FR2939318A1

FR2939318A1 - Systeme d'encapsulation pour imagerie cest avec quelate q superieur ou egal a 2

Info

Publication number: FR2939318A1
Application number: FR0858457A
Authority: FR
Inventors: Marc Port
Original assignee: Guerbet SA
Current assignee: Guerbet SA
Priority date: 2008-12-10
Filing date: 2008-12-10
Publication date: 2010-06-11
Anticipated expiration: 2028-12-10
Also published as: US20110243859A1; FR2939318B1; EP2373350A2; WO2010066815A3; WO2010066815A2

Abstract

La présente invention concerne une composition pour imagerie CEST comprenant un système d'encapsulation encapsulant au moins un agent CEST constitué par un chélate de métal de type q ≥ 2, ledit chélate étant libre à l'intérieur du système d'encapsulation.

Description

La demande concerne des agents de contraste pour imagerie CEST. Le brevet WO2004032705 décrit des produits de contraste destinés à l'imagerie CEST, comportant des systèmes d'encapsulation de type nanoparticules lipidiques (notamment liposomes et émulsions doubles) capables d'inclure une phase aqueuse et ayant un effet en imagerie CEST. Ces systèmes d'encapsulation (ES) de WO2004032705 incorporent, associés à leur membrane ou libres à l'intérieur du compartiment délimité par cette membrane, des chélates capables de chélater des ions de métaux à effet CEST (agents CEST également désignés agents de shift). Les métaux à effet CEST (utiles en imagerie CEST) sont connus de l'homme du métier, il s'agit notamment des éléments suivants : Fer (II), Cu(II), Co(II), Erbium (II), Nickel (II), Europium (III), Dysprosium (III), Gadolinium (III), Praseodynium (III), Neodinium (III), Terbium (III), Holmium (III), Thulium (III), Ytterbium (III). Le besoin demeure d'améliorer encore la sensibilité de tels agents de contraste CEST. En particulier, il n'est pas toujours aisé de bien distinguer le signal en imagerie CEST de tels systèmes CEST associé à une certaine valeur mesurée de déplacement chimique Delta, du signal endogène de molécules notamment de protéines porteuses de fonctions amides. Il est rappelé que ce signal endogène correspond à un déplacement Delta inférieur ou égal à une valeur proche de 4 ppm aux fréquences d'irradiation appropriées. Il s'agit ainsi pour l'homme du métier de réussir à obtenir un signal distinctif pour le produit de contraste injecté au patient, et en particulier d'augmenter suffisamment la valeur Delta pour le produit, pour obtenir une valeur supérieure à environ 4 ppm. Grâce à des études complémentaires, le demandeur a fait des essais approfondis sur certains chélates et a démontré une efficacité toute particulière de chélates de type q supérieur ou égal à 2, en particulier de chélates de type q=2 et q=3, et cela particulièrement avantageusement lorsque ces chélates sont libres à l'intérieur du système d'encapsulation. On rappelle que la valeur q correspond au nombre de molécules d'eau en situation d'échange avec le chélate. Par ailleurs, afin de limiter l'osmolalité du produit injecté, le demandeur a également amélioré les systèmes de l'art antérieur en utilisant des chélates sous forme de complexes multimériques de chélates. Il est rappelé en effet qu'un problème supplémentaire consiste à réussir à obtenir des systèmes dont l'osmolalité à l'intérieur du système d'encapsulation n'est pas trop élevée, et en particulier est voisine de celle du sang (300moOsm/Kg). En effet si l'osmolalité est trop différente entre l'intérieur et l'extérieur du système, celui-ci risque de se déformer et d'être endommagé (explosion ou implosion notamment). Comme décrit plus loin, le demandeur a en particulier utilisé des multimères non chargés qui permettent d'obtenir à la fois une grande quantité de chélates encapsulés dans le système pour accroître le signal et l'osmolalité réduite avantageuse.

A cet effet l'invention concerne selon un premier aspect une composition pour imagerie CEST comprenant un système d'encapsulation ES encapsulant au moins un agent CEST constitué par un chélate de métal de type q > 2, ledit chélate étant libre à l'intérieur du système d'encapsulation. Avantageusement, l'agent CEST est totalement encapsulé dans la phase aqueuse du système d'encapsulation.

On entend par l'expression chélate libre à l'intérieur du système d'encapsulation , que le chélate ne porte pas de groupes d'ancrage (groupes lipophiles en particulier) qui permettent une liaison covalente avec la membrane interne du système d'encapsulation. Le chélate n'est donc pas lié de façon covalente au système d'encapsulation, en particulier à la paroi du système d'encapsulation. En particulier ce chélate n'est pas modifié par l'adjonction d'un groupe lipophile tel que décrit dans l'exemple 3 de la demande de brevet WO2004032705 ou du type phospholipide ou à longue chaîne carbonée (par exemple plus de 15 à 20 atomes de carbones). Avantageusement, il s'agit donc d'un chélate hydrophile, c'est-à-dire soluble dans une phase aqueuse.

Dans la demande, on désigne par le terme chélate de type q> 2 ou plus simplement chélate q > 2 , tout chélate présentant un échange de q molécules d'eau dans la sphère interne ou la seconde sphère du chélate, avec q> 2. Cela inclut le cas des chélates de type q=n, n étant supérieur à 2, notamment q=2 et q=3.

Avantageusement le chélate q=2 est choisi parmi : PCTA, DO3A, DO3MA, AAZTA, HOPO et leurs dérivés, de préférence il s'agit du PCTA ou du DO3A, avantageusement du PCTA. Avantageusement les chélates q=3 sont choisis parmi : HOPO (hydroxypyridinone), PC2A, BP2A, TX (texaphyrine), NOVAN, N6-Ll et leurs dérivés, avantageusement 10 parmi HOPO, PC2A, BP2A et Tx. Parmi les dérivés q > 2 connus de l'art antérieur on citera en particulier les composés du tableau suivant, ceux décrits dans Chemical Reviews, 1999, vol 99, n°9, 2293, et tout dérivé pouvant être prédit par chimio-informatique, la méthode de prédiction étant décrite par exemple dans Inorg Chem, 1996, 35 , 7013-7020, Bioconjugate Chem, 15 1999, 10 ,958-964, Bioconjugate Chem, 2004, 15, 1496-1502. chélate Valeur q Référence PC2A 3 Chem Reviews, 1999, 99,9,p 2328-2329 PCTA et dérivés 2 Chem Reviews, 1999, 99,9,p 2328-2329 Et Coordination chemistry Reviews, 251, 2007, 2428-2451 composés 47,48,50 BP2A 3,5 Chem Reviews, 1999, 99, 9, p 2328-2329 NOVAN 4 Chem Reviews, 1999, 99, 9, p 2328-2329 Tx 3,5 Chem Reviews, 1999, 99, 9, p 2328-2329 N6-Ll 3 Chem Reviews, 1999, 99, 9, p 2328-2329 DO3A et dérivés 2 Inorg.Chem, 1996, 35, p7013-7020 et Coordination chemistry Reviews, 251, 2007, 2428-2451, composés n°13,14,21,27,28,30,31,32,33,34,35-36, et composés 53,54,55,56 DO3MA 2 Inorg.Chem, 1996, 35, p7013 MeDTPA 2 Inorg.Chem, 1996, 35, p7013 MeDTA 2 Inorg.Chem, 1996, 35, p7013 Me2DETA 2 Inorg.Chem, 1996, 35, p7013 NOTMA 2 Inorg.Chem, 1996, 35, p7013 DO2A 3 The Chemistry of contrast agents in medical MRI, A.Merbach, 2001, chap 2, p44-119, relaxivity of gadolinium III complexes PDTA 2 The Chemistry of contrast agents in medical MRI, A.Merbach, 2001, chap 2, p44-119, relaxivity of gadolinium III complexes TTAHA 2 The Chemistry of contrast agents in medical MRI, A.Merbach, 2001, chap 2, p44 Taci 2 The Chemistry of contrast agents in medical MRI, A.Merbach, 2001, chap 2, p44 Composé 3 Coordination chemistry Reviews, 251, 2007, bipyridinique 51, 2428-2451 52 et dérivés Composés de 2 à 3 Angewandte Chem Int Ed, 2008, 47, 2 à 15 type HOPO et Chélates des composés de la figure 6 dérivés -',•. . n".n ees ;.:.e, n,n. 011.,k.s,ns ei't';Z,.':^ 1'1•'':,'i. ..M. ä 'e)e . e.-,,<,,- Avantageusement les métaux sont choisis parmi les suivants Fer (II), Cu(II), Co(II), Erbium (II), Nickel (II), Europium (III), Dysprosium (III), Gadolinium (III), Praseodynium (III), Neodinium (III), Terbium (III), Holmium (III), Thulium (III), Ytterbium (III) ; et de préférence parmi : Dy3+, Tb3+, Tm3+,Yb3+, Eu3+, Gd3+, Er3+ et Ho3+, en particulier parmi Dy3+, Tb3+, Tm3+,Yb3+, Eu3+, Gd3+.. Avantageusement les chélates sont choisis parmi PCTA Tm, DO3A Tm, HOPO Tm, AAZTA Tm, PCTA Dy, DO3A Dy, HOPO Dy et AAZTA Dy, avantageusement parmi PCTA-Tm, PCTA-Dy, DO3A-Tm et DO3A-Dy.

Dans la demande, on désigne par le terme système d'encapsulation (ES) les liposomes ou tout autre système capable d'inclure une phase aqueuse contenant un agent CEST (chélate associé à un métal actif en CEST) qui permet d'apporter un effet en imagerie CEST, ce qui inclut notamment les liposomes (bicouche lipidique), les émulsions doubles eau/huile/eau, les émulsions eau dans huile, les micelles inverses dans un solvant organique (monocouche lipidique avec une partie polaire tournée vers l'intérieur du micelle de manière à ménager un espace aqueux dans le compartiment délimité par le micelle). Les définitions de ces systèmes sont bien connues et par exemple rappelées sur http://en.wikipediaorg/wiki/J\4icelle. Ainsi avantageusement on entend par liposome une vésicule sphérique ou non sphérique dont le centre est occupé par une cavité aqueuse et dont l'enveloppe est constituée par un nombre variable de feuillets bimoléculaires à base de phospholipides. Avantageusement il s'agit de liposomes non sphériques. Les liposomes peuvent être multi lamellaire, c'est-à-dire comporter plusieurs compartiments concentriques et plusieurs parois (lamelles ou feuillets).

Avantageusement, le diamètre de la cavité aqueuse va de 100 à 150 nm, la distance entre les feuillets est de l'ordre de 1,8 nm et l'épaisseur de chaque feuillet va de 4,8 à 6,9 nm de diamètre total et entre 0,4 et 3,5 micromètres. Avantageusement les liposomes selon la présente invention ont un diamètre, dans le cas des liposomes sphériques, ou une plus grande dimension, dans le cas des liposomes non sphériques, comprise entre 20 et 500nm, avantageusement entre 20 et 200 nm. Avantageusement les liposomes sont obtenus à partir de phospholipides. Ils sont en particulier décrits dans la demande de brevet WO2004032705. Ils peuvent se former spontanément par dispersion de lipides, en particulier de phospholipides, dans un milieu aqueux par des techniques conventionnelles telles que celles décrites dans WO92/21017 qui inclut la sonication, l'homogénéisation, la microémulsification et la formation spontanée par hydratation d'un film lipidique sec. En particulier, au sens de la présente invention, on entend par micelle un agrégat sphéroïdal de molécules possédant une tête polaire hydrophile dirigée vers le solvant aqueux et une chaine hydrophobe dirigée vers l'intérieur. Les micelles inverses ont quant à elles une chaine hydrophobe dirigée vers le solvant organique et une tête polaire hydrophile dirigée vers l'intérieur. Selon des réalisations, le système d'encapsulation (avantageusement liposome) comprend plusieurs agents CEST identiques ou différents. Ainsi, ce système d'encapsulation encapsule au moins un chélate q > 2 mais également au moins un autre chélate différent par exemple choisis parmi les catégories suivantes : a) un chélates de type q > 2 , par exemple un autre chélates q=2 b) un chélate q=1 Cet autre chélate peut ne pas être libre à l'intérieur du système d'encapsulation et par exemple être associé à la membrane du système d'encapsulation. Avantageusement, il est libre à l'intérieur du système d'encapsulation. Ainsi, le système d'encapsulation selon l'invention encapsule ainsi a) plusieurs chélates identiques ou différents entre eux et de type q > 2 , par exemple plusieurs chélates q=2 b) au moins un chélate q> 2 et au moins un chélate q=1 c) au moins un chélate q=2 et au moins un chélate q> 2 Pour chacune de ces catégories, les agents de shift (c'est à dire le métal) sont identiques ou différents entre les chélates.

Selon des réalisations, la composition comprend plusieurs systèmes d'encapsulation (avantageusement liposome) avec plusieurs agents CEST différents, par exemple la composition est un mélange de liposomes encapsulant un chélate de type q>2 et de liposomes encapsulant un chélate de type q=2 ou de type q=1 On aura par exemple : a) des liposomes différents dans un agent de contraste, par exemple des liposomes encapsulant un premier chélate avec un premier métal, et des liposomes encapsulant un autre chélate avec un autre métal ; on aura par exemple une composition comprenant des liposomes encapsulant un ou plusieurs chélates PCTA-Tm et des liposomes encapsulant un ou plusieurs chélates DO3A-Ym b) des liposomes incluant chacun des métaux différents ; on aura par exemple une composition de liposomes identiques, chaque liposome encapsulant par exemple un ou plusieurs chélates PCTA-Tm et un ou plusieurs chélates DO3A-Ym ou un ou plusieurs chélates PCTA-Tm et un ou plusieurs chélates PCTA-Ym.

On comprend ainsi que les différentes combinaisons sont possibles.

Dans un mode de réalisation particulier le chélate selon l'invention est un multimère, avantageusement un dimère, un trimère ou un tétramère.

Selon des réalisations, les chélates de type q> 2 sont sous forme de multimères de chélates q>2, par exemple 2, 3, 4 chélates PCTA reliés entre eux. Selon des réalisations les multimères forment des ensembles linéaires de chélates. Les multimères linéaires sont avantageusement de formule (I) (Ch i) û (linker i) û (Ch j) û (linker j) û ... - (Ch k) les chélates Ch i,j,k étant des chélates q > 2 identiques ou différents entre eux les linkers i, j, k étant une liaison chimique ou un groupe de liaison chimique, et étant identiques ou différents entre eux. La structure des chélates et des linkers est choisie de manière que les multilères de formule (I) aient un comportement de type q=2, le chélate Ch i,j,k étant le cas échéant fonctionnalisé pour un greffage possible avec le linker. On évitera en particulier des linkers et des fonctionnalisations porteurs d'atomes coordinant la première sphère de coordination du complexe de manière à éviter qu'ils entraînent un comportement q=1 des chélates.

On citera notamment comme linkers les suivants 1) (CH2)2 - phényl - NH, (CH2)3 - NH, NH-(CH2)2-NH, NH-(CH2)3-NH, rien ou une simple liaison 2) Alkylène en C1-C20 notamment C3-CIO linéaire ou ramifié saturé ou insaturé, propyle, alkoxyalkylène, polyalkoxyalkylène, polyéthylène glycol, cycloalkyle, alkylène interrompu par phénylène, arylène ou arylène substitué, alkylidène, alcilidène, NH-C=O, -NH-CH=NH, NH-C=S, COO, OCO, O, S, dérivé de squarate, à condition que le chélate conserve un comportement q=2 On utilisera par exemple aussi des linkers décrits (et dont l'utilisation pour associer plusieurs chélates est décrite) dans US 5 446 145 colonnes 6-8 de type groupe hydrocarboné comportant un ou plusieurs groupes polyalkylamine (tel que -NH(CH2 CH2 NH--)j, j étant de préference 1 à 8), ou aminopolyether ou aminopolyalcool avec de préférence 4 à 20 atomes de carbone, ou aminocarbohydrate.

On cite par exemple les linkers : 1,2-diaminoethane, 1,3 -diaminoprop ane, 1,4-diaminobutane, 1,5-diamino-3-(2-aminoethyl)-pentane, N,N'-dimethyl-1,2-diaminoethane, N,N'-dimethyl-1,3-diaminopropane, 2-hydroxy-1,3-diaminopropane, 2-amino-1,3-diaminopropane, 2,3-diamino-1,4-butanediol, 1,4-diamino-2,3-butanediol, 1,4- diaminocyclohexane, 1,4 -phenylene di amine, and especially 1,1,1- tris(aminomethyl)ethane, 2,2',2"-triaminotriethylamine, tris- (aminomethyl)methane, diethylenetriamine , tri ethylenetetraamine, 1,3,5- triaminocyclohexane, and 1,3,5-phenylenetriamine 5 - 2,2 -dimethyl- 1 ,3 -propanediol, tris(2-hydroxyethyl)amine, 1,1,1-tris(hydroxymethyl)ethane, and tris(hydroxymethyl)aminomethane.

On a avantageusement les dimères de chélates q=2 suivants : Al 0 0- \ I o 0 0 0 l i o 0 N N 3+ N Tm N 3+ Ç /N Tm N O L ^ ( /N v IOI v ~/ I O 1101/ \ H//w H Ô O A2 o o^ vm/ ( H H ^o~o- N{i ~N N O 3+ 1 rN N1 O_C~` / 13+ TmNov> o J ~i-O_ 0- 0 0 0_ A3 N o\ O N N O O N~\N \N H 1 \ O O O ~ Tm\ \ s*/o \ I o 0 T 0/ 2 2 HN O O NH HN NH O O A4 3, N0 O O o Tm OH (ro) N O N 3 GN \N Tm O O HN N O N~ OH ° O A5 o o- \ I o 0 0 0 l i o 0 N N 3+ 3+ CN Tm N CN / Tm N N(v) N(v) Où O 0%~O O N~ùN O H H A6 H 3+ T 3+ T7 O 2 O O O O I 2 HN p N-N NH H H A7 O O O 3 N(iv) (1v) s Où Tm HO Tm N I~OH N ~N O O N` O v O O O On a par exemple également les trimères linéaires obtenus de formule Chl-linker 1-Ch2-linker 2-Ch3 avec Ch 1 = Ch 2 = Ch 3 = PCTA avec un métal utilisable en CEST et linker 1 = linker 2 = chaîne alkyle (C1-C20), notamment C3-CIO, linéaire ou ramifié), hydroxylalkyl, arylalkyl. Selon des réalisations, les multimères forment des ensembles ramifiés comprenant 5 plusieurs chélates greffés sur un noyau chimique central, et notamment les composés de formule (II)

(II) Noyau û (Chélate i,j,k) n

avec :

Noyau étant un noyau chimique sur lequel sont greffés plusieurs chélates 10 identiques ou différents

Chélate étant un chélate q= 2

n étant compris entre 2 et 6, avantageusement n=2, 3 ou 4

i, j, k étant identiques ou différents

Selon des réalisations avantageuses, le noyau est : H NNHZ 15 a) pour former des dimères : une diamine par exemple 2 , un diacide par exemple O ou , un dibromé par exemple OH HO r b) pour former des trimères : une triamine par exemple H2N ou H`^' H HzN^~N 7~ _ % _ 7~ NN2 Il O'\J)\ Il /\N)H HzN ou lys-lys-lys, un triacide par exemple O O , un HO OH tribromé par exemple trichloro[1,3,5)triazine , une trazine par exemple 2,4,6- r CyNYCI N`/N

CI , tout noyau aromatique comprenant trois fonctions appropriées pour le couplage avec trois chélates

H2N NHZ NH2 b) pour former des tétramères : une tétramine par exemple NH2 ou 7 HN ~(\1yO Y I ^/NIrJI N Il/vJ ° HN 0 SH PANAM GO H=N NH, O N oÿ I r "a 0 ° ~ ô ou PANAM G0.5 un tétrabromé par HZN /NHz un tétrakis par exemple HO OH OH exemple 14 d'autres structures telles que c,s N C // s d) pour former des héxamères un phosphazène par O exemple HO O 4>s O O HO /r:t ~I O N~P O II I _O N~ O HO O O OH On comprend que le multimère peut avoir également pour formule Noyau û [(linker - Chélate)] n avec n, Noyau, linker et chélate tels que définis ci-dessus. En utilisant comme linker comme précédemment un groupe choisi parmi : - Alkylène en C1-C20 notamment C3-CIO linéaire ou ramifié saturé ou insaturé, alkoxyalkylène, polyalkoxyalkylène, polyéthylène glycol, 10 cycloalkyle, - alkylène interrompu par phénylène, arylène ou arylène substitué, alkylidène, alcilidène, NH-C=O, NH-CH=NH, NH-C=S, COO, OCO, O, S, dérivé de squarate - polyalkylamine (tel que -NH(CH2 CH2 NH--)j, j étant de préference 1 to 8), ou aminopolyether ou aminopolyalcool, avec de préférence 4 à 20 atomes de carbone, ou aminocarbohydrate.

On choisit une structure des chélates et des linkers telle que les chélates aient un comportement de type q=2, on obtient ainsi les composés multimères suivants de chélates q=2: o - B1 0 o- B2 0- o- o Ot I N Tm O N Fi O N N s. N Tm N(iv) H O ' \ O O O N (iv) 3 N Tm \ N ° O B3 p N/ N~~N O H O O / \ Tm 3/ O O N'N7 ~N O\ H H N O T s~ O/ O \\ I / HN O NH O 1 p O NH N N~H O O NH C O\ j N Tm O O NH - - 2 B4 o o - 0 p 3+ iv> OH Tm I N N II( -O N JL\\ O O O N(1v) 3+ O Tm p O O N O O N~ p1i0 ÇOH p O H N N H Niv> O O O 3 Tm\ O~N N O O B5 - - - - o o O O I o O O l i N N y 3+ 3+ Tm Tm CN % N(v) N(v) O O O O O NH NH O O O _ HN O O N H N(iv) s Tm 3+ N Tm3=N(IV) lN N_ O- N~ O O O O_ B6 Ip N N~~N O O H~~N~ N~ O\ \ p 3/O O O O O y//fil 1 CNH O 2 O N HN /T~ 3 / ,/ I I N O/O HN N O \ O ~ I /2 2 o HN NH / O ~H O o J O NH \O 2 N O p\ 1 Tm /Trc3 H N~/N_ O p N / ù B7 O O GN 0 O p O O a+ N(iv) O N(Iv' Tm OH HO Tm p N ~I I( N ùH O H O N~ O O O N N O O O (`) I O O 1 Ir N O N N H H N (iv) O Tm HO ù iv;Tm O N O~ O ~ O O Selon des réalisations, les systèmes d'encapsulation de la demande, incorporant des chélates q> 2 sous forme de monomères ou de multimères, comprennent d'une part des chélates encapsulés et libres à l'intérieur du compartiment du système d'encapsulation et d'autre part en outre des chélates associés à la membrane (désignés chélates membranaires), par exemple grâce à l'aide de groupes lipophiles. De tels chélates membranaires sont décrits en détail dans le document WO2004032705, avec l'exemple de chélates de type PCTA notamment. Dans des réalisations, les chélates membranaires sont orientés (pour la partie chélate) essentiellement vers l'intérieur du système, c'est à dire que les chélates sont en majorité orientés vers l'intérieur (la partie polaire comprenant le noyau polyazoté est située à la surface interne du système, c'est à dire l'intérieur du liposome). Dans des réalisations, les chélates membranaires sont orientés (pour la partie chélate) essentiellement vers l'extérieur du système (le chélate lipophile comprend alors une partie lipophile d'association à la membrane, et une partie polaire comprenant le noyau polyazoté et située à la surface externe du système). On aura ainsi par exemple des liposomes comprenant d'une part des chélates q=2 encapsulés libres à l'intérieur et d'autre part des chélates membranaires orientés vers l'intérieur et/ou vers l'extérieur du liposome. Selon des réalisations, les systèmes d'encapsulation de la demande, incorporant des chélates q> 2 sous forme de monomères ou de multimères, a une structure modifiée pour améliorer le signal Cest en particulier l'effet de susceptibilité, et est avantageusement un liposome déformé non sphérique (appelé shrunken) décrit dans Chem. Commun., 2008, 600 û 602 et WO 2006/095234, obtenu par application d'un choc osmotique et en utilisant des constituants des membranes appropriés. Pour l'obtention de ces liposomes on utilisera avantageusement le protocole décrit dans l'art antérieur (incorporé par référence) par exemple dans Angewandte Chemie, vol 46, issue 6, p 807-989 et Chem .commun, 2008, 600-602. On pourra pour ces systèmes non sphériques utiliser des monomères ou multimères libres à q=2 avec des complexes de lanthanide lipophiles (à q=1 ou 2) s'insérant dans la membrane afin de contrôler l'orientation dans le champ magnétique du liposome non sphérique.

Selon des réalisations, les systèmes d'encapsulation de la demande, incorporant des chélates q> 2 sous forme de monomères ou de multimères, comprennent en outre au moins un biovecteur de ciblage dune zone pathologique d'intérêt diagnostique, le biovecteur étant avantageusement un acide aminé, peptide, un polypeptide, une vitamine, un mono ou poly saccharide, un anticorps, un acide nucléique, avantageusement un peptide ou un polypeptide, en particulier un biovecteur ciblant des récepteurs cellulaires (en particulier tous les récepteurs décrits ci-dessous), un pharmacophore (molécule organique à activité pharmacologique), un biovecteur de ciblage de l'angiogenèse, un biovecteur de ciblage de MMP, un peptide de ciblage de tyrosine kinase, un peptide de ciblage de la plaque d'athérome ou un biovecteur de ciblage de plaques amyloïdes. Avantageusement, on entend par biovecteur dans le cadre de la présente invention, toute biomolécule capable de cibler spécifiquement une cible biologique telle qu'un récepteur cellulaire, ou un composant tissulaire, par exemple choisi parmi les cellules myocardiales, endothéliales, épithéliales, tumorales, ou du système immunitaire ou les composants de l'architecture tissulaire normale ou pathologique. De manière plus large, le ou les biovecteurs sont par exemple choisis parmi la liste suivante (les documents et références entre parenthèses sont des exemples et non une liste limitative) : 1) Les biovecteurs ciblant des récepteurs VEGF et angiopoiétine (décrits dans WO 01/97850), les polymères tels que polyhystidine (US 6,372,194), les polypeptides ciblant la fibrine (WO 2001/9188), les peptides de ciblage d'intégrines (WO 01/77145, WO 02 26776 pour alphav beta3, WO 02/081497, par exemple RGDWXE), les pseudopeptides et peptides de ciblage de métalloprotéases MMP (WO 03/062198, WO 01/60416), les peptides ciblant par exemple le récepteur KDR/Flk-1 ou les récepteurs Tie-1 et 2 (WO 99/40947 par exemple), les glycosides de sialyl Lewis (WO 02062810 et Müller et al, Eur. J. Org. Chem, 2002,3966-3973), les antioxydants tels que l'acide ascorbique (WO 02/40060), les biovecteurs de ciblage de la tuftsine (par exemple US 6,524,554), de ciblage de récepteurs à protéine G GPCR en particulier la cholécystokinine (WO 02/094873), les associations entre antagoniste d'intégrine et mime de la guanidine (US 6 489 333), les quinolones ciblant alphav beta3 ou 5 (US 6,511,648), les benzodiazépines et analogues ciblant des intégrines (US A 2002/0106325, WO01/97861), les imidazoles et analogues (WO 01/98294), les peptides RGD (WO 01/10450), les anticorps ou fragments d'anticorps (FGF, TGFb, GV39, GV97, ELAM, VCAM, inductible par TNF ou IL (US 6,261,535), les molécule de ciblage modifiées par interaction avec la cible (US 5,707,605), les agents de ciblage de dépôts amyloïdes (WO 02/28441 par exemple), les peptides clivés cathepsines (WO 02/056670), les mitoxantrone ou quinone (US 6,410,695), les polypeptides ciblant des cellules épithéliales (US 6,391,280), les inhibiteurs de cystéines protéases (WO 99/54317), les biovecteurs décrits dans : US 6,491,893 (GCSF), US 2002/0128553, WO 02/054088, WO 02/32292, WO 02/38546, WO20036059, US 6,534,038, WO 0177102, EP 1 121 377, Pharmacological Reviews (52, n°2, 179 ; facteurs de croissance PDGF, EGF, FGF...), Topics in Current Chemistry (222, W.Krause, Springer), Bioorganic & Medicinal Chemistry (11, 2003, 1319-1341 ; dérivés tétrahydrobenzazépinones ciblant alphav beta3).

2) Les inhibiteurs d'angiogenèse, notamment ceux testés en essais cliniques ou déjà commercialisés, notamment : - les inhibiteurs d'angiogenèse impliquant des récepteurs FGFR ou VEGFR tels 25 que SU101, SU5416, SU6668, ZD4190, PTK787, ZK225846, des composés azacycles (WO 00244156, WO 02059110) ; - les inhibiteurs d'angiogenèse impliquant des MMP tels que le BB25-16 (marimastat), le AG3340 (prinomastat), le solimastat, le BAY12-9566, le BMS275291, le metastat, le neovastat ; - les inhibiteurs d'angiogenèse impliquant des intégrines tels que le SM256, le SG545, des molécules d'adhésion bloquant le EC-ECM (tels que le EMD 121-974, ou la vitaxine) ; - des médicaments à mécanisme d'action antiangiogenèse plus indirect tels que le carboxiamidotriazole, le TNP470, la squalamine, le ZD0101 ; - les inhibiteurs décrits dans le document WO 99/40947, les anticorps monoclonaux très sélectifs pour la liaison au récepteur KDR, les analogues de la somatostatine (WO 94/00489), les peptides de liaison à la sélectine (WO 94/05269), des facteurs de croissance (VEGF, EGF, PDGF, TNF, MCSF, interleukines); des biovecteurs de ciblage de VEGF décrits dans Nuclear Medicine Communications, 1999, 20 ; - les peptides inhibiteurs du document WO 02/066512. 3) Des biovecteurs capables de cibler des récepteurs : CD36, EPAS-1, ARNT, NHE3, Tie-1, 1/KDR, Fit-1, Tek, neuropiline-1, endogline, pléientropine, endosialine, Axl., alPi, a2ssl, a4P 1, a5pl, eph B4 (éphrine), récepteur laminine A, récepteur neutrophiline 65, récepteur leptine OB-RP, récepteur chimiokine CXCR-4 (et autres récepteurs cités dans le document WO99/40947), LHRH, bombésine/GRP, récepteurs gastrine, VIP, CCK. 4) Des biovecteurs de type inhibiteurs de tyrosine kinase. 5) Les inhibiteurs du récepteur GPIIb/IIIa connus choisis parmi : (1) le fragment fab d'un anticorps monoclonal du récepteur GPIIb/IIIa, Abciximab, (2) les petites molécules peptidiques et peptidomimétiques injectées en intraveineuse telles que l'eptifibatide et le tirofiban. 6) Des peptides antagonistes de récepteurs au fibrinogène (EP 425 212), des peptides ligands de récepteurs IIb/IIIa, des ligands du fibrinogène, des ligands de la thrombine, des peptides capables de cibler la plaque d'athérome, les plaquettes, la fibrine, des peptides à base d'hirudine, des dérivés à base de guanine ciblant le récepteur IIb/IIIa. 7) D'autres biovecteurs ou fragments biologiquement actifs de biovecteurs connus de l'homme du métier comme médicaments, à action anti-thrombotique, anti agrégation plaquettaire, antiathérosclérotique, antiresténotique, anticoagulante. 8) D'autres biovecteurs ou fragments biologiquement actifs de biovecteurs ciblant av(33, décrits en association avec des DOTA dans le brevet US 6 537 520, choisis parmi les suivants : mitomycine, tretinoine, ribomustine, gemcitabine, vincristine, etoposide, cladribine, mitobronitol, methotrexate, doxorubicine, carboquone, pentostatine, nitracrine, zinostatine, cetrorelix, letrozole, raltitrexed, daunorubicine, fadrozole, fotemustine, thymalfasin, sobuzoxane, nedaplatin, cytarabine, bicalutamide, vinorelbine, vesnarinone, aminoglutethimide, amsacrine, proglumide, elliptinium acetate, ketanserin, doxifluridine, etretinate, isotretinoine, streptozocine, nimustine, vindesine, flutamide, drogenil, butocin, carmofur, razoxane, sizofilan, carboplatine, mitolactol, tegafur, ifosfamide, prednimustine, picibanil, levamisole, teniposide, improsulfan, enocitabine, lisuride, oxymetholone, tamoxifen, progesterone, mepitiostane, epitiostanol, formestane, interferon-alpha, interferon-2 alpha, interferon-beta, interferon-gamma, colony stimulating factor-1, colony stimulating factor-2, denileukin diftitox, interleukin-2, leutinizing hormone releasing factor. 9) certains biovecteurs ciblant des types particuliers de cancers, par exemple des peptides ciblant le récepteur ST associé au cancer colorectal, ou le récepteur tachykinine. 10) des biovecteurs utilisant des composés de type phosphines. 11) des biovecteurs de ciblage de P-sélectine, E-sélectine ; par exemple, le peptide de 8 acides aminés décrit par Morikawa et al, 1996, 951, ainsi que différents sucres. 12) l'annexine V ou des biovecteurs ciblant les processus apoptotiques. 13) tout peptide obtenu par des technologies de ciblage telles que le phage display, modifié éventuellement par des acides aminés non naturels (http//chemlibrary.bri.nrc.ca), par exemple des peptides issus de banques phage display : RGD, NGR, KGD, RGD-4C. 14) d'autres biovecteurs peptidiques connus de ciblage de plaques d'athérome, cités notamment dans le document WO 2003/014145. 15) des vitamines, notamment l'acide folique et ses dérivés connus capables de cibler les récepteurs au folate. 16) des ligands de récepteurs hormonaux dont les hormones et les stéroïdes. 17) des biovecteurs ciblant des récepteurs opioïdes. 18) des biovecteurs ciblant des récepteurs TKI. 19) des antagonistes LB4 et VnR. 20) des composés nitriimidazoles et benzylguanidines. 21) des biovecteurs rappelés dans Topics in Current Chemistry, vol.222, 260-274, Fundamentals of Receptor-based Diagnostic Metallopharmaceuticals, notamment : - des biovecteurs de ciblage de récepteurs peptidiques surexprimés dans les tumeurs (récepteurs LHRH, bombésine/GRP, récepteurs VIF, récepteurs CCK, récepteurs tachykinine par exemple), notamment les analogues de somatostatine ou de bombésine, des peptides dérivés octréotide éventuellement glycosylés, les peptides VIF, les alpha-MSH, les peptides CCK-B - des peptides choisis parmi : des peptides cycliques RGD, des peptides de ciblage de la fibrine, de la tuftsine, des peptides de ciblage de récepteur : laminine. 22) des oligosaccharides, des polysaccharides et des dérivés d'oses, des dérivés ciblant les récepteurs Glut (récepteurs d'oses) ou des transporteurs de glutamine. 23) des biovecteurs utilisés pour des produits de type smart. 24) des marqueurs de la viabilité myocardique (par exemple tétrofosmine et hexakis2méthoxy-2méthylpropylisonitrile). 25) des traceurs du métabolisme des sucres et des graisses. 26) des ligands de récepteurs de neurotransmetteurs (récepteurs D, 5HT, Ach, GABA, NA, NMDA). 27) des oligonucléotides. 28) le facteur tissulaire 29) des biovecteurs décrits dans WO 03/20701, en particulier le PK11195 ligand du récepteur périphérique aux benzodiazépines. 30) des peptides liant la fibrine, notamment les séquences peptidiques décrites dans WO 03/11115. 31) des inhibiteurs d'agrégation de plaques amyloïdes décrits dans 10 WO 02/085903. 32) des composés de ciblage de la maladie d'Alzheimer, en particulier les composés comprenant les squelettes de type benzothiazoles, benzofuranes, styrylbenzoxazoles/thiazoles/imidazoles/quinoline, styrylpiridines et leurs dérivés connus. 15 Le brevet WO2004032705 illustre des exemples nombreux de couplage chimique incorporés par référence du liposome avec différentes catégories de biovecteurs, et des exemples nombreux de compositions de liposomes incorporés par référence. Ces biovecteurs attachés au système d'encapsulation (typiquement à la surface externe, le cas échéant à l'aide de groupes lipophiles d'ancrage dans la membrane) permettent d'atteindre la zone cible reconnue ainsi spécifiquement. Le cas échant le système d'encapsulation comprend en outre, par exemple à l'intérieur du liposome, un agent thérapeutique approprié pour traiter la zone malade à traiter. 20 Selon des réalisations on utilisera des systèmes de la demande pour le ciblage de cellules en utilisant des propriétés en imagerie T2 de ces systèmes liées à des effets de susceptibilité. Le demandeur a décrit tout particulièrement des agents CEST de type liposomes encapsulant des chélates libres à l'intérieur du liposome. Le brevet WO2004032705 25 décrit également des systèmes lipidiques de type nanoparticules, et notamment émulsions (également désignés emulcest), avec ou sans composés fluorés de type perfluorocarbones, pour lesquelles des chélates sont greffés sur la face externe, en utilisant des émulsions (appelées aussi nanodroplets décrites notamment dans US 6 676 963). Le demandeur a ainsi également étudié le greffage de chélates q> 2 sur la face externe de nanoémulsions et de micelles (monocouche lipidique avec une partie polaire tournée vers l'extérieur du micelle). Dans ces systèmes particulaires, l'effet CEST dû principalement aux chélates greffés sur la face externe (et typiquement insérés en partie dans la couche lipidique à l'aide groupes lipophiles des chélates et le cas échéant de groupes linkers aliphatiques et/ou aromatiques) est obtenu grâce au très grand nombre de chélates greffés aux particules. Selon des réalisations, le système d'encapsulation est ainsi une nanoémulsion ou un micelle, avantageusement perfluorés, les chélates étant essentiellement situés sur la face externe du système. Le demandeur a ainsi étudié le greffage de chélates q> 2 à des nanoparticules lipidiques décrites dans WO2008/132666, WO2007/141767.

L'invention est également intéressante pour le greffage de chélates q> 2 à des composés de types polymères utilisés en imagerie médicale, dendrimères, systèmes polypeptidiques ou protéiques, polysaccharides, acides nucléiques, nanoparticules polymériques, nanoparticules métalliques notamment d'oxydes de métaux y compris de lanthanides (nanoparticules dont le métal ou le mélange de métaux n'interfère pas de manière gênante avec l'effet cest des chélates). La description d'exemples détaillés qui suit permet d'illustrer l'invention. Description des figures : La figure 1 représente l'intensité normalisée (par rapport à la valeur obtenue lors de l'irradiation à+ 20 ppm) en fonction de la fréquence d'irradiation pour un liposome sphérique encapsulant le chélate PCTA-Tm selon l'invention en imagerie CEST. La figure 2 représente Is/Io (%) pour un liposome sphérique encapsulant le chélate PCTATm selon l'invention en imagerie CEST où Is est l'intensité mesurée lors de la saturation à gauche du pic de l'eau externe et Io l'intensité lors de la saturation à droite du pic en fonction de la fréquence d'irradiation.

La figure 3 représente l'intensité normalisée (par rapport à la valeur obtenue lors de l'irradiation à + 20 ppm) en fonction de la fréquence d'irradiation pour un liposome sphérique encapsulant le chélate DO3A-Tm selon l'invention en imagerie CEST. La figure 4 représente Is/Io (%) pour un liposome sphérique encapsulant le chélate DO3A- Tm selon l'invention en imagerie CEST où Is est l'intensité mesurée lors de la saturation à gauche du pic de l'eau externe et Io l'intensité lors de la saturation à droite du pic en fonction de la fréquence d'irradiation.

PARTIE I/ Synthèse des complexes monomères i=2 Tous ces composés ont été fabriqués avec comme métal Tm3+. Toutefois, l'homme du métier grâce à ses connaissances générales est à même de fabriquer ces composés avec d'autres métaux utilisables en CEST.

Exemple 1 : Composé A La synthèse est identique à celle décrite dans l'exemple 1 du brevet WO2006/100305 en effectuant la complexation (étape i) avec 705mg TmC13, 6H2O C25H30N5O6Tm m/z (ES-) = 664

Exemple 2 : Composé B 20 La synthèse est identique à celle décrite dans l'exemple 2 du brevet W02006/100305 en effectuant la complexation (étape d) avec 1,4g TmC13, 6H20 C25H30N5O6Tm m/z (ES-) = 664

Exemple 3 : Composé C a) 28 OH 130mg (0,23mmol) du triméthyl-a,a', a "-triméthyl(S)-2-(nitrobenzyl)]-1,4,7,10-tetraazacyclododecane-4,7, 10-triacétate dont la synthèse est décrite par Woods et al (Dalton Trans), 2005, 3829-3837 sont dissous dans 5m1 de THF. 1,8m1 de soude 1M et 5m1 d'eau sont ajoutés. Le milieu réactionnel est agité à 55°C pendant 24h avant d'être évaporé à sec. Le produit est repris dans l'eau et purifié par HPLC prep. On obtient 100mg. m /z (ES+) = 524 b) 0mg de l'intermédiaire obtenu en a) sont dissous dans 4m1 d'eau. Le pH de la solution est amené à 5 par addition de soude 2N. Après addition de 71,3mg de TmC13, 6H20, le milieu réactionnel est chauffé à 80°C pendant 6h en maintenant le pH à 5 par addition de soude 2N. Après filtration, le résidu est cristallisé dans l'éthanol. Le précipité est dissous dans l'eau et traité par une résine Chelex 100 (Bio-Rad). Après filtration et précipitation dans l'éthanol, le précipité est filtré et séché. m = 120mg. m /z (ES-) = 688 c) réduction du groupement nitro NO2 en NH2 A partir de 120mg du composé obtenu en b), en appliquant le même mode opératoire que celui décrit à l'étape j de l'exemple 1 du brevet W02006/100305, on obtient 100mg du composé C m /z (ES-) = 658

Exemple 4 : composé D NH N 3+ _ CN")m N 0C \-ihr° O NH N 3+ CN~V)m N O_C U)yO

0- 29 H2N a) 30 N 25g (49mmol) de l'intermédiaire obtenu en a) (ex29) sont mis en suspension dans 175mL CH3CN avec 13,5g (98mmol) de K2CO3, sous argon. 1,16eq (12.2g) de 4- nitrobenzylbromide sont dilués dans 65mL CH3CN, puis ajoutés goutte à goutte. Le milieu réactionnel est laissé sous agitation au reflux pendant 24H puis est évaporé à sec. Le produit repris avec 250mL CH2C12, lavé 3 fois avec 150mL H20. La phase organique est concentrée puis reprise avec 250mL HC1 1N et lavée avec 250mL éther éthylique. La phase aqueuse est basifiée (pH9) avec Na2CO3. Le produit est extrait par 250mL CH2C12 et séché sur MgSO4. La phase organique est séchée sous vide. m(brut) =26g qui sont purifiés sur lkg de silice. Eluant : 90/10 (CH2C12/MeOH) m/z (ES+) = 650 A partir de 18g du composé obtenu en a), en appliquant le même mode opératoire que celui décrit à l'étape a) du composé B, on obtient 10g.du composé. m/z (ES+) = 482 OH 20 c) 0 o o- ~/ CNTm3 N( rv) N o A partir de 13g du composé obtenu en b), en appliquant le même mode opératoire que celui décrit à l'étape b) du composé C, on obtient 10g. du composé. m/z (ES+) = 646 d) Réduction du nitro o /--~10 - HZN / j N N 3+ CNîv N urc) 0-CC O A partir de 13g du composé obtenu en c), en appliquant le même mode opératoire que 10 celui décrit à l'étape j de l'exemple 1 du brevet W02006/100305, on obtient 12g. du composé D. m/z (ES-) = 616 Exemple 5 : Composé E /NH2 31 15 La synthèse est identique à celle décrite dans l'exemple 11 du brevet WO2006/100305 en effectuant la complexation (étape e) avec TmC13, 6H2O C20H28N5O6Tm m/z(ES-) = 602 Exemple 6 : Composé F NH2 La synthèse est identique à celle décrite dans l'exemple 13 du brevet WO2006/100305 en effectuant la complexation (étape c) avec TmC13, 6H2O 10 C20H28N5O6Tm m/z(ES-) = 602 Exemple 7 : Composé G 15 a) 1g du composé 18b décrit par S.J. Krivickas et al; JOC, 2007, 72, pp8280-8289 sont mis en solution dans 10ml de TFA. Le milieu est agité pendant 1h puis évaporé à sec. Le produit est repris dans l'ether puis filtré. On obtient 550mg du composé. 20 m/z (ES+) = 406 (n=4) 33 b) O o) n CN N NJ ° 1--~ 0 O n =2 ou4 550mg du composé obtenu en a) et 618mg de K2CO3 sont dissous dans 10ml d'acétonitrile. 747mg de bromoacétate d'éthyle (3,3équiv) sont ajoutés goutte à goutte puis le mélange est agité à 60°C pendant 4 jours. Après évaporation à sec, le produit est repris dans 20 mL de dichlorométhane et 4 ml d'eau. Après séparation des phases la phase organique est évaporée et purifiée par flash chromatographie sur silice avec 2% de méthanol dans le dichlorométhane. On obtient 2g du composé. m/z (ES+) = 749 (n=4) c) O HO' n =2 ou4 CN N\ N NJ HO-1E/ Li ~OH A partir de 2g du composé obtenu en b), en appliquant le même mode opératoire que celui décrit à l'étape a) de l'exemple 3. On obtient 1,2g du composé. 15 m /z (ES+) = 580 (n=4) d) Complexation 0 o \kn n N N Tm n =2 ou4 \_ir o- A partir de 1,2g du composé obtenu en c), en appliquant le même mode opératoire que celui décrit à l'étape b) de l'exemple 3. On obtient 1,4g du composé. m /z (ES-) = 744 (n=4) e) n =2 ou4 A partir de 1,4g du composé obtenu en d), en appliquant le même mode opératoire que celui décrit à l'étape b) de l'exemple 13 du brevet W02006/100305. On obtient 1g du composé G. m /z (ES-) = 610 (n=4)

Exemple 8 : Composé H a) En appliquant le même mode opératoire que celui décrit à l'étape b) de l'exemple 7. On obtient 380mg, à partir de 250mg du composé 15 décrit par P.L. Cox dans J. Chem. Soc. Perkin Trans.l, 1990, p2567. m/z = 620 (ES+) oû\ 20 b) iv 02 OH OH O A partir de 350mg du composé obtenu en a), en appliquant le même mode opératoire que celui décrit à l'étape a) de l'exemple 3. On obtient 200mg du composé. 5 m/z = 418 (ES+) c) CNN Tm3l] N(iv) N Ov 0- O A partir de 200mg du composé obtenu en b), en appliquant le même mode opératoire 10 que celui décrit à l'étape b) de l'exemple 3, on obtient 250mg du composé H. m/z = 582 (ES-) Exemple 9 : Composé I HN 35 HO.Or_(/ CN H1 NHZ Synthèse décrite dans Angew.Chem. Int. Ed, 2008, 47, pp8568 en effectuant la complexation avec TmC13, 6H20 C30H35N8010Tm m/z(ES-) = 835 Exemple 10 : Composé J o Obtenu en effectuant la complexation avec TmC13, 6H20 à partir du ligand dont la synthèse est décrite dans W02006/100305, 10 C15H23N408Tm m/z(ES-) = 555

Exemple 11 : a) Composé K OH 15 La synthèse est identique à celle décrite dans l'exemple 3 du brevet W02006/100305 en effectuant la complexation (étape d) avec TmC13, 6H20 C20H25N4O8Tm m/z(ES-) = 617 b) Composé K'5 OH La synthèse est identique à celle décrite dans l'exemple 3 du brevet W02006/100305 en effectuant la complexation (étape d) avec DyC13, 6H20 C20H25N408Dy m/z(ES-) = 611 Exemple 12 : Composé L OH La synthèse est identique à celle décrite dans l'exemple 15 du brevet W02006/100305 en effectuant la complexation (étape d) avec TmC13, 6H20 C21H27N408Tm 10 m/z(ES-) = 631

Exemple 13 : Composé M OH La synthèse est identique à celle décrite dans l'exemple 16 du brevet W02006/100305 en effectuant la complexation (étape d) avec TmC13, 6H20 15 C19H23N4O8Tm 375 m/z(ES-) = 603 Exemple 14 : Composé N o La synthèse est identique à celle décrite dans l'exemple 4 du brevet W02006/100305 en effectuant la complexation (étape j) avec TmC13, 6H20 C19H23N4O9Tm m/z(ES-) = 619 Exemple 15 : Composé O OH Obtenu en effectuant la complexation avec TmC13, 6H20 à partir du ligand dont la synthèse décrite dans Angew.Chem. Int. Ed, 2008, 47, pp8568 C28H29N60 i i Tm m/z(ES-) = 793 Exemple 16 : Composé P 3815 Obtenu en effectuant la complexation avec TmC13, 6H20 à partir du ligand dont la synthèse est décrite dans Angew.Chem. Int. Ed, 2008, 47, pp8568 C31H34N7O12Tm m/z(ES-) = 864 Exemple 17 : Composé Q o Obtenu en effectuant la complexation avec TmC13, 6H20 à partir du ligand dont la synthèse est décrite dans PCT/EP2006/063368 C16H22N3O10Tm 10 m/z(ES-) = 584 Exemple 18 : Composé R S=N N N ,Tm 3+ CN") N O Q `/\O O /0 395 2g d'intermédiaire obtenu à l'étape d) du composé D sont dissous dans un mélange constitué de 16m1 de CHC13 et 24m1 d'H20. 0,5m1 de thiophosgène sont ajoutés goutte à goutte. Le milieu réactionnel est agité pendant 4h à TA. La phase aqueuse est lavée 3

fois avec CHC13 puis est évaporée sous vide en maintenant la température inférieure à 35°C. Le produit est repris dans l'éther et filtré. On obtient 2g du composé R. C22H28N506STm

m/z(ES-) = 658 Exemple 19 : Composé S eres N N Tm O~ÇN(V N 3+ o La synthèse est identique à celle décrite dans l'exemple 9 du brevet W02006/100305 en effectuant la complexation avec TmC13, 6H20 C26H28N506STm m/z(ES-) = 706

Exemple 20 : Composé T La synthèse est identique à celle décrite dans l'exemple 12 du brevet WO2006/100305 en effectuant la complexation avec TmC13, 6H2O C26H32N5O9Tm m/z(ES-) = 726 Exemple 21 : Composé U La synthèse est identique à celle décrite dans l'exemple 14 du brevet WO2006/100305 en effectuant la complexation avec TmC13, 6H2O C26H32N5O9Tm 10 m/z(ES-) = 726 41 15 15 Exemple 22 : Composé V A partir de 1g du composé obtenu en e) du composé G, en appliquant le même mode opératoire que celui décrit à l'étape a) de l'exemple 12 du brevet W02006/100305. 5 On obtient 1,1g. du composé V. C26H40N509Tm m /z (ES-) = 734 (n=4) PARTIE II/ Préparation de composés désignés coeur (noyau) pour la synthèse de multimères q = 2 R' (COOH)n R"(NH2)n n = 2 : Dimère HO commercial Ethylène diamine VI HO o O I o C 3+ n =2 ou4 Nf"m N o- o 42 n = 3 : Trimère HO ° H2N^~% ~~NHZ HO OH H2N o o II VII commercial commercial H H HzN^~N~~ù 7~ N~~NHz O NH II H2N VIII n = 4 : Tétramère HO OHp HZN NH2 rJ OH NH2 NH2 IX Commercial OH O O décrit synthèse III des MIM Na O_ p O O Na H2N % O J/NHz ' -Ç / `\ H N^~N HN O O ~^~N 1 0 O O O HN pù NH Na J Na' IV H2N NH X Commercial chez Aldrich Commercial (ref : 67874-43-5) OH V (décrit synthèse des MIM) n = 6 : Hexamère O O O O HO NPe~N Il I_.O OùP, iP, HO O N O HO O O PARTIE III/ Synthèse des multimères

Exemple 23 : Condensation des amines aromatiques (Rl-NH2) sur le chlorure de 5 cyanurile NYNyN-R1 N R1 0,19g (lmmol) de chlorure de cyanurile, dissous dans 1Oml de dioxane, sont introduits 10 en une fois dans 50m1 de solution aqueuse obtenue par dissolution de x g (3,3mmol, 3,3eq) de composé aminé (R1-NH2) et 456g (3,3eq) de K2CO3. Le pH est maintenu à 9 par ajout de K2CO3. Après 18H à température ambiante, le pH est ramené à 6,5 par ajout de résine IRC50. Le milieu réactionnel est filtré et concentré avant d'être versé goutte à goutte dans de l'éthanol. Le précipité formé est filtré, lavé par de l'éthanol 15 puis de l'éther. Le produit est purifié par HPLC préparative sur colonne LICHROSPHER RP18, 15gm,300A, 400*60mm avec phase mobile TFA/CH3CN. CI N~ CI NY~N + R1ùNH2 N iN Cl IR1-.

Rl-NHz x (g) Composé obtenu 2,2 g de composé A C78H87N18O18Tm3 m/z (ES-) = 2069 2,2 g de composé B C78H87N18O18Tm3 m/z (ES-) = 2069 2,2 g de composé C C75HI05N18O18Tm3 m/z (ES-) = 2052 2,0 g de composé D C66H87N18O18Tm3 m/z (ES-) = 1925 Exemple 24: Condensation des amines aliphatiques (R2-NHz) sur des coeurs polyacide R'(COOH)n R'(COOH)n + n R2-NH2 -* R'(CONH-R2),, 0,8 mmol du composé acide et 1,léquivalent par fonction acide du composé amine (R2-NH2) (soient 1,8mmol, 2,6mmol, 3,5mmol ou 5,3 mmol respectivement pour réaction avec diacide, triacide, tétra-acide, hexa-acide) sont dissous en chauffant à 40°C dans 15m1 de DMAC. Après dissolution, rajouter 153 mg (0,8mmol) EDCI, 19mg (0,14mmol) d'HOBT et 0,15m1 de TEA. Laisser 18H à 45°C. Le milieu réactionnel est refroidi avant d'être versé goutte à goutte dans l'éthanol. Le précipité obtenu est filtré et lavé par de l'éther. Le produit est purifié par Ultrafiltration sur membrane 1 KD ou par HPLC prep.

Composés obtenus avec R2-NH2 = composé E, F, G, H , I ou J : I II III IV V E C48H58N10014Tm2 C69H84N15021Tm3 C109H124N20028Tm4 C94H128N22028Tm4 C162H186N33048P3Tm6 m/z(ES-) = 1336 m/z(ES-) = 1964 m/z(ES-)= 1417 m/z(ES-)= 1343 m/z(ES-)= 1488 (z=3) (z=2) (z=2) F C48H58N10014Tm2 C69H84N15021Tm3 C109H124N20028Tm4 C94H128N22028Tm4 C162H186N33048P3Tm6 m/z(ES-) = 1336 m/z(ES-) = 1964 m/z(ES-)= 1417 m/z(ES-)= 1343 m/z(ES-)= 1488 (z=3) (z=2) (z=2) G C48H74N10014Tm2 C69H108N15021Tm3 C109H156N20028Tm4 C94H160N22028Tm4 C162H234N33048P3Tm6 m/z(ES-) = 1351 m/z(ES-) = 1988 m/z(ES-)= 1433 m/z(ES-)= 1359 m/z(ES-)= 1504 (z=3) (z=2) (z=2) H C44H66N10014Tm2 C63H96N15021Tm3 C101H140N20028Tm4 C86H144N22028Tm4 C150H210 33048P3Tm6 m/z(ES-) = 1295 m/z(ES-) = 1904 m/z(ES-)= 1377 m/z(ES-)= 1303 m/z(ES-)= 1448 (z=3) (z=2) (z=2) j C68H72N16022Tm2 C99H105N24033Tm3 C149H152N32044Tm4 C134H156N34044Tm4 C222H228N51072P3Tm6 m/z(ES-) = 1801 m/z(ES-) = 2663 m/z(ES-)= 1883 m/z(ES-)= 1809 m/z(ES-)= 1954 (z=3) (z=2) (z=2) ii77 J C388H48N8018Tm2 C54H69N12027Tm3 C89H104N16036Tm4 C74H108N18036Tm4 C132H156N27060P3Tm6 m/z(ES-) = 1241 m/z(ES-) = 1823 m/z(ES-)= 1323 m/z(ES-)= 1249 m/z(ES-)= 1394 (z=3) (z=2) (z=2) Exemple 25 : Condensation des amines aromatiques (R1~NH~,) sur des coeurs polyacide R'(COOH)a R'(COOH)n + n R1-NH2 -* R'(CONH-R1)n

1 mmol du composé acide et 1,léquivalent par fonction acide du composé amine (R3-NH2) (soient 2,2mmol, 3,3mmol, 4,4mmol ou 6,6 mmol respectivement pour réaction 10 avec diacide, triacide, tétra-acide, hexa-acide) sont dissous dans un mélange H2O/DMSO 25/75 v/v. Après dissolution, rajouter 384 mg (2mmol) EDCI, 79mg (0,6mmol) d'HOBT. Le milieu réactionnel est agité pendant 18h à TA en maintenant le pH à 6. Le milieu réactionnel est versé goutte à goutte dans l'éthanol. Le précipité obtenu est filtré et lavé par de l'éther. 15 Le produit est purifié par Ultrafiltration sur membrane 1 KD ou par HPLC prep.5 Composés obtenus avec Rl-NH2 = composé A, B, C, ou D : I II III IV V A C58H62N10014T C84H90N15021Tm3 C129H132N20028TM4 C114H136N22028Tm4 C192H198N33048P3Tm6 M2 m/z(ES-) = 2150 m/z(ES-)= 1541 (z=2) m/z(ES-)= 1467 (z=2) m/z(ES-)= 1612 (z=3) m/z(ES-) = 1459 B C58H62N10014T C84H90N15021Tm3 C129H132N2o028Tm4 C114H136N22028Tm4 C192H198N33048P3Tm6 M2 m/z(ES-) = 2150 m/z(ES-)= 1541 (z=2) m/z(ES-)= 1467 (z=2) m/z(ES-)= 1612 (z=3) m/z(ES-) = 1459 C C56H74N10014T C81H108N15021Tm3 C125H156N20028TM4 C110H160N22028Tm4 C 1 86H234N33 0 4 8P3Tm6 M2 m/z(ES-) = 2132 m/z(ES-)= 1529 (z=2) m/z(ES-)= 1455 (z=2) m/z(ES-)= 1600 (z=3) m/z(ES-) = 1447 D C50H62N10014T C72H90N15021Tm3 C113H132N20028TM4 C98H136N22028Tm4 C168H198N33048P3Tm6 M2 m/z(ES-) = 2006 m/z(ES-)= 1445 (z=2) m/z(ES-)= 1371 (z=2) m/z(ES-)= 1516 (z=3) m/z(ES-) = 1363 Exemple 26: Condensation des acides carboxyliques sur des cœurs polyamine R" NH R"(NH2)n + n R3-COOH -* R"(NHCO-R3).

Composés obtenus avec R3-COOH = composé K, K', L, M, N, O, P ou Q : VI VII VIII IX X K C42H54N10014Tm2 C66H87N10021Tm3 C25H102N19024Tm3 C96H132N22028Tm4 C102H140N26032Tm4 m/z(ES-) = 1259 m/z(ES-) = 972 m/z(ES-)= 1079 m/z(ES-)= 1357 m/z(ES-)= 1457 (z=2) (z=2) (z=2) (z=2) K' C42H54N10014~Y2 C66H87N10021~y3 C25H102N19024~y3 C96H132N22028Dy4 C102H140N26032~Y4 m/z(ES-) = 1246 m/z(ES-) = 962 m/z(ES-)= 1069 m/z(ES-)= 1344 m/z(ES-)= 1444 (z=2) (z=2) (z=2) (z=2) L C44H58N10014Tm2 C69H93N16021Tm3 C78H108N19024Tm3 C100H140N22028Tm4 C106H148N26032Tm4 m/z(ES-) = 1287 m/z(ES-) = 993 m/z(ES-)= 1100 m/z(ES-)= 1385 m/z(ES-)= 1485 (z=2) (z=2) (z=2) (z=2) M C40HSON10014Tm2 C63H81N16021Tm3 C72H96N19024Tm3 C92H124N22028Tm4 C98H132N26032Tm4 m/z(ES-) = 1231 m/z(ES-) = 951 m/z(ES-)= 1058 m/z(ES-)= 1329 m/z(ES-)= 1429 (z=2) (z=2) (z=2) (z=2) N C40HSO TT~~ii10016Tm2 C63H81N16024Tm3 C72H96N19027Tm3 C92H124N22032Tm4 C98H132N26036Tm4 m/z(ES-) = 1263 m/z(ES-) = 975 m/z(ES-)= 1082 m/z(ES-)= 1361 m/z(ES-)= 1461 (z=2) (z=2) (z=2) (z=2) O C58H62N14020Tm2 C90H99N22030Tm3 C99H114N25033Tm3 C128H148N30040Tm4 C134H156N34044Tm4 m/z(ES-) = 1611 m/z(ES-)= 1236 m/z(ES-)= 1343 m/z(ES-)= 1709 m/z(ES-)= 1809 (z=2) (z=2) (z=2) (z=2) P C64H72N16022Tm2 C99H114N25033Tm3 C108H129N28036Tm3 C140H168N34044Tm4 C146H176N38048Tm4 m/z(ES-) = 1753 m/z(ES-)= 1343 m/z(ES-)= 1449 m/z(ES-)= 1851 m/z(ES-)= 1951 (z=2) (z=2) (z=2) (z=2) Q C34ii77 ~~48N8018Tm2 C54H78N13027Tm3 C63H93N16030Tm3 C80H120N18036Tm4 C86H128N22040Tm4 m/z(ES-) = 1193 m/z(ES-) = 923 m/z(ES-)= 1029 m/z(ES-)= 1291 m/z(ES-)= 1391 (z=2) (z=2) (z=2) (z=2) Exemple 27 : Condensation des isothiocyanate sur des coeurs polyamine R''(NHz)a R"(NH2)n + n R4-NCS -* R"(NH-(C=S)-NHR4)n Le composé isothiocyanate (1,5mmol) est dissous à température ambiante dans 20 ml de DMSO. Le coeur polyamine (n=2 : 0,68mmol ; n=3 : 0,45mmol ; n=4 : 0,34mmol ) est ensuite ajouté et le milieu réactionnel est agité pendant 48h avant d'être précipité dans 200m1 d'éther éthylique. Le précipité est lavé avec de l'ether éthylique puis de l'éthanol. Le produit est ensuite purifié sur silice.

Composés obtenus avec R4-NCS = composé R ou S : VI VII VIII IX X R C46H64N12O12S2Tm2 C72H102N19O18S3Tm3 C81H117N22O21S3Tm3 C104H152N26O24S4Tm4 C110H160N30O28S4Tm4 m/z(ES-) = 1377 m/z(ES-)=1061 m/z(ES-)=1167 (z=2) m/z(ES-)=1475 (z=2) m/z(ES-)=1575 (z=2) (z=2) S C54H64N12O12S2Tm2 C84H102N19O18S3Tm3 C93H117N22O21S3Tm3 C120H152N26O24S4Tm4 C126H160N30O28S4Tm4 m/z(ES-) = 1473 m/z(ES-)=1133 m/z(ES-)=1167 (z=2) m/z(ES-)=1571 (z=2) m/z(ES-)=1671 (z=2) (z=2) Exemple 28 : Condensation des squarate sur des cœurs polyamine R" NH / H H R" N NùR5 O O R"(NH2)n + n R5-squarate -* Le composé squarate (1,5mmol) est dissous à température ambiante dans 20 ml de DMSO. Le cœur polyamine (n=2 : 0,68mmol ; n=3 : 0,45mmol ; n=4 : 0,34mmol) ainsi que 1,5 mmol de triéthylamine sont ensuite ajoutés et le milieu réactionnel est agité pendant 24h à 50°C avant d'être précipité dans 200m1 d'éther éthylique. Le précipité est lavé avec de l'ether éthylique puis de l'éthanol. Le produit est ensuite purifié sur silice.

Composés obtenus avec R5-squarate = composé T, U ou V : VI VII VIII IX X T C50H60N12016Tm2 C78H96N19O24Tm3 C87H111N22O27Tm3 C112H144N26O32Tm4 C118H152N30O36Tm4 m/z(ES-) = 1421 m/z(ES-) = 1094 m/z(ES-)= 1200 m/z(ES-)= 1519 (z=2) m/z(ES-)= 1619 (z=2) (z=2) (z=2) U C5oH6oN12016Tm2 C78H96N19O24Tm3 C87H111N22O27Tm3 C112H144N26O32Tm4 C118H152N3oO36Tm4 m/z(ES-) = 1421 m/z(ES-) = 1094 m/z(ES-)= 1200 m/z(ES-)= 1519 (z=2) m/z(ES-)= 1619 (z=2) (z=2) (z=2) n V C50H76N12016Tm2 C78H120N19024Tm3 C87H135N22O27Tm3 C112H176N26O32Trn4 C118H184N30036Trn4 m/z(ES-) = 1437 m/z(ES-) = 1106 m/z(ES-)= 1212 m/z(ES-)= 1535 (z=2) m/z(ES-)= 1635 (z=2) (z=2) (z=2) PARTIE IV/ Synthèse des complexes lipophiles pour incorporation dans un système d'encapsulation (émulsion ou liposome en particulier): Exemple 29 (complexe q=2) NH OH LA synthèse est identique à celle décrite dans l'exemple 5 du brevet W02006/100305 en effectuant la complexation (comme étape i exl) avec TmC13, 6H20 C61HI05N5O15PTm Maldi-Tof (mode négatif) : m/z = 1346

Exemple 30 (q=2)15

51 La synthèse est identique à celle décrite dans l'exemple 8 du brevet W02006/100305 en effectuant la complexation avec TmC13, 6H20 C56H94N5O16PTm Maldi-Tof (mode négatif) : m/z = 1291 Exemple 31 (q=2) La synthèse est identique à celle décrite dans l'exemple 19 du brevet W02006/100305 en 10 effectuant la complexation avec TmC13, 6H20 C65H108N5016PTm Maldi-Tof (mode négatif) : m/z = 1427 Exemple 32 (q=2) La synthèse est identique à celle décrite dans l'exemple 21 du brevet W02006/100305 en effectuant la complexation avec TmC13, 6H20 C58H99N5015PTm 20 Maldi-Tof (mode négatif') : m/z = 1304 o NH O e O O-P-O,2 ÔH 15 Exemple 33 (complexe q=1) : a) Synthèse du (4,7-bis-tert-butoxycarbonylmethyl-1,4,7,10tetraaza-cyclododec-l-yl)-5 acetic acid tert-butyl ester 3 O H n N N _/( C-j >Lo/ Dans un ballon de 1L mis sous Argon sont incorporés 20g de 1,4,7,10-10 tétraazacyclododécane recristallisé (118mmol; léquiv) et 30g d'acétate de sodium (366mmo1; 3,léquiv) dissous dans 428m1 de DMAC. 71,4g de bromoacétate de tert-butyle (366mmo1; 3,1équiv) sont ajoutés goutte à goutte puis le mélange est maintenu sous agitation modéré pendant 3 semaines. Il est ensuite refroidi dans un bain de glace puis filtré. Le précipité est lavé avec 50mL de DMAC et 70 mL 15 d'AcOEt. Après filtration, le précipité récupéré est dissous dans 320 mL de dichlorométhane et lavé à l'eau. Après concentration à sec on obtient 23g d'une poudre blanche (Rendement : 37%) C26HSON406 ; m/z 515.5 (ES+) 20 b) Synthèse du (4-benzyloxycarbonylmethyl-7,10-bis-tert-butoxycarbonylmethyl-1,4,10 tetraaza-cyc lo do de c- 1 -yl)-acetic aci d tert-butyl ester 52 O O >Lo/ O~

Dans un ballon de 500 mL, 5g de l'intermédiaire obtenu en a) (8,4mmol ; 1équiv) sont dissous dans 125 mL de CH3CN en présence de 2,3g de carbonate de potassium K2CO3 (17mmol ; 2équiv). 1,6 mL de bromoacétate de benzyle (10mmol ; 1,2équiv) sont ensuite ajoutés goutte à goutte, à température ambiante. Le mélange est ensuite porté à reflux toute une nuit. Le milieu réactionnel est filtré et le solvant est évaporé. L'huile obtenue est redissoute dans 125 mL de HC1 1N puis est extraite par 2x50mL de toluène. La phase aqueuse est refroidie avant d'ajustée le pH à 9 avec une solution de NaOH 2N. La nouvelle phase aqueuse est extraite par 2x70mL de toluène. Après évaporation à sec, on obtient 5,4g (Rendement=97%)

C35H58N408 ; m/z 663,41 (ES+) et Synthèse du (4,7,10-tris-tert-butoxycarbonylmethyl-1,4,7,10 tetraaza-cyclododec-l-yllacetic acid

HO O -, N O CN NJ O 5,4 g de l'intermédiaire obtenu en b) (8,2mmol ; léquiv) sont dissous dans 80 mL d'éthanol puis 1,1g de Pd/C sont ajoutés. Le mileu réactionnel est alors surmonté d'un ballon de baudruche rempli avec du dihydrogène. Le milieu réactionnel est laissé sous agitation toute la nuit à température ambiante. 53 Le Pd/C résiduel est filtré sur Whatman et après concentration à sec du filtrat, un solide jaune est récupéré (m=5g) La purification par chromatographie FLASH sur silice (Merck , 40-60 m) en éluant avec un mélange CH2C12/CH3OH permet d'obtenir 1,8g de produit. C28H52N4O8 ; m/z = 573,35 (ES+)

d) Synthèse du (4,7-bis-tert-butoxycarbonylmethyl-10-dioctadecylcarbamoylmethyl-1,4,7, 10tetraaza-cyclododec-l-yl)-acetic acid ester N O ° Vin] r° ° 680mg de l'intermédiaire obtenu en c) (1,2mmol; léquiv) sont dissous dans du 15 dichlorométhane CH2C12. 138 mg de NHS (1,2mmol; léquiv) et 245mg de DCC (1,2mmol ; léquiv) sont additionnés. L'agitation est maintenue 30 minutes à température ambiante puis le milieu réactionnel est filtré. Le filtrat est ajouté goutte à goutte sur la dioctadécylamine (619mg ; 1,2mmol ; léquiv) mise en solution dans la pyridine à 70°C. L'agitation est maintenue à 40°C durant une nuit. Après évaporation du solvant, le solide 20 est repris à l'eau et la solution obtenue est centrifugée. Le surnageant est prélevé et le solide est séché à l'évaporateur rotatif. 800mg d'un solide jaune sont récupérés (Rendement=63%)

CMH125N5O7 ; MALDI-TOF : mode positif m/z 1076,97 10 e) Synthèse du (4,7-bis-carboxymethyl-10-doctadecylcarbamoylmethyl-1,4,7, 10tetraaza-cvclodode-l-yl)-acetic acid O CnOH HO OH

Dans un ballon de 25mL, 40mg de l'intermédiaire obtenu en d) (0,037mmol ; 1 équiv) sont dissous dans 4mL d'acide trifluoroacétique. et lmL de CH2C12 pendant 5h. Après évaporation du mélange de solvants, le solide jaune (32mg) est précipité dans l'éther diéthylique puis filtré sur fritté.

C52H101N507 ; MALDI-TOF mode positif m/z 908,76

f) Synthèse du (2-{4-dioctadécvlcarbamovlmehyl-7,10-bis-f(ethoxycarbonylmethyl- carbamoyl)-methyl]-1,4,7,10tetraaza-cyclododec-1 -yl} -acetylamino)-acetic acid ester LN] _0 H O H O O Dans un ballon de 25mL, 80 mg de l'intermédiaire obtenu en e) (0,09mmol ; léquiv) et 27mg de glycine éthylester (0,26mmol ; 3équiv) sont dissous dans 4mL de chloroforme CHC13. 121 mg de HBTU (0,32mmol ; 3,5équiv) et 97mg de DMAP (0,79mmol ; 8,8équiv). Le milieu réactionnel est alors à 30°C pendant 2 jours puis est évaporé à sec. Le produit est lavé avec de l'eau puis filtré (88,8mg)

C64H122N8010 ; MALDI-TOF: Mode positif: m/z 1163,94

g) Synthèse du (2-{4,7-bis-f(carboxymethyl-carbamoyl)-methyll-10- dioctadecylcarbamoylmethyl-1,4,7,10tetraaza-cyclododec-1-y11 -acetylamino)acetic acid N r-\ O rN N-1 )_5 L HO- OH 40mg de l'intermédiaire obtenu en f) (0,03 mmol ; 1 équiv) sont dissous dans 20mL d'un 15 mélange 1/1 (v/v): 1 HC1 concentré/dioxane. Le milieu réactionnel est mis sous agitation pendant 2 heures à température ambiante. Après évaporation à sec du solvant et lavage à l'eau, 27,7mg d'une poudre blanche sont obtenus. 20 C58H110N8010 ; MALDI-TOF: Mode positif m/z 1079,83 h) Synthèse des Complexes de lanthanide (exemple avec chaîne aliphatique lipophile) 100mg de l'intermédiaire obtenu en f) (0,09 mmol; 1 équiv) sont dissous dans 2mL de 5 CH3OH. 0,1 mmol (1,leq) de chlorure de lanthanide (EuC13, 6H20, TmC13, 6H20, YbC13, 6H20) sont ensuite ajoutés. Le pH est ajusté à 7 par addition d'acétate de sodium 0,1N dans MeOH. Le milieu réactionnel est chauffé à reflux pendant 1h. Après évaporation à sec, le produit est lavé par de l'eau puis filtré. On obtient 100mg de poudre blanche.

10 Ln~+ Formule m/z (Maldi-Tof) négatif Eu'+ C58HIo~N8OioEu 1226 Tm3 C58H10~N8Oi°Tm 1244 Yb'+ C58HimN8OioYb 1247 Dy" C58Hio7N80IoDy 1237 Gd3 C58H10~N8OioGd 1231 57 Les composés obtenus à cet exemple 33 sont en particulier utiles comme chélate q=1 membranaire utilisés en plus de chélates q=2 libres encapsulés.

PARTIE VI) Synthèse des liposomes incorporant des chélates : Liposomes sphériques 2,5mL d'une solution de lipide à 25mg/ml total dans un mélange chloroforme-méthanol sont préparés dans les proportions suivantes : 55% POPC (34mg), 5% DPPG (3mg) et 40% Cholestérol (25mg).

La solution est ensuite évaporée à sec et le film lipidique ainsi obtenu est séché sous vide pendant une nuit avant d'être réhydraté avec 2,5m1 d'une solution aqueuse pH7 de complexe monomère ou de multimère q=2 à 300mOsm/kg préalablement filtrée sur 0,22 m. La solution est agitée pendant 1h à 40°C avec des billes de céramiques. Elle est ensuite placée 10 min aux ultrasons. Cette solution est ensuite extrudée successivement sur des filtres de 1 m, 0,8 m, 0,4 m et enfin 0,2 m en chauffant à 45°C. Enfin les liposomes sont purifiés sur gel d'exclusion stérique sur des cartouches Séphadex G25M (GE). Complexe Diamètre Osmolalité [Tm] hydrodynamique (mOsm/kg) mM (nm) DO3A-Tm 154 222 PCTA-Tm ~ ~ o 195 308 6,1 o N 3+ re'-TTm O N ~ O Inorganic Chemistry, 36(14), 2992-3000 (1997), and Magn. Reson. Chem., 36, S200- 208 (1998) DOTA-Tm 172 272 2,5 DOTMA-Tm 179 2,9 Le même protocole expérimental est utilisé avec les compositions suivantes en surfactant. Egg PC/Cholestérol/DSPE-PEG2000 75/20/5 Egg PC/Cholestérol 80/20 Egg PC/ DSPE-PEG2000 95/5 DMPC/Cholestérol/DSPE-PEG2000 75/20/5 DMPC/DSPE-PEG2000 95/5 DMPC/cholestérol 80/20 Liposomes non sphériques Une solution de lipide à contenant en moles 75 % DPPC, 20% de complexe lipophile, 5% DSPE-PEG2000 est dissoute dans le chloroforme à température ambiante. La solution est ensuite évaporée à sec et le film lipidique ainsi obtenu est séché sous vide pendant une nuit avant d'être réhydraté à 55°C par une solution aqueuse à 40 mM de complexe monomère ou multimère q=2 préalablement filtrée sur 0,22 m. Cette solution est ensuite extrudée 6 fois sur des filtres de 0,2 m en chauffant à 55°C. La suspension liposomale est ensuite dialysée contre une solution isotonique (300 Osm, pH=7,4) afin de purifier le liposome et le rendre asymétrique.

Emulsion CEST Les nanoparticules sont obtenues en émulsifiant 15% (v/v) de perfluorooctylbromide (PFOB), 1% (w/v) d'un mélange de surfactant (phosphatidylcholine/ dipalmitoylphosphatidylethanolamine et le complexe lipophile à q = 2 dans un ratio 59/1/40) et 2.5% de glycerine (w/v) et de l'eau. Ce mélange est émulsifié durant 4 minutes à 20000 psi.

PARTIE VI) Propriétés en imagerie CEST de liposomes encapsulant des chélates q=2 notamment de liposomes sphériques tels que fabriqués ci-dessus

1) chélates PCTA-Tm Spectre Z spectra à 310 K et 300 MHz Conditions expérimentales: SW 75 ppm, TD:32768, NS:1 ou 4, DS:2, AQ:0.72 s, D1= 15s saturation pendant 3s La figure 2 met en évidence un pic autour de 8 ppm qui démontre l'efficacité du produit. L'intensité du pic de l'eau est mesurée à une puissance d'irradiation de 31 dB (figures 1 15 et 2).

2) chélates DO3A-Tm Spectre Z spectra à 310 K et 300 MHz Conditions expérimentales: 20 SW 75 ppm, TD:32768, NS:1 ou 4, DS:2, AQ:0.72 s, D1= 15s saturation pendant 3s La figure 4 met en évidence un pic autour de 8 ppm qui démontre l'efficacité du produit. L'intensité du pic de l'eau est mesurée à une puissance d'irradiation de 31 dB (figures 3 et 4).

25 En comparaison les composés de l'art antérieur DOTA-Tm et DOTMA-Tm (de type q=1) donnent une valeur de déplacement delta (pic) de respectivement 4 et 1,8, soit bien inférieure aux valeurs des compositions de chélates selon la présente invention (pic à 8 ppm).

Claims

REVENDICATIONS1. Composition pour imagerie CEST comprenant un système d'encapsulation 5 encapsulant au moins un agent CEST constitué par un chélate de métal de type q 2, ledit chélate étant libre à l'intérieur du système d'encapsulation.
2. Composition selon la revendication 1 caractérisée en ce que le chélate est un chélate q=2.
3. Composition selon la revendication 2 caractérisée en ce que le chélate est 10 choisi parmi : PCTA, DO3A, DO3MA, AAZTA, HOPO et leurs dérivés, de préférence le PCTA ou le DO3A.
4. Composition selon la revendication 1 caractérisée en ce que le chélate est un chélate q=3
5. Composition selon la revendication 4 caractérisée en ce que le chélate q=3 est 15 choisi parmi HOPO, PC2A, BP2A et Tx.
6. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 caractérisée en ce que le chélate est un multimère, avantagement un dimère, un trimère ou un tétramère.
7. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 caractérisée en ce 20 que le métal est choisi parmi Dy3+, Tb3+, Tm3+,Yb3+, Eu3+, Gd3+.
8. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisée en ce que le chélate de métal est choisi parmi PCTA-Tm, PCTA-Dy, DO3A-Tm, DO3A-Dy.
9. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 caractérisée en 25 ce que le système d'encapsulation est un liposome, une émulsion double eau/huile/eau, une émulsion eau dans huile ou un micelle inverse.
10. Composition selon la revendication 9 caractérisée en ce que le système d'encapsulation est un liposome non sphérique.
11. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 caractérisée en ce que le système d'encapsulation encapsule en outre un deuxième chélate différent q > 2 .
12. Composition selon l'une quelconque des revendications 2, 3 et 6à 11, caractérisée en ce que le chélate est un chélate q=2 et en ce que le système d'encapsulation encapsule en outre un chélate q=1.
13. Composition selon l'une quelconque des revendications 11 ou 12 caractérisée en ce qu'au moins le deuxième chélate est associé à la membrane.
14. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 caractérisée en ce que le système d'encapsulation comprend en outre au moins un biovecteur de ciblage d'une zone pathologique d'intérêt, avantageusement un acide aminé, un peptide, un polypeptide, une vitamine, un mono ou polysaccharide, un anticorps, un acide nucléique, un biovecteur ciblant des récepteurs cellulaires, un pharmacophore, un biovecteur de ciblage de l'angiogenèse, un biovecteur de ciblage de MMP, un peptide de ciblage de tyrosine kinase, un peptide de ciblage de la plaque d'athérome ou un biovecteur de ciblage de plaques amyloïdes.