 Ma pWG200 (figure 2D), Bacillus thuringiensis 407 Ma (figure 2E) et Bacillus thuringiensis 407 Mla pHT50 (figure 2F).
Les souches sont préalablement cultivées en milieu LB (sans addition d'agar) à 37 °C pendant 15h.
Un dépôt de 5μΙ de culture à environ 2.108 UFC/ml est alors réalisé au centre de chaque boite de Pétri, soit environ 106 UFC.
Les boites sont ensuite incubées 24h à 37°C, puis le diamètre du disque microbien obtenu est mesuré à l'aide d'un décimètre.
Résultats et interprétation
Les disques microbiens obtenus sont présentés aux figures 2A à 2F.
Dans ces conditions expérimentales et pour les microorganismes testés, un disque avec un diamètre supérieur à 30 mm indique une forte capacité de déplacement en milieu visqueux (un cercle de 30 mm est représenté en pointillés sur les figures).
Ainsi, on observe que la propagation du tapis microbien pour certaines souches est bien au moins égale à 30mm (figure 2A, 2B et 2C), tandis que pour d'autres souches la propagation du tapis microbien est très inférieure à 30mm (figures 2D, 2E et 2F) dans les conditions du test.
Le test est ici présenté pour des Bacillus, mais il peut aisément être adapté à d'autres microorganismes en jouant sur la nature du milieu de culture, la concentration en agar, le temps et la température d'incubation.
2- Identification de microorqanismes nageurs au sein d'un biofilm de Bacillus thuringiensis
Un biofilm Bacillus thuringiensis a été observé par microscopie confocale à balayage laser. Cette méthode permet de conserver l'intégrité du biofilm, et d'observer d'éventuels changements structuraux et physiologiques dans toutes les dimensions dudit biofilm.
Matériel et méthode
La souche utilisée pour ce protocole est Bacillus thuringiensis, naturellement dotée de capacité de nage et génétiquement marquée avec la GFP (Green Fluorescent Protein) fluorescente. La souche est stockée en cryotubes à -80 °C dans du glycérol 20%. Après deux précultures, la souche est ensemencée au millième dans 1 0 mL de milieu de culture Luria-Bertani (LB, Difco, référence 244620) et incubée à 30 °C 15h sous agitation (180 rpm).
Les biofilms ont été cultivés à 30 °C dans des chambres à flux dédiées FC81 (Biosurface Technologies Corporation, Bozeman, États-Unis). Pour lancer la croissance du biofilm, 2 ml de culture en phase exponentielle diluée à une DO6oo de 0,01 sont injectés dans la chambre à flux. Après une heure d'adhésion, un flux constant de milieu de culture LB à 27ml/h est appliqué dans la chambre à l'aide d'une pompe péristaltique (Watson-Marlow 205S Watson-Marlow Ltd, Falmouth, Angleterre). Le biofilm est ainsi cultivé à 30 °C pendant 48h, à l'issue desquelles les mouvements cellulaires individuels sont observés par Microscopie Confocale Laser à Balayage (Leica SP2 AOBS, plateforme d'imagerie MIMA2). La fluorescence de la GFP est générée sous excitation d'un laser à 488 nm à travers un objectif x63 à immersion et elle est collectée dans la gamme 500-600 nm sur un photomultiplicateur. La nage des cellules est détectée par l'acquisition de séquences d'images dans le temps (une image toutes les 1 ,6s pendant quelques dizaines de secondes). Résultats et interprétation
L'observation de ce biofilm permet de mettre en évidence parmi l'ensemble des bactéries formant ce biofilm, la présence de bactéries mobiles à fort pouvoir de déplacement, ou bactéries nageuses. Ainsi, ces bactéries présentent une vitesse de déplacement d'environ 57000 μιη.η"1, et peuvent se déplacer, de manière aléatoire, à travers tout le biofilm, en le traversant de part en part.
Ces bactéries forment transitoirement des canaux (figure 1 A) et des trous (figure 1 B), macroscopiques, à travers plusieurs couches, et qui ne se referment pas immédiatement.
Ces déplacements sont liés à la force propulsive des flagelles desdites bactéries. En effet, un biofilm de mutants de Bacillus thuringiensis sans flagelles ou à flagelles paralysés, ne présente pas de tels mouvements.
Ces bactéries à très forte mobilité changent de trajectoire dès lors qu'elles rencontrent un obstacle, ce qui laisse présager de leur potentiel à explorer l'ensemble du biofilm.
Sur les figures 1 C et 1 D, on a représenté la trajectoire d'une telle bactérie à fort pouvoir de déplacement dans un biofilm de 48h, sur une période de 80 secondes seulement. Ces représentations illustrent bien le fort potentiel de déplacement de telles bactéries dans un biofilm.
Par ailleurs, on a testé le potentiel de déplacement de ces bactéries Bacillus thuringiensis à fort pouvoir de déplacement dans des biofilms composés d'autres microorganismes. On a ainsi pu constater que ces bactéries gardaient leur capacité de déplacement dans de nombreux biofilms de bactéries Gram-positives {Staphylococcus aureus, Entereococcus faecalis, Listeria monocytogenes etc.) et de bactéries Gram-négatives { Yersinia enteritidis). Cette même capacité de déplacement a été observée entre autre chez Bacillus subtilis. EXEMPLES DE MISE EN ŒUVRE DU PROCEDE SELON
L'INVENTION
1 - Premier exemple : élimination d'un biofilm de Staphylococcus aureus par un cocktail de microorqanismes comportant des bactéries nageuses Bacillus thuringiensis produisant de la lysostaphine Dans cet exemple, on a voulu mettre en évidence l'effet d'une bactérie nageuse productrice d'un composé toxique sur un biofilm indésirable.
Le modèle d'interaction présenté est celui de la dissolution de biofilms de 24h de Staphylococcus aureus RN4220 génétiquement marqué à la GFP fluorescente par des souches mobiles de Bacillus thuringiensis productrices de lysostaphine, une autolysine spécifique de Staphylococcus aureus. La souche Bacillus thuringiensis 407 pHT50 et son mutant non mobile ont été construits pour les besoins de ces expérimentations.
Matériel et méthode
A- Souches et conditions de culture
Les souches de bactéries utilisées dans cette expérimentation sont listées dans le tableau I ci-dessous. Les souches sont conservées à -80 °C dans une solution de glycérol à 20%.
Tableau I : Souches utilisées.
Figure imgf000016_0001
Construction génétique des souches productrices de lysostaphine (Bacillus thuringiensis 407 Mla pHT50 et Bacillus thuringiensis 407 Mla PHT50) : Le gène codant pour la lysostaphine a été amplifié par PCR à partir du plasmide pWG200 (Gaier et al., 1992) en introduisant les sites de restriction Xhol en 5' et Xbal en 3'.
Le promoteur papha3 du gène apha3 a été amplifié par PCR à partir du plasmide pDG783 (Guerout-Fleury et al., 1995) en introduisant les sites de restriction EcoRI en 5' et Xhol en 3'.
Les fragments obtenus ont étés digérés par Xhol et Xbal ou par EcoRI et Xhol et ligaturés dans le plasmide pHT1618 (Lereclus et al., 1992) ouvert par EcoRI et Xbal.
Le plasmide obtenu, résistant à la tétracycline et portant le gène de la lysostaphine sous le contrôle du promoteur papha3, est appelé pHT50. Les souches Bacillus thuringiensis 407 sauvage et Afla (Houry et al., 2010) ont été transformées par électroporation par le plasmide pHT50 et sélectionnées sur boîte de Pétri.
B- Formation des biofilms cibles de Staphylococcus aureus GFP.
Le protocole utilisé pour la formation des biofilms cibles est inspiré de celui décrit dans l'article Bridier et al. 2010.
Une préculture de Staphylococcus aureus RN4220 GFP est réalisée en inoculant 1 cryotube de 1 mL de la souche dans 9 mL de TSB (Biomérieux, réf : 51019), à 37 °C, avec agitation à 180rpm pendant 8h.
La culture est réalisée par inoculation de ~\ 0 μ1 de préculture dans 10 mL de milieu de culture, à 37°C, avec agitation à 180 rpm, pendant 15h.
La concentration bactérienne est alors ajustée à environ
107 cellules/mL en ajustant la densité optique à 600nm de la suspension à 0,01 dans du TSB.
Dans une microplaque de 96 puits (GreinerBioOne, μΰΙβ3Γ, référence 655090) on inocule 250 μΐ de la suspension de Staphylococcus aureus GFP ajustée dans chaque puits et on incube la microplaque pendant 1 h à 37°C pour permettre l'adhésion initiale des cellules.
Les cellules non adhérentes sont alors éliminées par un renouvellement du milieu de culture dans chaque puits par 250 μΐ de TSB stérile. La microplaque est alors incubée à 37°C pendant 24h, ce qui permet la formation de 96 biofilms de Staphylococcus aureus GFP présentant une épaisseur au moins égale à 30 μιη. C- Mise en interaction avec un cocktail de microorganismes comportant Bacillus thuhngiensis.
Une première préculture des deux souches de Bacillus thuhngiensis {Bacillus thuringiensis 407 pHT50, Bacillus thuringiensis 407 Ma pHT50) se fait en inoculant 1 cryotube de 1 ml_ dans 9 mL de milieu LB (Difco, réf : 244620) que l'on incube 15h à 37°C, avec agitation à 180 rpm.
Une seconde préculture est réalisée en mettant 10 μΐ de la première préculture dans 10 mL de milieu de culture, pendant 8h, à 37°C, avec agitation à 180 rpm.
La culture est alors obtenue en inoculant 10 μΐ de la seconde préculture dans 10 mL de milieu de culture à 37°C avec agitation à 180 rpm durant 15h.
La concentration cellulaire des suspensions de Bacillus thuringiensis {Bacillus thuringiensis 407 pHT50, Bacillus thuringiensis 407 Ma pHT50) est ajustée en LB au spectrophotomètre à DO6oonm = 0.02 (soit environ 2.106 cellules/mL).
5 mL des suspensions sont stérilisés par filtration avec des filtres 0,22 μηπ (Syringe Filter Nalgene®, Cat n °190-2520) afin de récolter les surnageants stériles des cultures qui serviront de contrôle ultérieurement.
Sur la microplaque contenant les 96 biofilms de Staphylococcus aureus RN4220 GFP de 24h d'une épaisseur supérieure à 30 μιη, les surnageants de chaque puits sont prélevés délicatement (en prélevant 250 μΐ avec une micropipette).
250 μΐ de suspensions calibrées de Bacillus thuringiensis 407 pHT50 sont ajoutés dans 18 puits.
250 μΐ de suspensions calibrées de surnageants stériles de Bacillus thuringiensis 407 pHT50 sont ajoutés dans 18 autres puits.
250 μΐ de suspensions calibrées de Bacillus thuringiensis 407 Ma pHT50 sont ajoutés dans 18 autres puits. 250 μΙ_ de suspensions calibrées de surnageants stériles de Bacillus thuhngiensis 407 Ma pHT50 sont ajoutés dans 18 autres puits.
Les 24 puits restants sont simplement renouvelés en milieu de culture stérile et servent de contrôle des biofilms cibles sans traitement.
La microplaque est ensuite incubée pendant 1 heure à 37°C pour permettre l'interaction initiale entre les préparations et les biofilms cibles. Un renouvellement du milieu de culture de l'ensemble des puits est alors réalisé avec 250 μΐ de milieu de LB.
Après 24h d'incubation à 37°C sans agitation de la plaque, les biofilms résiduels de Staphylococcus aureus GFP sont analysés à l'aide d'un Microscope Confocale Laser à Balayage (MCLB) selon le protocole décrit par Bridier et al. 2010.
Il est possible de visualiser et de quantifier le biovolume de cellules pathogènes du biofilm résiduel en présence ou non du traitement biologique, et ainsi d'évaluer quantitativement l'efficacité du procédé à éliminer le biofilm cible.
Par exemple, on construit des projections 3D de la structure des biofilms à l'aide de la fonction easy 3D du logiciel Imaris 7.0 (Bitplane, Suisse). Puis, on détermine le biovolume des biofilms cibles résiduels à partir des séries d'images confocales obtenues par l'outil Matlab PHLIP comme décrit dans l'article Bridier et al. 2010.
Interprétation des résultats
Seul les résultats obtenus avec Bacillus thuhngiensis 407 pHT50 sont montrés (figures 3A à 3E et figure 4), mais des résultats similaires sont obtenus avec Bacillus subtilis.
Afin de montrer la stabilité/répétabilité des résultats obtenus, les figures 3A à 3E montrent, pour chaque expérimentation, les résultats obtenus pour trois puits de Staphylococcus aureus.
La figure 4 présente la quantification (biovolume en μιη3) du biofilm résiduel de Staphylococcus aureus en présence ou non d'un cocktail de microorganismes nageurs, produisant ou non un produit antimicrobien.
La figure 3A montre un biofilm de Staphylococcus aureus GFP de 24h. Le biofilm présente une épaisseur de 30 μιη, et une homogénéité visuelle et structurelle dans toutes ses dimensions. Sur la figure 3B, le même biofilm de Staphylococcus aureus GFP de 24h a été soumis à un cocktail de bactéries comportant uniquement des Bacillus thuringiensis 407.
La figure 3C montre que l'on n'observe aucune action sur ce même biofilm de Staphylococcus aureus GFP de 24h d'un filtrat de Bacillus thuringiensis 407 pHT50. Ainsi, la quantité de lysostaphine contenue dans le surnageant du cocktail n'est pas suffisante pour déstructurer le biofilm cible. Il en est de même avec le filtrat de la souche Bacillus thuringiensis 407 Afla pHT50 qui ne présente aucune activité sur le biofilm cible.
De même, l'interaction du biofilm avec un cocktail de bactéries non nageuses produisant la lysostaphine {Bacillus thuringiensis 407 Ma pHT50) n'induit pas d'effet visible sur le biofilm, qui après 24h continue de persister (figure 3E).
L'effet le plus spectaculaire observé est celui obtenu par interaction, toujours de 24h, avec Bacillus thuringiensis 407 pHT50 (figure 3D). La production et la libération de lysostaphine par les bactéries nageuses permet d'éradiquer l'ensemble du biofilm dans un temps court.
Les résultats quantitatifs de la figure 4 confirment clairement les résultats des figures 3A à 3E, à savoir que les bactéries mobiles produisant de la lysostaphine permettent une destruction rapide du biofilm. L'étoile indique une différence de biovolume statistiquement différente de celle du biofilm non traité (P<0.05). Le biovolume du biofilm de Staphylococcus aureus traité par les souches productrices de lysostaphine mobile est environ 6 fois plus faible que le biovolume du biofilm de Staphylococcus aureus traité par les souches productrices de lysostaphine, mais non mobiles, démontrant l'apport de la nage dans le traitement du biofilm cible.
2- Deuxième exemple : élimination d'un biofilm de Staphylococcus aureus par un cocktail de microorqanismes comportant des bactéries nageuses Bacillus thuringiensis ne produisant aucun produit antimicrobien, en association avec un composé antimicrobien exogène : la lysostaphine
Le composé actif peut être un composé antimicrobien (désinfectants chimiques, biomolécules actives) ou un agent dispersant (tensio-actifs, enzymes...). Dans l'exemple qui suit, le composé actif est la lysostaphine, une autolysine spécifique de Staphylococcus aureus dont l'efficacité est améliorée par un pré-traitement des biofilms cibles avec un cocktail de bactéries nageuses non productrices de composé antimicrobien.
Matériel et méthode
Les souches de bactéries utilisées pour ces expérimentations correspondent aux souches de Staphylococcus aureus RN4220 GFP et de
Bacillus thuhngiensis 407 décrites dans le tableau I.
Les biofilms cibles de Staphylococcus aureus RN4220 GFP cultivés en microplaques et les cultures de Bacillus thuhngiensis 407 utilisées sont obtenues selon le protocole décrit précédemment.
Sur une microplaque contenant des biofilms de 24h de
Staphylococcus aureus RN4220 GFP de plus de 30μιη d'épaisseur, on prélève délicatement 250 μΐ de surnageant dans chaque puits. 250μί de milieu de culture (contrôle) ou de suspension de Bacillus thuhngiensis 407 calibrée à 108 cellules/mL sont alors ajoutés dans chaque puits.
Les biofilms de Staphylococcus aureus en présence ou non de bactéries nageuses sont ensuite incubés à 37°C pendant 4h.
Ces biofilms cibles, sensibilisés ou non durant 4h par un cocktail de bactéries nageuses, sont alors traités par ajout dans les puits de 250 μΐ de lysostaphine dans la gamme de concentration 0 à 0,5 μg/ml.
Interprétation des résultats
Le même dispositif expérimental que celui décrit dans la première expérimentation a été utilisé pour quantifier l'efficacité du traitement (comparaison du biovolume résiduel du biofilm cible lors de l'action de la lysostaphine avec ou sans pré-traitement avec un cocktail de bactéries nageuses).
Les résultats présentés à la figure 5 montrent que, lorsque le composé antimicrobien seul ne permet pas l'éradication du biofilm cible (concentration en lysostaphine < 0.5 μg/ml), son efficacité sur le biofilm cible est améliorée par le pré-traitement avec un cocktail de bactéries nageuses (l'étoile indique un effet du prétraitement statistiquement significatif, P<0.05). „„
3- Troisième exemple : élimination d'un biofilm de Staphylococcus aureus par un cocktail de bactéries comportant des bactéries nageuses Bacillus thuringiensis ne produisant aucun produit antimicrobien, en association avec un microorganisme non nageur producteur de composés antimicrobiens
D'une manière générale, le protocole décrit ici permet de mettre en évidence l'effet sur un biofilm indésirable, d'un microorganisme nageur (non producteur de composés antimicrobiens) en association avec un (ou plusieurs) microorganismes non nageurs mais producteur de composé(s) antimicrobien(s).
Le microorganisme non doté de capacité de nage peut produire des bactériocines (exemple : Lactococcus lactis producteur de nisin), des acides (bactéries lactiques), d'autres biomolécules actives.... L'exemple d'interaction présenté est celui de la dissolution de biofilms de 24h de Staphylococcus aureus RN4220 GFP par des souches mobiles de Bacillus thuringiensis en association avec des souches non nageuses productrices de lysostaphine. Matériel et méthode
Les souches de microorganismes utilisés pour ces expérimentations correspondent aux souches de bactéries Staphylococcus aureus RN4220 GFP, de Bacillus thuringiensis 407 (bactéries nageuses) et Bacillus thuringiensis 407 Ma pHT50 (bactéries non nageuses productrices de composés antimicrobiens) décrites dans le tableau I.
Les biofilms cibles de Staphylococcus aureus RN4220 GFP cultivés en microplaques et les cultures de Bacillus thuringiensis 407 et Bacillus thuringiensis 407 Ma pHT50 utilisées sont obtenus selon les protocoles décrits précédemment.
Sur la microplaque contenant les biofilms de 24h de Staphylococcus aureus RN4220 GFP de plus de 30μιη d'épaisseur, on prélève délicatement 250 μΐ de surnageant dans chaque puits.
250 μΐ de milieu de culture (contrôle, indiqué « Sans Bt Mla » à la figure 6) ou de suspension de Bacillus thuringiensis 407 calibrée à 108 cellules/mL sont alors ajoutés dans chaque puits. Les biofilms de Staphylococcus aureus en présence ou non de bactéries nageuses sont alors incubés à 37°C pendant 4h.
Ces biofilms cibles, sensibilisés ou non par un cocktail de bactéries nageuses, sont ensuite mis en contact avec 250 μΙ_ d'une suspension contenant 6, 7 ou 8 log/ml de bactéries non mobiles produisant un agent antimicrobien spécifique, la lysostaphine (souche Bacillus thuringiensis 407 Afla pHT50 indiquée « Bt Afla Lys 6 log », « Bt Afla Lys 7 log », ou « Bt Ma Lys 8 log » à la figure 6).
Après une heure d'interaction, le surnageant des biofilms est remplacé par 250 μΙ_ de milieu de culture stérile, et les biofilms incubés à 37°C pendant 15h.
Comme précédemment, les biofilms résiduels du pathogène cible sont alors quantifiés par calcul du biovolume à partir de séries d'images obtenues en MCLB.
Interprétation des résultats
Le même dispositif expérimental que celui décrit dans la première expérimentation a été utilisé pour quantifier l'efficacité du traitement (comparaison du biovolume résiduel du biofilm cible lors de l'action du cocktail de microorganismes non nageurs produisant de la lysostaphine, avec ou sans pré-traitement avec un cocktail de microorganismes nageurs).
Les résultats présentés à la figure 6 montrent que, lorsque le biofilm cible n'est pas éradiqué par le cocktail de bactéries non nageuses mais produisant de la lysostaphine (concentration < 8 log/ml de Bacillus thuringiensis 407 Afla pHT50), le prétraitement du biofilm par un cocktail de bactéries nageuses a permis d'améliorer l'efficacité du traitement (l'étoile indique un effet significatif du prétraitement sur la déconstruction du biofilm cible, P<0,05).
4- Quatrième exemple : élimination d'un biofilm de Staphylococcus aureus par un cocktail de microorqanismes comportant des bactéries nageuses Bacillus thuringiensis ne produisant aucun produit antimicrobien et des bactéries nageuses Bacillus licheniformis ne produisant aucun produit antimicrobien, en association avec un composé antimicrobien exogène : le chlorure de benzalkonium Dans l'exemple qui suit, le composé actif est le chlorure de benzaikonium, un biocide fréquemment utilisés dans les hôpitaux et les sites industriels.
Deux souches de bactéries nageuses différentes sont utilisées.
- la souche de bactéries nageuses Bacillus thuhngiensis 407 {Bt), ainsi que la souche non nageuse mutante correspondante 407Afla {Bt àfla, contrôle négatif) décrites dans le tableau 1 ci-dessus. Ces bactéries présentent un diamètre d'environ 1 ,5 μιη.
- la souche de bactéries nageuses Bacillus licheniformis LMG7560 (désignée par le code Bl) (disponible dans la collection www.belspo.be/bcm), présentant un diamètre plus faible, inférieur à 1 μιη, et une capacité de nage estimée par microscopie environ deux fois plus rapide que la souche de Bacillus thuhngiensis 407. Matériel et méthodes
Les biofilms cibles de Staphylococcus aureus RN4220 GFP cultivés en microplaques et les cultures des bacilli utilisés sont obtenus selon le protocole décrit précédemment pour Bacillus thuhngiensis 407.
Sur une microplaque contenant des biofilms de 24h de Staphylococcus aureus RN4220 GFP de plus de 30μιη d'épaisseur, on prélève délicatement 250 μΐ de surnageant dans chaque puits. 250 μΐ de milieu de culture (contrôle) ou de suspension de :
- Bt
- BtAfla
- Bl
- ou Bt + Bl à des concentrations égales,
calibrée à 108 cellules/mL sont alors ajoutés dans chaque puits.
Les biofilms de Staphylococcus aureus en présence ou non de bactéries sont ensuite incubés à 37°C pendant 4h pour permettre l'infiltration des bactéries nageuses. Les surnageants sont éliminés avant la mise en contact avec le biocide.
Ces biofilms cibles sont alors traités par ajout dans les puits de 200 μΐ de chlorure de benzaikonium C14 (BAC, Fluka, Buchs, Suisse) à une concentration de 750 ppm, ou de 200 μΙ de chlorure de sodium (NaCI) 150 M (biofilm « non traité ». Après 5 minutes de contact à 20 °C, 200 μΙ d'une solution neutralisante (3 g/1 L- -phosphatidylcholine, 30 g/1 Tween 80, 5 g/1 thiosulfate de sodium, 1 g/l L-histidine, 30 g/l saponine) sont ajoutés dans les puits pour bloquer l'activité du biocide.
Les biofilms sont alors mécaniquement désagrégés à l'aide d'un cône de micropipette et la suspension collectée immédiatement dispersée dans 5 ml de solution neutralisante.
Les bactéries S. aureus survivantes sont dénombrées sur de l'agar TSA après dilutions sériées dans du NaCI 150 mM et incubation pendant 24 h à 37 °C.
Les réductions Iog10 des bactéries S. aureus sont calculées en comparant le rapport de survivants dans les biofilms désinfectés avec la population de biofilms non-traités.
Interprétation des résultats
Les témoins négatifs, c'est-à-dire ayant subi le traitement au moyen de la souche non nageuse BtMa, ou n'ayant subi aucun traitement par le chlorure de benzalkonium, ont donné des résultats comparables.
La figure 7 montre les résultats obtenus, en termes de réduction log des biofilms. Sur cette figure, les barres représentent les erreurs standards à partir de 16 valeurs obtenues dans 5 expérimentations indépendantes.
On y observe que la réduction log des biofilms augmente significativement lorsque le traitement par le chlorure de benzalkonium a été précédé d'un traitement par les bactéries nageuses, qu'il s'agisse de la souche de Bacillus thuringiensis {Bf) ou de la souche de Bacillus licheniformis {Bl).
On observe par ailleurs que le pré-traitement par un cocktail de microorganismes comportant ces deux souches {Bt + BI) a provoqué une réduction plus importante du biofilm que chacune de ces souches mise en œuvre séparément.
5- Cinquième exemple : élimination d'un biofilm de Staphylococcus aureus par un cocktail de microorqanismes comportant des bactéries nageuses Bacillus thuringiensis ne produisant aucun produit antimicrobien et des bactéries nageuses Bacillus licheniformis ne produisant aucun produit antimicrobien, de deux souches différentes, en association avec un composé antimicrobien exogène : le chlorure de benzalkonium
L'expérimentation de l'Exemple 4 ci-dessus a été reproduite en utilisant deux souches différentes de Bacillus licheniformis : la souche LMG 7560, décrite ci-dessus, désignée dans cet exemple par le code BI1, et la souche également nageuse LMG 7559, désignée par BI2 (également disponible dans la collection www.belspo.be/bcm).
Ces deux souches ont été testées isolément, ainsi qu'en mélange, et en mélange chacune avec la souche de Bacillus thuhngiensis 407 {Bf). Un mélange de ces trois souches nageuses {Bt + BI1 + BI2) a également été testé.
Les résultats, en termes de réduction log des biofilms, sont montrés dans le Tableau 2 ci-après.
Figure imgf000026_0001
Tableau 2 - Effet sur l'élimination du biofilm du mélange de plusieurs souches nageuses de propriétés différentes
Comme dans l'exemple précédent, on observe de ces résultats que le mélange de deux souches nageuses de propriétés différentes, dont une souche de bactéries de plus grand diamètre {Bt) et une souche de bactéries de plus grande vitesse de déplacement dans le biofilm {BI1 et/ou BI2) présentent, en combinaison avec le chlorure de benzalkonium, une efficacité bien plus importante que chacune de ces souches isolément. BIBLIOGRAPHIE
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Claims

REVENDICATIONS
1 - Procédé d'élimination d'un biofilm de microorganismes préexistant sur une surface inerte, caractérisé en ce que :
- on soumet ledit biofilm à un cocktail de microorganismes comportant au moins une population de microorganismes dits « nageurs >> dont l'énergie cinétique est telle qu'ils sont aptes à traverser ledit biofilm dans le plan et dans l'épaisseur, et
- on soumet ledit biofilm à au moins un produit antimicrobien dirigé contre au moins un microorganisme du biofilm à éliminer.
2- Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce qu'on utilise dans le cocktail de microorganismes des souches nageuses aptes à synthétiser au moins un produit antimicrobien dirigé contre au moins un microorganisme du biofilm à éliminer.
3- Procédé selon l'une des revendications 1 et/ou 2, caractérisé en ce que le cocktail de microorganismes utilisé comporte en outre des souches dites « non nageuses >> aptes à synthétiser au moins un produit antimicrobien dirigé contre au moins un microorganisme du biofilm à éliminer.
4- Procédé selon l'une des revendications 1 et/ou 2, caractérisé en ce qu'on soumet le biofilm, préalablement traité par le cocktail de microorganismes, à un second cocktail de microorganismes comportant au moins des souches dites « non nageuses >> aptes à synthétiser au moins un produit antimicrobien dirigé contre au moins un microorganisme du biofilm à éliminer.
5- Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le cocktail de microorganismes utilisé comporte en outre au moins un antimicrobien dirigé contre au moins un microorganisme du biofilm à éliminer.
6- Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'on soumet le biofilm, préalablement traité par le cocktail de microorganismes, à au moins un antimicrobien biologique ou chimique dirigé contre au moins un microorganisme du biofilm à éliminer.
7- Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que les microorganismes nageurs du cocktail de microorganismes utilisé sont choisis parmi les bactéries Bacillus thuringiensis, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Serpens flexibilis.
8- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le cocktail de microorganismes comporte au moins une première souche de microorganismes nageurs de plus grande taille et de plus faible vitesse de déplacement dans ledit biofilm, et une deuxième souche de microorganismes nageurs de plus petite taille et de plus grande vitesse de déplacement dans ledit biofilm.
9- Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le rapport de la taille des microorganismes nageurs de la première souche, sur la taille des microorganismes nageurs de la deuxième souche, est supérieur ou égal à 1 ,5.
10- Procédé selon l'une des revendications 8 à 9, caractérisé en ce que le rapport de la vitesse de déplacement dans ledit biofilm des microorganismes nageurs de la deuxième souche, sur la vitesse de déplacement dans ledit biofilm des microorganismes nageurs de la première souche, est supérieur ou égal à 1 ,5.
1 1 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, caractérisé en ce que la première souche appartient à l'espèce Bacillus thuringiensis et la deuxième souche appartient à l'espèce Bacillus licheniformis.
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