DISPOSITIF DE CONTROLE ET DE REGULATION DE LA PRESSION PARTIELLE EN OXYGENE ET SON UTILISATION DANS DES ESSAIS IN VITRO PERMETTANT DE RESPECTER LA « PHYSIOXIE » L'invention a pour objet un dispositif de contrôle et de régulation de la pression partielle en oxygène et son utilisation dans des essais in vitro. Un tissu est composé d'un ensemble de cellules qui interagissent les unes avec les autres pour construire un microenvironnement qui reflète l'état physiologique. L'alimentation en oxygène des tissus par la circulation sanguine ainsi que sa diffusion dans les tissus situés sous la paroi des vaisseaux sont des éléments clés des interactions cellulaires. A partir des quantités d'oxygène délivré et de la consommation d'oxygène, on obtient la pression partielle en oxygène qui est une propriété caractéristique du milieu qui contrôle les réactions cellulaires. De façon remarquable, la pression partielle en oxygène physiologique qui varie considérablement d'un tissu ou organe à un autre est comprise entre 1% et 13%, alors que la pression partielle en oxygène de l'air est de 20%. Les présents inventeurs ont montré l'effet drastique de la pression partielle en oxygène sur les tissus et la physiologie des organes ainsi que sur la modulation des cytokines et chimiokines envers l'activité des médicaments utilisés spécialement pour la thérapie anticancéreuse aussi bien dans des conditions normales que pathologiques. Après avoir revu la littérature et avoir accumulé un grand nombre de données les présents inventeurs sont arrivés à la conclusion que la plupart des expériences conduites avec des cellules en milieu appelé «normoxie », c'est-à-dire en utilisant une pression partielle en oxygène correspondant à celle de l'air ambiant soit 20%, sont fausses ou peuvent conduire à des méprises. De nombreuses données doivent être revues car pour être représentatives des conditions in vivo, les expériences devraient être refaites à une pression partielle en oxygène inférieure correspondant à la pression partielle en oxygène réelle des tissus sur lesquels elles ont été réalisées. Ces données conduisent les chercheurs à modifier les approches et conditions expérimentales biologiques qui étaient classiquement utilisées en vue des applications biotechnologiques. Compte tenu de ces constatations, de nombreuses sociétés ont mis en place des incubateurs et des systèmes expérimentaux complexes pour restaurer et contrôler la pression partielle en oxygène.
Il existe des incubateurs permettant, à l'aide de systèmes complexes, de contrôler la pression partielle en oxygène de l'atmosphère régnant dans l'incubateur. Cependant, à ce jour, à la connaissance des inventeurs, il n'existe pas de système permettant de contrôler et de régler avec précision la pression partielle en oxygène, séparément, dans chacun des récipients de culture et dans le milieu de culture lui-même. Compte tenu de l'importance de la pression partielle en oxygène dans la physiologie cellulaire, notamment dans la physiologie des cellules cancéreuses, il était urgent de mettre à disposition des dispositifs individuels, simples et efficaces permettant le contrôle et la régulation de la pression partielle en oxygène des milieux cultivés in vitro, afin d'obtenir des résultats d'essais in vitro fiables et véritablement représentatifs des conditions in vivo. Ainsi les essais in vitro peuvent être réalisés dans ce que l'on peut appeler les conditions de « physioxie ». Les présents inventeurs ont mis au point un dispositif de construction et d'utilisation simples, permettant la mesure et la régulation de la pression partielle en oxygène dans un milieu de culture tissulaire in vitro pendant de longues périodes de temps. Ce dispositif individuel fait l'objet de la présente invention. Ce dispositif est dit « individuel » car il s'adapte à chaque milieu de culture c'est-à-dire à chaque récipient de mise en culture et non pas à la globalité de la chambre d'incubation dans laquelle sont renfermés différents récipients de culture.
Ainsi, la présente invention porte sur un dispositif individuel permettant de modifier les conditions de composition de l'atmosphère gazeuse dans laquelle se trouve la culture cellulaire, et permettant le contrôle et la régulation de la pression partielle en oxygène d'un milieu de culture, ledit dispositif comprenant : - un capteur de pression partielle en oxygène destiné à être placé au voisinage ou au contact du milieu de culture, ledit capteur étant relié à des moyens de mesure de ladite pression ; - des moyens de contrôle et de régulation de ladite pression partielle en oxygène. Le milieu de culture est un milieu de culture classiquement utilisé en biotechnologie, qui permet la culture de cellules ou tissus de mammifères, en particulier d'humains. Ce milieu est une couche liquide contenant ou recouvrant les cellules et disposé sur le fond du récipient de culture. Ce milieu contient tous les éléments nutritifs nécessaires au développement des cellules cultivées qui sont ensemencées sur celui-ci. Le dispositif selon l'invention permet de mesurer et de réguler la pression partielle de ce milieu, de telle sorte que cette pression partielle en oxygène soit la plus proche possible de la pression partielle en oxygène physiologique des tissus ou cellules cultivés. Selon un mode de réalisation particulier le dispositif selon l'invention comprend en outre un capteur de température couplé audit capteur de pression partielle en oxygène, et des moyens de connexion dudit capteur de température à un appareil de mesure de la température. La dissolution de l'oxygène dans les milieux dépend notamment de la température de celui-ci. Les cultures se font classiquement dans des enceintes isothermes. Cependant, les réactions qui se produisent lors de la culture cellulaire ou tissulaire peuvent être endothermiques ou exothermiques. In vivo, des systèmes de régulation permettent de pallier à ces variations de température. La présence de ce capteur de température couplé au capteur de pression partielle en oxygène, va permettre une régulation précise et continue de la température du milieu de culture. Dans le dispositif selon l'invention, les moyens de régulation de ladite pression partielle en oxygène comprennent au moins un élément tubulaire. En utilisation, l'une des extrémités de cet élément tubulaire débouche dans le récipient de culture et l'autre extrémité est reliée à une alimentation en gaz. Les gaz d'alimentation sont des mélanges riches en oxygène et dépourvus d'oxygène mais non toxiques pour les cultures. De façon générale, on utilise des mélanges air/N2 et CO2/N2. La régulation de la pression partielle en oxygène est réalisée par ajustement de l'alimentation en mélange gazeux air/CO2 pour augmenter la pression partielle en 02 ou en N2 /CO2 pour diminuer la pression partielle en 02. Le dispositif est doté de moyen d' ouverture/fermeture de l'alimentation gazeuse. De façon particulière, ce moyen d'ouverture/fermeture est placé sur l'élément tubulaire du côté de l'extrémité reliée à l'alimentation en gaz et est constitué par une vanne à trois voies. Quand le capteur de pression partielle en 02 indique une valeur inférieure à la pression partielle en 02 consigne, l'ouverture de l'alimentation en air/CO2 est activée. Quand le capteur de pression partielle en 02 indique une valeur supérieure à la pression partielle en 02 consigne, c'est alors l'ouverture de l'alimentation en N2/CO2 qui est activée. Quand la pression partielle en 02 est à la valeur consigne demandée, la vanne d'alimentation est fermée. Le capteur de pression partielle en oxygène est relié à un appareil de mesure et de régulation de la pression partielle en oxygène. La régulation de la pression partielle est réalisée de façon automatique en utilisant un logiciel permettant de respecter une valeur consigne par ouverture ou fermeture des vannes d'alimentation en gaz riche en oxygène ou dépourvu d'oxygène, après analyse de la valeur de pression partielle en oxygène reçue par le capteur.
Le capteur de température est relié à un appareil de mesure et de régulation de la température, de telle sorte qu'en utilisation, le milieu de culture soit maintenu à une température constante donnée comme valeur consigne au système de régulation. La régulation de la température peut elle aussi être automatisée. Le dispositif individuel de contrôle et de régulation de la pression partielle en oxygène selon l'invention est incorporé au récipient renfermant le milieu de culture, en particulier au système de fermeture dudit récipient. Selon un mode de réalisation permettant une adaptation simple à tous les récipients de culture existants dans le commerce, le dispositif individuel selon l'invention se présente sous la forme d'un bouchon de récipient de culture.
Selon ce mode de réalisation particulier, ledit bouchon présente une face supérieure et une face inférieure et comprend : au moins un trou traversant débouchant d'une part sur la face inférieure et d'autre part sur la face supérieure ; un élément tubulaire inséré de façon étanche dans ledit trou traversant, ledit élément tubulaire étant destiné à être connecté à l'une de ses extrémités à un dispositif d'alimentation en gaz ; un capteur de pression partielle en oxygène fixé à l'autre extrémité dudit élément tubulaire; un moyen d'ouverture et fermeture de l'élément tubulaire placé sur celui-ci du côté de l'extrémité de connexion à l'alimentation en gaz ; des moyens de connexion dudit capteur à un appareil de mesure de la pression partielle en oxygène. Selon un autre mode de réalisation du dispositif sous forme de bouchon, ledit bouchon présente une face supérieure et une face inférieure et comprend deux trous traversant, chacun débouchant d'une part sur la face inférieure et d'autre part sur la face supérieure ; un élément tubulaire inséré de façon étanche dans ledit trou traversant, ledit élément tubulaire étant destiné à être connecté à l'une de ses extrémités à un dispositif d'alimentation en gaz ; un capteur de pression partielle en oxygène fixé à l'autre extrémité dudit élément tubulaire; un moyen d'ouverture et fermeture de l'élément tubulaire placé sur celui-ci du côté de l'extrémité de connexion à l'alimentation en gaz ; des moyens de connexion dudit capteur à un appareil de mesure de la pression partielle en oxygène. Le dispositif comprenant deux capteurs de pression partielle en oxygène permet à la fois de mesurer la pression partielle en oxygène du milieu de culture et de l'atmosphère environnant. Lors de l'utilisation, un capteur de pression partielle en oxygène est directement placé dans le milieu de culture lui-même et l'autre est placé dans le récipient de culture fermé juste au dessus du milieu de culture. Dans un mode de réalisation avantageux, au moins un capteur est situé à une distance du bouchon telle qu'en utilisation, c'est-à-dire lorsque le bouchon est placé sur un récipient de culture, il est en contact avec le milieu de culture présent dans ledit récipient. Ainsi, dans ce mode de réalisation, c'est la pression partielle en oxygène du milieu lui-même, et éventuellement sa température, qui est contrôlée et qui peut être régulée. Dans le dispositif selon l'invention, les moyens de connexion dudit capteur à un appareil de mesure de la pression partielle en oxygène sont disposés dans ledit élément tubulaire. Lorsqu'un capteur de température est présent, les moyens de connexion de ce dernier à un appareil de mesure de la température sont également disposés dans l'élément tubulaire. Ainsi, l'étanchéité ne doit être assurée qu'entre l'élément tubulaire et le reste du dispositif, en particulier entre l'élément tubulaire et le trou traversant du bouchon. Lors de l'utilisation du dispositif selon l'invention, au moins un capteur est placé de façon à être en contact avec le milieu de culture présent. Le dispositif selon l'invention va être décrit plus avant en lien avec les dessins annexés sur lesquels : La figure 1 est un schéma illustrant un mode de réalisation du dispositif selon l'invention, mis en place sur un flacon de culture tissulaire ; La figure 2 est un graphe représentant la pression partielle en oxygène mesurée dans le milieu et dans l'atmosphère de culture en fonction du temps, telle que régulée par un dispositif selon l'invention mis en oeuvre dans l'exemple 1 ci-dessous. Sur la figure 1 on voit un dispositif individuel 1 selon l'invention sous la forme d'un bouchon 2 placé sur un récipient de culture 3. Ledit bouchon d'étanchéité 2 est percé de deux trous 4 et 5 traversant. Par chacun des trous traversant est inséré un élément tubulaire 6 et 7 permettant une alimentation en gaz et le passage des éléments de connexion 6a, 6b et 7a, 7b à un capteur de température 8, 9 et capteur d'oxygène 10, 11, lesdits capteurs étant fixés à l'extrémité placée à l'intérieur du flacon. Un des couples de capteurs 8,9 est placé dans le milieu de culture 12, l'autre couple de capteurs 10, 11 étant placé dans l'atmosphère recouvrant le milieu de culture 12. L'autre extrémité est connectée à un appareil de mesure Oxy Lite et de régulation de type Biospherix (non représenté). L'invention porte également sur l'utilisation d'un dispositif décrit 10 précédemment pour la culture in vitro, à une pression partielle en oxygène prédéterminée et inférieure à la pression partielle en oxygène de l'air. Elle porte également sur une méthode de culture cellulaire ou tissulaire in vitro en physioxie. On entend par "physioxie" la pression partielle en oxygène à laquelle est soumise la cellule ou le tissu cultivé lorsqu'elle (il) se trouve dans l'organisme vivant. A 15 titre d'exemple, on peut indiquer que la physioxie pour les poumons est de l'ordre de 11 %, dans les tissus musculaires de 7 %, entre le derme et d'épiderme elle n'est que de 1 à 2 % et entre 2,5 et 5 % pour les autres tissus. Ainsi cette méthode comprend : a/ le choix d'un tissu ou type de cellules à cultiver in vitro ; 20 b/ la détermination de la valeur de la pression partielle en oxygène de ce tissu ou type de cellules in vivo ; c/ la connexion dudit dispositif selon l'invention placé sur un récipient de culture contenant un milieu de culture à un système d'alimentation en gaz et de contrôle et régulation de la pression partielle en oxygène ; 25 d/ l'application de la pression partielle en oxygène, déterminée en b/ comme valeur consigne par le système de régulation ; e/ la stabilisation de cette valeur consigne ; et f/ l'introduction des cellules ou tissus devant être cultivés tout en maintenant la valeur consigne de la pression partielle en oxygène. 30 Cette méthode peut être appliquée également en imposant une valeur de température consigne pour le milieu de culture. Le dispositif et la méthode conformes à l'invention sont particulièrement importants pour l'étude des événements de l'angiogénèse, notamment tumorale, qui est déclenchée par l'atmosphère hypoxique des tumeurs. L'invention permet l'étude des interactions cellulaires, l'évaluation des produits médicaments pro ou anti angiogènes. Il s'agit d'introduire après équilibrage de la substance dans le milieu de culture mis en conditions d'atmosphère contrôlée, les substances à tester, ou les cellules en vue des études d'interaction dans les conditions de physioxie.
La présente invention est illustrée de façon non limitative par les exemples suivants. Exemple 1 : On utilise le dispositif représenté sur la figure 1. Le milieu de culture utilisé est un milieu de culture de lymphocytes RPMI1640 (Gibco) complété par du sérum bovin foetal (10% v/v) et de la pénicilline et de la streptomycine (Gibco) en tant que compléments antibiotiques. L'un des couples capteurs est placé dans le milieu de culture et l'autre dans l'atmosphère au-dessus du milieu de culture. La température est mesurée en continu et maintenue à une valeur de 37°C et la pression partielle en oxygène est elle aussi mesurée en continu au niveau du milieu de culture et dans l'atmosphère. Les valeurs obtenues sont reportées sur le graphe de la figure 2. Ce graphe représente la valeur de la pression partielle en oxygène au cours du temps pour le milieu de culture (traits pleins) et pour l'atmosphère régnant au-dessus du milieu de culture (traits pointillés). On voit que l'équilibre entre l'atmosphère et le milieu est atteint en environ 12h (point A) et que cet équilibre est maintenu pendant au moins 16 heures, c'est-à-dire jusqu'au temps 28h.