FR2955028A1 - Traitement des infections par les chlamydiaceae par les beta-lactames - Google Patents

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Abstract

L'invention a pour objet une méthode de traitement avec une β-lactame des infections par une bactérie de la famille des Chlamydiaceae. L'invention a aussi pour objet une méthode de traitement avec une β-lactame des pathologies causées par une infection par une bactérie de la famille des Chlamydiaceae.

Description

Introduction La famille des Chlamydiaceae comprend deux genres, Chlamydia et Chlamydophila, eux-mêmes comprenant chacun plusieurs espèces ; chaque espèce se compose de différents biovars et sérovars. Chacune de ces espèces conduit à un ensemble de pathologies graves chez l'Homme ou les animaux. 10 Les bactéries de la famille des Chlamydiaceae sont des bactéries gram négatives. Elles sont dites « intracellulaires strictes » car ne pouvant croître et se multiplier que dans une vacuole parasitophore au sein d'une cellule eucaryote infectée. Au cours de leur développement, les bactéries de la famille des Chlamydiaceae se présentent sous deux 15 formes : • Le corps élémentaire (CE), qui est la forme infectieuse et ne se divise pas, et • Le corps réticulé (CR), non infectieux, strictement intracellulaire et qui se divise par fission binaire.
20 Le CE pénètre la cellule hôte au sein d'une vésicule. Si plusieurs CE infectent la même cellule, les vésicules se regroupent au niveau du centrosome et fusionnent entre elles pour former l'inclusion. Après 5 à 12 heures d'infection, les CE se différencient en CR qui se multiplient activement. Après 30 à 40 heures, les CR se transforment en CE ; l'inclusion et la cellule hôte sont ensuite lysées, libérant la progéniture bactérienne qui va 25 infecter les cellules voisines. Tous ces paramètres peuvent varier d'un serovar et d'une espèce bactérienne à l'autre, et en fonction des conditions expérimentales (Fields, K. A. & T. Hackstadt, Annu Rev Cet/ Dev Biot 18: 221-45, 2002).
Au cours de son cycle de développement, la bactérie met en place de nombreuses 30 stratégies afin de survivre dans la cellule hôte. La bactérie Chlamydiaceae inhibe notamment l'apoptose induite par les signaux externes, inhibe la fusion des lysosomes avec l'inclusion bactérienne, déroute le trafic vésiculaire vers la vacuole pour permettre 15 la croissance de celle-ci, et injecte dans le cytoplasme une protéase clef (chlamydia protease/proteasome-like activity factor, CPAF) responsable de la dégradation de nombreuses protéines eucaryotes, dont des facteurs de transcription des molécules du complexe majeur d'histocompatibilité, responsables de la présentation des antigènes au système immunitaire.
A ces mécanismes développés au cours d'un cycle bactérien continu s'ajoute le phénomène de persistance. En réponse à certains stress dans l'environnement cellulaire, tels que la présence de certains antibiotiques ou de l'Interféron gamma (IFN-y), la bactérie arrête son cycle bactérien et son mécanisme prolifératif, devenant ainsi un corps persistant, viable mais non cultivable in vitro. La persistance rend compte d'un haut niveau d'interaction entre le pathogène et l'hôte et permettrait à la bactérie de pouvoir rester vivante dans l'organisme pendant des mois. Bien qu'il soit très difficile de mettre en évidence la persistance in vivo, de multiples études permettent de penser qu'une bactérie Chlamydiacea peut exister pendant plusieurs années au sein d'un tissu tel que le tractus génital, la muqueuse conjonctive et le tissu vasculaire, engendrant ainsi et infections récurrentes et inflammation chronique (Beatty et al., Microbiol Rev 58(4): 686-99, 1994; Kern et al., FEMS Immunol Med Microbiol. 55(2): 131-9, 2009).
Chlamydia trachomatis, qui est sous-divisée en 2 biovars (Trachoma et Lymphogranulomatum) et 18 serovars (A à L), est plus particulièrement responsable d'un large spectre de maladies à travers le monde.
Par exemple, dans les pays développés, les serovars D à K de Chlamydia trachomatis constituent de loin la première cause d'infections sexuellement transmissibles d'origine bactérienne. Le biovar LGV est lui responsable d'une autre maladie sexuellement transmissible, le lymphogranulome vénérien ou maladie de Durand-Nicolas-Favre.
Chez la femme, les chlamydioses génitales sont très fréquemment asymptomatiques et, de ce fait, non traitées. Chlamydia trachomatis peut atteindre tous les niveaux de l'appareil génital et entraîner des endocervites au niveau du col de l'utérus où elle constitue un réservoir de l'infection. Chlamydia trachomatis peut également entrainer des urétrites et des endométrites. L'inflammation chronique due à l'infection est à l'origine de lésions tissulaires au niveau des trompes de Fallope (salpingites) qui sont partiellement ou totalement obstruées. Chlamydia trachomatis représente la cause la plus fréquente de salpingites typiques ou atypiques muettes se révélant souvent lors de complications. Les salpingites représentent le principal facteur de risque de stérilité d'origine tubaire et de grossesse extra-utérine chez la femme. Il faut noter que les atteintes de trompes de Fallope ont des conséquences sur la capacité reproductrice de la femme plusieurs mois après l'infection à Chlamydia trachomatis. Il y a donc une période où une fécondation et un passage de l'oeuf fécondé est possible. L'oeuf arrive alors dans une cavité utérine contaminée. Dans ce cas, il a été constaté des défauts d'implantation, des retards de croissance in utero et des accouchements prématurés par inflammation du chorion.
D'autre part, les serovars A à c de Chlamydia trachomatis sont responsables d'une atteinte oculaire, le trachome, responsable de cécité acquise. La primo-infection est à l'origine d'une conjonctivite mucopurulente qui est à l'origine sans séquelles. Les épisodes répétés ou persistant d'infection sont à l'origine d'une inflammation chronique caractérisée par la présence de follicules subépithéliaux suivie d'une hypertrophie papillaire de la conjonctive tarsale de la paupière supérieure. L'atteinte de ce tissu conjonctif peut progresser durant des années aboutissant à une inflexion des cils vers l'oeil, provoquant une irritation de la cornée (trichiasis) entraînant une opacification responsable de la cécité. Là encore, l'inflammation chronique due à la présence de bactéries suite à des réinfections ou à la persistance est à l'origine des séquelles des chlamydioses. La persistance peut être expliquée par l'infection de cellules en contact direct avec la conjonctive, les cellules de l'épithélium cornéen ou les cellules souches du limbe, or, la cornée étant totalement avasculaire, elle est inaccessible aux cellules immunitaires, ce qui pourrait favoriser la persistance. Avec 84 millions de personnes touchées (la quasi totalité dans les régions les plus pauvres du globe) dont 8 millions avec une déficience visuelle, cette maladie très ancienne était en 2007 la première cause évitable de cécité dans le monde. Elle fait l'objet d'un programme d'éradication par l'Organisation Mondiale de la Santé.
En général, les infections dues aux Chlamydiaceae sont traitées avec des antibiotiques capables de passer à travers les membranes plasmiques lipophiliques pour atteindre les CR, lesquels sont actifs métaboliquement et sont donc les plus sensibles aux traitements. Les cyclines (doxycycline et tétracycline), les quinolones (ofloxacine et levofloxacine) et les macrolides (érythromycine et azithromycine) sont les trois familles d'antibiotiques les plus utilisées dans les infections aux Chlamydiaceae. Elles sont très efficaces pour éliminer les bactéries de la famille des Chlamydiaceae des tissus infectés, notamment dans le cas d'infections génitales non compliquées. Néanmoins, le taux de guérison effectif n'est que de 70 à 80 %, sans que les malades aient pu être réinfectés ou que l'antibiothérapie ait pu être interrompue. Ceci tend à démontrer que l'antibiothérapie anti-Chlamydiaceae actuelle n'est pas totalement efficace. Il est suggéré que l'inefficacité de ces traitements chez certains patients pourrait être due, au moins en partie, à la présence de formes persistantes de la bactérie.
L'hypothèse de l'insensibilité des formes persistantes de la bactérie aux traitements actuellement proposés, est étayée par plusieurs études réalisées in vitro utilisant des formes bactéricides d'antibiotiques. Dans ces études, seule l'azithromycine semble efficace pour éradiquer les formes persistantes de Chlamydia. Néanmoins, une étude réalisée in vivo a permis de mettre en évidence par microscopie électronique des formes anormales de la bactérie, évoquant des corps persistants, dans des biopsies de col utérin et d'uretère masculin chez des patients traités à l'azithromycine, ce qui va à l'encontre d'un effet destructeur de cet antibiotique sur les formes persistantes de Chlamydia (Bragina et al., JEur Acad Dermatol Venereol. 15(5):405-9, 2001 ; Katz & Fortenberry, Proceeding of the Ninth International Symposium on Human Chlamydia) Infection, 1998).
La vaccination est maintenant considérée comme le meilleur moyen de contrôler les infections aux Chlamydiaceae. Néanmoins, la recherche d'un vaccin anti-Chlamydiaceae est une tâche complexe qui nécessite de trouver un équilibre entre immunité protectrice efficace et pathologie associée à cette réponse. D'autre part, les formes persistantes des Chlamydiaceae étant indétectables par le système immunitaire, il est peu probable qu'un vaccin puisse permettre d'éradiquer celles-ci.
Il existe donc toujours un besoin pour un traitement efficace contre les infections aux Chlamydiaceae et, en particulier, contre les infections persistantes des Chlamydiaceae.
Les présents inventeurs ont trouvé de façon surprenante que les formes persistantes des Chlamydiaceae sont sensibles aux (3-lactames et que les (3-lactames peuvent donc être utilisées pour traiter les chlamydioses.
Description de l'invention Jusqu'à ce jour, il était communément admis que les (3-lactames, et la pénicilline G en particulier, induisaient la persistance des Chlamydiaceae. Le traitement à la pénicilline G était même l'un des moyens préférentiels utilisés en laboratoire pour induire la persistance (Beatty et al., Microbiol. Rev. 58(4) : 686-699, 1994 ; Huston et al., BMC Microbiol. 8:190, 2006 ; Goellner et al., Infect Immun. 74(8): 4801-8, 2006 ; Skilton, R.J. et al., PLoS One 4:e7723, 2009). Le développement de ce modèle était dû à des observations datant des années 1970 selon lesquelles le traitement de cellules infectées par de la pénicilline G affecte la division des CR et conduit à la production d'un phénotype bactérien apparemment persistant (Matsumoto, A. et G.P. Manire, J Bacteriol 101: 278-285, 1970; Kramer, M.J. et F.B. Gordon, Infect Immun 3: 333-341, 1971; How, S.J.et al., JAntimicrob Chemother 15:399-404, 1985; Kuo, C.C.et al., Antimicrob Agents Chemother 12: 80-83, 1977; Huston, W.M. et al., BMC Microbiol 8:190, 2008; Skilton, R.J. et al., PLoS One 4:e7723, 2009; Johnson, F.W. et D. Hobson, JAntimicrob Chemother 3:49-56, 1977; Lambden, P.R. et al., Microbiology 152:2573-2578, 2006).
Toutefois, les mêmes études souvent montraient aussi que le traitement avec une f3- lactame n'affectait pas les cinétiques de croissance de l'inclusion bactérienne, mais entraînait la formation de bactéries anormales, beaucoup plus grandes (5 à 10 µm) que des bactéries persistantes « classiques ». De plus, d'autres études ont montré que l'élimination de la pénicilline G ne permettait pas de retrouver l'infectiosité (Johnson, F.W. et D. Hobson, J Antimicrob Chemother 3:49-56, 1977; Wolf, K. et al., Infect Immun 68: 2379-2385, 2000; Peters, J. et al., Cell Microbiol 7:1099-1108, 2005). Bien que de telles caractéristiques s'accordent mal avec la définition de la persistance, il était néanmoins postulé qu'une antibiothérapie avec des 13-lactames pourrait entraîner la persistance des bactéries in vivo. De ce fait, cette antibiothérapie avec des 13-lactames était déconseillée.
En accord avec un rôle de la pénicilline G dans l'induction de la persistance chez Chlamydia trachomatis, les essais cliniques qui ont été réalisés n'ont pas démontré d'activité thérapeutique des 13-lactames. Les auteurs concluaient même que la pénicilline G et les autres 13-lactames n'avaient aucun effet sur Chlamydia trachomatis (Heinonen et al., Genitourin Med 62 : 235-239, 1986 ; Ridgway G.L., J Antimicrob Chemother 40(3):311-4, 1997). C'est l'opinion couramment admise aujourd'hui.
Or les présents inventeurs ont montré pour la première fois que la pénicilline G, loin d'induire la persistance des Chlamydiaceae, entraîne en fait sa dégradation. En particulier, des bactéries de la famille des Chlamydiaceae traitées à la pénicilline G perdent toute infectiosité et ce, même après que l'antibiotique a été enlevé du milieu. Cet effet thérapeutique n'est pas limité à la pénicilline G, mais peut être observé avec au moins un ensemble de 13-lactames. Ledit effet thérapeutique n'est pas non plus restreint à une espèce bactérienne particulière, mais peut être obtenu avec n'importe quelle bactérie de la famille des Chlamydiaceae.
L'invention a donc pour objet une méthode de traitement par une 13-lactame d'une infection par une bactérie de la famille des Chlamydiaceae. L'invention a aussi pour objet une méthode de traitement par une f3-lactame d'une pathologie causée par une infection par une bactérie de la famille des Chlamydiaceae. Selon un aspect préféré de l'invention, ladite bactérie est une bactérie de l'espèce Chlamydia trachomatis, de l'espèce Chlamydophila pneumoniae ou de l'espèce Chlamydophila psittaci. Selon un aspect particulièrement préféré de l'invention, ladite bactérie est une bactérie de l'espèce Chlamydia trachomatis.
Selon un autre aspect, l'invention a pour objet l'utilisation d'une 13-lactame pour fabriquer un médicament pour traiter les infections par une bactérie de la famille des Chlamydiaceae. Selon encore un autre aspect, l'invention a aussi pour objet l'utilisation d'une f3-lactame pour fabriquer un médicament pour traiter les pathologies causées par une infection par une bactérie de la famille des Chlamydiaceae. Selon un aspect préféré de l'invention, ladite bactérie est une bactérie de l'espèce Chlamydia trachomatis, de l'espèce Chlamydophila pneumoniae ou de l'espèce Chlamydophila psittaci. Selon un aspect particulièrement préféré de l'invention, ladite bactérie est une bactérie de l'espèce Chlamydia trachomatis.
On entend au sens de l'invention par f3-lactame tout antibiotique qui contient un noyau f3-lactame dans sa structure moléculaire. Sont ainsi compris dans les f3-lactames au sens de l'invention aussi bien les dérivés de la pénicilline que les céphalosporines, les monobactames, les carbapénèmes ou les inhibiteurs de la f3-lactamase. En particulier, la f3-lactame selon l'invention peut être la benzylpénicilline (pénicilline G), la phénoxyméthylpénicilline (pénicilline V) , l'ampicilline (pénicilline A), la benzatine benzylpénicilline,la méticilline, la dicloxacilline, la flucloxacilline, l'amoxicilline, la co- amoxiclav (amoxycilline+acide clavulanique), la pipéracilline, la ticarcilline, l'azlocilline, la carbénicilline, la céphalexine, la céphalotine, la céphazoline, le céfaclor, le céfuroxime, le céfamandole, le cefotetan, le cefoxitin, la ceftriaxone, le céfotaxime, la ceftazidime, le céfépime, le cefpirome, l'imipénème en association avec la cilastatine, le méropénème, l'ertapénéme, l'aztréonam, l'acide clavulanique, le tazobactam ou le sulbactam. Selon un aspect préféré de l'invention, ladite f3-lactame est la pénicilline G.
Alors que l'art antérieur enseignait que la pénicilline G est un facteur déclenchant la persistance, les présents inventeurs ont montré que le traitement à la pénicilline G entraîne une perte irréversible d'infectiosité des bactéries. En particulier, le traitement à la pénicilline G entraîne la dégradation des Chlamydiaceae. Quand les cellules infectées sont traitées à la pénicilline G, l'expression des ARN ribosomiques (ARNr) bactériens 16 S n'est plus détectée et les cellules infectées deviennent sensibles aux stimuli apoptotiques externes.
Selon un aspect plus particulier, l'invention a donc pour objet l'utilisation de la pénicilline G pour fabriquer un médicament pour traiter les infections par une bactérie de la famille des Chlamydiaceae ou pour traiter les pathologies causées par une infection par une bactérie de la famille des Chlamydiaceae caractérisée en ce que ledit traitement entraîne une perte irréversible d'infectiosité de ladite bactérie. Cette infectiosité peut être mesurée par toutes les méthodes à cet effet qui sont à la disposition de l'homme du métier. Ces méthodes ont déjà été décrites dans l'art antérieur (voir par exemple Verbeke, P. et al. PLoS Pathog 2:e45, 2006) ; il n'est donc pas nécessaire de les détailler plus avant ici ; un exemple d'une telle méthode est donné dans les exemples expérimentaux.
D'autre part, le traitement à la pénicilline G selon l'invention entraîne une dégradation des bactéries par l'intermédiaire d'une fusion avec les lysosomes. Un autre aspect plus particulier de l'invention consiste donc en l'utilisation de la pénicilline G pour fabriquer un médicament pour traiter les infections par une bactérie de la famille des Chlamydiaceae ou pour traiter les pathologies causées par une infection par une bactérie de la famille des Chlamydiaceae caractérisée en ce que ledit traitement entraîne la dégradation de ladite bactérie. Selon un aspect encore plus particulier de l'invention, la dégradation de ladite bactérie résulte de la fusion de la bactérie avec les lysosomes.
Les inventeurs ont montré que la pénicilline G est capable d'induire la dégradation des bactéries de la famille des Chlamydiaceae. Par « famille des Chlamydiaceae », on entend au sens de l'invention l'ensemble taxonomique composé de deux genres, Chlamydia et Chlamydophila, tel que défini dans Bush & Everett, Int J Syst Evol Microbiol. 51(Pt 1):203-20, 2001. De même, par « genre Chlamydia », on entend au sens de l'invention l'ensemble taxonomique comprenant les espèces Chlamydia trachomatis, Chlamydia suis et Chlamydia muridarum, et par « genre Chamydophila », l'ensemble taxonomique composé des espèces Chlamydophila abortus, Chlamydophila psittaci, Chlamydophila caviae, Chlamydophila pecorum, Chlamydophila felis et Chlamydophila pneumoniae (Bush & Everett, Int JSyst Evol Microbiol. 51(Pt 1):203-20, 2001). Il est bien connu de l'homme du métier que ces espèces ont des spectres d'hôtes distincts : par exemple, Chlamydia trachomatis et Chlamydophila pneumoniae sont responsables d'infections chez l'Homme, Chlamydia suis chez le porc et Chlamydophila abortus chez les ruminants. L'invention n'est pas limitée à une espèce bactérienne spécifique, mais peut être appliquée à n'importe laquelle des espèces de la famille des Chlamydiaceae et, en particulier, à celles mentionnées ci-dessus.
Plus spécifiquement, les inventeurs ont montré que la pénicilline G est capable d'induire la dégradation de Chlamydia trachomatis, quel que soit son biovar ou même son serovar. Par « Chlamydia trachomatis », on entend donc au sens de l'invention tout aussi bien les bactéries du biovar trachoma que celles du biovar lymphogranuloma venerum. De même, l'invention n'est donc pas restreinte à un serovar particulier, mais peut être utilisée pour traiter les infections par n'importe lequel des 18 serovars (A à L) connus. En particulier, l'invention peut être utilisée pour traiter aussi bien les infections par l'un des sérovars A-C que par l'un des sérovars D à K et L1 à L3.
Par « infection par une bactérie de la famille des Chlamydiaceae » ou « infection par une Chlamydiaceae », on entend la présence dans au moins une cellule du corps du patient ou de l'animal de ladite bactérie de la famille des Chlamydiaceae. L'infection peut être génitale, oculaire ou pulmonaire ; elle peut aussi toucher d'autres sites, comme l'endothélium ou les articulations. Ladite bactérie peut être présente sous forme CE ou CR ; elle peut encore être présente sous forme persistante. Dans un aspect plus particulier de l'invention, la bactérie est présente sous forme persistante dans le corps du patient.
Il est connu que les infections par des bactéries de la famille des Chlamydiaceae n'entrainent pas nécessairement l'apparition de symptômes. Par exemple, il est estimé que la plus grande partie des infections cervico-vaginales est asymptomatique ou ne résulte que dans l'apparition de symptômes mineurs (Paavonen et Eggert-Kruse, Hum Reprod Update 5(5):433-47, 1999). Néanmoins, la présence de bactéries Chlamydiaceae pourra être détectée par tous les moyens bien connus de l'homme du métier et qu'il n'est pas nécessaire de rappeler ici. On se contentera de mentionner en particulier que l'utilisation de tests de diagnostics basés sur l'amplification des acides nucléiques, tels que la PCR (polymerase chain reaction), la RT-PCR (real time polymerase chain reaction) et la LCR (ligase chain reaction), permet de distinguer sans ambigüité les personnes infectées par une bactérie de la famille des Chlamydiaceae de celles qui ne le sont pas. D'autre part, la mesure de l'expression des ARN ribosomiques 16S et 23S permet de déterminer que la bactérie est active métaboliquement et donc viable. Ces tests et leur utilisation pour l'étude des infections par les Chlamydiaceae sont couramment utilisés en laboratoire et ne seront donc pas détaillés ici (Mpiga et Ravaoarinoro, Microbiol Res. 161(1):9-19, 2006).
La présente invention a donc pour objet, dans un aspect particulier, une méthode de traitement par la 13-lactame d'une infection par Chlamydiaceae ou d'une pathologie causée par une infection par Chlamydiaceae comprenant une étape de détection de Chlamydiaceae. Plus particulièrement, cette étape de détection comprend une amplification d'un acide nucléique bactérien par PCR, LCR ou RT-PCR.
Il est bien connu de l'homme du métier que les espèces bactériennes de la famille des Chlamydiaceae ont des spectres d'hôtes distincts. De même, l'homme du métier sait quels sont les organismes qui seront infectés pas chacune desdites espèces : il sait que, par exemple, Chlamydia trachomatis et Chlamydophila pneumoniae sont responsables d'infections chez l'Homme, Chlamydia suis chez le porc et Chlamydophila abortus chez les ruminants. L'invention peut donc être appliquée pour traiter aussi bien des infections causées par les Chlamydiaceae chez l'Homme que chez l'animal. De même, il est possible selon l'invention de traiter avec une 13-lactame les infections par les Chamydiaceae aussi bien chez l'Homme que chez l'animal.
Bien qu'un grand nombre des infections causées par Chlamydiaceae soit asymptomatique, lesdites infections peuvent néanmoins causer des pathologies sérieuses chez les patients ou les animaux. Par « pathologie causée par une infection par Chlamydiaceae », on entend au sens de l'invention toute pathologie dont le déclenchement est directement ou indirectement causé par une infection par une bactérie de la famille des Chlamydiaceae.
Sont ainsi comprises dans les pathologies causées par une infection par Chlamydiaceae au sens de l'invention les pathologies causées chez les animaux par Chlamydia suis, Chlamydia muridarum, Chlamydophila abortus, Chlamydophila psittaci, Chlamydophila caviae, Chlamydophila pecorum et Chlamydophila felis. Sont ainsi plus particulièrement incluses dans lesdites pathologies causées par une infection par Chlamydiaceae au sens de l'invention les avortements et les mortalités néo-natales causés par Chlamydophila abortus, ainsi que les conjonctivites, les kératoconjonctivites, les rhinites purulentes, les entérites, les bronchopneumonies et les pneumonies causées chez le porc par Chlamydia suis.
Chez l'Homme, ces pathologies peuvent en particulier être des pathologies génitales ou des pathologies oculaires, mais elles peuvent aussi être des pathologies respiratoires.
Ainsi il est connu que les infections par Chlamydophila pneumoniae provoquent une forme de pneumonie et que Chlamydophila psittaci est responsable de la psittacose. Il est également connu que les infections par des bactéries de la famille des Chlamydiaceae disséminent dans l'organisme provoquant de nombreuses infections et pathologies atypiques comme des dysfonctionnements cardio-vasculaires et circulatoires (athérome).
Parmi les dysfonctionnements cardio-vasculaires et circulatoires causés par les bactéries de la famille des Chlamydiaceae, on peut citer respectivement les sténoses valvaires et l'athérome. D'autre part, lesdites bactéries de la famille des Chlamydiaceae peuvent aussi causer des arthrites sévères.
Toutefois, dans un aspect préféré de l'invention, les pathologies causées par une infection par Chlamydia sont des pathologies oculaires ou des pathologies génitales. Selon un aspect plus particulièrement préféré de l'invention, les pathologies oculaires causées par les infections par Chlamydia comprennent le trachome. Selon un autre aspect plus particulièrement préféré, les pathologies génitales causées par Chlamydia comprennent le lymphogranulome vénérien ou maladie de Durand-Nicolas-Favre. Selon encore un autre aspect plus particulièrement préféré de l'invention, les pathologies génitales chez l'homme causées par Chlamydia comprennent des pathologies telles que des urétrites et des orchi-épididymites. Celles-ci peuvent conduire à une diminution de la fertilité masculine. Selon encore un autre aspect plus particulièrement préféré de l'invention, les infections par Chlamydia causent chez la femme des pathologies génitales telles que des cervico-vaginites, des cervicites, des endocervites, des urétrites, des endométrites ou des péri-hépatites, qui peuvent donner des complications comme des infections génitales hautes et, en particulier, des salpingites pouvant évoluer entre autres vers la formation de pyosalpinx et hydrosalpinx responsables de l'obstruction totale des trompes de Fallope. Les salpingites représentent ainsi le principal facteur de risque de stérilité d'origine tubaire et de grossesse extra-utérine chez la femme.
Alors que la doxycycline ne permet qu'une amélioration partielle des salpingites, le traitement à la pénicilline G selon l'invention empêche l'apparition d'hydrosalpinx causés par une infection génitale par Chlamydia. Le traitement à la pénicilline G selon l'invention est capable d'empêcher les lésions tissulaires dues à l'infection à Chlamydia.
Ledit traitement à la pénicilline G selon l'invention montre donc une efficacité supérieure par rapport au traitement à la doxycycline, lequel est actuellement le traitement de référence chez l'Homme.
Les pathologies génitales peuvent être causées par une infection par Chlamydia seule ; cependant, elles peuvent aussi être causées par l'association d'une infection par Chlamydia et d'une infection par un autre organisme infectieux. En particulier, les organismes infectieux susceptibles de causer lesdites pathologies sont les protozoaires avec Trichomonas vaginalis; les champignons avec Candida albicans; la prolifération de bactéries anaérobies (Bacteroides, Peptostreptococcus, Gardnerella vaginalis, Gardnerella mobiluncus) lors d'une vaginite bactérienne par exemple ; d'autres bactéries comme Haemophilus ducreyi, Mycoplasma hominis, Streptococcus, Escherichia coli, Staphylococcus, Neisseria gonorrhoeae ; et des infections virales, par exemple, avec le virus de l'Herpes simplex. Selon un aspect plus particulier de l'invention, l'organisme infectieux capable de causer une pathologie génitale comme décrite ci-dessus est Neisseria gonorrhoeae. Selon un autre aspect plus particulier de l'invention, l'organisme infectieux capable de causer une pathologie génitale comme décrite ci-dessus est Trichomonas vaginalis.
La présente invention a donc aussi pour objet une méthode de traitement par une f3- lactame d'une pathologie génitale causée par une infection par une bactérie de la famille des Chlamydiaceae , caractérisée en ce que ladite (3-lactame est administrée avec un autre agent thérapeutique. Selon un aspect particulier de l'invention, ledit autre agent thérapeutique est choisi parmi les agents permettant de traiter les infections par Neisseria gonorrhoeae. Selon un autre aspect particulier de l'invention, ledit autre agent thérapeutique est choisi parmi les agents permettant de traiter les infections par Trichomonas vaginalis. Ledit autre agent thérapeutique est en particulier choisi dans le groupe constitué de la ceftriaxone, la céfixime, la spiramycine, la spectinomycine, l'azythromycine, l'ofloxacin, la ciprofloxacine, le métronidazole, le tinidazole et le mimorazole.
L'invention a également pour objet les compositions pharmaceutiques renfermant comme 10 principe actif une 13-lactame. Ladite 13-lactame peut être associée ou non à un autre agent thérapeutique tel que défini ci-dessus.
Ces compositions peuvent être administrées par voie buccale, rectale, parentérale ou par voie locale en application topique sur la peau et les muqueuses, mais la voie 15 d'administration préférée est la voie buccale.
Elles peuvent être solides ou liquides et se présenter sous les formes pharmaceutiques couramment utilisées en médecine humaine, comme par exemple, les comprimés, simples ou dragéifiés, les gélules, les granulés, les suppositoires, les préparations injectables, les 20 collyres, les pommades, les crèmes, les gels ; elles sont préparées selon les méthodes usuelles. Le ou les principes actifs peuvent y être incorporés à des excipients habituellement employés dans ces compositions pharmaceutiques, tels que le talc, la gomme arabique, le lactose, l'amidon, le stéarate de magnésium, le beurre de cacao, les véhicules aqueux ou non, les corps gras d'origine animale ou végétale, les dérivés 25 paraffiniques, les glycols, les divers agents mouillants, dispersants ou émulsifiants, les conservateurs. Ces compositions peuvent également se présenter sous forme d'une poudre destinée à être dissoute extemporanément dans un véhicule approprié, par exemple de l'eau stérile apyrogène.
30 La dose administrée est variable selon l'affection traitée, le sujet en cause, la voie d'administration et le produit considéré. Elle peut être, par exemple, comprise entre 50 µg et 300 mg par jour par voie orale, chez l'adulte.
Légendes des figures
Figure 1. Le traitement à la pénicilline G n'entraîne pas un arrêt du développement des 5 inclusions contenant des formes anormales de Chlamydia trachomatis.
Des cellules HeLa ont été infectées par le serovar L2 de Chlamydia trachomatis et traitées avec l'IFNy (100 ng.mL-i) ou la pénicilline G (100 U.ml-i) ou la gentamycine (25 µg. L-1). À différents temps après l'infection (heures après l'infection ou heures post 10 infection, hpi), les cellules ont été fixées et marquées avec un anticorps dirigé contre Chlamydia sp. (vert dans la figure originelle) et avec le Hoechst (bleu dans la figure originelle). Les cellules HeLa infectées traitées avec la pénicilline G présentent des corps anormaux qui grossissent et qui sont phénotypiquement très différents de ceux formés durant le traitement avec IFNy. Les corps formés avec la pénicilline G sont sensiblement 15 différents des corps persistants « classiques ». Échelle: 10 µm. Chaque expérience a été reproduite au moins trois fois.
Figure 2. Le traitement à la pénicilline G entraîne une perte irréversible d'infectiosité de Chlamydia trachomatis. 20 Des cellules HeLa ont été infectées par le serovar L2 de Chlamydia trachomatis à IFU (unité formant inclusion) = 1. À 3 hpi, 3 lots égaux sont distingués et la pénicilline G a été ajoutée à 100U.m1_1 au lot « pénicilline G » (barre noire) et « réversion » (barre grise) mais pas dans le lot témoin (barre blanche). À 24 hpi, la pénicilline G a été éliminée du 25 milieu de culture dans le groupe réversion. À 48 hpi ou 100 hpi, les surnageants et les cellules ont été rassemblés et stockés à -80°C. Des cultures fraîches de cellules HeLa ont ensuite été incubées pendant 1 h avec des extraits de cellules (gauche) ou des surnageants (droite), incubées avec du cycloheximide et fixées 24 h plus tard. Les noyaux et les inclusions ont été marqués et comptés pour calculer le nombre d'IFU.mF-l. 30 Dans les conditions témoins, une capacité infectieuse significative a été détectée, alors qu'aucune capacité infectieuse n'a pu être mise en évidence après le traitement à la pénicilline G, qu'il y ait ou non une phase de réversion. Ce résultat constitue une preuve 14 forte que la pénicilline G n'induit pas la persistance. C'est aussi une première indication de létalité des Chlamydia. *: significativement différent des autres conditions (p<0.05) ^: significativement différent de 0 (p<0.05) •: pas significativement différent de 0
Figure 3. Le traitement à la pénicilline G conduit à la perte de contrôle de Chlamydia trachomatis sur l'apoptose de la cellule hôte.
A : Des cellules HeLa ont été infectées par Chlamydia trachomatis et traitées ou non avec la pénicilline G à 3 hpi. À 21 hpi, la staurosporine a été ajoutée au milieu de culture. Les cellules ont été fixées à 48 hpi, et marquées avec un anticorps dirigé contre Chlamydia sp. (vert dans la figure originelle) et Hoechst (bleu dans la figure originelle). B : Des noyaux normaux ou apoptotiques associés avec les inclusions ont été comptés, et les pourcentages de cellules infectées en apoptose ont été calculés. Échelle : 10 µm. *: significativement différent (p=0.01)
Figure 4: Le traitement à la pénicilline G entraîne une absence d'expression de l'ARNr 16S.
Des cellules HeLa ont été infectées par le serovar L2 de Chlamydia trachomatis et traitées ou pas avec la pénicilline G à 3 hpi. À 100 hpi, les cellules ont été récoltées et les ARN extraits avec précaution pour éviter la contamination par l'ADN. Une moitié des ARN isolés a été utilisée pour la reverse transcription. Les ARN et des ADNc ont été amplifiés par PCR avec des amorces pour les ARNr 16S (bactérien) et 18S (eucaryote), afin d'étudier l'activité bactérienne et vérifier la qualité et la quantité des ADNc. La PCR à partir des ARN permet de vérifier l'absence de contamination par de l'ADN. Elle indique aussi l'absence de contaminant dans la PCR. Les cellules infectées traitées avec la pénicilline G expriment l'ARN 18S, mais pas le 16S, ce qui indique que les formes bactériennes anormales ne sont pas viables.
Figure 5. Le traitement à la pénicilline G entraîne l'entrée des lysosomes dans les inclusions anormales.
Des cellules HeLa ont été infectées par Chlamydia trachomatis et ont été soit fixées et 5 marquées (A) soit observées immédiatement (B et C) à 24 hpi. A: Marquage au Hoechst (bleu dans la figure originelle), anti-Chlamydia sp. (vert dans la figure originelle) et anti-cathepsine D (rouge dans la figure originelle). La cathepsine D est remarquablement présente dans les corps anormaux. Échelle : 101m. B: Les cellules ont été incubées avec le lysotracker pendant 30 min. Le lysotracker est 10 localisé surtout dans les inclusions anormales présentant un réseau membranaire complexe. Les détails montrent des points fortement brillants dans des inclusions anormales, suggérant l'entrée d'un lysosome dans une inclusion anormale. Tête de flèche: membrane de l'inclusion, flèche: compartiment chargé en lysotracker. DIC: contraste interférentiel différentiel. Échelle : 10 µm. 15 C: Vidéomicroscopie (time lapse) avec un microscope confocal équipé d'un scanner à haute résonnance. En gris, contraste interférentiel différentiel, en rouge (dans la figure originelle), le lysotracker. Un lysosome (flèche), proche d'une inclusion, entre dans cette structure anormale et semble rester à l'intérieur.
20 Figure 6. L'effet de la pénicilline G sur Chlamydia est indépendant du type de cellule hôte, du serovar, du biovar ou de l'espèce de Chlamydia.
Une lignée cellulaire tumorale de monocyte/macrophage, THP-1, une lignée cellulaire tumorale endométriale, RL95-2, et une lignée cellulaire tumorale cervicale, HeLa, 25 infectées par le serovar L2 du biovar LGV de Chlamydia trachomatis, ou par le serovar D du biovar Trachoma, ou par Chlamydia muridarum, et traitées avec la pénicilline G (3 hpi) présentent des inclusions anormales. En bleu dans la figure originelle, Hoechst, en vert dans la figure originelle: anti-Chlamydia sp. Image prise à 24 hpi (RL95-2/Chlamydia L2; HeLa/Chlamydia-D; HeLa/C.muridarum) ou à 48 hpi (THP- 30 1/Chlamydia-L2; THP-1/Chlamydia-D). Échelle : 10 µm.
Figure 7. Le traitement à la pénicilline G conduit à une perte très rapide du contrôle de Chlamydia trachomatis sur l'apoptose de la cellule hôte.
Des cellules HeLa ont été infectées en absence (barre blanche) ou en présence de pénicilline G (100 U.ml-i) ajoutée à 2 hpi (barre gris clair) ou à 29 hpi (barre gris foncé). La staurosporine a été ajoutée à 31 hpi. Les cellules ont été fixées et observées comme décrit ci-dessous. Les noyaux apoptotiques ou normaux associés avec les inclusions ont été comptés, et les pourcentages de cellules infectées en apoptose ont été déterminés. En 2 h, le traitement à la pénicilline G induit une perte de contrôle de Chlamydia trachomatis sur l'apoptose de la cellule hôte. *: significativement différent (p<0.05)
Figure 8. Des concentrations faibles de pénicilline G induisent le même état non infectieux de Chlamydia trachomatis.
Des cellules HeLa ont été infectées par le serovar L2 Chlamydia trachomatis à IFU = 1. À 3 hpi, la pénicilline G a été ajoutée à 1, 10 or 100 U.ml-i dans les échantillons pénicilline G (-) et réversion (+). À 24 hpi, la pénicilline G a été enlevée du milieu de culture dans le groupe de réversion (+). À 48 hpi ou 100 hpi, les surnageants et les cellules ont été récoltés et stockés à -80°C. Des cellules HeLa ayant poussé sur lames ont été incubées pendant 1h avec des extraits des cellules (gauche) ou avec des surnageants (droite), traitées avec le cycloheximide et fixées 24 h plus tard. Les noyaux et les inclusions ont été marqués et comptés pour déterminer le nombre de IFU.ml-1. Dans les conditions témoins (progéniture bactérienne provenant de cellules non traitées), une infectiosité significative a été détectée, alors qu' aucune réinfection n'a été obtenue avec des bactéries collectées à partir de cellules traitées de façon permanente ou transitoire avec la pénicilline G. *: significativement différent des autres conditions (p<0.05) ^: significativement différent de 0 (p<0.05) •: pas significativement différent de 0 Figure 9. La cathepsine D est localisée dans les formes anormales de Chlamydia trachomatis indépendamment du biovar et du type de cellule hôte.
Les cellules ont été infectées et traitées à 3 hpi avec la pénicilline G. À 24 hpi, les cellules ont été fixées et marquées avec des anticorps anti-Chlamydia sp. (vert dans la figure originelle) et anti-cathepsine D (rouge dans la figure originelle), ainsi qu'avec le Hoechst (bleu dans la figure originelle).
Figure 10. Effet d'un traitement à la pénicilline G sur le développement d'hydrosalpinx 10 suite à l'infection de souris C57B1/6 par Chlamydia muridarum,
Les souris ont été infectées par la voie vaginale avec 107 IFU de Chlamydia muridarum. Après dix jours, un groupe de souris n'a pas reçu d'antibiotique (non traitée), un autre a été traité par de la doxycycline à 5mg/ml per os et le dernier groupe a reçu de la 15 pénicilline G à 5mg/ml per os. Le traitement antibiotique est interrompu après 20 jours et les souris ont été maintenues isolées pendant 60 jours supplémentaires. Les souris ont ensuite été sacrifiées, l'aspect du tractus génital analysé et la présence d'hydrosalpinx (flèches) recherchée.
20 Exemples expérimentaux 1.Matériels
1.1. Anticorps et réactifs 25 Les milieux de culture (DMEM, HAMF F12, HAMF12K, RPMI-1640), le FCS et la solution de gentamycine ont été obtenus auprès d'Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). L'IFN-y recombinant humain, la cycloheximide, la 3-méthyl-adénine (3-MA), la staurosporine et la pénicilline G ont été obtenus de Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA). 30 Le lysotracker provient aussi d'Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Un mélange de deux anticorps monoclonaux de souris contre le genre Chlamydia et conjugués au FITC ont été obtenus d'Argen Biosoft (Varhilles, France). Les anticorps polyclonaux de lapin (IgG) contre la cathepsine D et les anticorps de chèvre anti-lapin conjugués au Texas Red proviennent de Santa Cruz (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA). Les IgG de lapin témoin ont été purifiés à partir de sérum de lapin en utilisant la protein A-sepharose. 1.2. Cultures cellulaires et souches bactériennes
Tous les types cellulaires (HeLa, RL-95.2, THP-1) ont été cultivés selon les recommandations de l'American Type Culture Collection (ATCC ; Manassas, VA, USA), dans des flacons de culture de 75 cm2 pour la maintenance et dans des plaques de 12 ou 24 puits avec couvercle ou dans des chambres de culture Lab-TekTM , pour les expériences. La différentiation des cellules THP-1 en macrophages a été obtenue à l'aide de PMA à 0.25 µM dans le milieu de culture.
Afin d'examiner si les effets de la pénicilline G sur l'infectiosité des bactéries dépendait de la souche ou du serovar, le serovar L2 de 1'ATCC et le serovar D de C. trachomatis, gracieusement fourni par Dr. de Barbeyrac (Université de Bordeaux II, Bordeaux, France) ont été utilisés. C. muridarum a été obtenu du Dr. Roger Rank (University of Arkansas, Little Rock, Arkansas, United States). Les bactéries ont été propagées en routine dans des cellules HeLa comme décrit précédemment et stockées à -80°C en attendant d'être utilisées (Scidmore, M.A. Curr Protoc Microbiol Chapter 11:Unit 1lA 11, 2005). Le nombre d'unités formant des inclusions bactériennes (inclusion forming unit, IFU) a été déterminé par immunofluorescence, ainsi que précédemment décrit (Verbeke, P. et al. PLoS Pathog 2:e45, 2006). 2.Méthodes
2.1. Infection et traitement avec la pénicilline G
Pour examiner les effets de la pénicilline G sur l'infection des cellules par Chlamydia, les cellules hôtes ont été cultivées jusqu'à 70% de confluence sans antibiotiques, puis ont été infectées avec les souches L2 ou D de C. trachomatis ou avec C. muridarum à une IFU de 1. Les infections ont été réalisées à 37°C pendant 90 min sous centrifugation, suivies par un lavage des bactéries extracellulaires. À 3 hpi, après des lavages, le milieu de culture medium a été remplacé par du milieu contenant soit de la gentamycine à 25 µg.ml-i, soit de la pénicilline G à 1-100 IU.ml-i. À intervalles réguliers après le traitement à la pénicilline G, les cultures ont été soit fixées dans du PFA 4% tamponné à pH neutre pendant 30 min pour être préparées pour la microscopie confocale, soit récoltées pour déterminer l'infectiosité de la progéniture bactérienne, selon la méthode précédemment décrite (Verbeke, P. et al. PLoS Pathog 2:e45, 2006).
2.2. Persistance induite par le traitement à l'IFN-y Des cellules HeLa cultivées en monocouches sur lames ont été infectées avec le serovar L2 à une IFU de 1, ainsi que précédemment décrit (Verbeke, P. et al. PLoS Pathog 2:e45, 2006). Trois heures après l'infection, le milieu a été éliminé et remplacé par du milieu de culture contenant de l'IFN-y humain recombinant à 500 IU.ml-i (concentration finale). Les cellules infectées ont été incubées pendant 100 heures supplémentaires en présence de IFN-y , avant d'être préparées pour la microscopie confocale comme décrit ci-dessous.
2.3. Test de réactivation Des cellules HeLa cultivées en monocouches sur lames ont été infectées avec le serovar L2 de Chlamydia trachomatis et traitées par la pénicilline G, ainsi que décrit ci-dessus. Vingt heures après l'infection, la culture a été lavée et le milieu remplacé par du milieu ne contenant pas de pénicilline G. Entre 48 et 100 hpi, les cellules et le milieu de culture ont été récoltés à différents intervalles et un test de titration a été conduit selon la méthode de l'art antérieur (Scidmore, M.A. Curr Protoc Microbiol Chapter 11:Unit 1lA 11, 2005). Pour déterminer si le traitement à la pénicilline G pouvait affecter la persistance bactérienne, des cellules HeLa infectées par L2 et traitées à IFN-y avec de la pénicilline G (500 IU.ml-i) de 48 hpi (soient 24 h après le traitement à IFN-y) jusqu'à 72 hpi (soient 48h après le traitement à IFN-y). Les lames ont ensuite été fixées et observées à l'aide d'un microscope à épifluorescence (Leica DM, Leica, Mannhein, DE) équipé de deux ensembles de filtres de détection (Hoechst 360/40nmBP-425nmLP; FITC 480/40nmBP-527/30nmBP) et connecté à une caméra CCD.
2.4. Sensibilité à l'apoptose L'effet du traitement à pénicilline G sur l'activité anti-apoptotique de Chlamydia a été déterminé. Des cellules HeLa cultivées en monocouches sur lames ont été infectées avec le serovar L2 et traitées par la pénicilline G à 3 hpi ou 29 hpi. À 25 hpi ou 32 hpi, respectivement, les cellules ont été incubées avec de la staurosporine 1 µM, fixées à 40 hpi ou 48 hpi et préparées pour la microscopie par épifluorescence. Les pourcentages de cellules infectées contenant des noyaux apoptotiques ont été calculés.
2.5. Microscopie confocale Des cellules HeLa cultivées en monocouches sur lames ont été infectées avec le serovar L2. À 3 hpi, les cellules ont été ou non traitées par la pénicilline G. Puis, les cellules ont été fixées à 24 hpi, perméabilisées et incubées (2 h, température ambiante) avec un anticorps anti-cathepsine D (1/50) en PBS-BSA 1%. Après plusieurs lavages, un IgG de chèvre anti-lapin conjugué au Texas Red (1/200) a été ajouté sur les lames (1h, température ambiante). Ensuite, les cellules ont subi un contremarquage pendant 1h avec un anticorps anti-Chlamydia conjugué au FITC (1/800) et 5 min avec du Hoechst (1/2000). Les lames ont ensuite été montées et observées à l'aide d'un microscope confocal (Leica, TCS Sp5 AOBS tandem, Leica, Mannheim, DE) équipé de deux diodes lasers (1 et 25nW) émettant respectivement à 405nm et 561nm et d'un laser à argon (100nW) émettant à 488 nm. Les signaux émis ont été recueillis à 411-481 nm pour le Hoechst, 493-555 nm pour le FITC et 591-703 nm pour le Texas Red. Chaque expérience a été conduite, acquise et analysée de façon similaire, et a été répétée trois fois. 2.6. Marquage des cultures cellulaires avec le lysotracker rouge.
Des cellules croissant en chambres de culture Lab-TekTM (Thermo Fisher Scientific, Roskilde, DK) ont été infectées et traitées ou non avec la pénicilline G à 3 hpi. À 22 hpi, les cellules ont été incubées avec 10 µM de lysotracker rouge dilué en DMEM (30 min, 37°C). Les lames ont été observées à 37°C sous 5 % CO2 par vidéomicroscopie (time lapse) à l'aide d'un microscope confocal Leica équipé d'un scanner résonnant en tandem. L'excitation a été faite à 561 nm avec une diode laser (1 nW) et le signal émis a été recueilli entre 565 et 641 nm. Les images ont été acquises toutes les 2 min pendant des périodes pouvant aller jusqu'à 4 h 2.7. Préparation des ARN et analyse de l'expression des gènes
Environ 1.105 cellules HeLa ont été infectées et exposées ou non à la pénicilline G, comme décrit plus haut. À 100 hpi., les ARN totaux ont été isolés en utilisant le kit RNeasy Mini Plus (Qiagen, Hilden, DE). Les échantillons ont été traités à la DNase I pendant 1 h à 37°C. L'enzyme a ensuite été dénaturé à 70°C pendant 10 min. Les ARN ont été rétrotranscrits en ADNc en utilisant des amorces hexamèriques aléatoires et la reverse transcriptase affinity Script MT (Agilent, Santa Clara, CA, USA) et en suivant les instructions du fabriquant pour la RT-PCR. Les ADNc et les ARN ont été amplifiés par PCR avec la Taq Polymerase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) afin de vérifier l'absence de contamination par de l'ADN.
Les amorces utilisées pour amplifier l'ARNr 16S sont : SEQ ID NO : 1 CGCCTGAGGAGTACACTCGC SEQ ID NO : 2 CCAACACCTCACGGCACGAC Les amorces utilisées pour amplifier l'ARNr 18S eucaryote sont : SEQ ID NO : 3 ATGGCCGTTCTTAGTTGGTG SEQ ID NO : 4 CGCTGAGCCAGTCAGTGTAG)
30 Une analyse semi-quantitative des produits de PCR a été réalisée par électrophorèse en gel d'agarose et détection aux UV.25 2.8. Analyse statistique Les données sont présentées en tant que moyenne ± écart type de "n" expériences. Les moyennes ± écart type sont montrées dans les figures; les p-valeurs sont calculées à l'aide d'un test de Student apparié. Une p-valeur de moins de 0,05 est considérée comme statistiquement significative.
2.9. Modèle in vivo
Des souris C57B1/6 ont été infectées par Chlamydia muridarum, une espèce de Chlamydia qui infecte souris et cobayes et qui est génétiquement proche de Chlamydia trachomatis. Les souris ont été cyclées par injection de progestérone, puis infectées par la voie vaginale après 3 jours (10' IFU). Dix jours après l'infection, les souris ont été divisées en trois groupes, un groupe témoin négatif ne recevant aucun antibiotique, un groupe témoin positif recevant de la doxycycline (5mg/ml) et un groupe test recevant de la pénicilline G (5mg/ml). La durée du traitement était de 20 jours ; les antibiotiques, doxycycline et pénicilline G ont été ajoutés à l'eau de boisson des souris. Après le traitement, les souris ont été maintenues isolées pendant 60 jours afin de permettre aux bactéries persistantes de reprendre leur cycle et aux séquelles de se développer. Les souris ont ensuite été sacrifiées, l'aspect du tractus génital analysé et la présence d'hydrosalpinx recherchée. Différents organes ont aussi été prélevés. 3.Résultats 3.1. Le traitement par la pénicilline G de cellules infectées par le serovar L2 de Chlamydia trachomatis conduit à la formation d'inclusions anormales qui ne sont pas persistantes
30 Les travaux de l'art antérieur présentaient le traitement des cellules hôtes en culture par la pénicilline G comme un modèle de la persistance de Chlamydia. Toutefois, les caractéristiques particulières de la forme bactérienne causée par le traitement avec cet25 antibiotique et la controverse sur l'obtention d'une progéniture infectieuse après l'élimination de la pénicilline G du milieu ont conduit les inventeurs à réexaminer cette question.
Des cellules infectées par Chlamydia ont été traitées par la gentamycine, pénicilline G ou IFN-y, ce dernier étant un inducteur bien connu de la persistance. La taille des inclusions bactériennes produites par le traitement avec IFN-y reste constante quand les cellules sont maintenues en culture pendant 4 jours (Figure 1). Cette absence de croissance a été observée pendant plus de deux semaines. Le diamètre moyen des formes persistantes dans de telles inclusions était de 2 à 3 µm. Ces deux caractéristiques (inclusions qui ne croissent pas et taille modérée des inclusions) sont classiques de la persistance de Chlamydia. En revanche, il a été observé par vidéomicroscopie que les inclusions des cellules infectées traitées avec la pénicilline G croissent aussi vite que celles des cellules traitées à la gentamycine. A 120 hpi (heures post-infection), les cellules infectées traitées avec pénicilline G étaient lysées, relarguant leurs structures dans le milieu de culture. Le diamètre de ces structures (5 à 10 µm) présentes dans les inclusions était bien supérieur à celui des corps persistants obtenus par le traitement avec IFN-y (2 à 3 µm).
Dans une seconde série d'expériences, il a pu être montré que la génération et le développement de telles inclusions contenant des particules bactériennes anormales étaient indépendants du type de la cellule hôte ou du serovar, du biovar ou même de l'espèce de la bactérie Chlamydia utilisée (Figure 6). De plus, des cellules infectées ont été traitées à différents temps après l'infection avec la pénicilline G. Il a été observé que la pénicilline G entraîne l'apparition de structures anormalement dilatées dans les inclusions seulement quand la pénicilline G est ajoutée dans la première phase du cycle bactérien (avant 24 hpi). Ceci démontre que la pénicilline G affecte le développement des CR et non pas des CE. Dans leur ensemble, ces résultats montrent que le traitement à la pénicilline G conduit à la formation de formes bactériennes dilatées dans une inclusion non persistante. 3.2. Le traitement des cellules hôtes avec la pénicilline G cause une perte irréversible d'infectiosité des bactéries.
Quand les cellules étaient traitées en continu avec 100 IU.mF-1 de pénicilline G, les bactéries récoltées à 48 hpi étaient plusieurs centaines de fois moins infectieuses que les bactéries récoltées à partir de cellules traitées à la gentamicine (Figure 2). Dans les mêmes conditions, à 100 hpi, les bactéries relarguées par les cellules hôtes traitées à la pénicilline G étaient totalement non infectieuses.
Selon une autre caractéristique de la persistance, l'inclusion peut croître de nouveau quand le stimulus de persistance est enlevé du milieu. En même temps, le corps persistant 10 est converti en CR.
Il a donc été examiné si des bactéries infectieuses pouvaient être récupérées en enlevant la pénicilline G à 24 hpi (soit 21 h après le début du traitement à la pénicilline G). Dans cette expérience, aucun cycle de développement normal dans les cellules infectées n'a été 15 observé par vidéomicroscopie. De plus, aucune amélioration de l'infectiosité n'a été mise en évidence (Figure 2). La même perte irréversible d'infectiosité a été observée en utilisant des concentrations de pénicilline G jusqu'à 1 IU.ml-1 (Figure 7). Ces résultats montrent que l'incubation temporaire ou continue des cellules infectées avec la pénicilline G abolit complètement l'infectiosité de Chlamydia. 20 3.3. Le traitement avec la pénicilline G rend les cellules infectées susceptible d'apoptose.
La capacité de contrôler et d'inhiber l'apoptose de la cellule hôte induite par des stimuli externes est une propriété majeure du cycle de Chlamydia. La capacité des cellules 25 infectées traitées par la pénicilline G d'inhiber les voies de déclenchement de l'apoptose a donc été testée.
Les résultats montrent que, lorsque des cellules infectées sont traitées avec 4µM de staurosporine à 21 hpi, 11,83 % d'entre elles seulement présentent un caractère de 30 cellules apoptotiques à 48 hpi, alors que des cellules témoins non infectées sont toutes en apoptose (Figure 3). En revanche, dans les mêmes conditions, 70,39 % des cellules infectées traitées à la pénicilline G montraient des signes d'apoptose. Pour évaluer la rapidité de l'effet de la pénicilline G sur la perte de résistance à l'apoptose, des cellules infectées ont été traitées avec de la pénicilline G soit à 2 hpi, soit à 29 hpi. Les cellules traitées ont ensuite été incubées avec de la staurosporine à 31 hpi. Les cellules ont été observées 8 heures plus tard (Figure 8). Environ 38 % des cellules étaient apoptotiques dans les deux conditions, ce qui indique donc que la pénicilline G a un effet très rapide. Ce résultat montre que les bactéries traitées avec la pénicilline G perdent très rapidement le contrôle du déclenchement de l'apoptose des cellules hôtes.
3.4. Le traitement avec la pénicilline G conduit à la perte de l'expression de l'ARN 10 ribosomique 16S.
Il est connu qu'aussi bien le CR que la forme persistante de Chlamydia expriment l'ARN ribosomique (ARNr) 16S, lequel est essentiel pour la bactérie. L'expression de cet ARNr 16S a été étudiée dans les formes bactériennes anormales induites par la pénicilline G. À 15 100 hpi, les ARN ont été extraits de cellules infectées traitées par la pénicilline G, la gentamicine ou l'IFN-y et l'expression de l'ARNr 16S a été étudiée par RT-PCR. Une séquence spécifique de l'ARNr 16S a ainsi pu être amplifiée à partir des cellules infectées traitées à la gentamicine (Figure 4) ou avec l'IFN-y. En revanche, les cellules infectées traitées avec la pénicilline G ne produisent pas d'ARN bactérien. Toutefois, toutes les 20 cellules infectées exprimaient toutes les mêmes niveaux d'ARNr 18S eucaryote, indiquant que l'extraction d'ARN et la RT-PCR étaient efficaces. De plus, aucune contamination par de l'ADN n'a été observée par PCR sur les ARN extraits. Dans leur ensemble, ces résultats montrent que le CR et la forme persistante de Chlamydia produisent de l'ARNr 16S. En revanche, les bactéries traitées par la pénicilline G ont 25 perdu la capacité d'exprimer cet ARN essentiel.
3.5. Le traitement des cellules infectées par la pénicilline G conduit à la fusion des lysosomes avec l'inclusion anormale.
30 Le phénotype anormal des bactéries traitées avec la pénicilline G, couplé à la perte de contrôle sur les fonctions apoptotiques de la cellule hôte et à l'absence d'expression des gènes bactériens essentiels, suggère que la pénicilline G entraîne la dégradation de Chlamydia. Les particules intracellulaires confinées dans des vésicules sont envoyées vers le lysosome pour être dégradées. La possibilité que les inclusions anormales fusionnent avec le lysosome ainsi été étudiée.
Les cathepsines sont des protéases qui tiennent une place importante dans la dégradation des protéines par le lysosome. En particulier, la cathepsine D est une protéase aspartique lysosomale. La localisation de la cathepsine D a été étudiée dans les cellules infectées traitées à l'IFNy et la pénicilline G ou non. À 24 hpi, la majorité des formes bactériennes anormales contenaient de la cathepsine D (Figure 5A). Comme attendu, ce marqueur était exclu des inclusions normales et persistantes. Dans des expériences faites en utilisant un isotype témoin, aucun marquage n'a été mis en évidence. Ces résultats ont été confirmés par l'étude du marquage au lysotracker de cellules infectées traitées ou non à la pénicilline G (Figure 5B). Le lysotracker est une sonde utilisée pour détecter les compartiments acides tels que les lysosomes. Le mécanisme de rétention du lysotracker fait intervenir sa protonation qui conduit à sa localisation dans les membranes des organites (Haugland, R.P. The Handbook, A guide to fluorescent probes and Labelling Technologies, l0th edition 2005. Invitrogen Corp©, Spence M.T.Z. ed. 580-588 pp). Le marquage des cellules infectées par cette sonde a permis de mettre en évidence un réseau tubulaire complexe dans les inclusions anormales et seulement dans les inclusions anormales. De plus, des points de très forte intensité ont été observés dans la majorité de ces inclusions anormales (Figure 5B, encadré). Ces points pourraient être des lysosomes pénétrant dans une inclusion anormale. Afin de tester cette hypothèse, le comportement des lysosomes des cellules infectes a été étudié par vidéomicroscopie confocale. Il a ainsi été mis en évidence que les compartiments marqués au lysotracker entrent dans les inclusions anormales (Figure 5C). De plus, les inclusions anormales produites dans des cellules RL95-2 infectées avec le serovar L2 ou dans des cellules HeLa infectées avec le serovar D contiennent la cathepsine D aussi (Figure 9). Dans leur ensemble, ces résultats montrent que la pénicilline G induit la fusion des lysosomes avec les inclusions anormales de Chlamydia. 3.6. Le traitement des bactéries persistantes par la pénicilline G induit la fusion des inclusions de Chlamydia avec les lysosomes et la destruction de leur progéniture.
Les effets de la pénicilline G ont été testés sur les infections persistantes. Les cellules ont été infectées puis traitées par IFN-y à 3 hpi. Une fois que l'apparition d'inclusions persistantes a été observée au microscope, la pénicilline G a été ajoutée aux cellules infectées cultivées en présence de d'IFN-y. Un redémarrage rapide de la croissance des inclusions a alors été observé, ainsi qu'une expansion anormale des particules bactériennes dans lesdites inclusions. Vingt-quatre heures après l'addition de pénicilline G, la majorité des formes bactériennes anormales contenaient de la cathepsine D. Enfin, les cellules ont lysé 70 h après le début du traitement à la pénicilline G, lyse accompagnée de la libération de bactéries non infectieuses. Ce résultat montre que le traitement à la pénicilline G conduit à la dégradation des formes persistantes de Chlamydia.
3.7. Le traitement de souris infectées par la pénicilline G conduit à une absence 15 d'hydrosalpinx
Les effets de la pénicilline G ont été testés dans un modèle murin d'infection génitale. Dans ce modèle, la formation d'hydrosalpinx au niveau des cornes utérines est observée. Ces kystes inflammatoires très fréquemment observés chez les mammifères en cas 20 d'infections pelviennes par Chlamydia trachomatis résultent de l'accolement des parois et de la collection de liquide.
Alors que les souris non traitées (témoin négatif) présentent des hydrosalpinx très importants sur toute la longueur de la corne utérine, les souris infectées traitées à la 25 doxycycline (témoin positif) présentent de petits hydrosalpinx au niveau de l'oviducte (Figure 10). De façon tout à fait frappante, le tractus génital des souris traitées à la pénicilline G avait un aspect normal, suggérant que le traitement à la pénicilline G serait capable d'empêcher les lésions tissulaires dues à l'infection à Chlamydia. Ces données sont les premières montrant une efficacité supérieure du traitement à la pénicilline G par 30 rapport au traitement à la doxycycline, lequel est actuellement le traitement de référence chez l'Homme.

Claims (20)

  1. Revendications1. Utilisation d'une 13-lactame pour fabriquer un médicament pour traiter les infections par une bactérie de la famille des Chlamydiaceae.
  2. 2. Utilisation d'une 13-lactame pour fabriquer un médicament pour traiter les pathologies causées par une infection par une bactérie de la famille des Chlamydiaceae.
  3. 3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2 caractérisée en ce que ladite 13-lactame est la 10 pénicilline G.
  4. 4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que ladite bactérie est sous forme persistante. 15
  5. 5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que ledit traitement entraîne une perte irréversible d'infectiosité de ladite bactérie.
  6. 6. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que ledit traitement entraîne la dégradation de ladite bactérie.
  7. 7. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en que ledit traitement entraîne la fusion du lysosome avec ladite bactérie.
  8. 8. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce 25 que ladite bactérie de la famille des Chlamydiaceae est une bactérie d'une espèce choisie parmi Chlamydia trachomatis, Chlamydia suis, Chlamydia muridarum, Chlamydophila abortus, Chlamydophila psittaci, Chlamydophila caviae, Chlamydophila pecorum, Chlamydophila felis et Chlamydophila pneumoniae. 30
  9. 9. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que ladite bactérie de la famille des Chlamydiaceae est Chlamydia trachomatis. 20
  10. 10. Utilisation selon l'une des revendications 2 à 9 caractérisée en ce que la pathologie est une pathologie oculaire, une pathologie génitale, une pathologie respiratoire, un dysfonctionnement cardio-vasculaire ou un dysfonctionnement circulatoire.
  11. 11. Utilisation selon la revendication 10 caractérisée en ce que la pathologie oculaire est un trachome.
  12. 12. Utilisation selon la revendication 10 caractérisée en ce que le dysfonctionnement cardio-vasculaire est un athérome.
  13. 13. Utilisation selon la revendication 10 caractérisée en ce que le dysfonctionnement circulatoire est un athérome.
  14. 14. Utilisation selon la revendication 10 caractérisée en ce que la pathologie génitale est 15 choisie parmi le groupe composé du lymphogranulome vénérien, des urétrites, des orchi-épididymites, des cervico-vaginites, des cervicites, des endocervites, des endométrites, des péri-hépatites et des salpingites.
  15. 15. Utilisation selon la revendication 14 caractérisée en que ladite pathologie génitale est 20 une salpingite.
  16. 16. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que la 13-lactame est administrée avec un autre agent thérapeutique. 25
  17. 17. Utilisation selon la revendication 16 caractérisée en ce que ledit autre agent thérapeutique est un agent thérapeutique permettant de traiter les infections et/ou les pathologies causées par un autre agent infectieux.
  18. 18. Utilisation selon la revendication 17 caractérisée en ce que ledit autre agent 30 infectieux est choisi parmi les protozoaires (notamment Trichomonas vaginalis); les champignons avec (Candida albicans); les bactéries anaérobies (Bacteroides, Peptostreptococcus, Gardnerella vaginalis, Gardnerella mobiluncus); d'autres10 bactéries comme Haemophilus ducreyi, Mycoplasma hominis, Streptococcus, Escherichia coli, Staphylococcus, Neisseria gonorrhoeae ; et des infections virales, avec notamment le virus de l'herpex simplex.
  19. 19. Utilisation selon la revendication 18 caractérisée en ce que ledit autre agent infectieux est Neisseria gonorrea ou par Trichomonas vaginalis .
  20. 20. Utilisation selon l'une des revendications 16 à 19 caractérisée en ce que ledit autre agent thérapeutique est choisi dans le groupe constitué de la ceftriaxone, la céfixime, la spiramycine, la spectinomycine, l'azythromycine, l'ofloxacine, la ciprofloxacine, le métronidazole, le tinidazole et le mimorazole.
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