FR2929859A1 - Dispositif et procede pour la formation de micro depots. - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un dispositif pour la formation de microdépôts d'un échantillon liquide, comprenant :- un réservoir (11) destiné à recevoir un échantillon liquide à déposer, le fond du réservoir étant pourvu d'un trou débouchant, le trou étant dimensionné pour maintenir l'échantillon dans le réservoir par capillarité ;- une aiguille (3) présentant une pointe montée mobile jusqu'à une position où elle traverse le trou pour faire saillie à l'extérieur du réservoir et entraîner une fraction de l'échantillon hors du réservoir; et- un organe de commande (53) commandant le déplacement de la pointe jusqu'à ladite position.

Description

L'invention concerne l'analyse d'échantillons, et en particulier des méthodes et appareils pour la formation de multiples micro-dépôts sur des surfaces à partir d'un même échantillon.

La possibilité de réaliser plusieurs centaines d'analyses multiplexées d'un même échantillon, en utilisant des micro-dépôts de réactifs sur des surfaces planes, est aujourd'hui largement démontrée. L'analyse de l'expression génétique d'un même échantillon fait notamment appel aux micro-dépôts de séquences nucléotidiques. Des micro-dépôts d'antigènes servent également à mettre en évidence les anticorps de sujets en situation d'infection ou de vaccination dans le domaine de l'immunochimie. L'analyse multiplexée d'échantillons est actuellement cantonnée au domaine de la recherche en raison du coût et de la lenteur des procédés de micro dépôt. Cependant, une telle analyse multiplexée présente de nombreuses applications dans le domaine du diagnostic. Il est notamment utile de pouvoir soumettre un prélèvement à plusieurs réactifs. En outre, un même réactif doit fréquemment être appliqué sur un grand nombre de prélèvements distincts. Des techniques de dépôt ont été conçues pour la formation de puces à ADN. Une puce ADN est une petite plaque en verre, en silicium ou en plastique, sur laquelle sont déposées des séquences nucléiques qui sont caractéristiques de certains gènes et qui, dans un mélange de molécules, en s'appariant avec des séquences nucléiques complémentaires, permettent de détecter la présence des mêmes gènes dans des cellules soumises à l'analyse. Cependant, en raison de leur coût trop élevé et de leur faible cadence de réalisation, ces techniques ne sont pas transposables pour des applications de diagnostic à grande échelle. Des machines de formation de micro dépôts sont connues pour réaliser les puces ADN. Ces machines sont conçues pour former des points de dépôts ou points d'échantillon sur des lames de microscope. On dépose sur un plateau un certain nombre de lames de verre au format du microscope (25 x 75 mm). Les solutions à déposer sont contenues dans une plaque à alvéoles formant un réservoir. Une tête de dépôt aspire les solutions dans la plaque à alvéoles. La tête de dépôt se déplace au dessus des lames pour y déverser les solutions et est entraînée par une mécanique X. Y. Z. très précise.

Ces machines sont optimisées pour réaliser un grand nombre de dépôts différents sur un nombre réduit de lames. Toutefois, il y a un grand gaspillage des solutions à déposer car la fréquence de réutilisation de la tête de dépôt implique de nombreux rinçages. De plus, ces machines sont incapables de former des dépôts sur des plaques de diagnostic. Le standard des plaques de diagnostic comprend 96 puits répartis sur huit lignes et 12 colonnes avec un pas de 9 mm et une profondeur de 8 mm qui rend impossible la mise en place de dépôts avec les machines actuelles. En particulier, la société Genetic Microsystems fabrique une machine de dépôt sous la référence Arrayer 417. Cette machine utilise une technologie du type pin and ring . Seule cette technologie permet actuellement de réaliser des dépôts à partir de suspensions bactériennes sans colmatage. Elle a donné lieu au brevet US 6,269,846 portant sur le guidage de l'aiguille. On constate en pratique que la taille des dépôts est variable en fonction de la position de la lame. Par ailleurs, la décantation et l'évaporation de la solution à déposer ne sont pas maîtrisées, ce qui entraîne la variation de sa concentration. Cette machine effectue des lavages répétés de la tête de dépôt, ce qui induit en pratique une perte de l'ordre de 95 % de la solution à déposer.

L'invention vise à résoudre un ou plusieurs de ces inconvénients. L'invention fournit en effet des procédés et appareils permettant de réaliser des micro-dépôts d'un échantillon sur un support adapté, de manière stable, reproductible et fiable. L'invention permet notamment de réaliser de grandes séries de micro-dépôts et est applicable à tout type d'échantillon.

L'invention porte ainsi sur un dispositif pour la formation de microdépôts d'un échantillon liquide, caractérisé en ce qu'il comprend : - un réservoir destiné à recevoir un échantillon liquide à déposer, le fond du réservoir étant pourvu d'un trou débouchant, le trou étant dimensionné pour maintenir l'échantillon dans le réservoir par capillarité ; - une aiguille présentant une pointe montée mobile jusqu'à une position où elle traverse le trou pour faire saillie à l'extérieur du réservoir et entraîner une fraction de l'échantillon hors du réservoir; et - un organe de commande commandant le déplacement de la pointe jusqu'à ladite position.

Un autre objet de l'invention concerne un dispositif comprenant: -un convoyeur d'entraînement de supports selon une direction de traitement ; -un dispositif de chargement de supports sur le convoyeur ; -un dispositif de formation de microdépôts d'échantillon tel que défini ci-dessus, disposé à l'aplomb de supports placés sur le convoyeur en aval du dispositif de chargement, le dispositif formant des dépôts sur les supports de façon synchronisée avec l'entraînement par le convoyeur ; et -un dispositif de déchargement (87) de support du convoyeur, disposé en aval du dispositif de formation de dépôts.

Un autre objet de l'invention concerne un procédé pour la formation de dépôts d'un échantillon liquide sur un support, comprenant l'application des dépôts au moyen d'un dispositif tel que défini ci-dessus. L'invention concerne également l'utilisation d'un dispositif tel que défini ci-dessus pour la formation de microdépôts d'un ou plusieurs échantillons liquides sur un support L'invention concerne encore un procédé de production de supports comportant des microdépôts d'échantillon, le procédé comprenant l'application des microdépôts au moyen d'un dispositif tel que défini ci-dessus.

Dans des modes de réalisation préférés, le dispositif de l'invention comporte en outre une ou plusieurs des caractéristiques suivantes : la pointe (34) est montée mobile entre une position où elle est logée à l'intérieur du réservoir et ladite position où elle fait saillie à l'extérieur du réservoir ; le trou est de forme circulaire et présente un diamètre compris entre 0,3 et 0,6 mm ; la pointe (34) présente un diamètre compris entre 0,10 mm et 0,3 mm ; la pointe présente plusieurs parties successives de sections croissantes en partant de l'extrémité libre de la pointe (34) ; le réservoir (11) présente une contenance comprise entre 5 et 100 microlitres, de préférence entre 5 et 50 microlitres ; le réservoir présente un alésage cylindrique dans sa partie supérieure (13), et un alésage conique dans sa partie inférieure (14) joignant l'alésage cylindrique au trou débouchant; la partie extérieure du réservoir entourant le trou débouchant est recouverte d'un revêtement hydrophobe ; le poids de l'aiguille (3) entraîne la pointe vers la position ou elle est en saillie à l'extérieur du réservoir, et l'organe de commande comprend un moteur (52) et un levier (53) actionné par le moteur entraînant l'aiguille vers la position où la pointe (34) est logée à l'intérieur du réservoir ; 91e dispositif comprend plusieurs réservoirs et aiguilles associés, les réservoirs étant séparés par un même pas, le levier entraînant les pointes desdites aiguilles vers la position où ces pointes sont logées à l'intérieur de leurs réservoirs associés ; les réservoirs sont ménagés dans un même composant monobloc (1) ; le dispositif comprend un guide (2), et l'aiguille comprend un corps (32,33) surplombant et solidaire de la pointe, le corps étant guidé en translation par le guide (2) ; le guide (2) est solidaire du réservoir (11) ; le réservoir (11) présente une paroi extérieure de forme cylindrique vissée dans un alésage inférieur du guide (2) ; le guide forme un épaulement (23) en saillie radialement au-delà de la paroi extérieure du réservoir (11) ; le dispositif comprend une pluralité d'aiguilles groupées en damier reproduisant le patron des micro-dépôts à effectuer, une plaque (91) dans laquelle des puits (92) sont ménagés ,un dispositif de montée-descente permettant une pénétration des aiguilles dans les puits (92), la pluralité d'aiguilles et la plaque (91) étant assujetties à des mouvements relatifs perpendiculaires ; l'aiguille forme un renflement (35) en saillie radialement à l'intérieur du guide (2) sous le palier (21) ; et/ou le dispositif comprend en outre un organe de placement et de retrait d'un support à l'aplomb de la pointe (34) .

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront clairement de la description qui en est faite ci-après, à titre indicatif et nullement limitatif, en référence aux dessins annexés, dans lesquels : -la figure 1 est une vue en coupe de côté d'un premier mode de réalisation d'une machine de micro dépôts ; -la figure 2 est une vue schématique de dessus d'une ligne de dépôt sur des lames de verre, utilisant la machine de la figure 1; -la figure 3 est une vue de dessus d'un deuxième mode de réalisation d'une machine de micro dépôts durant son fonctionnement ; -les figures 4A et 4B sont des vues en coupe de côté d'aiguilles de la machine de la figure 3 durant différentes étapes de fonctionnement ; -la figure 5 est une vue en coupe de la machine de la figure 3 durant son fonctionnement ; -la figure 6 est une image de fluorescence de dépôts réalisés avec une machine selon l'invention.

La présente demande concerne des procédés et dispositifs pour la formation de micro-dépôts (ou points de dépôt) d'un échantillon sur la surface d'un support approprié. Comme il sera décrit plus en détail dans la suite du texte, l'invention est applicable à tout type d'échantillon liquide, c'est-à-dire notamment toute solution ou suspension, par exemple aqueuse. L'échantillon peut être de nature variée, comme par exemple un échantillon de nature polypeptidique (peptides, polypeptides, protéines, anticorps, etc.), nucléique (ADN, ARN, etc), cellulaire, virale, lipidique, biologique, etc. L'invention permet la formation de microdépôts, c'est-à-dire typiquement de dépôts présentant un volume inférieur à 50 nl, typiquement compris entre 0,1 et 10n1, cette quantité étant ajustable par l'homme du métier. L'invention permet de former des dépôts sur tout type de support approprié. Il s'agit de préférence de support comprenant une surface essentiellement plane (comme une lame, une membrane, un filtre, etc.). Il peut également s'agir de support présentant des surfaces planes séparées par des cloisons, par exemple des puits d'une plaque. Le support peut être en tout matériau adapté (verre, plastique, tout polymère compatible, métal, silice, céramique, corail, etc.). Il s'agit typiquement d'une plaque multi-puits, comme par exemple une plaque 12, 24 ou 96 puits, ou plus. Il peut également s'agir d'une lame de verre.

Un premier aspect de l'invention concerne un dispositif pour la formation de dépôts à partir d'un échantillon liquide (par exemple une solution aqueuse) contenu dans un réservoir. Un trou débouchant est ménagé dans le fond du réservoir. Le trou est dimensionné pour maintenir l'échantillon liquide dans le réservoir par capillarité. Le dispositif comprend une pointe d'aiguille apte à entraîner l'échantillon à travers le trou.

Le dispositif de formation de dépôts illustré à la figure 1 comprend une bande 7 de convoyage de lames de verre 6. Les lames 6 successives sont disposées sur la bande 7 avec un pas prédéfini, par exemple de 35 mm. Les lames 6 pourront par exemple être positionnées en X. et Y. au moyen d'un gabarit. Deux faces perpendiculaires d'une lame 6 sont en contact avec deux faces respectives d'un gabarit. La bande 7 entraîne les lames 6 selon la direction X. Le dispositif comprend une plaque 1 surplombant la bande 7. Plusieurs réservoirs 11 sont ménagés dans la plaque 1 et présentent un trou débouchant dans leur fond. Ces réservoirs 11 sont remplis de solutions 12 à déposer sous forme de dépôts. Chaque trou est dimensionné pour maintenir la solution dans le réservoir 11 par capillarité. Les réservoirs présentent typiquement une contenance comprise entre 5 et 100 microlitres, de préférence entre 5 et 50 microlitres, même si celle-ci peut être adaptée par l'homme du métier, et variable d'un réservoir à un autre. La plaque 1 est surplombée par un plateau 4 qui sert de couvercle et de guide. Le plateau 4 est fixé de façon amovible sur la plaque 1, par exemple pour réaliser des opérations de maintenance ou faciliter le remplissage des réservoirs 11. Le plateau 4 présente des alésages filetés disposés à l'aplomb de réservoirs respectifs 11 de la plaque 1. Des supports de guidage 2 sont fixés dans les alésages du plateau 4. Des aiguilles 3 sont guidées en translation selon l'axe Z par le support de guidage 2. Les aiguilles 3 présentent une pointe 34 au niveau de leur extrémité inférieure, disposée à l'intérieur d'un réservoir respectif 11 dans la position illustrée. Le dispositif comprend de plus un levier 53 définissant la course en translation de la pointe 34. En abaissant une pointe 34 selon la direction Z, cette pointe entraîne une fraction de la solution 12 présente dans le réservoir 11 à travers le trou débouchant, pour la déposer sur la plaque de verre 6 se trouvant à l'aplomb.

L'invention permet de réaliser un grand nombre de dépôts avec une cadence élevée à partir de la solution 12 présente dans le réservoir 11, en limitant l'évaporation de cette solution 12. Par ailleurs, la pointe 34 forme un piston traversant le trou du réservoir 11 et évite ainsi son colmatage. La pointe 34 garantit une grande reproductibilité des dépôts formés. Par ailleurs, durant tout le processus de formation des dépôts, les solutions et les aiguilles 3 sont isolées de l'extérieur ce qui élimine les risques de contamination.

La plaque 1 présente plusieurs réservoirs 11 destinés à recevoir des solutions 12 à déposer sur les lames de verre 6. Ces réservoirs 11 pourront être réalisés par usinage d'une même plaque métallique. Les réservoirs 11 sont disposés avec un pas correspondant aux pas entre les lames 6 successives sur la bande 7. Avantageusement, les réservoirs 11 et la bande 7 pourront être déplacés relativement l'un par rapport à l'autre selon la direction Y, de façon à former plusieurs dépôts selon la plus grande dimension d'une lame de verre 6. La plaque 1 pourra notamment être motorisée afin d'être déplacée selon les axes X et Y par rapport à la bande 7. Des lames de verre 6 présentant chacune jusqu'à 18 zones de dépôt entourées par des délimitations hydrophobes pourront être utilisées. Un alésage est ménagé dans chaque réservoir 11 et présente une partie supérieure 13 de forme cylindrique, et une partie inférieure 14 de forme conique formant le fond du réservoir 11. Le trou débouchant est formé dans la partie inférieure 14. Le réservoir 11 présentera typiquement une hauteur de plusieurs millimètres, par exemple comprise entre 2 et 4 millimètres. La partie supérieure 13 présentera un diamètre de plusieurs millimètres. Le trou débouchant ménagé dans la partie inférieure 14 présente avantageusement un diamètre compris entre 0,3 et 0,6 millimètres. Un tel diamètre est suffisant pour permettre le passage des particules présentes dans la solution 12. Pour la plupart des solutions à déposer, un tel diamètre du trou permet de maintenir la solution 12 dans le réservoir 11 sans couler, du fait de la force capillaire. Ainsi, il n'est pas nécessaire de faire appel à un mécanisme complexe de retenue de la solution. Afin de renforcer la force capillaire sur la solution 12, la partie inférieure 14 du réservoir 11 est avantageusement recouverte par un revêtement hydrophobe, par exemple du silicone ou du polytétrafluoroéthylène.

Le support de guidage 2 est réalisé sous forme de cylindre creux. Il supporte les paliers de guidage supérieur et inférieur de l'aiguille, qui sont soit usinés dans la masse, soit constitués de bagues rapportées. Le support de guidage est solidaire du réservoir. Dans un mode de réalisation particulier, la partie inférieure du support de guidage est taraudée et le réservoir est fileté. Ce mode est particulièrement adapté à la formation de microdépots sur plaques multipuits, par exemple sur plaques 96 puits. En effet, avec ce type de supports il est avantageux que le réservoir puisse se déplacer en hauteur pour pénétrer dans le puits, ce qui est obtenu par exemple en le suspendant à l'aiguille. Dans un autre mode de réalisation, la surface extérieure de la partie inférieure du support de guidage 2 est filetée et le réservoir est surmonté d'un alésage taraudé. Dans une autre réalisation, avantageuse pour associer plusieurs réservoirs, la partie inférieure du support de guidage est vissée dans l'alésage taraudé correspondant du plateau 4.

Le positionnement radial et le guidage en translation de l'aiguille 3 sont assurés par l'intermédiaire du palier supérieur 21 ménagé dans le support de guidage et par l'intermédiaire du palier inférieur 22 ménagé dans le plateau 4. Le palier supérieur 21 est réalisé dans un épaulement ménagé dans la partie supérieure du support de guidage 2. Le palier inférieur 22 est réalisé dans un épaulement ménagé dans le fond d'un alésage taraudé du plateau 4. On pourrait également envisager de réaliser le palier inférieur 22 dans le support de guidage 2. Cet épaulement forme également un couvercle pour le réservoir 11. Les paliers supérieur 21 et inférieur 22 sont séparés par une distance d'environ 20 mm. Les paliers inférieur et supérieur pourront être munis d'une bague cylindrique en polytétrafluoroéthylène.

L'aiguille 3 présente une pointe 34 immergée dans la solution 12 et dont l'extrémité inférieure est destinée à amener une fraction de cette solution en contact avec la lame de verre 6. La pointe 34 présente avantageusement un diamètre compris entre 0,1 et 0,3 mm. La partie inférieure de la pointe 34 est de préférence polie. La pointe 34 est surmontée par une première partie de guidage en translation 33. La pointe 34 pourra présenter une section croissante entre son extrémité libre et sa jonction avec la première partie de guidage 33, afin d'accroître l'agitation de la solution 12 et ainsi assurer l'homogénéité de cette solution pour les différents dépôts réalisés. La pointe 34 pourra également présenter plusieurs sections de diamètres distincts et croissants en partant de l'extrémité libre jusqu'à la première partie de guidage 33. La pointe pourra notamment présenter une section d'un diamètre de 0,3 mm joignant l'extrémité libre à la première partie de guidage 33. Cette partie de guidage 33 présente un diamètre d'environ 1 mm et est montée selon un ajustement glissant par rapport au palier 22. La première partie de guidage 33 est surmontée d'une deuxième partie de guidage en translation 32. La partie de guidage 32 présente un diamètre d'environ 4 mm et est montée selon un ajustement glissant par rapport au palier 21 du support de guidage 2. La deuxième partie de guidage 32 est surmontée par une butée 31 présentant un diamètre supérieur à cette deuxième partie de guidage 32. L'aiguille 3 peut être réalisée en acier inoxydable et présenter un poids compris entre 4 et 6 grammes approximativement. L'aiguille 3 pourra présenter une hauteur comprise entre 30 et 50 mm. Les surfaces de l'aiguille 3 guidées en translation par les paliers 21 et 22 sont avantageusement polies pour limiter les frottements. Les efforts de frottement durant la translation de l'aiguille 3 seront avantageusement inférieurs à 0,01 N. Des essais ont été mis en oeuvre avec une aiguille 3 présentant les dimensions suivantes: -une pointe 34 munie d'une extrémité libre d'un diamètre de 0,15 mm et d'une hauteur de 0,8 mm, et munie d'une partie de jonction d'un diamètre de 0,3 mm et d'une hauteur de 3,2 mm ; -une première partie de guidage 33 d'un diamètre de 1 mm et d'une hauteur de 17 mm ; -une deuxième partie de guidage 32 présentant une première section de 2,32 mm diamètre et 8,02 mm au et une deuxième section de 4 mm de diamètre et de 8 mm de haut ; -une butée 31 de 8 mm de diamètre et de 8 mm de haut. Une telle aiguille 3 s'est avérée très accessible et aisément démontable pour procéder à son nettoyage.

La précision du centrage de l'aiguille 3 par rapport au support de guidage 2, et la précision de centrage du support de guidage 2 par rapport à la plaque 4 permet de maintenir un jeu entre la pointe 34 et le trou débouchant du réservoir associé. Ce jeu sera de préférence inférieur à 100 pm. Un centrage approprié de l'aiguille permettra de définir la position du dépôt avec une précision de 50 pm. Le dispositif pourra comprendre un agitateur de l'échantillon liquide à déposer.

Un levier 53 définit la course en translation des aiguilles 3. Ce levier 53 est monté pivotant autour de deux axes 51. Le levier 53 est entraîné par un moteur 52 associé à une came. La came présente une partie saillante excentrique, supportant le levier 53. Lors d'une rotation de la partie saillante, le levier 53 s'abaissera sous l'effet de son poids propre. On pourra également utiliser un roulement à billes monté à rotation excentrée par rapport à son axe, afin de limiter l'usure. Le moteur 52 limitera la vitesse de descente de l'aiguille 3 à environ 10 à 20 mm par seconde. Le moteur 52 pourra être commandé de façon à assurer une durée de contact entre la pointe 34 et la lame de verre 6 comprise entre 0,05 et 0,15 secondes. La durée de contact pourra notamment être définie par la différence entre la course de l'extrémité du levier 53 et la course de l'aiguille 3. Dans ce mode de réalisation, l'aiguille 3 est entraînée vers le bas par son poids propre. Le levier 53 est alors utilisé pour contrôler la vitesse de descente de l'aiguille 3. Le levier 53 retient l'aiguille 3 par l'intermédiaire de la butée 31. La course descendante du levier 53 peut se poursuivre au delà du contact entre la pointe 34 et la lame de verre 6, la force de contact étant alors uniquement définie par le poids de l'aiguille 3, garantissant une grande régularité de la force d'appui sur la lame de verre 6. La course en translation de la pointe 34 sera par exemple comprise entre 4 et 7 mm. Le levier 53 maintient la pointe 34 dans le réservoir 11 jusqu'à une commande de dépôt. Lors d'une commande de dépôt, le levier 53 pivote pour autoriser la descente de la pointe 34 jusqu'au contact avec une lame de verre 6. La pointe 34 entraîne une goutte de la solution 12 et la dépose alors sur la lame de verre 6. Pour opérer la remontée de l'aiguille 3, le moteur 52 continue sa course de façon à faire pivoter le levier 53 en sens inverse, de sorte que l'aiguille 3 est entraînée vers le haut par l'intermédiaire de la butée 31. Selon une variante, on peut envisager que le levier 53 soit solidarisé à l'aiguille 3 par l'intermédiaire d'un ressort. Si le levier 53 est entraîné après que la pointe 34 soit entrée en contact avec la lame de verre 6, le ressort limite la force de contact transmise entre le levier 53 et la pointe 34. La descente de l'aiguille 3 peut être définie par d'autres mécanismes de commande. La descente peut notamment être définie par l'intermédiaire d'un moteur pas à pas, par l'intermédiaire d'une came transformant un mouvement circulaire en mouvement linéaire, par une crémaillère, ou un dispositif à vis sans fin. On peut utiliser un moteur 52 du type pas-à-pas avec repérage de l'origine. Selon une variante, on utilise un moteur 52 de type asynchrone, avec un même repérage de position.

La figure 2 est une vue schématique de dessus d'une ligne de formation 8 de dépôts sur des lames de verre 6, utilisant une machine du type détaillé à la figure 1. La ligne de dépôt 8 comprend une bande 7 de convoyeur défilant selon une direction suivant laquelle les lames de verre 6 subissent des traitements. La ligne de dépôt 8 comprend un dispositif 81 de placement des lames de verre 6 sur la bande 7. Le dispositif 81 comprend des vérins 82 plaçant les lames de verre 6 sur la bande 7 à intervalles réguliers. Une rampe de lavage 83 est disposée dans la course des lames de verre 6 entre le dispositif 81 et la bande 7. Un dispositif de séchage 84 est disposé en aval au-dessus de la bande 7, de façon à éliminer l'eau résiduelle déposée par la rampe de lavage 83 sur les lames de verre 6. La ligne de dépôt 8 comprend plus en aval plusieurs machines de dépôt 85 de dépôts, du type détaillé auparavant. Chaque machine de dépôt 85 comprend un levier 53 monté pivotant autour d'un axe 51 et un moteur 52 commandant les montées ou les descentes du levier 53. Chaque levier 53 commande les montées ou les descentes de six aiguilles 3 alignées selon la direction de défilement du convoyeur, comme détaillé auparavant. A l'aplomb de chaque machine de dépôt 85, et solidaire de la dite machine, on trouve un gabarit, non représenté sur la figure 2, qui permet de bloquer les lames à la position exacte voulue pour le dépôt. La ligne de dépôt 8 pourra présenter le nombre d'aiguilles nécessaires pour déposer différentes solutions sur une lame 6. Un organe de contrôle 86 analyse la conformité des dépôts formés sur les lames de verre 6 en aval des machines de dépôt 85. L'organe de contrôle 86 extrait les lames de verre 6 jugées non conformes hors de la bande 7. En aval de l'organe de contrôle 86, un dispositif de manipulation 87 comprend un vérin 88. Le vérin 88 place les lames de verre 6 dans un boîtier de rangement 89 destiné à recevoir une multitude de lames de verre 6. La bande 7 est entraînée de façon à déplacer les lames de verre 6 d'incréments de distance correspondant aux pas entre les plaques 6. La bande 7 du convoyeur peut être remplacée par un transporteur rigide, à griffes ou à encoche, qui prend et relâche les lames en un mouvement cyclique, leur faisant faire un pas et les déposant dans un gabarit fixe où elles seront maintenues en position convenable.

La figure 3 est une vue de dessus d'un deuxième mode de réalisation d'une machine de formation de dépôts en utilisant des plaques de diagnostic standard. Des plaques de diagnostic 91 comprennent 96 puits 92 répartis sur huit lignes et douze colonnes avec un pas de 9 mm, conformément aux standards. Les plaques de diagnostic 91 sont disposées sur un convoyeur 94 apte à les entraîner selon la direction X. La machine comprend par ailleurs deux rails 93 orientés selon la direction Y. Une tête 95 est montée coulissante sur les rails 93. Un moteur non illustré positionne la tête 95 selon la direction Y. La tête 95 supporte une pluralité de réservoirs et d'aiguilles 3 guidées et disposées selon une matrice carrée de 6 x 6 par exemple, disposition dite en damier. Les aiguilles 3 illustrées par des cercles pleins sont descendues selon la direction Z verticale dans des puits 92. Les aiguilles 3 illustrés par des cercles vides ne sont pas descendues dans des puits. La disposition des aiguilles et des réservoirs associés reproduit le même patron que celui à réaliser pour les microdépôts au fond des puits.

Les figures 4a et 4b représentent une aiguille 3 dans deux positions de fonctionnement. Dans la position illustrée à la figure 4a, la pointe 34 est logée à l'intérieur du réservoir 11 et plonge dans la solution 12. Dans la position illustrée à la figure 4b, la pointe 34 fait saillie hors du réservoir 11 et entraîne une fraction de la solution 12 pour réaliser un microdépôt sur un support. L'aiguille 3 est montée coulissante dans un support de guidage 2, de façon similaire à la figure 1.

Le support de guidage 2 présente dans sa partie inférieure un alésage fileté. Le réservoir 11 présente une forme extérieure cylindrique. La surface extérieure du réservoir 11 est filetée. Le réservoir 11 est vissé dans l'alésage fileté du support de guidage 2. Afin de pouvoir pénétrer dans les puits 92, les réservoirs 11 pourront présenter un diamètre extérieur inférieur ou égal à 8 mm. En permettant la descente du réservoir 11 dans le puits 92, on peut limiter la course de la pointe 34 nécessaire au-delà du trou débouchant. La course de la pointe 34 au-delà du trou débouchant pourra par exemple être limitée à 2 mm. La partie inférieure du support de guidage 2 forme un épaulement 23 par rapport à la surface extérieure du réservoir 11. Cet épaulement 23 est utilisé comme butée pour limiter la descente du réservoir 11 à l'intérieur d'une alvéole 92.

L'épaulement dans lequel le palier inférieur 22 est ménagé forme un couvercle au dessus du réservoir 11. L'aiguille 3 présente un renflement 35 apte à entraîner l'épaulement supérieur lorsque l'aiguille 3 est remontée. Ainsi, par une traction sur la butée 33, on peut extraire le réservoir 11 d'une alvéole 92. L'aiguille 3, son guide et le trou débouchant pourront être légèrement décentrés par rapport à l'axe du puits de façon à obtenir un écartement adéquat entre les dépôts. La figure 5 est une vue en coupe de la machine au niveau des puits 92 d'une plaque de diagnostic 91. Un substrat de dépôt tel qu'une feuille transparente de verre ou de plastique 96 est disposé en appui contre le fond de la plaque 91. Le substrat 96 est surmonté par un quadrillage dans lequel les puits 92 sont formés. La machine présente une plaque de contrôle 54 munie d'électroaimants 55a à 55e. Les électroaimants 55a à 55e permettent de retenir ou de libérer respectivement les aiguilles 3a à 3e. En position relevée, l'extrémité supérieure des aiguilles 3a à 3e est maintenue par la plaque de contrôle 54. L'extrémité supérieure des aiguilles 3a à 3e est soutenue par une plaque de commande 56. Les réservoirs des aiguilles 3b à 3e sont alors disposés dans les puits 92. La partie supérieure 97 du quadrillage est à une hauteur prédéfinie, et forme une butée pour l'épaulement 23 durant la descente des aiguilles 3. La plaque de commande 56 est mobile verticalement entre une position haute illustrée en pointillés, et une position basse illustrée en traits pleins. Dans sa position basse, la plaque de commande 56 permet la descente des aiguilles jusqu'à ce qu'une pointe 34 sorte au-delà du trou débouchant de son réservoir et forme un dépôt sur le substrat 96. L'aiguille 3a est disposée hors de la zone du quadrillage, et le réservoir qui lui est associé est au dessus d'une surface périphérique 98 de la plaque 91. Par ailleurs, l'aiguille 3a et l'aiguille 3e sont maintenues en position relevée par l'électroaimant 55a. L'épaulement 23 des guides des aiguilles 3b à 3d est en butée contre la partie supérieure 97 de la plaque quadrillée. Le réservoir et le guide de ces aiguilles sont donc immobilisés verticalement. Une commande de descente de la plaque de commande 56 ayant été appliquée, la pointe 34 des aiguilles 3b à 3d fait saillie hors de leur réservoir et vient en contact avec le substrat 96 de façon à former un microdépôt. Comme dans l'exemple de la figure 1, les aiguilles 3 viennent en contact avec le substrat 96 sous l'effet de leur poids propre.

Des essais ont été réalisés avec un réservoir 11 présentant un diamètre de 2 millimètres et une hauteur de 5 mm. 10 microlitres d'une solution d'albumine bovine marquée à l'aminométhyle coumarine ont été placés dans ce réservoir. Un volume mort de quatre microlitres a été conservé. Les essais font apparaître une évaporation réduite. Cette solution a permis de réaliser 6500 dépôts sans recharger le réservoir. En l'absence de volume mort, un tel réservoir peut donc comprendre environ 15 microlitres de solution et permettre la formation de 10 000 dépôts. La figure 6 présente une image de fluorescence bleue de 81 dépôts de BSA*AMCA, obtenue avec une excitation de 365 nm. On note que ces dépôts sont assez homogènes entre eux, ce qui confirme que le mouvement de l'aiguille à l'intérieur du réservoir entretien une agitation régulière de la solution. Le CV intralame est compris entre 10 et 13 % (n=81%). Le CV de la moyenne interlame est de 5,62 % (n=14). À partir des images moyennes de la fluorescence des dépôts, on quantifie la fluorescence bleue des microdépôts d'échantillon, leur écart type et le CV pour chaque lame dans les différentes conditions d'essai. On a notamment constaté que l'utilisation de différentes aiguilles présentant des poids variant de 6,48 g à 12,56 g n'induisait pas de variation de la taille ou de la fluorescence des dépôts. On en déduit donc que des dépôts peuvent être formés à pression réduite, ce qui favorise notamment le dépôt de cellules.

Claims (19)

1. REVENDICATIONS1. Dispositif pour la formation de microdépôts d'un échantillon liquide, caractérisé en ce qu'il comprend - un réservoir (11) destiné à recevoir un échantillon liquide (12) à déposer, le fond du réservoir étant pourvu d'un trou débouchant, le trou étant dimensionné pour maintenir l'échantillon dans le réservoir par capillarité ; - une aiguille (3) présentant une pointe (34) montée mobile jusqu'à une position où elle traverse le trou pour faire saillie à l'extérieur du réservoir (11) et entraîner une fraction de l'échantillon hors du réservoir; et - un organe de commande (5), commandant le déplacement de la pointe jusqu'à ladite position.
2. 2. Dispositif selon la revendication 1, dans lequel la pointe (34) est montée mobile entre une position où elle est logée à l'intérieur du réservoir et ladite position où elle fait saillie à l'extérieur du réservoir.
3. 3. Dispositif selon la revendication 1 ou 2, dans lequel le trou est de forme circulaire et présente un diamètre compris entre 0,3 et 0,6 mm.
4. 4. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la pointe (34) présente un diamètre compris entre 0,10 mm et 0,3 mm.
5. 5. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la pointe 25 présente plusieurs parties successives de sections croissantes en partant de l'extrémité libre de la pointe (34).
6. 6. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le réservoir (11) présente une contenance comprise entre 5 et 100 microlitres, de préférence entre 5 et 30 50 microlitres.20 15
7. 7. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le réservoir présente un alésage cylindrique dans sa partie supérieure (13), et un alésage conique dans sa partie inférieure (14) joignant l'alésage cylindrique au trou débouchant.
8. 8. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la partie extérieure du réservoir entourant le trou débouchant est recouverte d'un revêtement hydrophobe.
9. 9. Dispositif selon la revendication 2, dans lequel le poids de l'aiguille (3) entraîne la pointe vers la position où elle est en saillie à l'extérieur du réservoir, et dans lequel l'organe de commande comprend un moteur (52) et un levier (53) actionné par le moteur entraînant l'aiguille vers la position où la pointe (34) est logée à l'intérieur du réservoir.
10. 10. Dispositif selon la revendication 9, comprenant plusieurs réservoirs et aiguilles associés, les réservoirs étant séparés par un même pas, le levier entraînant les pointes desdites aiguilles vers la position où ces pointes sont logées à l'intérieur de leurs réservoirs associés.
11. 11. Dispositif selon la revendication 10, dans lequel les réservoirs sont ménagés dans un même composant monobloc (1).
12. 12. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant un guide (2), solidaire du réservoir (11), dispositif dans lequel l'aiguille comprend un corps (32,33) surplombant et solidaire de la pointe, le corps étant guidé en translation par le guide (2). 25
13. 13. Dispositif selon la revendication 12, dans lequel le réservoir (11) présente une paroi extérieure de forme cylindrique vissée dans un alésage inférieur du guide (2).
14. 14. Dispositif selon la revendication 12 ou 13, dans lequel le guide forme un épaulement (23) en saillie radialement au-delà de la paroi extérieure du réservoir (11).
15. 15. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant une pluralité d'aiguilles groupées en damier reproduisant le patron des micro-dépôts à effectuer, une plaque (91) dans laquelle des puits (92) sont ménagés un dispositif de montée-descente 30permettant une pénétration des aiguilles dans les puits (92), la pluralité d'aiguilles et la plaque (91) étant assujetties à des mouvements relatifs perpendiculaires
16. 16. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'aiguille forme un renflement (35) en saillie radialement à l'intérieur du guide (2) sous un palier (21).
17. 17. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant en outre un organe de placement et de retrait d'un support à l'aplomb de la pointe (34).
18. 18. Dispositif comprenant : -un convoyeur d'entraînement (7) de supports (6) selon une direction de traitement ; -un dispositif de chargement (81) de supports sur le convoyeur (7); -un dispositif de formation de microdépôts d'échantillon (85) selon l'une quelconque des revendications précédentes, disposé à l'aplomb de supports placés sur le convoyeur en aval du dispositif de chargement, le dispositif formant des dépôts sur les supports de façon synchronisée avec l'entraînement par le convoyeur ; et -un dispositif de déchargement (87) de support du convoyeur, disposé en aval du dispositif de formation de dépôts.
19. 19. Procédé pour la formation de dépôts d'un échantillon liquide sur un support, comprenant l'application des dépôts au moyen d'un dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 17.