FR2948663A1 - "APTAMERES INHIBITEURS DE L'ACTIVITE DE LA PROTEINE Rad51 HUMAINE ET LEURS APPLICATIONS BIOLOGIQUES" - Google Patents

Abstract

L'invention à pour objet aptamères susceptibles d'être obtenus par la technique SELEX, les aptamères sélectionnés présentant un effet inhibiteur de l'activité recombinase de Rad51 d'au moins 70%, plus spécialement d'au moins 80%. Applications comme inhibiteurs de Rad51, notamment en thérapeutique.

Description

Aptamères inhibiteurs de l'activité de la protéine Rad5l humaine et leurs applications biologiques

L'invention a pour objet des aptamères inhibiteurs de l'activité la protéine Rad5l humaine et leurs applications biologiques. La protéine Rad5l humaine (HsRad5l, désignée par Rad5l) joue un rôle central dans la réparation des cassures double brin de l'ADN, via la recombinaison homologue. Rad5l initie la réaction de recombinaison par la formation d'un filament nucléoprotéique, grâce à l'association coopérative des monomères de Rad5l sur de l'ADN simple brin. Le complexe formé fixe un deuxième ADN double brin, afin d'échanger les brins homologues, étape qui s'accompagne de l'hydrolyse d'ATP. Cette activité est nécessaire à la survie et à la prolifération cellulaire. Cependant, son activité a un effet négatif sur les traitements anticancéreux. Elle est en effet liée à la résistance des cellules cancéreuses aux chimio- et radiothérapies.

On mesure l'intérêt de disposer de produits capables de diminuer la résistance des cellules tumorales aux traitements anticancéreux. Les travaux des inventeurs dans ce domaine les ont amenés à retenir Rad5l comme cible pour le développement de nouveaux agents thérapeutiques. Rad5l chez l'homme est une protéine de 339 acides aminés de poids moléculaire de 36966 Da. Sa séquence primaire est donnée dans le document Listage des séquences et identifiée sous SEQ ID N°1. II s'agit d'une protéine complexe comportant plusieurs domaines, dont un domaine ATPase avec les boucles L1 et L2 de liaison à l'ADN. Elle est d'une part capable de former un homopolymère et d'autre part capable d'interagir avec l'ADN.

Dans leur recherche de ligands de haute affinité et spécificité vis-à-vis de Rad5l, les inventeurs ont utilisé la méthode SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) développée par Tuerk et Gold, (1) et Ellington et Szostak (2). Cette méthode permet d'isoler des séquences d'oligonucléotides de type ARN ou ADN simple brin, à partir d'une banque aléatoire d'oligonucléotides.

Ces séquences ont été désignées par le terme aptamères par Ellington et Szostak, pour décrire leur propriété à interagir de façon spécifique avec d'autres molécules biologiques. Ce terme sera utilisé ci-après indifféremment avec celui d'inhibiteur pour désigner les oligonucléotides selon l'invention.

En opérant dans des conditions déterminées de sélection, les inventeurs ont ainsi isolé des aptamères qui se sont avérés correspondre à des inhibiteurs de fort potentiel sur l'activité de la protéine. L'invention a donc pour but de fournir, en tant que nouveaux produits, des oligonucléotides ou aptamères capables notamment de moduler l'activité de Rad5l et même de l'inhiber ce qui permet notamment, d'augmenter la sensibilité des cellules cancéreuses aux traitements anticancéreux. Elle vise également des moyens pour sélectionner ces aptamères selon la méthode SELEX.

Selon encore un autre aspect, l'invention vise les applications en diagnostic et en thérapeutique de ces aptamères. L'invention vise des aptamères susceptibles d'être obtenus par la technique SELEX, dans laquelle une banque d'ADN simple brin (ADNsb) synthétique, contenant une région centrale aléatoire entourée de régions constantes aux extrémités 5' et 3', utilisées comme sites de fixation pour les amplifications,est incubée avec une molécule cible, les ADN ayant interagi avec la cible étant seuls retenus et amplifiés pour un nouveau tour de sélection, pour enrichir la banque en séquences interagissant spécifiquement avec la protéine cible, les ADN sélectionnés étant clonés et le cas échéant séquencés.

Conformément à l'invention, de tels aptamères sont tels qu'obtenus par un procédé caractérisé en ce que - la molécule cible est la protéine Rad5l, cette protéine étant incubée avec une banque d'ADNsb, en présence d'un tampon de sélection renfermant MgCl2 et ATP, le complexe ADN-Rad5l formé est séparé par électrophorèse et l'ADN retardé extrait du gel, - à chaque tour de sélection, l'ADN sélectionné est ré-amplifié à l'aide des amorces P1 et P2, puis uniquement avec l'amorce P1, et l'affinité relative vis-à-vis de Rad5l est évaluée, l'astringence étant augmentée durant la sélection, les ADNsb issus du dernier tour de sélection sont isolés, clonés dans des plasmides, les plasmides étant ensuite extraits, purifiés et séquencés, les séquences sélectionnées sont regroupées sur la base de leurs similarités et de la présence de motifs consensus, les aptamères ainsi sélectionnés présentant un effet inhibiteur de l'activité recombinase de Rad5l d'au moins 70%, plus spécialement d'au moins 80%. Dans le procédé de sélection ci-dessus, les ADNsb incubés avec la cible sont marqués, par exemple avec un fluorophore IRD. Dans une autre variante, les ADNsb ne sont pas marqués. L'incubation est notamment réalisée 30 min à température ambiante. Des plasmides appropriés pour l'étape de clonage comprennent le plasmide pCR -Blunt IITOPO . Comme illustré par les exemples, ce plasmide a notamment été utilisé pour transformer les cellules E.coli TOPO10, qui ont été mises en culture.

Les aptamères de l'invention sont plus spécialement caractérisés en ce qu'ils présentent un Kd apparent de l'ordre de 40 à 90 nM et comportent environ 60% de bases G-C. Des aptamères préférés répondent aux séquences SEQ ID N°2-10. Avantageusement, la procédure SELEX est initiée avec Rad5l à 2pM en présence de la banque d'ADNsb à 4pM dans un tampon de sélection de pH7,9 renfermant 2mM de MgCl2 et 1 mM d'ATP. Tout au long de la sélection, la concentration de la banque est maintenue à 3-4 pM. De préférence, l'astringence est augmentée durant la sélection, par exemple d'une valeur de 2 à 75.

Dans ces conditions, 7 tours de sélection permettent d'obtenir environ 80 aptamères d'intérêt dont l'analyse in silico conduit à l'établissement de clusters avec des similarités de séquences. Comme le démontrent les résultats donnés dans les exemples, les aptamères de l'invention se liant à Rad5l avec une haute affinité, de l'ordre du nM et inhibent avec une grande efficacité la réaction d'échanges de brins de l'ADN de Rad5l, agissant ainsi sur l'activité de la protéine et non sur son expression. L'utilisation de ces aptamères permet ainsi de manière avantageuse de moduler l'activité de Rad5l. Ces aptamères sont de petites molécules et peuvent donc entrer facilement 30 dans les tissus. Ils peuvent être obtenus et modifiés aisément, par synthèse et de manière générale sont non ou faiblement immunogènes. L'invention vise ainsi l'utilisation des aptamères définis ci-dessus en tant qu'agents thérapeutiques.

Elle vise en particulier des compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles renferment une quantité thérapeutiquement efficace d'au moins un aptamère tel que défini ci-dessus, en association avec un véhicule pharmaceutiquement inerte.

Ces compositions sont avantageusement utilisées dans le cadre de traitements anticancéreux. Ces compositions pharmaceutiques sont caractérisées en ce qu'elles se présentent sous une forme destinée à une administration par voie orale, injectable ou parentérale..

Les doses d'administration seront aisément choisies par le praticien en fonction de l'âge et de l'état du patient. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans les exemples qui suivent dans lesquels il est fait référence aux figures 1 à 8. Ces figures présentent respectivement: Figure 1: l'effet des aptamères de l'invention sur l'activité recombinase de Rad5l Figure 2 : les structures secondaires d'aptamères de l'invention - Figure 3: l'affinité d'aptamères de l'invention pour Rad5l Figure 4: la spécificité d'aptamères sélectionnés selon l'invention Figures 5 et 6: les structures secondaires obtenues par MFoId pour des aptamères de l'invention et des fragments de ce dernier Figure 7: l'étude structurale par CD et UV d'aptamères de l'invention, Figure 8 : l'analyse en composante principale des données obtenues par SELEX.

Matériels et Méthodes 1 - Marqueurs de taille moléculaire Marqueurs d'ADN -SmartLadder (Eurogentec) : Le volume standard utilisé est 5 pL. La solution contient 14 fragments de 200 à 10000 paires de bases (pb) (200, 400, 600, 800, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 4000, 5000, 6000, 8000 et 10000 pb). -Low Molecular Weight DNA Ladder (BioLabs) : Le volume utilisé est 1 pL. La solution contient 11 fragments de 25 à 766 paires de bases (pb) (25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 500, 766 pb). Marqueurs de protéine Le marqueur Precision Plus ProteinTM Standards prestained Broad Range (Bio-Rad) contient 8 protéines de masse molaires comprises entre 6,5 et 210 kDa. Aprotinin 6,5 ; Lysozyme 14,4 ; Trypsin inhibitor 21,5 ; Carbonic Anhydrase 31 ; Ovalbumin 45 ; Serum Albumin (BSA) 66,2 ; Galactosidase 116,3 et Myosin 200 kDa. Le volume utilisé est de 4 pL.

2 - Peptides et oligonucléotides Le peptide correspondant à la boucle L1 de Rad51 biotinylée en N-terminal (biot-L1), biot-RTDYSGRGELSAR, a été synthétisé.

Les oligonucléotides ont été synthétisés. Ils présentent les séquences SEQ ID N°11-16 ci-dessous: SEQ ID N°11 : (P1) : 5'-TAGGGAATTCGTCGACGGATCC-3' SEQ ID N°12 :(P2): 5'- CGG CGC ATG CGT CGA CCT GGA G-3' SEQ ID N°13 (Rec58) : 5'- TCC TTT TGA TAA GAG GTC ATT TTT GCG GAT GGC 15 TTA GAG CTT AAT TGC TGA ATC TGG T- 3' SEQ ID N°14 (Rec32(: 5'- CCA TCC GCA AAA ATG ACC TCT TAT CAA AAG GA-3' SEQ ID N°15 (IRD-Rec32) : 5'- TCC TTT TGA TAA GAG GTC ATT TTT GCG GAT GG- 3' (marqué au fluorophore IRDye en 5') 20 SEQ ID N°16 (Banque d'ADNsb) : 5'- TAGGGAATTCGTCGACGGATCC-(N)50-CTCCAGGTCGACGCA TGCGCCG- 3' (3)

3 - Production et purification de Rad5l Production 25 Transformation de cellules par choc thermique Les bactéries compétentes E.coli JM109 (DE3) sont décongelées à 4°C. 100 pL de la solution sont additionnés à 1-50 ng du vecteur pET15b-HsRad51 et incubés dans la glace pendant 30 min. Le choc thermique est réalisé à 42°C pendant 45 secondes, suivi d'une incubation de 10 minutes dans la glace. Puis, 900 pL de milieu 30 LB préchauffé sont additionnés et le milieu est incubé pendant 60 min à 37°C sous agitation. La solution est par la suite centrifugée à 13000 rpm pendant 5 min. Le culot est repris dans 50 pL du milieu LB et étalé sur boite de LB agar qui contient de l'ampicilline (100 pg/mL) et du chloramphénicol (30 pg/mL), et incubé 16 heures à 37°C.

Culture bactérienne La culture se réalise dans 1 L de milieu LB contenant 1 mL d'ampicilline 100 mg/mL et 30 mg/mL de chloramphénicol avec la totalité du tapis bactérien provenant de la boite LB agar.

La culture est réalisée sous agitation à 30°C jusqu'à une DO à 600 nm de 0,6. Une induction par l'IPTG 1 mM est réalisée pendant 18 h. La culture est centrifugée à 4°C pendant 30 min à 4100 rpm et le culot cellulaire est conservé à -20°C. Purification de Rad5l Purification sur colonne Ni-NTA La protéine Rad5l contient dans sa partie C-terminal une étiquette polyhistidine (6- His), ce qui permet sa purification par chromatographie d'affinité sur colonne de nickel immobilisé. Ce système est basé sur la forte sélectivité et affinité qui possède l'étiquette histidine pour la matrice Ni2+-NTA (acide nitriloacétique) (Qiagen).

Le culot bactérien provenant de 2 L de culture est suspendu dans le tampon A (TrisHCl 50 mM pH 8,0, NaCl 500 mM, imidazole 5 mM, glycérol 10% et .13.-mercaptoéthanol 5 mM). Cette suspension est soumise à une sonication à 4°C (3 x 1'45 à 70%). La solution obtenue est centrifugée à 15000 rpm et 4°C pendant 25 min. Le surnageant obtenu est mélangé à 1 mL de résine Ni-NTA, qui a été préalablement lavée avec du tampon A, puis incubé pendant 60 min sous agitation à 4°C. La protéine est ensuite éluée par un gradient en imidazole (60 mM à 250 mM). Les différentes fractions contenant Rad5l sont rassemblées puis les concentrations de protéines sont estimées par la méthode de Bradford (8), en utilisant l'albumine serum bovine (BSA) comme standard. Afin d'éliminer l'étiquette histidine, les fractions contenant la protéine sont traitées avec de la protéase thrombine (Amersham Biosciences), 1,5 U/ 1 mg de Rad5l. Une dialyse est également réalisée contre 1 L de tampon (20 mM Tris HCI pH 8,0 ; 200 mM KCI ; 0,25 EDTA ; 2 mM ..-mercaptoéthanol) pendant 16-20 h, à 4°C sous agitation. Purification sur colonne échanqeuse d'anions Suite à la dialyse l'échantillon est centrifugé 10 min à 4100 rpm et le surnageant ajouté à la colonne MonoQ (Healthcare Biosciences), et les échantillons récupérés sont soumises à une dernière dialyse en tampon (20 mM TrisHCl pH 8 ; 200 mM KCI ; 0,25 mM EDTA ; 5 mM DTT ; 20% glycérol) pendant 3 h à 4°C. La concentration protéique des différentes fractions est déterminée par la méthode de Bradford. Dosage des protéines par la méthode de Bradford Le dosage des protéines a été réalisé par la méthode de Bradford. A 800 pL de la solution contenant la protéine, 200 pL de réactif Bio-Rad sont ajoutés. Après 15 min d'incubation à température ambiante, l'absorbance est lue à 595 nm. La concentration en protéines est déterminée en référence à une gamme étalon de sérum albumine bovine (2 à 20 pg/mL).

Analyse de la protéine sur SDS-PAGE Afin de visualiser les différentes étapes de purification, un échantillon est prélevé à chaque étape, additionné de tampon de charge en conditions dénaturantes, et dénaturé 5 min à 100°C. Les échantillons sont analysés par électrophorèse en conditions dénaturantes, dans un gel constitué d'une partie supérieure concentratrice et d'une partie inférieure séparatrice. La migration s'effectue à 120 volts. Le gel est ensuite soumis à la coloration de blue de Coomasie pour mettre en évidence les protéines. La présence et la pureté de la protéine sont déterminées par comparaison à un kit de marqueurs (6,5 à 200 kDa, Bio-Rad). 4- Immunodétection de protéines transférées (western blot) Les protéines présentes dans les échantillons sont préalablement résolues par SDS-PAGE puis transférées sur une membrane de nitrocellulose (Hybond TM ECLTM, Amersham Biosciences) dans un tampon de transfert (25 mM Tris base, 192 mM glycine, 20% éthanol) pendant 16 h à 4°C et 90 mA. La membrane est bloquée avec une solution de TTBS (10 mM Tris-HCI pH 7,4 ; 150 mM NaCl, 1% Tween 20) avec 5% BSA pendant 1 h à TA. Pour détecter la protéine Rad5l, la membrane est tout d'abord incubée avec un anticorps monoclonal de souris anti-Rad5l (Rad51 Ab-1 (NeoMarkers) clone 5l Rad01) dilué au 1/10.000 dans le tampon TTBS additionnée de 1% BSA, pendant 1 h à température ambiante.

Après l'incubation, 3 lavages de 5 min sont effectués avec du TTBS. La membrane est alors incubée pendant 45 min avec un deuxième anticorps, anti-souris marqué avec Alexa-Fluor 700 (Molecular Probes) dilué au 1/10000 en TTBS. A partir de cette étape la membrane est protégée de la lumière. Des lavages successifs sont réalisés dans du tampon TTBS pendant 45 min au totale. La détection de la protéine est réalisee en scannant la membrane à l'aide d'un scanner Odyssey (Infrared Imaging System, LI-COR Biosciences), qui détecte la fluorescence du fluorophore IRDye 700. Le marqueur de masse molaire est également détecté. - SELEX 5 Afin d'amplifier la banque utilisée pour les différents tours de sélection, deux différents types de PCR ont été utilisées : une PCR dite classique avec les amorces P1 et P2, qui vont produire des ADN double brin. Ainsi qu'une PCR asymétrique avec seulement PI, qui permet d'obtenir des ADN simple brin. PCR classique L'amplification d'ADN simple brin, a été réalisée avec les amorces P1 et P2 1 à 1 pM, dans un tampon Tris-HCI pH 8,8, 75 mM, 10 mM de KCI, 20 mM de BSA, 0,01% de Tween 20, 0,05% de nonidet P40 en présence de 200 ng d'ADN simple brin, 0,4 mM de dNTPs, 3 mM de MgCl2, et 2,5 U de l'enzyme Taq DNA Polymérase (Invitrogen) pour un volume final de 50 pL. Une dénaturation de 5 min à 94°C est effectuée pour la séparation initiale des brins de l'ADN, suivie de 30 cycles comprenant successivement une étape de dénaturation de 1 min à 94°C, une étape d'accrochage des amorces de 20 sec à 56°C et d'une étape d'extension de 30 sec à 72°C, suivi d'une extension finale de 5 min. PCR asymétrique Pour l'obtention des ADN simple brin, une amplification a été réalisée dans le même milieu que celui décrit ci-dessus, mais en utilisant comme matrice un aliquote d'ADN double brin (5 ng) obtenu par la PCR classique, et qui a été purifié préalablement à l'aide du kit MinElute (Qiagen). Pour la procédure de sélection la PCR asymétrique a été réalisée avec l'amorce P1. Pour le marquage des ADN on utilise la même amorce mais marquée avec le fluorophore IRDye800. Le programme de PCR est le même que pour la PCR classique, seul le nombre de cycles a été diminué à 25 à la fin de sélection. Purification à partir de produits PCR La purification de l'ADN obtenu par PCR (classique ou asymétrique) est réalisé avec le "MinElute PCR Purification Kit" (Qiagen) et en utilisant le protocole préconisé dans ce kit. Extraction et purification d'ADN à partir du gel Afin de récupérer l'ADN provenant de complexes ADN-RAD51 dans un gel d'agarose ou de polyacrylamide, le complexe est excisé du gel et ensuite purifié avec le kit QIAEX II (Qiagen), selon les instructions du fournisseur. Quantification des ADN La quantification des ADN purifiés se fait par mesure de l'absorbance à 260 nm avec un biophotomètre (Eppendorf). Une absorbance égale à 1 correspond à une concentration d'ADN simple brin de 40 pg/cm3 ou d'ADN double brin de 50 pg/cm3. - SELEX contre le peptide LI Pour effectuer la sélection des aptamères contre le peptide L1, un système avidine- biotine a été utilisé, qui permet d'isoler les complexes ADNsb- peptide L1 biotinylé . Avant chaque cycle de sélection la banque d'ADNsb est dénaturée à 90°C pendant 5 min, puis refroidie rapidement dans la glace, suivie de 15 min à température ambiante. Afin d'éviter de sélectionner des ADNsb qui aurait pu interagir avec l'avidine, une contre-sélection a été réalisée systématiquement avant chaque tour. Celle-ci consiste à incuber la banque d'ADNsb (1 pM) avec la résine avidine (80 pL) dans le tampon de sélection A (10 mM Tris-HCI pH 7,9; 30 mM KCI, 100 mM NaCl) pendant 15 min à 37°C dans un volume total de 250 pL. La solution contenant la résine est déposée dans une colonne. Les ADN non retenus sont utilisés pour effectuer un tour de sélection avec le peptide L1 biotinylé. La solution contenant la banque d'ADN (1 pM) est incubée avec le peptide biot-L1 (10 pM au premier tour, et 0,2 pM au cinquième tour, Tableau 111.1 chapitre III) pendant 15 min à 37°C. L'incubation se poursuit en présence de 600 pL de résine avidine pendant 15 min, puis la solution est déposée dans une colonne. Suite aux lavages, les complexes biot-L1/ ADNsb sont élués en 8 fractions de 300 pL avec un tampon PBS renfermant 2 mM biotine. L'absorbance des fractions est mesurée à 280 nm pour repérer les fractions les plus concentrées. L'ADN est extrait des fractions enrichies en complexes Rad51-ADNsb par une extraction au phénol- chloroforme. La phase aqueuse est récupérée par centrifugation (5 min à 4000 rpm), traité à l'éthanol et l'ADN précipité. L'ADNsb obtenu est amplifié comme décrit précédemment. Ces derniers peuvent être utilisés pour un nouveau tour de sélection. Extraction phénol-chloroforme A un volume déterminé de solution contenant l'ADN, le même volume de solution phénol-chloroforme est ajouté, et mélangé vigoureusement. Les phases aqueuses et organiques sont séparées après centrifugation à 6000 rpm pendant 7 min. La phase aqueuse est récupérée. Précipitation à l'éthanol La solution aqueuse contenant l'ADN est ajustée en concentration de cations en ajustant à 0,3 M d'acétate de sodium, et le volume finale déterminé. Deux volume de l'éthanol 100% à 20°C sont ajoutés à la solution, et précipité à -20°C pendant au moins 2 h. La solution est ensuite centrifugée pendant 10 min à 10 000 rpm et 4°C. Le culot est séché et repris dans de l'eau stérile. - SELEX contre la protéine humaine Rad51 La procédure SELEX est initiée avec l'ADN simple brin provenant de la banque initiale. Dès le deuxième tour de sélection, les ADNsb sont obtenus par PCR asymétrique, comme décrit précédemment. Le traitement des ADNsb a été réalisé dans les mêmes conditions que celles décrites pour le peptide L1.

Les ADNsb (autour de 4 pM) sont incubées avec la protéine Rad51 (2 pM au 1er tour et 0,05 pM au 7ème tour, tableau 111.2, chapitre III) dans le tampon de sélection B (20 mM Tris-HCI pH 7,9 ; 2 mM MgCl2, 1 mM ATP, et KCI de 30 à 70 mM) pendant 30 min à 30°C. Dans cette étude la séparation des ADNsb liées et libres est réalisée par gel de retard (gel d'agarose 1% ou de polyacrylamide en conditions natives pour les 2 derniers tours), le complexe ADNRad51 est excisé et récupéré à partir du gel. Les ADNsb sont amplifiés par PCR, comme décrit précédemment. Après sept tours de sélection les ADN simples brins obtenus sont amplifiés par PCR avec les amorces PI et P2, clonés, puis séquencés.

Clonage des séquences sélectionnées Les fragments d'ADN double brin nécessaires au clonage ont été obtenus par PCR classique en utilisant comme matrice 200 ng d'ADN simple brin (provenant du dernier tour de sélection), 0,4 mM de dNTPs, 3 mM de MgCl2, 1 pM des amorces P1 et P2 et 2,5 U de l'enzyme Pfu DNA polymérase haute fidélité (Promega) dans un volume final de 50 pL. L'ADN purifié à l'aide du kit MinElute kit (Qiagen) a été quantifié par absorbance à 260 nm. Par la suite, 160 ng d'ADN ont été mis en présence de 10 ng du plasmide pCR -Blunt IITOPO (Kit Zero Blunt TOPO PCR Cloning, Qiagen) (Figure 11.1), dans un tampon comprenant 50 mM Tris HCI pH 7,4 ; 1 mM EDTA, 2 mM DTT, 0,1% Triton X-100, 100 pg/mL de BSA et 50% de glycérol. Pour la transformation, 6 pL du milieu de clonage sont mélangés avec la souche chimiquement compétente E.coli TOPO10, selon le protocole fourni par le fabricant. Le vecteur pCRO-Blunt II-TOPOO permet une sélection directe des recombinants via l'interruption du gène létal ccdB d'E.coli. Dans le vecteur, le gène ccdB a été fusionné à l'extrémité 5' de la séquence du gène LacZa, codant pour l'extrémité C-terminale du fragment protéique LacZa La ligation d'un produit de PCR franc, obtenu à l'aide de l'enzyme Pfu DNA Polymerase (Promega), interrompt l'expression du gène de fusion LacZa- ccdB et assure, après transformation, la croissance des recombinants positifs. Les transformants sont étalés sur boites gélosée LB en présence de kanamycine 50 pg/mL et incubés dans une étuve à 37°C. Les cellules qui ne contiennent pas le vecteur ne se développent pas. Les colonies isolées sont cultivées dans un milieu liquide LB kanamycine 50 pg/mL pendant 12 h à 37°C. Les plasmides ont été purifiés avec le kit QlAprep Spin (Qiagen) en utilisant les protocoles d'extraction préconisés par le fournisseur. Le séquençage a été réalisé avec l'amorce M13 reverse . - Techniques pour l'étude de l'interaction protéine-acide nucléique Gel de retard et évaluation de l'affinité des aptamères La technique de retardement sur gel permet d'étudier les interactions protéine/acide nucléique in vitro. Le principe est basé sur la différence de migration electrophorétique entre le complexe protéine-ADN et l'ADN seul (Figure 11.2). Plus l'interaction est importante, plus la quantité d'ADN ralenti est importante. Ce retard peut être visualisé sur un gel d'agarose ou sur un gel de polyacrylamide en conditions natives. Les ADN marqués à l'IRDye800 ont été obtenus par PCR en utilisant l'amorce P1 marqué avec ce fluorophore. Les complexes protéine-ADN marqués sont formés dans un milieu réactionnel final de 10 pL. Une quantité fixe d'ADN (aptamère) est incubée avec des concentrations croissantes de protéine Rad51, dans le tampon de sélection B (20 mM Tris- HCI pH 7,9 ; 2 mM MgCl2, 30 mM KCI, 1 mM ATP) additionné de 5 mM DTT et 0,5% Tween, pendant 30 min à 37°C. Les complexes sont résolus dans un gel d'agarose 1%, ou sur un gel de polyacrylamide natif à 6%. Le gel est ensuite scanné dans un scanner Odyssey Infrared Imaging System (LICOR Biosciences). Les bandes obtenues sont quantifiés à l'aide du logiciel Odyssey. Pour calculer le Kd apparent de chaque aptamère, une concentration constante d'aptamère (2,5 nM) marqué à l'IRD800 est incubée 30 min à 37°C avec des concentrations croissantes de Rad5l (0 à 1 pM). Les produits sont alors résolus par gel de retard. Les bandes correspondant au complexe Rad51-aptamère, ainsi que la bande correspondant à l'aptamère seul sont quantifiées. Pour obtenir les valeurs de Kd, nous avons exprimé l'intensité de fluorescence du complexe par rapport à l'intensité totale du puits (ADN complexée + ADN libre). Le Kd correspond à la concentration de Rad5l nécessaire pour lier 50% de l'ADN. Le graphe, ainsi que les courbes de tendance ont été réalisés avec le logiciel SigmaPlot. Méthode dot-blot et évaluation de l'affinité d'une banque d'ADN Lors de la sélection des aptamères contre le peptide L1, l'affinité des ADN sélectionnés a été évaluée par le système de dot-blot. Les ADN marqués à l'IRD800 (10 nM) sont incubés avec des concentrations croissantes en Rad5l (0 à 1 pM) dans le tampon de sélection A, pendant 30 min à 37°C, dans un volume totale de 10 pL. Les échantillons sont dilués à 50 pL final, puis déposés sur une membrane (HAWP 0,45 pm, Millipore) immobilisée dans le système bio-dot (Bio-Rad). Cette membrane a été préalablement traitée à l'alkali avec 0,5 M KOH pendant 20 min (Pileur et al., 2003) pour éviter l'accrochage non spécifique des ADN sur la membrane. Une fois les complexes déposés, la membrane est lavée et scannée. Les spots sont ensuite quantifiés avec le logiciel Odyssey. L'intensité de fluorescence est directement proportionnelle à la quantité d'ADNsb liée à la protéine Rad5l retenue sur la membrane. La normalisation de spots est faite par soustraction du bruit de fond.

Pontage chimique de Rad5l La protéine Rad5l (2 pM) préalablement dialysée dans un tampon PBS avec une unité de dialyse (Slide A layer Mini Dialysis Units, Pierce), a été incubée seule, ou avec différentes concentrations d'ADN sélectionnées pendant 10 min à température ambiante, dans un tampon contenant 20 mM phosphate, 50 mM NaCl, 1 mM MgCl2 and 1 mM d'ATP. La réaction de pontage chimique (Figure 11.3) a été initiée avec l'adition BS3 (bis[sulfosuccinimidyl]suberate, Pierce) à 50 pM et laissée pendant 30 min à température ambiante. Les réactions sont ensuite arrêtées par l'incubation pendant 15 min avec 50 mM Tris-HCI pH 7,5. Les produits sont séparés sur un gel SDS-PAGE 10%, suivi d'un western blotting. La membrane a été scannée et la quantification des bandes correspondantes à Rad5l a été effectuée à l'aide du logiciel Odyssey. Les fonctions ester du crosslinker BS3(ou un analogue DSS) réagissent avec les groupes amine de protéines (-NH2) et forment une fonction amide, très stable, résistante aux conditions dénaturantes. Réaction d'échanqe de brins Cette étude est basée sur la capacité de la protéine Rad5l à échanger les brins d'ADN homologues. La réaction a été réalisée selon Takizawa et collaborateurs (4). L'oligonucléotide simple brin utilisé est nommé Rec58 (58 nt). L'ADN double brin (32 pb) est formé par hybridation des oligonucléotides nommés Rec32 et IRD-Rec32. La protéine Rad5l (0,5 pM) a été incubée avec l'ADN simple brin de 58 nt (100 nM) et en présence ou non des différents aptamères, dans un tampon contenant 20 mM Tris-HCI pH 8,0 ; 1 mM ATP, 1 mM DTT, 100 pg/mL BSA, 20 mM MgCl2, 2 mM créatine phosphate, 75 pg/mL créatine kinase et 2% glycérol, à 37°C for 15 min. La réaction a été initiée par l'adition de l'ADN double brin (32 pb) marqué à l'IRD, et qui présente une partie d'homologie de séquence avec la séquence de 58 nucléotides. La réaction est arrêtée après l h d'incubation à 37°C par l'addition de 0,7 SDS et 0,7 mg/mL protéinase K (Roche Molecular Biochemicals), puis incubé 10 min à 37°C. Les échantillons sont ensuite séparés dans un gel de polyacrylamide 15% en conditions natives, dans un tampon TBE, à 120 volts pendant 90 min environ. La détection de l'ADN marqué et la quantification de produits se font à l'aide du scanner Odyssey. - Spectroscopie La spectroscopie de fluorescence a été utilisée pour étudier l'interaction de la protéine Rad5l avec l'ADN, ainsi que des techniques de dichroïsme circulaire qui renseignent sur les structures secondaires des ADN et des protéines. Ces deux techniques font appel à un phénomène d'absorption de la lumière. Conditions expérimentales de mesures de CD et absorbance Les spectres CD des aptamères (100 pM en nucléotides) ou de Rad5l (0,5 et 1 pM) ont été déterminés à l'aide d'une cuvette de quartz de 0,2 x 1 cm à quatre faces (Hellma) dans un spectromètre J-810 (Jasco) avec des paramètres: largeur de fente : 2 nm ; temps de réponse : 0,125 sec ; intervalle de mesure : 0,1 s ; et 2 accumulations de mesure. Les spectres ont été mesurés dans 150 pL finale dans un tampon contenant 20 mM Tris-HCI pH 7,5 ; 2 mM MgCl2, 30 mM KCI. Le tampon a été filtré sur nitrocellulose et dégazé. Les spectres ont été pris à 20°C, sauf indication contraire. Les spectres d'absorbance ont été obtenus dans un spectromètre J-810 (Jasco) à 260 nm. La température initiale a été 20°C, puis augmenté à 80°C, à raison de 1°C par min. La valeur de la température de fusion (Tm) a été obtenue après les analyses des courbes. Traitement statistique des résultats Lorsque les expériences sont réalisées en triplicata ou plus, les valeurs présentées correspondent aux moyennes écartype de n expériences indépendantes. Les différences entre les moyennes pour les résultats présentés on été évalues statistiquement avec le test de Man & Whitney. Les résultats ont été jugés statistiquement significatifs si p < 0.01. Analyse des motifs et de structure avec MEME et MFold La recherche des motifs consensus a été réalisée avec chaque cluster séparément, et analysée avec le logiciel MEME (Multiple EM for Motif Elicitation, EM étant lui-même le sigle de Expectation Maximization ) (5) (6) (http://meme.nbcr.net/meure/cgi-bin/meme.cgi). Les paramètres utilisés ont été : un maximum de 8 motifs recherchés par cluster, avec une longueur du motif minimum de 6 et maximum de 50, et avec le maximum de nombre d'occurrences du motif. La prédiction de structures secondaires des aptamères a été réalisée avec le logiciel MFold (http://mfold.bioinfo.rpi.edu) (7) avec les conditions : 1 M NaCI et 37°C. Résultats Séquences des aptamères sélectionnés Toutes les séquences obtenues par la procédure SELEX sont présentées dans le tableau 1 ci-après.

Tableau 1

Séquences retenues après SELEX contre HsRad5l (clusters 2, 3, 4, 5) Exemple nomenclature utilisée: Al = Aptamère 1 = Clone 1

Cluster 2 >clone7 TAGGGAATTCGTCGACGGATCCCCGTCAGGGTTCGCACTCCAGGTCGACGCATGCGCC >clonel8 TAGGGAATTCGTCGACGGATCCCCGTCAGGGTTCGCACTCCAGGTCGACGCATGCGCC >clone47 TAGGGAATTCGTCGACGGATCCAGTCAACAACTCCAGGTCGACGCATGCGCC >clone58 TAGGGAATTCGTCGACGGATCCTCAAGTTATGTGGGCTCCAGGTCGACGCATGCGCCG >clone67 TAGGGAATTCGTCGACGGATCCGAGGCGGAAACTCCAGGTCGACGCATGCGCCG >clone75 TAGGGAATTCGTCGACGGATCCCCCTGACACGATCGCTCCAGGTCGACGCATGCGCC >clone7 9 TAGGGAATTCGTCGACGGATCCCGATACGCACTACAAACTCCAGGTCGACGCATGCGCCG >clone8 9 TAGGGAATTCGTCGACGGATCCTGATCGGACTTTACCTCCAGGTCGACGCATGCGCCG

Cluster 3

>clonel0 TAGGGAATTCGTCGACGGATCCAGTCCGTGGTTAGGGAATTCGTCGACGGATCCCTCCAGGTCGAC GCATGCGCCG >clone48 TAGGGAATTCGTCGACGGATCCGAGGAAACACGGGGTGTGGCTAGCCTCCAGGTCGACGCAT GCGCC >clone64 TAGGGAATTCGTCGACGGATCCTGCGTGGTTAGGGATTCGTCGACGGATCCCTCCAGGTCGA CGCATGCGCC >clone68 TAGGGAATTCGTCGACGGATCCAGTCCGTGGTTAGGGAATTCGTCGACGGATCCTCCAGGTC GACGCATGCGCC >clone9O TAGGGAATTCGTCGACGGATCCAGTCCGTGGATAGGGAATTCGTCGACGGATCCGCAGGCTC CAGGTCGACGCATGCGCCG Cluster 4

>clone3 TAGGGAATTCGTCGACGGATCCCGCATGGGAGCCGGCATCTCCTGGGACCATGAACTCGTTC GCTTATATGCCTCCAGGTCGACGCATGCGCCG >clone6 TAGGGAATTCGTCGACGGATCCCGCATGGGAGCCGGCATCTCCTGGGACCATGAACTCGTTC GCTTATATGCCTCCAGGTCGACGCATGCGCCG >clone9 TAGGGAATTCGTCGACGGATCCCGCATGGGAGCCGGCATCTCCTGGGACTATGAACTCGTTC 5 GCTTATATGCCTCCAGGTCGACGCATGCGCCG >clonel7 TAGGGAATTCGTCGACGGATCCCGCATGGGAGCCGGCATCTCCTGGGACCATGAACTCGTTCGCTTATA TGCCTCCAGGTCGACGCATGCGCCG >clone22 10 TAGGGAATTCGTCGACGGATCCCGCATGGGAGCCGGCATCTCCTGGGACCATGAACTCGTTC GCTTATATGCCTCCAGGTCGACGCATGCGCCG >clone27 TAGGGAATTCGTCGACGGATCCCGCATGGGAGCCGGCATCTCCTGGGACCGTGAACTCGTTC GCTTATATGCCTCCAGGTCGACGCATGCGCCG 15 >clone30 TAGGGAATTCGTCGACGGATCCCGCATGGGAGCCGGCATCTCCTGGGACCATGAACTCGTTC GCTTATATGCCTCCAGGTCGACGCATGCGCCG >clone4l TAGGGAATTCGTCGACGGATCCCGCATGGGAGCCGGCATCTCCTGGGACCATGAACTCGTTC 20 GCTTATATGCCTCCAGGTCGACGCATGCGCCG >clone42 TAGGGAATTCGTCGACGGATCCCGCATGGGAGCCGGCATCTCCTGGGACCATGGACTCGTTC GCTTATATGCCTCCAGGTCGACGCATGCGCCG >clone52 25 TAGGGAATTCGTCGACGGATCCCGCATGGGAGCCGGCATCTCCTGGGACCATGAGCTCGTTC GCTTATATGCCTCCAGGTCGACGCATGCGCC >clone55 TAGGGAATTCGTCGACGGATCCCGCATGGGAGCCGGCATCTCCTGGGACCATGAACTCGTTC GCTTATATGCCTCCAGGTCGACGCATGCGCCG 30 >clone72 TAGGGAATTCGTCGACGGATCCCGCATGGGAGCTGGCATCTCCTGGGACATGAACTCGTTCG CTTATATGCCTCCAGGTCGACGCATGCGCCG >clone8O TAGGGAATTCGTCGACGGATCCCGCATGGGAGCCGGCATCTCCTGGGACCATGAACTCGTTC 35 GCTTATATGCCTCCAGGTCGACGCATGCGCCG >clone82 TAGGGAATTCGTCGACGGATCCCGCATGGGAGCCGGCATCTCCTGGGACCATGAACCCGTTC GCTTATATGCCTTCAGGTCGACGCATGCGCCG >clone84 40 TAGGGAATTCGTCGACGGATCCCGCATGGGAGCCGGCATCTCCTGGGACCATGAACTCGTTC GCTTATATGCCTCCAGGTCGACGCATGCGCCG

Cluster 5 45 >clonel TAGGGAATTCGTCGACGGATCCCACGTAGTGGGATCAGGCCCGCGTAATGGTTGCAGTCTGG TCGGAGCCTTCTCCAGGTCGACGCATGCGCC >clone2 50 TAGGGAATTCGTCGACGGATCCAGTGTGCCCGGGGAGCGGGCTTGGCGCGAGGTTGGATCCA CTACTGGGATCTCCAGGTCGACGCATGCGCCG >clone5 TAGGGAATTCGTCGACGGATCCGGGACGCGCCAAAAGCTGGTCGAGTGCGAGTGTTGTGAAC GGATGGTGGTCTCCAGGTCGACGCATGCGCCG >clonell TAGGGAATTCGTCGACGGATCCCACGTAGTGGGATCAGGCCCGCGTAATGGTTGCAGTCTGG TCGGAGCCTTCTCCAGGTCGACGCATGCGCCG >clonel2 TAGGGAATTCGTCGACGGATCCCGCTTTTTAGGACACGGTTCGACTGACTTTGGCGCCTAGA TTGGATTAAGCTCCAGGTCGACGCATGCGCCG >clonel3 TAGGGAATTCGTCGACGGATCCATCCTCAAAGGTTGGACACACATCAATAATAATTGTTCTT GTGGGCTCGCGCTCCAGGTCGACGCATGCGCCG >clonel4 TAGGGAATTCGTCGACGGATCCGACTCGGACGGAGAATAGAGTTGCGTAACTCAATTATGCA 15 CCGAGGGGGACTCCAGGTCGACGCATGCGCCG >clonel5 TAGGGAATTCGTCGACGGATCCCACGTAGTGGGATCAGGCCCGCGTAATGGTTGCAGTCTGG TCGGAGCCTGCTCCAGGTCGACGCATGCGCCG >clonel6 20 TAGGGAATTCGTCGACGGATCCAGTCCGTGGCTAGGGAATTCGTCGACGGATCCAGTCCGTG GTTAGGGAATTCGTCGACGGATCCCCTCCAGGTCGACGCATGCGCCG >clone24 TAGGGAATTCGTCGACGGATCCAGTCTACAAACAGTGTCGCCTGAAGTTATTTCGCTGCTTG GTTCTACGGACTCCAGGTCGACGCATGCGCCG 25 >clone29 TAGGGAATTCGTCGACGGATCCCACGTAGTGGGATCAGGCCCGCGTGATGGTTGCAGTCTGG TCGGAGCCTTCTCCAGGTCGACGCATGCGCC >clone31 TAGGGAATTCGTCGACGGATCCGGTAGACCAGGGCTGATCGGCGGGGTCGGCGCAGAGATGT 30 GTAAGGATAGCTCCAGGTCGACGCATGCGCCG >clone3 6 TAGGGAATTCGTCGACGGATCCATGGCCGAGGCGTGCGTGGGATGGGACACTGCCTGAGGGG TGCACCCAACCTCCAGGTCGACGCATGCGCCG >clone37 35 TAGGGAATTCGTCGACGGATCCCACGTAGTGGGATCAGGCCCGCGTAATGGTTGCAGTCTGG TCGGAGCCTTCTCCAGGTCGACGCATGCGCC >clone38 TAGGGAATTCGTCGACGGATCCGGGACGCGCCAAAAGCTGGTCGAGTGCGAGTGTTGTGAAC GGATGGTGGTCTCCAGGTCGACGCATGCGCCG 40 >clone45 TAGGGAATTCGTCGACGGATCCTGCGTGGTTAGGGAATTCGTCGACGGATCCTGCGTGGTTA GGGAATTCGTCGACGGATCCCTCCAGGTCGACGCATGCGCCG >clone4 9 TAGGGAATTCGTCGACGGATCCACGGGCCGGGCTTCCTAGACAGGGTGTGTTATCGTGGTGT 45 CGGCACGGTGCTCCAGGTCGACGCATGCGCCG >clone53 TAGGGAATTCGTCGACGGATCCCACGTAGTGGGATCAGGCCCGCGTAATGGTTGCAGTCTGG TCGGAGCCTTCTCCAGGTCGACGCATGCGCC >clone60 50 TAGGGAATTCGTCGACGGATCCGTTTAACCGTGTGATCTGTGTTCTGCGCAATCTTGGTGCA GCGGGCCAACCTCCAGGTCGACGCATGCGCCG >clone62 TAGGGAATTCGTCGACGGATCCTGGTGGCAGGTGGGACGTGAGCGCGGAGCACGGAGGCGCC AGACTCGTGACTCCAGGTCGACGCATGCGCCG >clone63 TAGGGAATTCGTCGACGGATCCGAAGGATCCGGCAGTGGAGCTTGGTGTGGAACGTTTAGCA TCCAAAGGTGCTCCAGGTCGACGCATGCGCC >clone69 TAGGGAATTCGTCGACGGATCCGACTCGGACGGAGAATAGAGTTGCGTAACTCAATTATGCA CCGAGGGGGACTCCAGGTCGACGCATGCGCCG >clone7l TAGGGAATTCGTCGACGGATCCGAAAGTTGCCGACTGGGATGTTTTCACTTGGGGTAAGGAA CGGGGGGGTCTCCAGGTCGACGCATGCGCCG >clone7 6 TAGGGAATTCGTCGACGGATCCAGTGGCGGAGGGGTGCATGGCCGCGGGGGTGCCGTGGGCT 15 ATACTTCGATCTCCAGGTCGACGCATGCGCCG >clone77 TAGGGAATTCGTCGACGGATCCCACGTAGTGGGATCAGGCCCGCGTAATGGTTGCAGTCTGG TCGGAGCCTTCTCCAGGTCGACGCATGCGCC

20 >clone78 TAGGGAATTCGTCGACGGATCCTGGTCATCGCGGTGTGGTGGTACGGAGATCTTGGTCTACA GCTCCTTGGCTCCAGGTCGACGCATGCGCCG >clone83 TAGGGAATTCGTCGACGGATCCCACGTAGTGGGATCAGGCCCGCGTAATGGTTGCAGTCTGG 25 ACGGATCCCCTCCAGGTCGACGCATGCGCCG >clone87 TAGGGAATTCGTCGACGGATCCGCCTAGAACGCTCCCGCACAGGGTACGGTGGGATGTGGGT TGGGGCTACCCTCCAGGTCGACGCATGCGCCG Analyse in silico des séquences des aptamères sélectionnés Cette analyse in silico consiste à comparer toutes les séquences 2 à 2, ce qui a permis de construire une matrice de distance représentative de leur homologie respective. Dans cette matrice où chaque ligne/colonne représente une séquence, plus deux séquences nucléotidiques sont proches, plus la distance qui les sépare sera faible. Inversement, plus deux séquences sont éloignées, plus la distance qui les sépare sera grande. Cette matrice de distance peut être représentée sous la forme d'un arbre hiérarchique. L'approche des inventeurs a consisté alors à isoler les séquences similaires pour un seuil donné. Le seuil fixé pour cette analyse a permis d'identifier 6 clusters de séquences d'ADN. Pour une meilleure visualisation des résultats, la distribution des séquences est représentée en utilisant une analyse des données en composante principale (ACP) Jackson, (9). On recherche pour cela les axes de représentation (i.e. les composantes) qui expliquent le maximum de variance associé à la distance entre chaque séquence. On prend ainsi en compte les deux composantes les plus significatives. La première composante prend en compte 84,36% des écarts de données, et la deuxième composante prend en compte 7,8%, soit un total de 92,16% de la variation initiale du SELEX représentée par ces deux axes. Cette filtration et la représentation associée donne un aperçu de la distribution des données en fonction de la similarité des séquences (Figure 8). Chaque nuage de point sera alors considéré comme représentatif d'un cluster. Une analyse détaillée des clusters montre que les clusters les plus éloignés du centre de la représentation (i.e. barycentre des données) renferment les séquences les plus divergentes (i.e.variance la plus élevée par rapport à la moyenne des autres séquences). Chaque séquence obtenue est associée à un cluster donné. Les aptamères retenus pour la suite sont indiqués dans chaque cluster (A7, A13, A30, A45, A47, A48, A77, A79 et A90). Effet des aptamères sur l'activité d'échange de brins de Rad5l Des essais portant sur l'activité d'échange de brins de Rad5l ont été réalisés pour évaluer l'effet des inhibiteurs de l'invention. Le protocole de Takizawa et collaborateurs (4) a été utilisé. Brièvement, la protéine Rad5l est incubée avec un ADN simple brin substrat de 58 nucléotides (nt). La réaction est initiée par l'addition d'un ADN double brin de 32 pb marqué avec un fluorophore (IRDye800), qui présente un brin homologue à la séquence de 58 nt. Lorsqu'il existe une activité d'échange de brins, on observe l'apparition d'une bande d'ADN simple brin de 32 nt. Les séquences de l'invention, ne présentant pas toutes des tailles identiques, les concentrations sont exprimées en équivalent nucléotides (concentration en nucléotides = concentration molaire x nombre de nucléotides de la séquence entière) afin d'homogénéiser les résultats. Les concentrations molaires sont présentées dans le Tableau 2 ci-dessous. La taille de chaque aptamère est indiquée. Les concentrations molaires (nM) et en équivalent nucléotides (5pM) utilisées pour l'étude de l'activité d'échange de brins sont présentées.

Tableau 2 Aptamère Taille (nucléotides) Concentration en Concentration nucléotides (pM) molaire (nM) A7 58 5 86 A47 52 5 96 A79 60 5 83 A48 67 5 75 A90 81 5 62 A30 94 5 53 A13 95 5 53 A45 105 5 48 A77 93 5 54 Pour tester l'effet des aptamères sur l'activité d'échange de brins, la protéine Rad51 est incubée avec l'ADN simple brin substrat en présence ou en absence des aptamères. Ensuite, l'apparition de la bande d'ADNsb de la réaction est détectée et quantifiée. Les résultats sont donnés dans les figures 1A et 1B: (A) L'inhibition de l'activité recombinase de Rad5l (0,5 pM) par les aptamères sélectionnés (5 pM en nucléotides) a été détectée par séparation des produits sur un gel de polyacrylamide en conditions natives. Le contrôle ADN double brin (ADNdb) et l'activité contrôle en absence d'aptamère sont également montrés. (B) Les gels ont été scannés et les bandes d'intérêt quantifiées avec le logiciel Odyssey (LI-COR). La quantification de 3 expériences indépendantes est présentée après normalisation par rapport au contrôle. L'ADNdb marqué seul migre dans un gel natif de polyacrylamide sous la forme d'une seule bande. En l'absence d'aptamère, l'activité d'échange de brins conduit à l'apparition d'une bande d'ADN simple brin (ADNsb) (puits 2, activité contrôle). Cette activité d'échange de brins sera considérée comme activité de référence (égale à 1 dans la figure IB). L'activité est ensuite évaluée en présence des différents aptamères (puits 3 à 11).

Les résultats obtenus montrent que tous les inhibiteurs testés présentent un effet inhibiteur de l'activité recombinase de Rad5l. Les aptamères A79, A13 et A30 inhibent l'activité d'environ 70-80% (soit 83 nM pour A79 et 53 nM pour A13 et A30). Les résultats obtenus montrent que les aptamères sélectionnés en augmentant l'astringence lors des tours de sélection, la concentration en sel et le ratio Rad5l: ADN ont un effet inhibiteur sur l'activité d'échange de brins de Rad5l. En présence des aptamères A79, A30 et A13, l'activité d'échange de brins (ou activité recombinase) est diminuée d'un facteur proche de 4. Une analyse statistique des résultats (test de Mann & Whitney) indique que l'effet inhibiteur de A79 est significatif (p < 0,01) en comparaison à d'autres aptamères de taille similaire (A7, A47 et A48). L'inhibition observée en présence des aptamères A30 et A13 est également statistiquement significative (p < 0,01) par rapport à l'effet des aptamères A45, A77 et A90, de taille similaire. II est à noter la différence sur l'inhibition de l'activité recombinase par les aptamères A79 et A47, appartenant au cluster 2. Leur composition nucléotidique et leurs respectives structures secondaires déterminées avec MFold 37°C sont très similaires. On observe notamment dans ces structures secondaires une différence au niveau de la taille de la boucle fermée (Figure 2).

Caractérisation des inhibiteurs de l'invention Affinité des aptamères pour Rad5l Les aptamères A30, A13 et A79 ont été marqués par un fluorophore (IRDye800) et leur affinité relative vis-à-vis de la protéine évaluée par la technique de gel de retard. Les résultats sont donnés sur la Figure 3 (A) Les différents aptamères marqués à l'IRDye800 (2,5 nM) sont incubés en présence de concentrations croissantes de Rad5l (0-1 pM). Après séparation du milieu réactionnel par électrophorèse en gel d'agarose 1.5%, les bandes correspondant à l'aptamère libre et lié à Rad5l sont quantifiées. Dans chaque expérience, l'intensité de la bande correspondant à l'aptamère libre est prise comme référence (100%). (B) Les bandes correspondant aux aptamères libres et liés sont quantifiées et les résultats exprimés en % d'aptamères liés à la protéine. La constante de dissociation (Kd apparent) de chaque aptamère est calculée à partir de l'équation de la courbe de tendance. Le Kd correspond à la concentration de Rad5l à laquelle 50% de l'ADN est libre.

Les aptamères marqués à l'IRD sont incubés avec des concentrations croissantes en Rad5l et résolus sur un gel d'agarose. Le gel est scanné et les bandes quantifiées. Les résultats montrent que le Kd apparent est de 40 6 nM pour A79, de 72 25 nM pour A30, et de 76 12 nM pour A13. L'affinité de la banque initiale utilisée pour la sélection a également été évaluée et présente un Kd apparent majeur à 200 nM, ce qui nous confirme que les aptamères sélectionnés présentent une affinité accrue vis-à-vis de Rad5l. Les aptamères A13 et A30 présentent des valeurs de Kd apparent très similaires. Ces deux aptamères ont également des effets similaires sur l'inhibition de l'activité recombinase, ainsi que sur la liaison à l'ADN et sur l'oligomérisation de Rad5l. Comme décrit précédemment, A79 paraît moduler Rad5l d'une manière différente de A13 et A30.

Spécificité des aptamères pour Rad5l Afin de confirmer la spécificité des aptamères de l'invention, leur interaction avec l'homologue bactérien RecA, a été testée. Les expériences ont également été réalisées par gel retard. Les aptamères A30 et A79 marqués à l'IRDye800 (2,5 nM) sont incubés en présence de concentrations croissantes de RecA (0-1000 nM).

Après séparation du milieu réactionnel par électrophorèse en gel d'agarose 1.5%, aucune bande correspondant au complexe RecAaptamère n'est observée. Les résultats sont donnés sur les Figures 4A et 4B. Les résultats obtenus font nettement apparaître que A30 et A79 n'interagissent pas avec la protéine RecA ajoutée à des concentrations allant jusqu'à 1 pM, ce qui démontre la très haute sélectivité vis-à-vis de la protéine Rad5l humaine des aptamères inhibiteurs de l'invention.

Etudes structurales des aptamères A30 et A79 Les aptamères A79 et A30 ont été fragmentés de façon à prendre en compte les différentes parties de la séquence, et à maintenir des structures secondaires. Les structures obtenues sont représentées sur les Figures 5A et 5 B: (A) L'aptamère A30 a été fragmenté en 3 segments A30-1, A30-2, et A30-3 correspondant respectivement aux segments 1-31, 32-62, 63-94 de la séquence entière. (B) Les structures secondaires prévisionnelles de l'aptamère A30 entier et des fragments A30-1, A30-2, et A30-3 obtenues par MFold à 37°C sont présentées. Les séquences des différents segments des aptamères ont été analysées avec le logiciel en ligne MFold (7) (http://mfold.bioinfo.rpi.edu/).

L'aptamère A30, de 94 nucléotides (nt) a été découpé en 3 fragments d'environ 32 nt. Les structures secondaires prévisionnelles des différents fragments ont également été déterminées (Figure 5). L'aptamère A79 de 60 nt a été découpé en 4 fragments de tailles comprises entre 23 et 38 nt. Les structures secondaires prévisionnelles des différents fragments ont été également déterminées. Les résultats ont donnés sur la Figure 6: (A) L'aptamère A79 a été fragmenté en 4 segments A79-1, A79-2, A79-3 et A79-4 correspondant respectivement aux segments 1-35, 23-58, 12-49 et 27-49 de la séquence entière. (B) Les structures secondaires prévisionnelles de l'aptamère entier et les fragments A79-1, A79-2, A79-3 et A79-4 obtenues par MFold a 37°C sont présentées. Les résultats montrent que les deux aptamères (A30 et A79) forment des structures en tige- boucle connues pour favoriser la stabilité des acides nucléiques simples brins (ADN et ARN). Cette stabilité est également liée à la composition en bases, l'appariement entre guanine (G) et cytosine (C) favorisant la stabilité par rapport à l'appariement entre adénine (A) et thymine (T), dû au nombre de liaisons hydrogènes (3 liaisons pour G-C, contre 2 liaisons pour A-T). De plus, l'aptamère A30 comporte 61% de nucléotides G-C et 59% pour A79, ce qui contribue à la stabilisation de leur structure. La structure d'A30 est plus complexe, formant 4 boucles fermées, ainsi que 3 tiges avec plusieurs liaisons GûC (..G = -13,20 kcal/mol à 37°C, déterminé par MFold). L'aptamère A79 forme une structure visiblement moins complexe, avec un nombre plus faible de liaisons G-C qu'A30 (..G = -6,07 kcal/mol à 37°C, déterminé par MFold).

Étude de la structure des aptamères La structure des aptamères a été étudiée en utilisant le dichroïsme circulaire (CD, pour Circular Dichroism). La température induit des changements dans la structure des acides nucléiques. Le spectre des aptamères A79 et A30 a été étudié à différentes températures, pour des longueurs d'onde comprises entre 220 et 340 nm. Les résultats sont donnés sur la Figure 7: (A) Des spectres CD ont été obtenus à 20°C et à 80°C dans un tampon TrisHCl. Les 2 aptamères présentent une courbe positive à 275 nm et une courbe négative à 245 nm. (B) Des courbes CD des aptamères ont été mesurés à longueur d'onde constante de 275 nm. Des courbes en fonction de la température ont été obtenues, en montant la température de 20°C à 80°C et en descendant la température. (C) Des courbes d'absorbance ont été mesurées à 260 nm avec des variations de températures comme décrit en (B). L'amplitude du signal à ces deux longueurs d'onde est maximale à 20°C, et diminue d'environ 50% lorsque la température atteint à 80°C, ce qui reflète une perte de la structure. Cet effet majeur peut être expliqué par une chiralité des aptamères moins importante induite par un plus faible appariement et empilement des bases à 80°C. Des courbes CD et UV ont été obtenues en augmentant la température (de 20°C à 80 °C) et par la suite en descendant la température (de 80°C à 20°C). Les spectres CD montrent un point d'inflexion, qui correspond à un changement de la structure de l'aptamère, et qui corresponde au Tm (température de fusion). Ceci peut être visualisé également dans les courbes d'absorbance UV. La Tm pour l'aptamère A79 est de 55°C et la Tm pour A30 est de 40°C. La composition en bases des aptamères A30 et A79 montre qu'ils présentent 61% et 59% de bases G-C. Ce haut contenu en liaisons G-C pourrait expliquer la présence de structures secondaires. L'aptamère A30 contient 30% de G, 31% de C, 18% de A et 21% de T. L'aptamère A79 contient 27% de G, 32% de C, 25% de A et 16% de T.

Références Bibliographiques

1 - Tuerk et Gold 1990,, Science 249: 505-510 2 - Ellington et Szostak, 1990, 346: 812-822 3 - Fukusaki et al., 2000, Bioorg med Chem lett 10: 423-5 4 - Takisawa et al., 2004, genes to Cells, 9, 781-790 5 - Bailey & Elkan, 1994, Proc Int Conf Intell Syst Mol Biol, 2, 28-36, 6 - Bailey et al., 2006, Nucl.Acids Res.34: W369-373 7 - Zucker, 2003, Nucl.Acids Res.31: 3406-3415, 8 - Bradford, 1976, Anal Biochem, 72, 248-254, 9 - Jackson, 1991, A User's Guide to Principal Components, Wiley N.Y.

Claims (1)

1. Revendications1 - Aptamères susceptibles d'être obtenus par la technique SELEX dans laquelle une banque d'ADN simple brin (ADNsb) synthétique contenant une région centrale aléatoire entourée de régions constantes aux extrémités 5' et 3', utilisées comme sites de fixation pour les amplifications, est incubée avec une molécule cible, les ADN ayant interagi avec la cible étant seuls retenus et amplifiés pour un nouveau tour de sélection, pour enrichir la banque en séquences interagissant spécifiquement avec la protéine cible, les ADN sélectionnés étant clonés, caractérisés en ce que la molécule cible est la protéine Rad5l, cette protéine étant incubée avec une banque d'ADNsb, en présence d'un tampon de sélection renfermant MgCl2 et ATP, le complexe ADN-Rad5l formé est séparé par électrophorèse et l'ADN 15 retardé extrait du gel, - à chaque tour de sélection, l'ADN sélectionné est ré-amplifié à l'aide des amorces P1 et P2, de séquence SEQ ID N°11 et SEQ ID N° 12 respectivement, puis uniquement avec l'amorce P1, et l'affinité relative vis-à-vis de Rad5l est évaluée, 20 l'astringence étant augmentée durant la sélection, les ADNsb issus du dernier tour de sélection sont isolés, clonés dans des plasmides, les plasmides étant ensuite extraits, purifiés et séquencés, les séquences sélectionnées sont regroupées sur la base de leurs similarités et de la présence de motifs consensus, 25 les aptamères ainsi sélectionnés présentant un effet inhibiteur de l'activité recombinase de Rad5l d'au moins 70%, plus spécialement d'au moins 80%. 2 û Aptamères selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils présentent un Kd apparent de l'ordre de 40 à 90 nM et comportent environ 60% de bases G-C. 3 û Aptamères selon la revendication 1 ou 2, caractérisés en ce qu'ils répondent aux 30 séquences SEQ ID N°2-10. 4 û Aptamères selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 pour une utilisation comme inhibiteurs de Rad5l. 5 û Compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles renferment une quantité thérapeutiquement efficace d'au moins un apatamère selon l'unequelconque des revendications 1 à 3, en association avec un véhicule pharmaceutiquement inerte. 6 ù Compositions pharmaceutiques selon la revendication 5, caractérisées en ce qu'elles se présentent sous une forme destinée à une administration par voie orale, 5 injectable,parentérale.