FR2733055A1 - Nouveau dispositif d'etude de cultures organotypiques et ses applications en electrophysiologie - Google Patents

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Abstract

La présente invention se rapporte au domaine de la biochimie et aux dispositifs de mesure dans ce domaine. Elle a plus particulièrement pour objet un nouveau dispositif qui permet de maintenir en vie des explants tissulaires et de recueillir et d'analyser en continu l'activité électrophysiologique et biochimique du tissu étudié. Ce dispositif est formé de deux demi-cartes formant respectivement la partie supérieure et la partie inférieure de l'interface qui s'assemble pour former une carte destinée à être insérée dans un boîtier électronique spécialement conçu à cet effet. Application du dispositif à la mesure de l'activité électrophysiologique des cellules excitables à l'aide d'une ou plusieurs sondes de microdialyse.

Description

NOUVEAU DISPOSITIF DE MESURES ELETCROPHYSIOLOGIQUES
ET BIOCHIMIQUES DE CULTURES TISSULAIRES
La pressente invention se rapporte au domaine de la biochimie et aux dispositifs de mesure dans ce domaine.
La présente invention se rapporte à un rlouveau dispositif qui permet de maintenir en vie des explants tissulaires (ou cultures organotypiques). ct err outre, de recueillir et d'analyser, en continu, l'activité électrophysiologique et biochimique du tissu étudié.
L'invention se rapporte plus précisément à la fabrication d'une interface entre le milieu biologiquc et un boîtier électronique approprie. L'ensemble du système permet d'étudier les phénomènes électriques qui se produisent dans des cultures de tissu excitables et notamment dans des cultures de tissus cérébraux au cours de la culture, de la régénération ou de la différenciation des cellules.
L'interface biologiqueSélectroslique a spécifiquement pour objet un dispositif d'étude formé de deux demi-cartes formant respectivement le partie supérieure et la partie inférieure de l'interface.
Une membrane perméable et transparente est disposée sur la partie inférieure du dispositif. Sur celle-ci, repose une tranche de tissu que l'on peut perfuser d'une manière continue ou discontinue par un liquide nutritif.
Les deux demi-cartes s'assemblent pour former une carte qui peut être insérée dans un boîtier électronique spécialement conçu à cet effet.
Cette carte peut el.re perfusée stérilement soit avec un milieu de culture de contrôle (témoin), soit avec un milieu de culture sélectionné contenant les substances que l'on veut tester ou les médiateurs dont on veut déterminer les effets sur la préparation. La composition du milieu de culture est définie d'une manière plus précise dans la partie expérimentale.
On connaissait déjà un dispositif décrit par L.Stoppini
(Stoppini et ai. Journal of Neuroscience Méthode 37 (1991) 173), dans lequel des tranches de Lissu nerveux d'hippocampe de rat étaient maintenues en culLure à l'interface entre l'air et un milieu de culture. Les tranches placées sur une membrane stérile, transparente et poreuse étaient maintenues dans une boîte de Pétri disposée dans uxi incubateur. Des études histologiques et électrophysiologiques ont permis de montrer que cette Lechniciue permettait de maintenir en vie des explants et de garder une organisation tissulaire proche de celle que l'on peut trouver # in vivo .
L'objectif de la présente invention est de permettre la survie de cultures organotypiques en dehors d'un incubateur et de pouvoir eLfectuer sur ces cultures, des stimulations électriques et des enregistrements électrophysiologiques en continu, pendant: plusieurs jours jusqu'à plusieurs semaines.
A cette fin, le dispositit selon l'invention permet de mettre en contact un réseau d'électrodes biocompatibles
(plaquage or 18 carats) à la surface ou à l'intérieur du tissu étudié.
La partie inférieure de ld carte est en matériau plastique et comporte unc cavité présentant une entrée et une sortie.
La cavité est délimitée par une membrane perméable et transparente. La coupe de tissu (200-400 m) réalisée par un chopper ou un vibratome est déposée sur la membrane. Le milieu de culture traverse la membrane par capillarité et vient recouvrir le tissu d'un film de liquide. Ce montage est efficace pour assurer urit: bonne survie des cellules pendant plusieurs semaines en apportant les nutriments nécessaires et en facilitant la diffusion de 1'oxygène et du dioxyde de carbone dans touLe l'épaisseur de la tranche de tissu.
L'entrée et la sortie des liquides de la partie inférieure de la carte sont chacune obturées par un septum de qualité médicale, ce qui permet de conserver le contenu liquide de la chambre inférieure, ou de le remplacer commodément en une fois ou en continu, d'une manière stérile, sans être amené à procéder à cette opération sous atmosphère stérile ou sous flux laminaire.
La partie supérieure de la carte se fixe, à laide de clips, sur la partie inférieure. La partie supérieure de la carte est composée d'un élément en matière plastique et d'un circuit imprimé souple qui forme un faisceau d'électrodes reliées à des connecteurs.
L 'élément en plastique comporte un puits contenant une douille mobile qui peut descendre progressivement lorsque l'on visse un capuchon sur le puits. La progression vers le bas de la douille, en appuyant sur le. circuit imprimé souple, permet un positionnement vertical des électrodes à la surface ou à l'intérieur du tissu. Par ce procédé, aucun mouvement de torsion n'est exercé sur le circuit imprimé souple et on évite ainsi de léser le tissu biologique.
La présence d'un joint souple ou rigide entre les deux demicartes assure l'étanchéité de la chambre gazeuse de la demicarte supérieure du disposit,if. Cette chambre est humidifiée en continu par évaporation a travers la membrane du milieu contenu dans la cavité prévue pour contenir le liquide de la demi-carte inférieure. On peut aussi ajouter lorsque cela est nécessaire, un papier Liltre mouillé sur une portion de la douille
L'observation du tissu peut: sc faire par examen visuel, par transparence, aussi bien de la face supérieure que de la face inférieure de la carte.
Les explant tissulaires qui sont placés dans le dispositif peuvent être maintenus en vie pendant plusieurs semaines à l'extérieur d'un incubateur et sont ainsi suivis, en même temps, sous surveillance visuelle et sous contrôle électrophysiologique.
Les explants tissulaires peuvent être mis en culture soit directement dans la carte, soit peuvent êtrc dans un premier temps, cultivés dais un incubateur sur des pastilles de membrane, placés dans des boutes de pétri. Les tranches de tissu cultivées sur les pastilles de membrane peuvent être ensuite placées sur la membrane de la carte. Les explants tissulaires survivent de cette façon malgré la superposition de deux couches de membrane.
La survie des tissus étudiés a été mise en évidence par des marquages à laides de colorants vitaux sur le tissu vivant et par des études histologiques en microscopie optique, électronique et immunohistochimiques, après la fixation des tissus.
La survie des tissus étudiés a été notamment mise en évidence après marquage par des colorants vitaux en mesurant le taux de lactate deshydrogénase (LDH) dans le milieu de culture. En outre, l'immuno-histochimie renseigne sur la remise en tonctionrlement des neurones et des cellules gliales effectuant le marquage des neurofilaments pour les neurones et le merquage de la glial fibrillary acidic protein (GFAF) pour les cellules gliales.
Les enregistrements électrophysiologiques permettent de déterminer immédiatement, en fonction des réponses obtenues, l'état physiologique du tissu excitable étudié.
La mesure de l'activité du tissu comporte l'enregistrement, la numérisation et la mesure des réponses électrophysiologiques spontanées et des réponses évoquées.
Le boîtier électronique est composé de la façon suivante # la carte interface biologique/électronique s'enfiche dans
un boîtier électronique dont les fonctions sont les
suivantes
Chaque électrode de l'interface peut être dédiée soit
# à la stimulation positive (Stim-) ou à la stimulation
négative (Stim-)
# à l'enregistrement (Enreg.)
à la masse
Descriptif de ses trois fonctions e Stimulation
Stim+, Stim- l ordre de stimulation et de déclenchement (trigger) est donné soit par l'ordinateur, soit par un stimulateur externe Toutes les électrodes de stimulation sont isolées électriquement par optocouplage.Elles ont aussi un gain variable et peuvent être permutées.
Enregistrement
Après adaptation de l'impédance, la conversion en AC, l'amplification 3'un facteur 10C, et un offset réglable, le choix du canal d'acquisition pour la carte analogique/numérique est possilble.
. Mise à la masse
A titre d'application du dispositif selon l'invention, on va donner ci-aprés le détail des mesures biochimiques, l'adaptation de la tecInique de microdialyse au dispositif selon l'invention
En parallèle à la mesure de l'activité électrophysiologique, des analyses biochimiques du milieu extra cellulaire peuvent être effectuées en continu à laide d'une ou plusieurs sondes de microdialyse
La sonde de microdialyse est destinée a être mise en place, soit au niveau de la membrane située à la partie inférieure de la carte -le tissu est alors déposé sur la sonde soit en étant fixée sur le circuit imprime. Dans ce dernier cas, le positionnement vertical de la sonde, par rapport au tissu, s'effectue de la même façon que pour les électrodes.
La sonde est perfusée erl continu par l'intermédiaire d'une seringue mutile d'un piston à progression automatique.
Le dialysat recueilli à partir de la sonde est soumis a une analyse soit par CHLP, par injection automatique a l'aide d'une vanne électriquc à 6 voies, soit par électrophorèse capillaire.
La sonde de microdialyse permet également cie délivrer une ou plusieurs molécules directement dans le parenchyme du tissu et d'analyseur ainsi les modifications chimiques ou physiologiques entraînécs par ces substances.
On constate donc que le dispositif selon l'invention présente les avantages Suivants, par rapport aux dispositifs d'études in vivo et in vitro existants
simplification et gain de temps en ce qui concerne le
changement de milieu
maintien de la concentration lors de la perfusion de
molécules testées
non-obligation de placer les cultures de tissu dans un
incubateur e possibilité d'observer le développement des cultures
pendant plusieurs jours sous un microscope ou par
l'intermédiaire d'unie camera vidéo
gain de place et économie de matériel
cartes d'analyses jetables, produites industriellement en
grande quantité
absence dc risque de mélange résiduel des molécules
testées
possibilité d'utiliser le dispositif pour des cultures de
cellules dissociées ou pour l'étude de tranche de tissu
en aigu o risque de contamlnation réduit # stimulation et enregistrement en continu (chronique),
pendant plusieurs jours a' plusieurs semaines, de
l'activité élecL.rique du tissu étudié.
études simplifiées du passage de molécules à travers un
modèle irJ vitro dc barrière hémato-encéphalique.
Le schéma de l'ensemble du système est représenté à la figure 1.
Celui-ci est composé de trois parties principales
A, l'interface biologique/électronique
B. le boîtier électronique spécialement conçu pour recevoir
l'interface dans une enceinte Lhermostatde, pour stimuler
et pour amplifier les réponses provenant du réseau
d'électrodes en contact avec le tissu
C. un ordinateur qui possède une carte d'acquisition
permettant la numération des signaux analogiques et enfin, un programme qui i permet d'analyser les réponses
électrophysiologiques.
Le schéma de l'interface biologique/électronique est représenté à la figure 2.
Dans un mode d'exécution préféré, représenté sur la figure, le dispositif selon l'invention peut se définir de la façon suivante il comprend deux demi-cartes, l'une inférieure (7) et l'autre supérieure (3) dont l'assemblage forme le montage opérationnel.
La demi-carte inférieure possède une cavité (8) qui renferme le milieu de culture liquide, comportant deux tubulures d'amenée (8a) et (8b). chacune etant obturée à on extrémité par un bouchon de caoutchouc (9a) Ce (9b). La cavité est surmontée par une membrane transparente et: perméable (6) sur laquelle repose le prélèvement de tissu (10). Un joint (5) assure l'étanchéité lorsque les deux demi-cartes (7) et (3) sont assemblées.Le joint peut supporter une ou plusieurs sondes de microdialyse (A) et (u) dont les détails sont fournis dans la figure
La demi-carte supérieure comporte un puits décentré (12) à l'intérieur duquel coulisse une douille (2) La douille peut être abaissée lorsque l'on visse le capuchon (1).
Les deux demi-cartes s'emboîtent et sont rendues solidaires par des clips (13) La descente de la douille (1) en appuyant progressivement sur le circuit imprimé souple (4).
va entraîner les électrodes dorées (4a) (pattes en l'air) vers le bas, qui vont ainsi pouvoir toucher la surface de l'expiant tissulairc (10) . Suivant la texture du tissu, une pression suffisante au niveau du circuit imprimé (4) permettra de faire pénétrer- les électrodes (11), , à l'intérieur de l'expiant (10), si nécessaire.
Le schéma du dispositif de microdialyse est représenté à la figure 3.
Une ou plusieurs sondes de microdialyse (A2) sont moulées dans un joint de silicone (A1). Le détail d'une sonde est représenté dans la figure 3B. un sac de microdialyse de 200 à 300 m de diamètre exterieur (B2) est obturé à son extrémité par une silicone ou de ia résine Epon (B1), puis inséré dans un tuyau (B5 ) L'étanchéité du raccordement est réalisée par une goutte de colle siliconée (B4 et B7) . Le sac de dialyse est perfuse par l'intermédiaire de deux tubes en silice étiré. le premier tube (B3) pénètre jusqu'à l'extrémité du sac et amene la solution de perfusion. Le deuxième tube (B6) récupère le dialysat. Les sondes sont perfusées par une solution physiologique délivrée par l'intermédiaire d'un pousse seringue automatique.Le débit de la perfusion est en général compris entre 1 et 2 ul/min.
Les sondes peuvent être placées soit a la surface de la culture, soit etre prises en sandwich entre deux tranches de tissu. Le dialysat est directement injecté dans une pompe pour HPLC par une vanne électrique à 6 voics, ou bien encore peut être récupéré dans des flacons ad hoc pour des injections ultérieures.
Composition chimique des différents mi lieux de culture
MEM + 25 % SERUM DE CHEVAL (milieu standard)
100 ml 200 ml
MEM 2x 25 ml 50 ml
Tris 5mM 60 mg 120 mg
Penstrep 1 ml 2 ml NaHCO3 460 l 910 p1
H20 stérile à 50 ml à 100 ml
Sérum de cheval 25 ml 50 ml
Milieu de Tanks 25 ml 50 ml
MILIEU DE DISSECTION (milicu pour la mise en culture)
100 ml
MEM 2x 50 ml
Penstrep 1 ml
Tris 10mM 120 mg
H20 stérile (complété à 100 rnl)
DMEM 10% FCS (milieu pour les cellules dissociées)
100 ml
DMEM 2x 45 ml
NaHC03 1,5 ml
Penstrep 1 ml
H20 stérile (complété à 90 ml)
FCS 10 ml
MILIEU ODM (milieu défini sans sérum)
Milieu complémentaire pH 7,26
Osm 291 mosm/kq
CaCl2 1 mM 22 mg
KCl 3 mM 22,2 mg
NaCl 0,8 % 800 mg
MgSO4 2 mM 49 mg
(VITC) 4 mM 70 my
Glucose 0,6 mM 100 mg
HEPES 25 mM 595 mg
Tris 10 mM 120 mg
NaHCO3 4,2 mM 34,5 mg
KH2PO4 1,25 mM 17 mg 100 ml H20
Milieu MEM 1 X
MEM 2x 25 ml
Tris 60 mg
NaHCO3 460 ul de solution stock 7,5 z
Penstrep 1 ml 25 ml H2O le total faisait 50 ml
Milieu ODM
Milieu MEM 1 x 50 ml
Milieu Complémentaire 50 ml
Filtrer pH 7,32 (avant incubation) pH 7,1 (après incubation)
Osm 307 mosm/kg
La membrane de 1interface peut être caractérisée de la manière suivante
Les différents essais que le Demandeur a effectués indiquent que la porosité de la membrane peut varier de 0,02 à 10 m.
La composition chimique de la membrane ne semble pas être déterminante. Des membranes du type Millicell CM
(Millipore), Anopore (Whatman), polycarbonate, PET donnent des résultats équivalents. Les études ultérieures que le
Demandeur doit effectuer, seront déterminantes pour le choix du type de membrane qui doit etre utilisé.
Caractéristiques du circuit souple
Dessin : circuit 16 pas = 76 mm
Matières : Upilex 50 m + Cu ED 35 um + Au 0,8 um
Exécution circuit livrés sur film largeur 69,975 avec perforation s 70
Tolérances . - épaisseur Au 0,2/0,3
- largeur +/- 75 um
- image s/perfo +/- 65 um
- largeur des pistes dans la fenêtre
Kapton +/- 15 m

Claims (13)

  1. et la partie inférieure de l'interface.
    cartes formant respectivement la partie supérieure
    caractérisé en ce qu'il est formé de deux demi
    produisant dans des cultures de tissu excitables
    REVENDICATIONS 1. Dispositif d'étude des phénomènes électriques se
  2. 2. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en
    ce que l'on dispose une membrane perméable et
    transparente sur la partie inférieure du dispositif,
    sur laquelle repose la coupe de tissu.
  3. 3. Dispositif selon la revendication 1 ou la
    revendication 2, caractérisé en ce que la coupe de
    tissu est transfusée d'une manière continue ou
    discontinue par un liquide nutritif.
  4. 4. Dispositif selon au moins une des revendications 1 à
    3, dans lequel les deux demi-cartes s'assemblent
    pour former une carte destinée à être insérée dans
    un boîtier électronique spécialement conçu à cet
    effet.
  5. 5. Dispositif selon au moins une des revendications 1 à
    4, dans lequel la carte est perfusée stérilement
    avec un milieu de culture pour tester des substances
    ou des médiateurs.
  6. 6. Dispositif selon la revendication 5, dans lequel le
    milieu de culture de perfusion est un milieu de
    culture de contrôle.
  7. 7. Dispositif selon la revendication 5, dans lequel le
    milieu de culture de perfusion est un milieu de
    culture sélectionné.
  8. 8. Dispositif selon au moins une des revendications 1 à
    3, caractérisé en ce que la partie inférieure de la
    carte est en matériau plastique, comporte une cavité
    présentant une entrée et une sortie, et est
    délimitée par la membrane transparente.
  9. 9. Dispositif selon au moins une des revendications 1 à
    3, caractérisé en ce que la partie supérieure de la
    carte se fixe sur la partie inférieure à l'aide de
    clips.
  10. 10. Dispositif selon la revendication 9, caractérisé en
    ce que la partie supérieure de la carte est formée
    d'un élément rigide en matière plastique et d'un
    circuit imprimé souple qui forme un faisceau
    d'électrodes reliées à des connecteurs.
  11. 11. Dispositif selon la revendication 10, caractérisé en
    ce que l'élément rigide en matière plastique
    comporte un puits contenant une douille mobile qui
    peut descendre progressivement lorsqu'on visse un
    capuchon sur ledit puits.
  12. 12. Dispositif selon la revendication 4, caractérisé en
    ce que l'on dispose entre les deux demi-cartes, un
    joint souple ou rigide, pour assurer l'étanchéité de
    la chambre gazeuse de la demi-carte supérieure du
    dispositif.
  13. 13. Application du dispositif selon l'une au moins des
    revendications 1 à 12, à la mesure de l'activité
    électrophysiologique des cellules excitables à
    l'aide d'une ou plusieurs sondes de microdialyse.
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