CN104159559B - 装填管瓶 - Google Patents

Abstract

在一个说明性的实施例中，提供一种中空管瓶，这种中空管瓶包括：管瓶本体，其具有位于一端的顶表面、位于相对端的底表面，以及其之间的限定内部管瓶容积的外壁，顶表面具有开口；插管，其从底表面延伸并具有第一端、第二端以及其之间的限定插管体积的外表面，第一端与内部管瓶容积处于流体连通；以及盖，其具有舌片，舌片在尺寸上设置为可密封地关闭开口，舌片还具有大于或等于插管体积的体积。

Description

装填管瓶

背景技术

在美国、加拿大和西欧，死亡人数中大约7%由传染病导致，而在发展中地区，死亡人数中大约40%由传染病导致。传染病导致各种临床表现。常见的明显表现为发热、肺炎、脑膜炎、腹泻和含血腹泻。虽然身体表现提示某些致病菌为病原体并排除其它致病菌，但是各种潜在的病原体仍存在，并且明确诊断时常需要执行各种化验。用于诊断致病菌的传统微生物学技术可能发费数天或数周，时常耽误恰当的治疗疗程。

在最近几年中，聚合酶链反应(PCR)已经变成一种用于快速诊断传染原的选择方法。PCR可能是一种诊断传染病的快速、灵敏且特殊的工具。利用PCR作为诊断的主要方法的挑战是在某些病理标本中存在各种可能的病原微生物和低水平的微生物。运行大名单的PCR化验时常是不恰实际的，对于各种可能的病原微生物各一次PCR化验，其大多数预计是阴性的。当致病菌核酸是低浓度时，问题被恶化，并且需要大量样本以收集足够的反应模板。在某些情况下没有足够的样本针对所有可能的病原体进行化验。一种解决方法是运行“多重PCR”，其中样本在单个反应中同时针对多个目标进行化验。虽然已经证明多重PCR在某些系统中是有价值的，但是存在与高水平多重反应的稳健性和对于多个产物进行明确分析的困难相关的缺点。为解决这些问题，后续可将化验划分成多个次级PCR。在初级产物中嵌套次级反应提高稳健性。然而，这种进一步装卸可能是昂贵的，并且可能导致污染或其它问题。

本发明解决装卸材料以执行生物分析的各种问题。

发明内容

在一个说明性的实施例中，提供一种中空管瓶，这种中空管瓶包括：管瓶本体，其具有位于一端的顶表面、位于相对端的底表面以及其之间限定内部管瓶容积的外表面，顶表面具有开口；插管，其从底表面延伸并具有第一端、第二端以及其之间限定插管体积的外表面，第一端与内部管瓶容积处于流体连通；以及盖，其具有舌片，舌片在尺寸上设置为可密封地关闭开口，舌片还具有大于或等于插管体积的体积。作为说明，舌片放置到顶表面的开口中以可密封地关闭开口会对内部管瓶容积进行加压，并且底盖的移除会造成加压流体被迫进入插管中。过滤器可定位在管瓶本体的底表面附近，过滤器设置为用于当流体传送到插管中时过滤流体。在一个实施例中，过滤器具有的孔径足够大，以容许原生动物或其它微生物穿过，但足够小以捕获较大的颗粒物质。可提供第二管瓶，以便为流体系统提供水合流体。

在另一说明性的实施例中，提供一种中空管瓶，这种中空管瓶包括管瓶本体、插管、可移除的底盖，管瓶本体具有相对于外部环境被一个或多个外壁密封的内部管瓶容积，插管从管瓶本体的底表面延伸，并具有第一端和第二端，第一端和第二端由外表面连接，并限定内部插管体积，第一端与内部管瓶容积处于流体连通，可移除的底盖具有第一端，其在尺寸和形状上设置为当底盖固定在插管的第二端时相对于外部环境可移除地密封插管的第二端，其中设置在内部容积中的流体处于压力下，并且底盖的移除将使插管的第二端暴露于外部环境，从而迫使流体穿过插管。

在又一说明性的实施例中，提供一种容器(pouch)装填站，这种容器装填站包括槽、一个或多个容座和中空管瓶，槽设置为用于接收容器，各个容座设置为用于接收中空管瓶，各个中空管瓶包括管瓶本体、插管和可移除的底盖，管瓶本体设置为用于相对于外部环境密封内部容积，插管从管瓶本体的底表面延伸，并具有第一端和第二端，第一端与内部容积处于流体连通，可移除的底盖相对于外部环境密封插管的第二端，其中各个容座在尺寸上设置为用于与其相应的底盖的形状相配合，从而有助于底盖的移除。如果提供不止一个容座，那么容座可设置不同的尺寸或形状，以接收不同尺寸或形状的底盖。

在又一实施例中，提供一种用于对流体系统进行装填的方法，其包括：提供中空管瓶，中空管瓶包括管瓶本体、插管，管瓶本体具有相对于外部环境密封的内部容积，内部容积包括设置在压力下的流体和一定体积的气体，插管从管瓶本体的底表面延伸，并具有第一端和第二端，第一端与内部容积处于流体连通，并且插管的第二端相对于外部环境是密封的；开启插管的第二端，由此管瓶本体中的压力迫使流体进入插管中；将第二端放置在流体系统中，由此使流体系统处于真空下；以及容许真空从中空管瓶抽吸流体，其中流体还由于管瓶本体中的气体膨胀而驱动穿过插管且进入流体系统中。

对于本领域中的技术人员而言，在考虑优选实施例的以下详细说明时，本发明的附加特征将变得清晰明了，优选实施例举例说明目前被认为实施本发明的最佳模式。

附图说明

图1显示根据本发明的一个实施例的柔性容器。

图2显示根据图1的柔性容器的细胞溶解(lysis)区域的一个实施例。

图2a显示囊(bladder)的与图2中所示的细胞溶解区域相对应的部分的一个实施例。

图2b显示根据图1的柔性容器的细胞溶解区域的一个实施例，其具有备选旋涡机构。

图3显示根据图1的柔性容器的核酸制备区域的一个实施例。

图4显示根据图1的柔性容器的第一级扩增区域的一个实施例。

图5类似于图1，但显示容器的一个备选实施例。

图5a是图5的容器的配件的横截面图。

图5b是图5的容器的一部分的放大图。

图6是容器的另一备选实施例的透视图。

图6a是图6的容器的配件的横截面图。

图7显示与图6的容器一起使用的说明性的囊构件。

图8是与图6的容器一起使用的仪器的分解透视图，其包括图6的容器。

图9显示图8的仪器的局部横截面图，其包括图7的囊构件，其中图6的容器以阴影显示。

图10显示图8的仪器的局部横截面图，其包括用于夹阀和图6的容器的各种囊。

图11显示来自在图5的容器中进行溶解和扩增的样本的第二级扩增的扩增曲线(正控制；酿酒酵母(S. cerevisaie)靶标(target)1；酿酒酵母靶标2；酿酒酵母靶标3；裂殖酵母(S. pombe)靶标1；裂殖酵母靶标2；负控制)。

图12类似于图6，但显示具有第二级高密度阵列的容器。

图13显示图8的仪器构件的变体。支撑部件已经设有马达，其设置为与图12的容器一起使用。

图14是图12的第二级高密度阵列的分解透视图。

图15是在设置第二级高密度阵列期间所示的图12的第二级高密度阵列的仰视图。

图16显示用于装填图12的容器的装填站，其包括图12的容器。

图17显示用于将样本装填到图12的容器中的装填管瓶。

图18显示用于将水合流体提供至图12的容器中的水合管瓶。

图19显示可与图16相当的装填站，但显示不同的装填站设置和用于与装填站一起使用的管瓶。

图20显示图19的样本管瓶的一部分以及样本管瓶如何锁定到图19的装填站的样本管瓶容座上。

图21显示图19的水合管瓶的一部分以及水合管瓶如何锁定到图19的装填站的水合管瓶容座上。

具体实施方式

这里所述的独立的核酸分析容器可用于例如在单个闭合系统中针对各种生物物质，例如抗原和核酸序列的存在而化验样本。在一个实施例中，容器用于化验多个致病菌。作为说明，在可选的一次性的容器中可执行各种步骤，包括核酸制备、初级大体积多重PCR、初级扩增产物的稀释和次级PCR，最后是实时检测和/或扩增后分析，例如熔化曲线分析。然而，应该懂得致病菌检测是一种典型用途，并且容器可用于其它核酸分析或其它物质的检测，包括但不局限于肽、毒素和小的分子。此外，应该懂得，虽然在本发明的容器中可执行各种步骤，但是对于某些用途可省略其中一个或多个步骤，并且可相应地改变容器的设置。

虽然PCR是在这里示例中所使用的一种扩增方法，但是应该懂得，任何使用引物的扩增方法可能都是合适的。这种合适的步骤包括聚合酶链反应(PCR)；链置换扩增(SDA)；基于核酸序列的扩增(NASBA)；级联滚环扩增(CRCA)，DNA环介导等温扩增(LAMP)；等温和嵌合引物-引发的核酸扩增(ICAN)；基于靶标解旋酶依赖性扩增(HDA)；转录介导扩增(TMA)等等。因此，当使用术语PCR时，应该懂得其包括其它备选扩增方法。应该懂得，规程可能需要进行相应地调整。

图1显示说明性的独立的核酸分析容器10。容器10具有细胞溶解区域20、核酸制备区域40、第一级扩增区域60和第二级扩增区域80。包含核酸的样本通过样本注射端口12引进容器10中。容器10包括各种尺寸的各种通道和鼓泡，并且布置为使得样本流过系统。样本穿过各种区域，并进行相应的处理。

样本处理发生在各种鼓泡中，鼓泡定位在容器10中。提供各种通道用于使样本在处理区域中和之间移动，而提供其它通道将流体和试剂传送至样本或从样本中除去这种流体和试剂。作为说明，通过压力，例如气动压力而使容器10中的液体在鼓泡之间移动，如下所述，但可设想其它使材料在容器中移动的方法。

虽然可使用其它容纳器，但作为说明，容器10由双层柔性塑料膜或其它柔性材料例如聚脂、聚乙烯对苯二甲酸酯(PET)、聚碳酸酯、聚丙烯、有机玻璃和其混合物形成，层可通过本领域中已知的任何工艺来制成，包括挤压、等离子体沉积和叠片。还可使用金属箔或带有铝叠片的塑料。可密封在一起，以形成鼓泡和通道的其它阻隔材料在本领域中是已知的。如果使用塑料膜，那么作为说明，层可通过热密封而结合在一起。作为说明，材料具有低核酸结合力。

对于采用萤光监测的实施例，具有足够低的吸收性和在操作波长下自发荧光的塑料膜是优选的。这种材料可通过尝试不同的塑料、不同的塑化剂和复合比以及不同的膜厚度来确定。对于带有铝或其它箔叠片的塑料，可使有待荧光检测装置读取的容器的部分没有箔。例如，如果在容器10的第二级扩增区域80的鼓泡82中监测荧光，那么将使鼓泡82处的一个或两个层没有箔。在PCR的示例中，由大约0.0048英寸(0.1219mm)厚的聚脂(Mylar,Dupont, Wilmington DE)和0.001-0.003英寸(0.025-0.076mm)厚的聚丙烯膜组成的膜叠片工作性能很好。作为说明，容器10由能够透射大约80%-90%入射光的透明材料制成。

在说明性的实施例中，通过在鼓泡和通道上应用压力，例如气动压力，从而使材料在鼓泡之间移动。因此，在采用气动压力的实施例中，作为说明，容器材料是足够柔性的，以容许气动压力具有所需的效果。术语“柔性”这里用于描述容器材料的物理特征。术语“柔性”这里被限定为可易于通过这里使用的气动压力水平进行变形，而不会破裂、破坏、裂开等。举例说来，薄的塑料片，例如Saran^TM包装和Ziploc®包，以及薄的金属箔，例如铝箔都是柔性的。然而，即使在采用气动压力的实施例中，只是鼓泡和通道的某些区域需要是柔性的。此外，鼓泡和通道只有一个侧部需要是柔性的，只要鼓泡和通道可易于变形即可。容器10的其它区域可由刚性材料制成，或者可用刚性材料加强。

作为说明，塑料膜用于容器10。金属片，例如铝，或其它合适的材料可被铣削或切割，以产生具有凸出表面图案的模具。当配合到气压机(作为说明威斯康星州的米尔顿的Janesville Tool 公司的A-5302-PDS)中时，作为说明，在195℃的操作温度下进行调整时，气压机类似印刷机一样工作，仅在模具接触膜的地方熔化塑料膜的密封表面。在形成容器10时，可将各种成分，例如PCR引物(作为说明，点滴(spot)到膜上并进行干燥)、结合抗原的衬底、磁珠和硅酸锆珠密封在各种鼓泡内部。在密封之前，可将用于样本处理的试剂总地或单独地点滴到膜上。在一个实施例中，核苷酸三磷酸盐(NTP)与聚合酶和引物分开来点滴到膜上，基本上消除聚合酶的活性，直到反应被含水样本水化。如果含水样本在水合之前已经被加热，那么这创造用于真正热起动PCR的条件，并减少或消除对于昂贵的化学热起动成分的需求。这种单独的点滴将在下面参照图5b进行进一步的论述，但应该懂得，这种点滴可供这里论述的任何实施例使用。

当气动压力用于使材料在容器10中移动时，在一个实施例中可采用“囊”。在图2a中显示囊组件710的一部分，其可在类似于制造容器的工艺中制造而成，但囊组件710中的单独的鼓泡包括气动配件(作为说明，配件724a)，从而容许在囊组件710中通过压缩气体源对单独的囊进行加压。因为囊组件遇到压缩气体并可使用多次，所以囊组件可由比容器更坚韧或更厚的材料制成。或者，囊可由一系列板形成，板用垫圈、密封件、阀和活塞而紧固在一起。其它装置也在本发明的范围内。

当容器10放置在仪器中时，气动囊组件710被压在容器10的一个面上，所以如果某个特定的囊进行充气，那么压力将迫使液体流出相对应的容器10中的鼓泡。除与容器10的许多鼓泡相对应的气动囊之外，囊组件可具有与容器10的各种通道相对应的附加的气动促动器，例如囊或气动驱动的活塞。在被激励时，这些附加的气动促动器形成夹阀，以夹断和关闭相对应的通道。为限制容器10的某个特定鼓泡中的液体，通过来回鼓泡的通道，对夹阀气动促动器进行充气，使得促动器用作夹阀，以夹断通道。作为说明，为混合不同鼓泡中的两个液体体积，密封连接通道的夹阀气动促动器进行减压，并且鼓泡上的气动囊被交替地加压，迫使液体来回穿过连接鼓泡的通道，从而混合那里的液体。夹阀气动促动器可具有各种形状和尺寸，并可设置为用于一次夹断不止一个通道。这种说明性的夹阀在图1中显示为夹阀16，其可用于关闭所有注射端口。虽然这里论述气动促动器，但是应该懂得，可设想其它为容器提供压力的方法，包括各种电子机械促动器，例如线性步进马达、马达驱动的凸轮、被气动、液压或电磁力驱动的刚性桨叶、滚子、摇臂以及某些情况下竖起的弹簧。另外，除应用垂直于通道轴线的压力之外，还具有各种可逆或不可逆地关闭通道的方法。这些包括跨通道扭结包，热-密封，翻滚促动器，以及密封到通道中的各种物理阀，例如蝶形阀和球阀。另外，小型珀耳帖装置或其它温度调节器可放置在通道附近，并设置成足以冷冻流体的温度，从而有效地形成密封。另外，虽然图1的设计适用于特征为定位在各个鼓泡和通道上的促动器元件的自动化仪器，但是还可设想，促动器可保持固定，并且容器能够在一个或二个维度上平移，使得少量促动器可用于若干个处理站，包括样本破坏、核酸捕获、第一和第二级PCR，以及其它容器应用，例如免疫测定和免疫-PCR。在容器在站之间平移的设置中，作用在通道和鼓泡上的辊子可证明是特别有用的。因而，虽然在本公开的实施例中使用气动促动器，但是当这里使用术语“气动促动器”时，应该懂得，其它促动器以及其它提供压力的方式都可使用，这依赖于容器和仪器的设置。

参照图1，提供一种设置为用于核酸萃取和多重PCR的说明性的样本容器10。样本通过配件90中的样本注射端口12而进入容器10中。注射端口12可能是脆弱的密封件，单向阀，或其它进入端口。来自容器10内部的真空可用于将样本抽吸到容器10中，注射器或其它压力可用于迫使样本进入容器10中，或者可使用其它方法通过注射器端口12将样本引入到容器10中。样本通过通道14移动到细胞溶解区域20的三瓣区(lobe)鼓泡22中，其中样本中的细胞被溶解。一旦样本进入三瓣区鼓泡22中，就关闭夹阀16。随着可能已经关闭的夹阀36一起，夹阀16的闭合将样本密封在三瓣区鼓泡22中。应该懂得细胞溶解对于每个样本可能不是必须的。对于这种样本，可省略细胞溶解区域，或者可使样本直接移动到下一区域。然而，对于许多样本，细胞溶解是必须的。在一个实施例中，珠研磨用于溶解细胞。

在存在溶解颗粒例如硅酸锆(ZS)珠34的状况下通过摇动样本或使样本旋动进行的珠研磨是形成溶菌产物一种有效方法。应该懂得，这里使用的术语例如“溶解”和“溶解产物”并不局限于破裂的细胞，而是这种术语包括非细胞状颗粒、例如病毒的破坏。图2显示细胞溶解区域20的一个实施例，其中收敛的流产生高速珠冲击，从而产生溶解产物。作为说明，三瓣区鼓泡22的两个下瓣区24、26通过通道30进行连接，并且在通道30的相对侧部31上，上瓣区28连接在下瓣区24、26上。图2a显示囊组件710的配对部分，其将与容器10的细胞溶解区域20相接触。当容器10放置在仪器中时，容器10上的相邻的各个瓣区24、26、28是囊组件710中的相对应的气动囊724、726、728。应该懂得，术语“相邻”在表示容器中的鼓泡或通道和其相对应的气动促动器之间的关系时，其表示当容器放置到仪器中时在鼓泡或通道和相对应的气动促动器之间的关系。在一个实施例中，与下瓣区24、26相邻的两个下部气动囊724、726的气动配件724a、726a共同为铅垂的(plumbed)。气动配件724a、726a和与上瓣区28相邻的上部气动囊728的气动配件728a针对电动促动阀的相对侧部为铅垂的，电动促动阀设置为用于驱动双作用的气缸。因而经过设置，压力可在上部气动囊728和两个下部气动囊724、726之间交替。当阀被来回切换时，容器10中的液体通过通道30中的狭窄的结合部32而被驱动在下瓣区24、26和上瓣区28之间移动。因为两个下瓣区24、26在相同的时间是加压的，所以流汇聚并射入到上瓣区28中。依赖瓣区的几何形状，珠34在结合部32的碰撞速度可至少大约12米/秒，从而提供高冲击碰撞，导致溶解。作为说明，三瓣区系统允许进行良好的细胞破坏和结构稳健性，同时最大限度地减小尺寸和气动气体的消耗。虽然ZS珠用作溶解颗粒，但是应该懂得，这种选择只是说明性的，而且可使用其它材料和其它形状的颗粒。还应该懂得，其它用于细胞溶解区域20的设置也在本发明的范围内。

虽然三瓣区鼓泡用于细胞溶解，但是应该懂得，其它多瓣区设置也在本发明的范围内。例如，可使用四瓣区鼓泡，如苜蓿叶图案，其中相对的鼓泡同时进行加压，迫使溶解颗粒彼此相向移动，然后使其它两个瓣区发生偏角，然后可对其共同加压。这种四瓣区鼓泡将具有在两个方向上高速冲击的优点。此外，设想可使用单瓣区鼓泡，其中溶解颗粒快速从单瓣区鼓泡的一部分移动至另一部分。例如，气动促动器可用于封堵单瓣区鼓泡的区域，临时在剩余区域形成多瓣区鼓泡。还可使用其它促动方法，例如作用在该装置的瓣区上的马达、气动、液压或电磁驱动的桨叶。作为说明，如果在上瓣区和下瓣区之间提供再循环装置，并且促动器提供蠕动泵作用，那么辊子或旋转桨叶可用于在图2的结合部32处一起驱动流体。其它设置都在本发明的范围内。

还可以使样本和溶解颗粒足够快地移动，以便在单瓣区溶解鼓泡中实现溶解，而无需临时形成多瓣区鼓泡。在这样一个备选实施例中，如图2b中所示，通过使附接在电动马达19上的叶片或桨叶21旋转以便冲击容器，可实现旋流。叶片21可在溶解鼓泡处冲击容器，或者可在溶解鼓泡附近冲击容器，例如在与溶解鼓泡相邻的边缘17处。在这样一个实施例中，溶解鼓泡可包括一个或多个鼓泡。图12显示包括这样一个溶解鼓泡522的一个实施例。图13显示珠磨马达19，其包括叶片21，叶片21可安装在图8中所示的仪器800的第二支撑部件804的第一侧部811上。然而应该懂得，马达19可安装在第一支撑部件802上或仪器800的其它结构上。

图2a还显示具有气动配件716a的气动囊716，以及具有气动配件736a的气动囊736。当容器10放置在与囊组件710接触位置时，囊716与通道12对准，从而完成夹阀16。类似地，囊736与通道38对准，以完成夹阀36。气动囊716和736的操作容许夹阀16和36打开和关闭。虽然只显示细胞溶解区域附近的囊组件710的部分，但是应该懂得，囊组件710应设有相似的气动鼓泡装置，以控制遍及容器10的剩余区域的流体运动。

其它现有技术仪器教导在密封的柔性容纳器中的PCR。参见，例如美国专利No.6,645,758和6,780,617，以及共同待决的美国专利申请No.10/478,453，它们通过引用而结合在本文中。然而，在密封的PCR容纳器中包括细胞溶解可改善使用的简易性和安全性，尤其是有待测试的样本可能包含生物危害性时。在这里所示的实施例中，来自细胞溶解以及来自所有其它步骤的废物都保留在密封容器中。然而，应该懂得，可除去容器的内容物，以用于进一步的测试。

一旦细胞被溶解，就打开夹阀36，并使溶解产物通过通道38移动至核酸制备区域40，如图3中最佳所示，在此之后，关闭夹阀36，从而将样本密封在核酸制备区域40中。在图3所示的实施例中，核酸的净化采用珠研磨材料，并对基于二氧化硅的磁珠56使用吸引力结合，用乙醇冲洗珠，并用水或其它流体洗脱核酸，从而净化来自细胞溶解产物的核酸。作为说明，用于核酸萃取所需要的单独成分居于鼓泡44、46、48中，鼓泡通过通道45、47、49进行连接，以容许试剂混合。溶解产物从通道38进入鼓泡44中。鼓泡44可设有磁珠56和合适的结合缓冲剂，如高盐分缓冲剂，例如1-2-3™样本制备套件(犹他州盐湖城的爱达荷技术公司)的结合缓冲剂，或者后续通过连接在鼓泡44上的一个或多个通道可提供这些成分的之一或两者。核酸捕获在珠56上，然后打开夹阀53，并且可通过柔和的压力交替作用在鼓泡44和58上而使溶解产物和珠56混合，然后通过例如由囊组件710上相对应的气动囊所提供的气动压力而移动至鼓泡58。磁珠56通过可伸缩的磁体50捕获在鼓泡58中，磁体定位在鼓泡58附近的仪器中，并且废物可移动至废物储槽中，或者可通过对鼓泡58应用压力而使废物返回至鼓泡44中。然后关闭夹阀53。在释放夹阀55时，磁珠56利用来自鼓泡46所提供的乙醇、异丙醇或其它有机或无机清洗溶液进行清洗。可选地，磁体50可通过在鼓泡46和58上提供交替的压力而缩回，以容许珠进行清洗。珠56被磁体50再次捕获在鼓泡58中，并且溶解产物的非核酸部分从珠56上清洗掉，并可移动回鼓泡46中，并被夹阀55固定，或者可通过另一通道清洗至废物储槽中。一旦磁珠被清洗，就打开夹阀57，从鼓泡48中释放水(作为说明，缓冲水)或另一核酸洗脱液。再次，作为说明，通过在鼓泡48和58上提供交替的压力可使磁体50缩回，以容许水和珠56最大限度地混合。再次伸出磁体50以收集珠56。夹阀59被释放，并通过通道52使经洗脱的核酸移动到第一级扩增区域60中。然后关闭夹阀59，因而将样本固定在第一级扩增区域60中。

应该懂得，图3中所示和上面描述的用于核酸制备区域40的设置仅仅是说明性的，而且在本公开的范围内的各种其它设置都是可行的。

这里使用的乙醇、水以及其它流体可以不同的方式提供给鼓泡。流体可储存在鼓泡中，其颈部可被各种夹阀或者可在样本制备过程中的恰当时间打开的脆弱部分夹断。备选地，流体可储存在容器的储槽中，如图5所示的容器110，或储存在如关于图6的容器210所论述的配件中，并根据需要通过通道进行移动。在又一实施例中，可从外部来源引入流体，如图1中所示，尤其关于乙醇注射端口41、88和柱塞67、68、69。作为说明，柱塞67、68、69可插入到例如刚性较高材料形成的配件90中，并可在激励柱塞时提供测量好的体积的流体，如美国专利申请No.10/512,255中所述，其通过引用而结合在本文中。或者，柱塞可能是较软的材料，并且配件可能是刚性较高的材料。对于各个柱塞，测量好的体积可能是相同或不同的。最后，在又一实施例中，容器可设有经过测量的流体体积，其储存在一个或多个鼓泡中，其中流体包含在鼓泡中，作为说明，其设于鼓泡中的小的密封容器中，从而在鼓泡中有效地形成鼓泡。在适当的时间，然后可通过例如气动压力破坏密封容器，从而将流体释放到容器的鼓泡中。仪器还可设置为用于直接通过在仪器和配件或容器材料之间的液体接触而提供某些或所有试剂，假定流体的通路通过单向阀进行紧密调整，以防止仪器在运行期间被污染。此外，时常需要在操作之后密封容器或其配件，以抑制污染性DNA逃离容器。根据要求提供试剂的各种方法是已知的，例如注射泵，并且使流体与配件或容器(例如带钩的配件或O形密封圈)临时接触的各种方法是已知的。应该懂得，任何这些将流体引进合适的鼓泡的方法都可供这里论述的容器的任何实施例使用，这可由具体应用的需求来决定。

如上面论述的那样，嵌套的PCR包括分两级执行的靶标扩增。作为说明，在第一级中，靶标由基因组模板或反转录模板进行扩增。如果需要，第一级扩增可终止于高原期之前。在次级反应中，第一级扩增子可被稀释，并且次级扩增使用相同的引物，或者作为说明使用相对第一级产物的引物内部混杂的嵌套的引物。嵌套的PCR的优点包括：a)初始反应产物形成均质且特定的模板，确保次级反应中的高真实性，其中甚至相对低效率的第一级反应也会产生恰当的模板以支撑稳健的第二级反应；b)来自第一级反应的非特定产物不会明显干扰第二级反应，因为使用不同的嵌套的引物，并且原始扩增模板(作为说明，基因组DNA或反转录产物)可被稀释至一定的程度，消除其在次级扩增中的显著性；以及c)嵌套的PCR可实现更高级的反应多重复用。第一级反应可包括用于若干种独特扩增产物的引物。然后在第二级反应中标识出这些产物。然而应该懂得，第一级多重和第二级单重只是说明性的，而且其它设置是可行的。例如，第一级可利用单对引物扩增各种不同的相关扩增子，并且第二级可用于瞄准扩增子之间的差异，例如利用熔化曲线分析。

转回到图1，核酸样本通过通道52进入第一级扩增区域60中，并传送至鼓泡61中。在鼓泡61中可提供PCR混合物，其包括聚合酶(作为说明，Taq聚合酶)、dNTP和引物(作为说明，用于多重扩增的多对引物)，或者可通过各种方法引进鼓泡61中，如上面论述的那样。或者，干燥试剂可在组装容器10时点滴到鼓泡61的位置上，并且作为说明，可通过柱塞68将水或缓冲剂引入鼓泡61中，如图1中所示。如图4中最佳所示，样本现在通过夹阀59和72固定于鼓泡61中，并且作为说明通过热块或珀耳帖装置而在两个或多个温度之间进行温度循环，热块或珀耳帖装置定位在仪器中，并设置为可与鼓泡61相接触。然而应该懂得，本领域中已知的加热和冷却包含在鼓泡61中的样本的其它方法也在本发明的范围内。用于热循环的备选加热/冷却装置的非限制性的示例包括具有位于囊中的空气循环的鼓泡，其中鼓泡61附近的气动鼓泡中的空气在两个或多个温度之间进行循环；或者如美国专利申请No.10/478、453中所述，利用气动压力使样本移动至鼓泡61中的温度区域，该专利通过引用而结合在本文中，或者通过在轴线上平移容器10，或者为容器10提供旋转设计并使容器10旋转，从而使内容物在固定温度的热区域之间移动。

来自致病菌的核酸时常用相当数量的宿主核酸进行隔离。这些源自宿主的核酸时常与引物相互作用，导致不合需要的产物的扩增，所述产物然后清除引物、dNTP和聚合酶活性，潜在地消耗所需的资源产物。来自致病微生物的核酸通常具有低的丰度，并且不合需要的产物是个潜在问题。第一级反应区域60中的循环数量可经过优化，以便最大限度地增加特定产物并最大限度地减小非特定产物。最佳循环数量预计将在大约10至大约30个循环之间，作为说明，在大约15至大约20个循环之间，但应该懂得，循环数量可根据具体的靶标、宿主和引物序列而变化。

在第一级多重扩增之后，第一级扩增产物在流体传送到次级反应地点之前例如在不完全的PCR主混合中被稀释。

图4显示用于在三个步骤中稀释样本的说明性的实施例。在第一步骤中，打开夹阀72，并且通过将鼓泡61中的样本与来自鼓泡62的相等体积的水或缓冲剂混合，从而使样本经历两重稀释，水或缓冲剂如上面论述的那样提供给鼓泡62，以及鼓泡64和66。在鼓泡61、62之间来回挤压所述体积会提供完全的混合。如上面所述，混合可通过气动囊来提供，其设于囊710中，并定位在鼓泡61、62附近。气动囊可交替地进行加压，迫使液体来回移动。在混合期间，夹阀74防止液体流动到相邻的鼓泡中。在混合结束时，一定体积的稀释的样本被捕获在区域70中，并且关闭夹阀72，从而将稀释的样本密封在区域70中。夹阀74被打开，并且通过任一或两个鼓泡63、64中所提供的水或缓冲剂进一步稀释样本。如上所述，在鼓泡63、64之间来回挤压体积提供混合。接下来，关闭夹阀74，从而将进一步稀释的体积的样本密封在区域71中。作为说明，通过利用任一或两个鼓泡65、66中所提供的缓冲剂或水进行最后的稀释，如上面所述进行混合。作为说明，这最后的稀释利用不完全的PCR主混合物(例如包含除引物之外的所有PCR试剂)作为流体而进行。鼓泡66的内容物在第二级扩增之前的可选地加热可提供热起动扩增的好处，而不需要昂贵的抗体或酶。然而应该懂得，水或其它缓冲剂可用于最后的稀释，其中在第二级扩增区域80中提供附加的PCR。虽然说明性的实施例使用三个稀释级，但是应该懂得，可使用任何数量的稀释级，以提供合适的稀释水平。还应该懂得，稀释量可通过调整捕获在区域70和71中的样本体积而进行控制，其中捕获在区域70和71中的样本量越少，那么稀释量越大，或者其中通过重复打开和关闭夹阀72和74和/或夹阀74和76而捕获在区域70和/或区域71中的附加等分量可用于减少稀释量。预计大约10^-2至大约10^-5的稀释将适合于许多应用。

次级PCR反应的成功依赖于由多重第一级反应所产生的模板。PCR通常利用高纯度DNA来执行。诸如酚萃取或商业DNA萃取套件等方法提供高纯度的DNA。通过容器10处理的样本可能需要作出调节，以补偿纯度较低的制备。PCR可受到生物样本成分的抑制，其是潜在的障碍。作为说明，热起动PCR、较高浓度的耐热聚合酶、MgCl₂浓度的调整、引物浓度的调整以及辅助剂(例如DMSO、TMSO或甘油)的添加可选地用于补偿较低的核酸纯度。虽然纯度问题可能与第一级扩增更为相关，但是应该懂得，在第二级扩增也可提供相似的调整。

虽然在说明性的实施例中通过在容器的第一级PCR部分的鼓泡和通道中保留少量扩增的样本可完成稀释和第二级样本制备，但是应该懂得，这些过程还可以其它方式来执行。在这样一个说明性的示例中，预扩增的样本可捕获在能够使固定体积的样本从第一PCR试剂移动至第二级PCR试剂的部件中的小空腔中，作为说明，该部件可以是平移部件或旋转部件。一毫升量的预扩增的样本与100毫升新鲜的PCR试剂的混合将导致浓度减少到百分之一。但是应该懂得，这种稀释仅仅是说明性的，而且其它体积和稀释水平都是可行的。这种方法可通过迫使第一级扩增产物进入刚性配件中来完成，在这里其将与图1的其中一个柱塞68或69相接触。在这样一个实施例中，柱塞将设置为用于携带小分量的样本，使之与相邻的稀释缓冲剂或第二级PCR缓冲剂相接触。类似地，滑动元件可用于携带少量第一级扩增产物，使之与第二级反应混合物相接触，同时保持级之间的密封，并使扩增的样本包含在刚性配件90中。

在第一级PCR和稀释之后，通道78将样本传送到多个低体积鼓泡82中，以用于次级嵌套的PCR。在一个说明性的实施例中，第二级鼓泡中所提供的干燥的引物通过引入的含水材料而重新悬浮，从而完成反应混合物。可选地，在各个鼓泡中可提供用于检测双链核酸的荧光染料例如LCGreen^®+(犹他州盐湖城的Idaho技术公司)，或者荧光染料可添加至系列稀释结束时所提供的不完全PCR主混合中，但是应该懂得，LCGreen^®+仅仅是说明性的，并且本领域中已知的其它燃料都是可用的。在另一可选的实施例中，在各个相应的第二级鼓泡中可提供针对各个特定的扩增子而设置的干燥的萤光标记的低核苷酸探测剂以及相应的干燥引物。此外，虽然容器10设计为用于包含所有反应和处理，以减少污染，但是在某些情况下，可能需要从各个鼓泡82中除去扩增产物，以进行进一步的分析。本领域已知的其它用于检测第二级扩增子的方法也在本发明的范围内。一旦样本传送至鼓泡82，就激励夹阀84和86以封堵鼓泡82。各个鼓泡82现在包含用于扩增特定靶标所需要的所有试剂。作为说明，各个鼓泡可包含独特的成对引物，或者多个鼓泡82可包含相同的引物，以提供一定数量的制性扩增。

注意，这里公开的实施例使用鼓泡用于第二级扩增，其中鼓泡由与剩余柔性部分相同或相似的塑料膜形成。然而，在许多实施例中，第二级鼓泡的内容物永不从第二级鼓泡中除去，因此，不需要在柔性鼓泡中发生第二级反应。但是应该懂得，第二级反应可发生在多个刚性、半刚性或柔性室中，其流体连通在鼓泡上。如本示例中，室可通过在连接室的柔性通道上施加压力而进行密封，或者可以其它方式进行密封，作为说明，通过热密封或使用单向阀。这里论述的各种实施例包括仅仅用于收集废物而提供的鼓泡。因为废物可能从不被除去，所以废物可收集在刚性、半刚性或柔性室中。

在本发明的范围内可利用与第一级扩增中使用的相同的引物进行第二级扩增(参见美国专利No.6,605,451)。然而，时常有利的是在第一级产物内部的第二级反应中具有引物，使得在第一级和第二级引物结合地点之间没有重叠或有最小的重叠。第一级产物的稀释极大地消除原始模板DNA和第一级试剂对第二级反应的贡献。此外，作为说明，可使用具有比第一级所使用的引物更高的Tm的第二级引物来增强嵌套的扩增。引物可设计为用于避免明显的发夹、异质/同质二聚物和不合需要的混合化。因为嵌套格式，第二级引物容忍比单个步骤中扩增来自基因组DNA的靶标所使用的引物更多得多的有害的相互作用。可选地，热起动用于第二级扩增上。

如果荧光染料包含在第二级扩增中，例如作为本领域中已知的dsDNA结合染料或作为萤光探测的一部分，那么提供的光学器件可用于监测一个或多个样本的扩增。可选地，可提供扩增曲线的形状分析，以便称呼各个样本为正或负。在美国专利No.6、730、501中论述了称呼样本的说明性的方法，其通过引用而结合在本文中。或者，可使用采用跨越阈值的方法。在仪器外部或里面可提供计算机，并计算机可设置成用于执行该方法，并基于第二级扩增的存在或缺乏而称呼样本为正或负，并且可通过将扩增曲线的特征参数(例如跨越阈值)与标准曲线或相对于运行中的其它扩增曲线进行比较，从而提供关于起动模板浓度的定量信息。然而应该懂得，本领域中已知的其它方法可用于称呼各个样本。对于萤光信息可执行其它分析。这样一个非限制性的示例是使用熔化曲线分析来显示恰当的扩增子熔化特征(例如Tm，熔化轮廓形状)。提供的光学器件可设置为用于一次捕获所有鼓泡82的图像，或者可为各个单独的鼓泡提供单独的光学器件。其它设置都在本发明的范围内。

图5显示备选容器110。在这个实施例中，各种试剂通过配件190装填到容器110中。图5a显示配件190的横截面，其具有多个柱塞168的其中一个柱塞。应该懂得，虽然图5a显示穿过入口通道115a的横截面，如图5的实施例中所示，存在12个入口通道(入口通道115a至115l)，其均可具有其自己的用于配件190中使用的柱塞168，但在这个特殊的设置中，没有使用入口通道115c、115f和115i。应该懂得，具有12个入口通道的设置仅仅是说明性的，而且可使用任意数量的入口通道和相关联的柱塞。在说明性的实施例中，配件190的可选的真空端口142通过配件190的第一表面194而形成，以便于室192连通。可提供可选的真空端口142用于与真空或真空室(未显示)连通，以便从容器110中抽吸出空气，从而在室192和容器110的各种鼓泡和室中创造真空。然后将柱塞168插入到室192中足够远，以便密封真空端口142。作为说明，室192是在预定的真空量下提供的，从而在使用时将所需体积的液体抽吸到室192中。关于制备室192的附加信息可在美国专利申请No.10/512、255中找到，其已经通过引用而结合在本文中。

说明性的配件190还包括注射端口141，其成形于配件190的第二表面195中。作为说明，注射端口141定位在比真空端口142更靠近容器110的塑料膜部分的位置，如图5a中所示，使得柱塞168插入足够远以密封真空端口142，同时仍然容许通过注射端口141接近室192。如图所示，塑料膜部分117的第二表面119提供可穿透的密封件139以防止在室192和周围空气之间通过注射端口141的连通。然而，应该懂得，第二表面119可选地可不延伸至注射端口141，并且可采用各种其它密封件。此外，如果另一位置需要密封，例如配件190的第一表面194上，那么注射端口141可包括通向配件190上的那个位置的通道。通过引用而结合在本文中的美国专利申请No.10/512、255显示各种设置，其中密封件定位在远离注射端口的位置，并且密封件通过通道连接在室上。另外，美国专利申请No.10/512、255公开其中通道将单个密封件连接至多个室上的各种设置。密封位置的变化以及单个注射端口至多个室的连接都在本发明的范围内。可选地，密封件139可能是脆弱的，并可在插入插管(未显示)时破裂，以容许插管中的流体样本被抽吸或被迫进入到室192中。

容器组件110的说明性的柱塞168在形状上是圆柱形的，并且具有大约5mm的直径，以便挤压配合到室192中。柱塞168包括第一末端部分173和相对的第二末端部分175。如图5a中所示，在第二末端部分175中形成柱塞168的凹槽169。在使用中，第二末端部分175部分插入室192中，并且凹槽169可与注射端口141对准，以容许流体样本被抽吸或注射到室192中，即使当柱塞168插入得足够远使得柱塞168本来将阻塞注射端口141时。

作为说明，流体利用具有中空末端的注射器而放置在容纳器(未显示)中，中空末端可插入到注射端口141中，以刺破那里的密封件139。在空气排空的容器组件110时，当密封件139被刺破时，流体由于室192中相对于周围空气压力的负压而从容纳器中抽出。流体然后穿过端口141以填充室192。在这点上，流体通常不流入容器110的塑料膜部分117中。最后，柱塞168插入到室192中，使得柱塞168的第二末端部分175接近室192的底部191，从而将测量好的试剂或样本数量推入到塑料膜部分117中。如图所示，柱塞168设置为使得在全部插入时，第二末端部分175不太会碰到室192的底部191。剩余空间用于捕获气泡，从而减少进入塑料膜部分117中的气泡数量。然而，在某些实施例中，在柱塞168全部插入时可能需要第二末端部分175碰到底部191。在图5所示的实施例中，入口通道115a、115b、115d、115e、115g、115h、115j、115k和115l都通向反应区域或储槽鼓泡。但是应该懂得，与入口通道115a相关联的柱塞的全部插入将迫使样本进入到三瓣区鼓泡122中，与入口通道115b相关联的柱塞的全部插入将迫使试剂进入到鼓泡101中，与入口通道115d相关联的柱塞的全部插入将迫使试剂进入到鼓泡102中，与入口通道115e相关联的柱塞的全部插入将迫使试剂进入到鼓泡103中，与入口通道115g相关联的柱塞的全部插入将迫使试剂进入到鼓泡104中，与入口通道115h相关联的柱塞的全部插入将迫使试剂进入到鼓泡105中，与入口通道115j相关联的柱塞的全部插入将迫使试剂进入到鼓泡106中，与入口通道115k相关联的柱塞的全部插入将迫使试剂进入到鼓泡107中，并且与入口通道115l相关联的柱塞的全部插入将迫使试剂进入到鼓泡108中。

如果使用包括凹槽169的柱塞设计，如图5a所示的实施例中所示，柱塞168可在下降之前旋转，从而使凹槽169偏移，并封堵注射端口141，使其不与室192连通，从而密封那里的内容物。这用于最大限度地减少任何流体通过注射端口141潜在地回流至周围环境，这在需要使柱塞的全部插入延迟时是特别地有用的。虽然上面相对于柱塞168显示和描述凹槽169，但是在将流体样本分配到室192中之后立即通过其它方法封堵注射端口141也在本公开的范围内，例如朝着室192的底部压下柱塞168、热密封、单向阀或自密封的端口。如果热密封用作密封方法，那么在仪器中可包含密封棒，使得在容器插入到仪器中时，所有室都被热密封。

在说明性的方法中，用户将样本注射到与入口通道115a相关联的注射端口141中，并将水注射到各种其它注射端口中。水使试剂进行再水合，这些试剂之前已经在与各个入口通道115b、115d、115e、115g、115h、115j、115k和115l相关联的室192中冷冻干燥。水可通过单个密封件注射，然后通过通道分布至各个室，如下面图6中所示，或者水可独立地注射到各个室中。或者，替代注射水使干燥的试剂再水合，可将湿的试剂例如溶解试剂、核酸萃取试剂和PCR试剂注射到合适的配件190的室192中。

在与入口通道115a相关联的柱塞168被激励时，样本被迫使直接通过通道114进入到三瓣区鼓泡122中。用户还挤压剩余柱塞168，迫使内容物流出配件190中的各个室192，并进入到储槽鼓泡101至108中。在这点上，容器110被加载到仪器中，以用于进行处理。虽然图8中所示的仪器800设置为用于图6的容器210，但是应该懂得，仪器800的囊的设置的修改将使仪器800适合于与容器110和510一起使用，或与其它设置的容器一起使用。

在一个说明性的示例中，在压下柱塞168时，储槽鼓泡101现在包含位于异丙醇中的DNA-结合的磁珠，储槽鼓泡102现在包含第一清洗溶液，储槽鼓泡103现在包含第二清洗溶液，储槽鼓泡104现在包含核酸洗脱缓冲剂，储槽鼓泡105现在包含包括多重第一级引物的第一级PCR试剂，储槽鼓泡106现在包含没有引物的第二级PCR试剂，储槽鼓泡107现在包含没有引物且没有模板的负控制PCR试剂，并且储槽鼓泡108现在包含带模板的正控制PCR试剂。然而应该懂得，这些试剂仅仅是说明性的，而且可使用其它试剂，这依赖于所需的反应和最佳条件。

一旦容器110已经放置到仪器800中，并且样本已经移动至三瓣区鼓泡122中，就可通过利用溶解颗粒例如ZS或陶瓷珠搅动样本，从而使样本遭遇破坏。在三瓣区鼓泡122中可提供溶解颗粒，或者可将其与样本一起注射到三瓣区鼓泡122中。图5的三瓣区鼓泡122按照与图1的三瓣区鼓泡22相同的方式进行操作，其中两个下瓣区124、126被共同加压，并且压力在上瓣区128和两个下瓣区124、126之间交替变化。然而，如图所示，下瓣区124、126比下瓣区24、26更圆，容许珠平稳流动至通道130，并容许高速碰撞，即使在结合部32没有三角形的流分离器。如同三瓣区鼓泡22一样，图5的三瓣区鼓泡122容许样本中的微生物、细胞和病毒颗粒的有效的溶解或破坏。已经发现，具有大约3-4mm宽度，例如大约3.5mm的通道130在溶解期间保持相对干净的珠，并且在提供高速碰撞时是有效的。

在溶解之后，通过对定位在储槽鼓泡101上方的囊加压，从而将核酸-结合的磁珠经由通道138注射到上瓣区128中。作为说明，同溶解期间相比，磁珠与三瓣区鼓泡122的内容物进行更柔和的混合，并且溶液被静置例如大约1分钟，以容许核酸结合到珠上。

然后通过通道143将溶液抽送到“图8”的鼓泡144中，其中珠被封装在仪器中的可伸缩的磁体捕获，仪器作为说明是气动驱动的。珠捕获过程开始于对珠研磨装置122的所有瓣区124、126和128进行加压。这迫使大多数液体内容物122穿过通道143进入到鼓泡144中。磁体与鼓泡144的下面部分144b相接触，并且将样本静置若干秒，以容许磁体捕获溶液中的珠，然后使鼓泡122相邻的囊减压，对鼓泡部分144a和144b相邻的囊加压，并迫使液体回到鼓泡122中。因为并非在单个行程中捕获所有珠，所以这个过程可能重复高达10次，以便将基本所有珠捕获在鼓泡144中。然后液体被迫流出鼓泡144，仅留在磁珠和捕获的核酸后面，并且在两次连续的清洗过程中(分别通过通道145和147来自储槽鼓泡102和103)将清洗试剂引进鼓泡144中。在每次清洗中，定位在包含清洗试剂的储槽鼓泡上方的囊被加压，迫使内容物进入鼓泡144中。磁体被撤回，并且通过交替对覆盖鼓泡144的各个瓣区144a和144b的两个囊中的各个加压而破坏包含磁珠的球丸。当上瓣区144a受到压缩时，液体内容物被迫进入下瓣区144b中，并且当下瓣区144b受到压缩时，内容物被迫进入上瓣区144a中。通过在上瓣区144a和下瓣区144b之间搅动鼓泡144中的溶液，磁珠被有效地洗去杂质。在不充分的搅动和过分搅动之间保持平衡，不充分的搅动上珠的球丸未被打搅，并且过分搅动可能从珠表面洗去核酸，并随清洗试剂一起丢失它们。在各个清洗循环之后，通过鼓泡144中的磁体捕获磁珠，并且作为说明，清洗试剂被迫进入三瓣区鼓泡122中，其现在用作废物容纳器。然而应该懂得，使用后的储槽鼓泡也可用作废物容纳器，或者可提供其它鼓泡专门作为废物容纳器。

然后通过通道149将来自储槽鼓泡104的核酸洗脱缓冲剂注射到鼓泡144中，样本被再次搅动，并且通过采用磁体而再次捕获磁珠。鼓泡144中的流体混合物现在包含来自原始样本的核酸。鼓泡144上的压力使核酸样本通过通道152而移动至第一级PCR鼓泡161，其中样本与包含多个引物组的第一级PCR主混合物相混合，PCR主混合物是从储槽鼓泡105通过通道162来提供的。如果需要，样本和/或第一级PCR主混合物可在混合之前进行加热，从而提供热起动的优点。可选地，可在第一级PCR之前提供用于RNA靶标的逆转录的成分。或者，可在第一级PCR主混合物中提供RT酶，例如一种热稳定的RT酶，以容许RNA靶标的同时逆转录。应该懂得，在这里公开的任何实施例中，RT酶可存在于第一级PCR混合物中。如下面所见，图5的容器110设置为用于高达10个引物组，但是应该懂得，该设置可变化，并且可使用任何数量的引物组。对定位在鼓泡161上的囊在低压力下进行加压，以迫使鼓泡161的内容物与鼓泡161的另一侧部上的加热/冷却元件例如珀耳帖元件发生紧密接触。鼓泡161上的压力应该足以确保与加热/冷却元件良好的接触，但应该足够柔和，使得流体不被迫从鼓泡161中流出。加热/冷却元件进行温度循环，例如在大约60℃至大约95℃之间。作为说明，温度循环执行大约15-20个循环，导致存在的一个或多个核酸靶标的扩增。还作为说明，温度循环停止在高原期之前，并且可停止对数生长期，或甚至在对数生长期之前。在一个示例中，在不达到最小的检测水平的情况下，可能仅仅需要用所需的扩增子来浓缩样本。参见美国专利No.6,605,451，其通过引用而结合在本文中。

然后可选地通过迫使大多数样本通过通道152返回鼓泡144中而稀释扩增的样本，在鼓泡161中只留下少量(作为说明大约1-5%)扩增的样本，并且从储槽鼓泡106通过通道163提供第二级PCR主混合物。作为说明，样本通过在鼓泡106和161之间经由通道163来回移动而进行完全地混合。如果需要，在第二级扩增之前可将反应混合物加热至延伸温度以上，例如至少60℃。然后通过通道165迫使样本进入第二级扩增区域180的中心的低容积鼓泡182的阵列中。十个说明性的低容积鼓泡182均可包含不同的引物对，其要么基本上与第一级扩增中的其中一个引物对相同，或者“嵌套”在第一级引物对中，以扩增缩短的扩增子。现在被样本水合的引物完成扩增混合物。通过分别对储槽鼓泡107和108的内容物加压还引入正控制和负控制样本，迫使PCR主混合物在没有靶标DNA的状况下从储槽鼓泡107通过通道166流出，或者在有控制DNA的状况下从储槽鼓泡108通过通道167流出。如图所示，存在五个正控制鼓泡183和负控制鼓泡181，其可进行多重复用2倍，从而为十个不同的第二级扩增反应提供必要的控制。应该懂得，这种设置仅仅是说明性的，而且可提供任意数量的第二级鼓泡。

作为说明，用于第二级扩增的PCR主混合物缺乏引物，但在别的方面是完全的。然而，“不完全的”PCR主混合物也可能缺乏其它PCR成分。在一个示例中，第二级PCR主混合物仅仅是水或缓冲剂，其然后与可选地稀释的第一级PCR扩增产物相混合。这种混合物移动至小容积的PCR反应鼓泡中，其中之前已经提供所有剩余成分。如果需要，所有剩余成分可混合在一起，并作为单个混合物点滴到小容积的PCR反应鼓泡中。或者，如图5b中所示，各个成分可点滴小容积的PCR反应鼓泡182的单独的区域上。如图5b中所示，存在四个区域，作为说明，dNTP点滴在区域182a上，引物点滴在182b上，聚合酶点滴在182c上，并且镁化合物点滴在182d上。通过在使成分再水合之前单独点滴成分和加热样本混合物，可最大限度地减少非特定反应。应该懂得，任何成分组合可以这种方式进行点滴，而且这种将成分点滴到鼓泡的一个或多个区域上的方法可与本发明的任何实施例一起使用。

通向小容积PCR反应鼓泡181、182和183的通道165、166和167被密封，并且气动囊柔和地将阵列挤压在加热/冷却元件上，例如珀耳帖元件，以用于热循环。对于第二级热循环可独立地设定循环参数。作为说明，通过将激励源，例如蓝光(450-490nm)聚焦到阵列上，并对合成的发射萤光，例如510nm以上的发射萤光成像，从而监测反应。

在上面的示例中，没有论述夹阀。然而，应该懂得，当需要在其中一个鼓泡中包含样本时，定位在来回通向特定鼓泡的通道之上的气动促动器被加压，从而产生夹阀并关闭通道。相反，当需要从其中一个鼓泡移动样本时，合适的气动促动器被减压，以容许样本流过通道。

上面在图5中描述的容器包括试剂储槽鼓泡101至108，其中用户将试剂从配件190注射到容器110的塑料膜部分117中的试剂储槽鼓泡101至108中，例如在将容器110插入到仪器中之前。虽然使用图5的试剂储槽鼓泡具有优点，包括具有将各种鼓泡的内容物保持在不同温度的能力，但是也具有某些缺点。因为操作员负责使试剂从配件190移动至储槽鼓泡101至108，并且因为这时常在机器外面进行，并因而没有被激励的夹阀，所以试剂可能临时从储槽鼓泡泄漏至工作鼓泡中。在制备和装填期间，储槽鼓泡中的试剂是暴露的。如果它们被挤压、压挤或甚至轻轻地碰撞，试剂都可能通过可用通道而泄漏出来。如果试剂的损失相当大，那么反应可能完全失效。此外，在操作期间，在被迫从储槽鼓泡101至108流出的试剂数量方面可能存在某些变化，导致不一致的结果。对配件190引进试剂和使试剂从配件190运动至试剂储槽鼓泡101至108的自动化将解决许多这些问题，并且在本发明的范围内。

图6的容器210以不同的方式，通过使用直接注射方法解决许多这些问题，其中仪器本身通过例如气动活塞移动柱塞268，并在需要试剂时迫使试剂进入各种工作鼓泡中。替代将试剂储存在图5的储槽鼓泡101至108中，在图6的实施例中，试剂被引入配件290的各种室292中，并保持在那里，直至需要时。活塞268在恰当时间的气动操作将测量好的试剂量引入恰当的反应鼓泡中。除解决许多上述问题之外，容器210还具有更紧凑得多的形状，容许有更小型的仪器设计，并且容器210具有更短的通道，允许有更好的流体流动和最大限度地减小通道中的试剂损失。

在图6的一个说明性的实施例中，包括有待测试的样本(100μl)和溶解缓冲剂(200μl)的300μl混合物被注射到注射端口241a中。水也通过密封件239b注射到配件290中，使高达十一种不同的试剂进行水合，其均是之前以干燥的形式通过通道293提供于室292b至2921中(阴影所示)。作为说明，这些试剂可包括冷冻干燥的PCR试剂、DNA萃取试剂、清洗溶液、免疫测定试剂或其它化学物。对于图6的示例，试剂用于核酸萃取、第一级多重PCR、多重反应的稀释以及第二级PCR试剂的制备和控制反应。在图6所示的实施例中，所有需要注射的是端口241a中的样本和端口241b中的水。

如图6中所示，通过密封件293b注射的水通过通道293分布至各种室中。在这个实施例中，只有样本和水需要注射到容器210中。然而应该懂得，水可独立地注射到各个室292中。此外，应该懂得，替代在各种室292中提供干燥的试剂并在注射水时进行水合作用，根据需要可将湿试剂注射到各个室中。另外，应该懂得，其中一个或多个室292可仅仅设有水，并且可在恰当的反应鼓泡中提供干燥的必要的试剂。根据特定反应需求所指示的那样，上面的各种组合都在本发明的范围内。

如图6中所见，在配件290的底表面297上提供可选的突起物213。如图所示，突起物213定位在其相应的入口通道215中。然而，其它设置也是可行的。突起物213有助于打开入口通道215并防止当压下柱塞268时，底表面297与另一平面相接合而夹断入口通道215，这有助于防止激励柱塞268时的回流。这种突起物可用于根据本发明的任何各种容器上。

在将水注射到容器中，以便使配件中的多个室中的多个干燥的试剂进行水合作用的实施例中，需要一种关闭注射端口和许多室之间的通道的方法。如果通道不关闭，那么激励各个柱塞可能迫使其相应室中的某些内容物回流到通道中，潜在地污染邻近的室，并改变包含在室中和从室中传送的体积。已经使用若干种关闭这个通道的方法，包括旋转上面论述的带凹槽的柱塞268，以及跨通道热密封塑料膜，从而永久关闭通道，以及对通道应用压力作为夹阀。还可使用其它闭合方法，例如构建于配件中的阀，如说明性的单向阀。

在将流体装填到室292中，并将容器210加载到仪器中之后，通过例如气动活塞的激励而压下柱塞268a，迫使其余样本通过通道214进入到三瓣区鼓泡220中。如同图1和图5中所示的实施例一样，图7-9中所示的三瓣区鼓泡220的瓣区224、226和228通过囊组件810的囊824、826和828的作用而被连续压缩，迫使液体通过瓣区之间的狭窄的结合部232，并驱动高速碰撞，剪切样本并释放核酸，例如包括来自难以打开的孢子、细菌和霉菌的核酸。细胞溶解继续恰当的时间长度，例如0.5至10分钟。

一旦细胞已经被充分溶解，就激励柱塞268b，并通过通道236将储存在室292b中的核酸结合的磁珠注射到三瓣区鼓泡220的上瓣区228中。样本与磁珠混合，并且容许混合物静置合适的时间长度，例如大约10秒至10分钟。

样本和珠的混合物被迫通过囊826的作用经由通道238进入鼓泡244中，然后通过囊844的作用经由通道243并进入鼓泡246中，其中定位在仪器800中的与鼓泡245相邻的可伸缩的磁体850如图8中所示捕获溶液中的磁珠，形成靠在鼓泡246的内表面上的球丸。定位在鼓泡246上方的气动囊846然后迫使液体流出鼓泡246并通过鼓泡244返回到鼓泡222中，其现在用作废物容纳器。然而，如上面参照图5论述的那样，其它废物容纳器也在本发明的范围内。其中一个柱塞268c、268d和268e可被激励，以便通过通道245将清洗溶液提供给鼓泡244，然后通过通道243提供给鼓泡246。可选地，使磁体850收缩，并通过使珠从鼓泡244和246经由通道243来回移动，通过交替地压缩囊844和846而清洗磁珠。一旦磁珠得到清洗，就通过激励磁体850而将磁珠重新捕获在鼓泡246中，然后使清洗溶液移动至鼓泡222中。这个过程可根据需要进行重复，以便从核酸-结合的磁珠上清洗溶解缓冲剂和样本碎屑。作为说明，进行三次清洗，每次清洗利用室292c、292d和292e中的清洗试剂。然而应该懂得，更多或更少次清洗都在本发明的范围内。如果需要更多次清洗，那么可提供更多个室292。或者，各个室292可容纳更大体积的流体，并且柱塞的激励可在每次激励时只迫使一部分体积从室中流出。

在清洗之后，储存在室292f中的洗脱缓冲剂通过通道247移动至鼓泡248中，并使磁体缩回。溶液在鼓泡246和248之间通过通道252进行循环，打破鼓泡246中的磁珠的球丸，并容许捕获的核酸脱离珠并进入溶液中。磁体850被再次激励，将磁珠捕捉在鼓泡246中，并使洗脱的核酸溶液被迫进入鼓泡248中。

柱塞268h被下压，并且来自室292h的第一级PCR主混合物与鼓泡248中的核酸样本相混合。可选地，混合物通过备选囊848和864的激励而进行混合，通过通道253迫使混合物在248和264之间移动。在若干个混合循环之后，溶液包含在鼓泡264中，在该鼓泡中执行第一级多重PCR。如果需要，在混合之前，样本可保持在鼓泡246中，同时通过例如使第一级PCR主混合物移动到鼓泡264中或通过在鼓泡248附近的提供加热器而预热第一级PCR主混合物。如上面论述的那样，这种预热可提供热起动PCR的好处。图8中所示的仪器800特征在于基于珀耳帖的热循环器886和888，其加热和冷却样本。然而应该懂得，如上面论述的那样可使用其它加热器/冷却器装置。可选地，在鼓泡248和264之间的混合可在温度循环期间持续，其中热循环器886定位成可加热和冷却两个鼓泡248和264。已经发现，在某些实施例中，这种混合改善第一级PCR反应。另外，热循环可通过改变两个或多个不同鼓泡中的温度来实现，容许有最小的能量消耗，并最大限度地增加热循环速度。例如，鼓泡248中的温度可保持95℃，并且鼓泡264中的温度保持在65℃，并且在这些鼓泡之间移动样本可有效地将热量传递到样本中和从样本传递出来，从而容许有快速且精确的热循环。作为说明，温度循环执行15-20个循环，但根据应用可能需要其它扩增水平，如上面论述的那样。如下面所见，第二级扩增区域280设置为用于检测18个第二级反应中的扩增。因此，在鼓泡264中的PCR反应中可包含18对不同的引物。

在一个备选热起动方法中，容器210制成带有引物，其设于鼓泡，例如鼓泡264中。在一个实施例中，引物被单独冷冻干燥，然后在制造期间作为易碎的球丸引入到鼓泡264中。在第一级PCR之前，作为说明，样本从鼓泡246上洗脱，并推送到鼓泡264中，以便使引物球丸进行再水合。定位在鼓泡248和264附近的珀耳帖886被加热至48℃，并且PCR主混合物被推送至鼓泡248中。在保持例如10秒(在此期间两个鼓泡达到48℃)之后，在鼓泡248和264之间开始混合。因而，酶和dNTP保留在鼓泡248中，并且大多数样本和引物保留在鼓泡264中，直至这些成分已经单独地达到48℃。然而应该懂得，48℃的选择是为同时第一级扩增和使用AMY(其在高达50℃时是活性的)的RT而做出的。如果不需要RT，或者使用更耐热的RT酶，那么可将其中一个或两个鼓泡248和264加热至高达58℃，或甚至更高，这依赖于引物熔化温度或具体第一级扩增规程中的其它因素。应该懂得，这种热起动方法可供本发明的任何实施例使用。

在一个备选实施例中，为减少第一级PCR反应的复杂性，可将鼓泡248分隔成两个或多个鼓泡。多重反应的非特定产物的数量据信会随着混合物中的引物数量的平方(或可能更高的幂)而上升，而化验的灵敏度损失是输入样本数量的线性函数。因而，例如，将第一级PCR分裂成两个反应，即这个实施例的单个反应体积各一半，将使灵敏度降低到一般，但非特定反应的数量和复杂性将达1/4。如果鼓泡248被分隔成更多鼓泡，那么可将鼓泡264分隔成与鼓泡248的数量相等数目的鼓泡。各个相应的鼓泡248将通过相应的通道253而连接在其相应的鼓泡264上。各个鼓泡264将设有包括所有引物的子组的球丸。来自鼓泡246的样本将跨各个鼓泡248进行分隔，各个鼓泡248将相对于所有其它鼓泡进行密封，并且如上所述将对每对鼓泡248和264进行热循环。在热循环之后，样本将重组到鼓泡266中，或者单独地发送至独立的第二级鼓泡组中。

在第一级PCR已经进行所需的循环数之后，如上面参照图5的实施例所述可通过迫使大多数样本返回到鼓泡248中，只流下少量，并添加来自室292i的第二级PCR主混合物而稀释样本。或者，来自292i的稀释缓冲剂可通过通道249移动至鼓泡266，并通过在鼓泡264和266之间来回移动流体而与鼓泡264中的扩增的样本相混合。在混合之后，保留在鼓泡264中的稀释的样本的一部分被迫远离三瓣区鼓泡222，其现在是废物容纳器。如果需要，稀释可利用来自室292j和292k的稀释缓冲剂而重复若干次，然后将来自室292g的第二级PCR主混合物添加至某些或所有稀释的扩增的样本中。应该懂得，稀释的水平可通过改变稀释步骤的数量或通过改变在与稀释缓冲剂或第二级PCR主混合物混合之前丢弃的样本的百分比而进行调整。如果需要，在移动至第二级鼓泡282以用于第二级扩增之前，样本和第二级PCR主混合物的这种混合物可在鼓泡264中进行预热。如上面论述的那样，这种预热可消除第二级PCR混合物中对热起动成分(抗体、化学物或其它)的需求。

说明性的第二级PCR主混合物是不完全的，缺乏引物对，并且18个第二级鼓泡282均预装填有特定的PCR引物对。如果需要，第二级PCR主混合物可缺乏其它反应成分，并且这些成分然后也可预装填到第二级鼓泡282中。如上面关于之前示例所论述的那样，每对引物可与第一级PCR引物对是相同的，或可嵌套在第一级引物对中。样本从鼓泡264至第二级鼓泡的移动完成PCR反应混合物。来自室2921的控制样本也通过通道267移动至控制鼓泡283中。根据需要，控制样本可以是正控制或负控制。作为说明，各个容器将包含控制反应，其检验工艺中的各个步骤的操作有效性，并展示正的结果不是被之前扩增的核酸自污染的结果。然而，这在许多规程中是不切实际的，尤其对于高度复用的反应。提供合适控制的一种说明性的方法涉及用一物种例如面包酵母强化样本。核酸与其它核酸一并从酵母萃取出来。第一级和第二级PCR反应使来自酵母基因组的DNA和/或RNA靶标扩增。作为说明，源于拼接的pre-mRNA的mRNA序列可用于通过设置引物序列跨内含子而产生RNA-特定的靶标序列。基于参考标准的酵母复制数量的定量分析容许基本确认系统的各个成分正在工作。对于许多第二级化验的各个化验的负控制反应是更有问题的。可能需要并行或分开运行控制反应。

囊组件810的囊882的激励将样本密封到其相应的第二级鼓泡282、283中，并且囊880的激励在第二级鼓泡282、283上提供柔和的压力，从而迫使第二级鼓泡282、283与加热器/冷却器装置接触。定位在第二级扩增区域280上方的窗口847容许在PCR期间和反应产物的DNA熔化曲线分析期间对阵列的荧光进行监测。

注意，图6的容器210具有若干个未密封区域，例如未密封区域255和未密封区域256。这些未密封区域形成在这个说明性的实施例中不涉及任何反应的鼓泡。相反，这些未密封区域设于工作鼓泡和通道之间的空间中。在某些制造过程中，同密封在所有未使用的空间中的容器相比，已经发现，当提供未密封区域例如255和256时，有时产生较少的泄漏，据推测是由于减少膜材料中的有问题的折叠。这种未密封区域可选地设于任何容器实施例上。

图8显示可与容器210一起使用的说明性的仪器800。仪器800包括支撑部件802，其可形成外壳的壁或安装在外壳中。仪器800还包括第二支撑部件804，其可选地相对于支撑部件802移动，以容许容器210的插入和撤回。可移动的支撑部件804可安装在轨道上，或者可相对于支撑部件802以任何各种方式移动。作为说明，一旦容器210已经插入到仪器800中，就将盖805配合在容器210上。在另一实施例中，支撑部件802和804可以是固定的，其中容器210通过其它机械方法或通过气动压力而保持在合适位置。

作为说明，囊组件810和气动阀组件808安装在可移动的部件802上，而加热器886和888安装在支撑部件802上。然而应该懂得，这种布置仅仅是说明性的，而且其它布置也是可行的。因为囊组件810和气动阀组件808安装在可移动的支撑部件804上，这些气动促动器可朝着容器210移动，使得气动促动器与容器210相接触。当容器210插入到仪器800中，并且可移动的支撑部件804朝着支撑部件802移动时，容器210的各种鼓泡处于与囊组件810的各种气动囊及气动阀组件808的各种气动活塞相邻的位置，使得气动促动器的激励可迫使液体从容器210的一个或多个鼓泡中流出，或者可与容器210的一个或多个通道形成夹阀。在容器210的鼓泡和通道与囊组件810和气动阀组件808的气动促动器之间的关系将在下面参照图9和10进行更详细地论述。

各个气动促动器具有一个或多个气动配件。例如，囊组件810的囊824具有气动配件824a，并且气动活塞843具有其相关联的气动配件843a。在说明性的实施例中，囊组件810的各个气动配件穿过可移动的支撑部件804中的通道816，其中软管878通过阀899将各个气动配件连接到压缩空气源895上。在说明性的实施例中，通道816不仅提供接近压缩空气源895的通路，而且该通道还有助于使囊组件810各种构件对准，使得囊与容器210的鼓泡正确对准。

类似地，气动阀组件808也安装在可移动的支撑部件804上，但应该懂得，其它设置也是可行的。在说明性的实施例中，气动阀组件808上的销858安装在可移动的支撑部件804上的安装开口859中，并且气动活塞843、852、853和862穿过可移动的支撑部件804中的通道816，从而与容器210相接触。如图所示，囊组件安装在可移动的支撑部件804的第一侧部811上，而气动阀组件808安装在可移动的支撑部件804的第二侧部812上。然而，因为气动活塞843、852、853和862穿过通道816，所以气动阀组件808的气动活塞和囊组件810的气动囊一起工作，以便为容器210提供必要的气动促动器。

如上面论述的那样，囊组件810和气动阀组件808的各个气动促动器都具有相关联的气动配件。虽然在图8中只显示若干个软管878，但是应该懂得，各个气动配件通过软管878而连接在压缩气体源895上。压缩气体源895可以是压缩机，或者，压缩气体源895可以是压缩气瓶，例如二氧化碳气瓶。如果需要便携性，那么压缩气瓶是特别地有用的。其它压缩气体源也在本发明的范围内。

仪器810的若干个其它构件也连接在压缩气体源895上。作为说明，利用通过软管878来自压缩气体源895的气体使安装在支撑部件802的第一侧部813上的磁体850进行伸出和缩回，但是移动磁体850的其它方法在本领域中也是已知的。磁体850承座在支撑部件802的凹部81中。应该懂得，凹部81可以是穿过支撑部件802的通道，所以磁体850可与容器210的鼓泡246相接触。然而，根据支撑部件802的材料，应该懂得，凹部851不需要一直穿过支撑部件802，只要当伸出磁体850时，磁体850足够近以便在鼓泡246上提供充分的磁场，并且当磁体850缩回时，磁体850不会显著影响鼓泡246中存在的任何磁珠即可。虽然参考缩回的磁体850，但是应该懂得，可使用电磁体，并且电磁体可通过控制穿过电磁体的电流进行激励和去激励。因而，虽然本说明书论述撤回或缩回磁体，但是应该懂得，这些词语是足够广泛的，以包含撤回磁场的其它方法。应该懂得，气动连接可以是气动软管或气动空气歧管，因而减少需要的软管或阀的数量。

安装在支撑部件802上的气动活塞阵列869的各种气动活塞868也通过软管878而连接在压缩气体源895上。虽然只显示两个软管878将气动活塞868连接到压缩气体源895上，但是应该懂得，各个气动活塞868都连接在压缩气体源895上。图中显示十二个气动活塞868。当容器210插入到仪器800中时，这十二个气动活塞868被定位，以激励其相应的容器210的十二个柱塞268。当容器210上方的盖805关闭时，盖805上的唇缘806为配件290提供支撑，所以当气动活塞868被激励时，盖805将配件290保持在合适位置上。应该懂得，其它用于配件290的支撑也在本发明的范围内。

一对加热/冷却装置，例如珀耳帖加热器安装在支撑部件802的第二侧部814上。第一级加热器886定位成加热和冷却用于第一级PCR的鼓泡264的内容物。第二级加热器888定位成加热和冷却用于第二级PCR的容器210的第二级鼓泡282和283的内容物。然而应该懂得，这些加热器还可用于其它加热目的，而且可包含其它加热器，只要对具体应用适当即可。

如果需要，在仪器800中可包含反馈机构(未显示)，以用于提供关于样本是否已经实际被迫进入特定鼓泡中的反馈。说明性的反馈机构包括温度或压力传感器或光检测器，尤其是在包含萤光或有色染料时。作为说明，这种反馈机构可安装在支撑部件802或804中的任一个上。例如，压力传感器可安装在支撑部件802上，与鼓泡264位置相邻。当样本被假定移动至鼓泡264中时，如果压力传感器被下压，那么容许样本处理继续进行。然而，如果压力传感器没有被下压，那么可停止样本处理，或者可在屏幕892上显示错误信息。任何组合或所有鼓泡都可具有反馈机构，从而提供关于样本穿过容器的正确运动的反馈。

当需要萤光检测时，可提供光学阵列890。如图8中所示，光学阵列890包括光源898，例如过滤的LED光源、过滤的白光或激光照明和摄像机896。穿过可移动的支撑部件804的窗口847为光学阵列890提供接近容器210的第二级扩增区域280的通路。作为说明，摄像机896具有多个光检测器，其各与容器210中的第二级鼓泡282、823相对应。或者，摄像机896可获得图像，其包含所有第二级鼓泡282、283，并且图像可被分隔到与各个第二级鼓泡282、283相对应的独立区域中。根据设置，光学阵列890可以是固定的，或者光学阵列890可放置在动子上，动子连接在一个或多个马达上，并移动以获得来自各个单独的第二级鼓泡282、283的信号。应该懂得，其它布置也是可行的。

如图所示，计算器894控制压缩空气源895的阀899，并因而控制仪器800的所有气动装置。计算机894还控制加热器886和888以及光学阵列890。这些构件均通过例如电缆891进行电连接，但是其它物理或无线连接也在本发明的范围内。应该懂得，计算机894可容纳在仪器890中，或者可位于仪器890的外部。此外，计算机894可包括内置电路板，其控制某些或所有构件，并且还可包括外部计算机，例如桌面型计算机或膝上型PC，以接收和显示来自光学阵列的数据。可提供接口893，例如键盘接口，其包括键，用于输入信息和变量，例如温度、循环时间等等。作为说明，还可提供显示器892。显示器892可以是例如LED、LCD或其它这种显示器。

图9显示在仪器800的操作期间囊组件810和容器210之间的关系。囊组件包括子组件815、817、818、819和822。因为囊子组件815的囊809较大，所以作为说明，子组件815的囊具有两个气动配件815a和815b。囊809用于相对于容器210的塑料膜部分217封堵室292(如图6中所示)。当其中一个柱塞268被下压时，其中一个或两个气动配件815a和815b允许囊809放气。在来自其中一个室292的流体穿过之后，囊809被重新加压，密封通道214、236、245、247和249。虽然说明性的囊子组件815只有一个囊809，但是应该懂得，其它设置也是可行的，作为说明，各个通道214、236、245、247和249具有其自身相关联的囊或气动活塞。作为说明，囊子组件822包括三个囊824、826和828。如上面论述的那样，囊824、824和828驱动用于细胞溶解的三瓣区鼓泡222。如图所示，囊824、826和828略大于其相对应的鼓泡224、226、228。已经发现，当充气时，囊的表面可变成略微圆顶形状，并且利用略微过大尺寸的囊容许在相对应的鼓泡的整个表面上良好的接触，从而可实现更均匀的压力和使鼓泡更好地排空。然而，在某些情况下，单独鼓泡的完全排空可能是需要或不合需要的，并且较大或较小尺寸的囊可用于控制排空的鼓泡体积。囊子组件817具有四个囊。囊836用作用于通道236的夹阀，而囊844、848和866分别设置为用于在鼓泡244、248和266上提供压力。囊子组件818具有两个囊846和864，其分别设置为用于在鼓泡246和264上提供压力。最后，囊子组件819控制第二级扩增区域280。囊865用作用于通道265和267的夹阀，而囊882为第二级鼓泡282和283提供柔和的压力，从而迫使第二级鼓泡与加热器888紧密接触。虽然囊组件810设有五个子组件，但是应该懂得，这种设置仅仅是说明性的，而且可使用任意数量的子组件，或者可提供囊组件810作为单个整体组件。

图10类似地显示在仪器800的操作期间，在气动阀组件808和容器210之间的关系。替代囊，气动阀组件808具有四个气动活塞842、852、853和862。这些气动活塞842、852、853和862提供定向在通道242、252、253和262上的压力，各个气动活塞被压缩空气驱动。因为活塞在直径上相当狭窄，所以它们可配合在囊子组件817和囊子组件818之间，以便提供用于通道242、252、253和262的夹阀，从而容许通道242、252、253和262相当地短。然而，如果需要，气动活塞842、852、853和862可被可包含在囊组件810中的囊替代，消除对于气动阀组件808的需求。应该懂得，囊和气动活塞的任何组合都在本发明的范围内。还应该懂得，本领域中已知的在容器210的通道和鼓泡上提供压力的其它方法都在本发明的范围内。

图12显示容器510，其与图6的容器210是相似的。带有入口通道515a至515i的配件590类似于带有入口通道215a至215i的配件290。带有其相应的通道538、543、552、553、562和565的鼓泡544、546、548、564，和566类似于带有其容器210的相应通道238、243、252、253、262和265的鼓泡244、246、248、264和266。容器210的通道245、247和249已经略微重新设置，作为容器510上的通道545a-c、547a-b和548a-c；相应的通道510比其容器210上的配对通道略短。然而应该懂得，通道设置仅仅是说明性的，而且各种通道设置都在本发明的范围内。

在图12的容器510和图6的容器210之间存在两个主要区别。第一，三瓣区鼓泡222已经被溶解鼓泡522替代。如图2b中所示，溶解鼓泡522设置为通过利用连接在马达19上的旋转叶片或桨叶21产生的冲击而实现旋涡流动。因为这种溶解方法不依赖于气动活塞的交替压力，所以只显示单瓣区鼓泡。因为溶解鼓泡522只有单个瓣区，所以通道514和536通向溶解鼓泡522的单个瓣区。应该懂得，溶解鼓泡522可在这里所述的任何容器实施例中使用。还应该懂得，作为说明，可改进溶解组件810，以便用设置为用于鼓泡522的单个囊替换囊子组件822的囊824、826和828。相反，如上面的各种其它实施例中所述，可在容器510中使用三瓣区鼓泡。溶解鼓泡522可设有可选的加强补片523，其作为说明利用粘合剂或叠片而连接在溶解鼓泡522的外表面上。加强补片523有助于最大限度地减少容器510由于桨叶21的重复接触而被撕裂。图13显示安装在第二支撑部件804上的电动马达，例如Mabuchi RC-280SA-2865直流马达(日本千叶市)。在一个说明性的实施例中，马达以5000至25000rpm，更说明性地以10000至20000rpm，且仍更说明性地以大约15000至18000rpm进行旋转。对于Mabuchi马达，已经发现7.2V提供足够用于溶解的rpm。然而应该懂得，当叶片21冲击容器510时，实际速度可略微减慢。根据所使用的马达和桨叶，其它电压和速度可用于溶解。可选地，可将受控制的小体积的空气提供到与溶解鼓泡522相邻的囊中。已经发现在某些实施例中，用一个或多个小体积的空气部分地填充相邻的囊有助于在溶解过程中定位和支撑溶解鼓泡。或者，在溶解鼓泡522周围的其它结构，例如刚性或柔性垫圈或其它保持结构可用于在溶解期间限制容器510。

在图12的容器510和图6的容器210之间第二个主要区别是第二级扩增区域280的鼓泡281、282和283已经被第二级扩增区域580中的高密度阵列581替代。高密度阵列581包括多个第二级井582，例如50或更多个井，并且甚至更多，例如120或更多个井。带有更多第二级井582的实施例也在本发明的范围内，例如大约200、大约400或甚至大约500或更多。其它设置也在本发明的范围内。可通过使井582变小，通过使高密度阵列581更变大，或以其组合的方式而增加附加的第二级井582。对于第二级PCR，各个井可包含一对引物。但是应该懂得，一个或多个井可用于正控制或负控制。

当用鼓泡566中的稀释的第一级扩增产物填充井时，井之间的交叉污染可能是主要问题。如图9中所示，借助于通过通道265的单独分支填充各个第二级鼓泡，然后用囊882密封，从而控制容器210中的交叉污染。对于流体可填充某些或所有鼓泡584的高密度阵列581而言，也必须控制井之间的交叉污染。在一个实施例中，第二级PCR引物可共价地或非共价地结合在各个井的内表面上，因而起到类似PCR切片的作用。然而，在许多实施例中需要在不将PCR引物栓于井上的状况下控制井之间的交叉污染。在其中来自鼓泡566的流体通过跨高密度阵列581的第一表面581a流动而移动至井582中的一个实施例中，控制井之间的交叉污染可能较为困难。

存在若干个用于成功装填第二级扩增区域580的所需特征。首先，需要来自鼓泡566的进入的流体将基本所有的井582填充至基本相同的水平。未填充的井将产生错误的负信号。其次，需要的是，填充井582的过程不应造成井中的引物泄漏出来。一个井的引物的损失可能限制该井中的PCR反应的效率，并且可污染邻井。第三，在井582已经被填充并且PCR已经起动之后，需要井彼此完全被密封。扩增子从一个井泄漏至另一井中，其可能降低第一井中的信号，并升高第二井中的信号，潜在地导致第一井中的错误的负，以及第二井中的错误的正。此外，对于某种控制，重要的是，产生于一个井中扩增子不会进入另一井，在另一井中其可进行进一步扩增。

这个问题的解决方法包括使用阻隔层。在一个示例中，阻隔层是物理阻隔，其被提供，以容许井的快速装填和对大量流体快速密封。在另一示例中，使用组合的化学和物理阻隔，其中物理阻隔用于密封井，然后化学阻隔有条件地将低核苷酸引物释放到井溶液，例如通过加热、缓释或酶消化。井深度或各个井的通道长度还可用于控制来自井的试剂的释放。用于装填高密度阵列581的其它方法也是可行的。

图12-15显示利用物理阻隔的第二级580的一个说明性的实施例。夹在容器510的第一层518和第二层519之间的是高密度阵列581及井582。如图14中最佳所示，在高密度阵列581的一个侧部上提供带穿孔586的刺穿层585，以用作物理阻隔，并且在高密度阵列581的相对侧部上提供第二层587，以形成井582的底部。作为说明，刺穿层585和第二层587是通过例如热密封而已经密封在高密度阵列581上的塑料膜，但是应该懂得，可采用其它密封方法。还应该懂得，用于高密度阵列581的材料和用于刺穿层585和第二层587的材料应该彼此相容，并与所使用的密封方法和化学物相容。当用于PCR时，可用于高密度阵列581和可热密封的相容塑料的示例是PE、PP、Monprene®以及其它嵌段共聚物弹性体。如果在化学检测中使用荧光染料，那么可能需要高密度阵列581由炭黑或其它相对不透萤光的材料形成，以便最大限度地减小从一个井582发送至其邻井的信号，并且至少其中一个层585和587相对透萤光的。对于刺穿层585和第二层587，可使用带有可热密封的塑料层(例如PE、PP和DupontSurlyn®)的牢固的工程塑料的叠片，例如Mylar®或PET。对于基于粘合剂的系统，刚性工程塑料例如PET或聚碳酸酯可用于形成高密度阵列581，然后使用PCR-相容塑料的膜作为刺穿层585和第二层587。在一个说明性的实施例中，高密度阵列581由黑色PE形成，复合聚乙烯/PET叠片(或Xerox^®PN104702热叠片容器材料)用于刺穿层585和第二层587，其被热密封在高密度阵列581上，并且复合聚丙烯PET用于容器510的第一层和第二层518、519。

应该懂得，穿孔586与井582对准。还应该懂得，穿孔586足够小，使得在缺乏某些力的状况下，流体不容易流过穿孔586。说明性的刺可以是0.001-0.1mm，更具说明性地为0.005-0.02mm，并且更具说明性为大约0.01mm。在说明性的实施例中，使第二级扩增区域580处于真空下，使得当从鼓泡566接收流体时，真空将流体通过穿孔586抽吸到各个井582中。一旦井582被填充，就不再存在迫使流体流人或流出井582的力。然后可激励第二级扩增区域580附近的囊(未显示，但在位置上类似于囊880/882)，以便将第一层518挤压在高密度阵列581上，并将流体密封到井582中。虽然容器510的第一层518用于密封井582，但是应该懂得在刺穿层585和第一层510之间可提供可选的密封层。

在一个说明性的示例中，第二级扩增区域580可如下进行准备。通过首先冲孔、模制或以其它方式在塑料片(作为说明0.1至1mm厚)中形成井阵列582，从而可准备好高密度阵列581。井可形成所需的任何规则或不规则的阵列，并且可具有例如0.05μl至20μl的体积，且更具说明性地为0.1μl至4μl。然后说明性地通过热或粘合剂将其中一个层585或587层压到高密度阵列581的第一表面581a上。如图15中所示，刺穿层585应用于第一表面581a上。然后通过吸移管手动地，或自动地(作为说明，利用x/y可定位的点滴器，例如针式点滴器、点阵打印机、小容积自动吸移管或微流体微接触式点滴器)将试剂589，例如PCR引物对点滴到井中，其作为说明是独特的阵列化学元件。在试剂589已经在各个井582中进行干燥之后，就将第二层585或587应用于阵列581的第二表面581b。层585利用小直径的针阵列刺穿，从而形成穿孔586。在层585已经固定到阵列581上之前或之后可形成穿孔586。应该懂得，在刺穿之前或之后可在任一层585或层587上进行点滴。利用预刺穿的孔点滴出阵列未显示相当大的泄漏，并且提供用于刺穿的针不会由于接触到点滴的试剂而被污染的优点。或者，为最大限度地减小泄漏的可能性，并将点滴的试剂定位在阵列中的最远位置，可能需要将试剂589点滴到第二层587上，用层585密封阵列581，然后刺穿层585。在说明性的示例中，利用GeSiM A060-324 Nano-Plotter 2.1 E (德国的Grosserkmannsdorf公司)将试剂点滴到第二层587上。利用这种点滴器，可同时对多个阵列进行点滴。

一旦被点滴和刺穿，就将阵列581放置容器510的层518和519内部，并密封在合适位置，例如通过热密封，利用粘合剂，超声焊接，机械闭合，或其它将容器510内部的阵列581封装在鼓泡584中的方法。但是应该懂得，鼓泡584通过通道565流体连通地连接在鼓泡566上，而且液体可从通道565流入到鼓泡584中，并经过穿孔586。在一个说明性的示例中，当鼓泡584形成时，需小心考虑空气逃逸的通路。这可通过使第二级扩增区域580附近的第一层518的内表面“粗糙化(waffling)”来完成，从而使膜材料印制略微高出的纹理图案。这容许空气和液体沿着刺穿层585的表面通过，并且较好地容许液体到达和填充所有井582。然后将容器510放置在真空室的内部，并使之排空。作为说明，当压力已经达到大约0.3毫巴，就促动真空室内部的气瓶，驱动柱塞进入配件590中以密封通道567，从而切断密封容器内部阵列和真空室的通路。多个其它柱塞也被驱动到配件590中，以密封各种入口通道515。容器从真空室中移除，并可包装在真空容器中用于长期储存。

容器510可按照与容器210相似的方式使用。因为阵列581包装在真空中，所以当液体从鼓泡566移动至第二级扩增区域580时，液体样本被抽吸穿过穿孔586，并进入到井582中。过量的液体通过在阵列上使气动囊充气而被迫离开，并且如上所述，作为说明通过加热和冷却挤压在阵列的一个侧部上的珀耳帖元件而完成热循环。

如上面提到的那样，刺穿层585可被各种合适的物理或化学阻隔替代。在利用化学阻隔的一个说明性的实施例中，刺穿层585被省略，并且试剂589被点滴到井582中的缓冲剂中，缓冲剂分解相对较慢。作为说明，试剂589包含合适浓度的聚合物例如PEG、Ficoll或聚山梨酸酯20或糖如蔗糖、海藻糖或甘露糖醇，该试剂将与第二级PCR反应相容，并且可能比仅仅点滴在水或氨基丁三醇/乙二胺四醋酸中的引物更缓慢地分解。如上所述，点滴在这些缓冲剂的其中一种缓冲剂中的引物可在井582中风干(应该懂得，在这样一个实施例中，第二层587固定在高密度阵列581上，用于点滴)。这些相同的聚合物可用于酶试剂(例如PCR中使用的酶和缓冲剂)的冷冻干燥，从而形成包含稳定酶的开放基质。因而，点滴在这些缓冲剂中的引物可在井582中就地进行冷冻干燥，导致比风干更慢但潜在更完全的再水合作用。当容器510使用时，来自鼓泡566的流体被真空或压力驱动到井中，并开始分解引物混合物。通过选择恰当慢慢分解的缓冲剂，当第二级扩增区域580附近的囊被激励时，各个井582的内容物在发生任何相当大的交叉污染之前被密封在那里。

另一实施例使用直到第二级扩增区域580被加热至预定温度以上才分解的基质。这种基质的一个示例是低熔点琼脂糖，例如GenePure LowMelt Agarose (ISC Bioexpress公司)。在一个示例中，这种琼脂糖的1.5%的溶液在65℃熔化，并且在24-28℃下凝成胶。在点滴之前，作为说明可将试剂589加热至50℃，并与已经被熔化的这种琼脂糖混合，然后以小体积(作为说明100至500nl)点滴到井582中。为在点滴期间保持混合物液体，这可能必须在箱中完成，箱被加热至琼脂糖的熔化温度以上。或者，在没有熔化的状况下吸移琼脂糖的稀释溶液也是可行的。在琼脂糖/试剂混合物点滴之后，就干燥高密度阵列581。这可能是简单的风干，或者引物-琼脂糖混合物可包含上面列出的糖和聚合物，使得试剂可进行冷冻干燥。当容器510用于PCR时，随着流体从鼓泡566移动到高密度阵列581中时，可将第二级扩增区域580加热至例如55℃。在这个温度下，琼脂糖不会熔化，所以引物不会释放到溶液中。一旦高密度阵列581被填充，就使相对应的囊充气以密封井。当温度在第一PCR循环的第一变性步骤中上升到65℃以上时，包含引物的琼脂糖熔化，从而将引物释放到主混合物中。作为说明，热循环决不会低于60℃(或其它用于琼脂糖的熔化温度)，所以琼脂糖在热循环期间不会凝成胶。此外，在图8的说明性的仪器800中，重复的温度循环被加热器888驱动，其定位在容器的一个侧部上。预计在井582中将时常具有跨PCR溶液的温度梯度，其应通过对流的流体流动而促进引物的混合。在相似的实施例中还可使用蜡。

在进一步的实施例中，引物可有条件地结合到井581上，后续在井581已经被填充之后释放引物到溶液中。根据如何将引物连接在塑料衬底上，可利用热(作为说明，在PCR反应的第一循环期间)、光(作为说明，通过窗口847照射)、化学物(例如二硫苏糖醇与热一起将减少可用于将引物联接到井上的二硫键)或酶(例如位置特定的朊酶，如组织胞浆素原活化体可用于劈开将引物连接在衬底上的恰当的肽腱)而劈开引物。

在又一实施例中，扩增之后可将DNase(脱氧核糖酸酶)注射到第二级扩增区域580中，从而进一步最大限度地减小任何潜在的污染风险。

应该懂得，这里已经描述用于供PCR使用的第二级扩增区域580。然而，对于容器510和第二级扩增区域580的其它用途也在本发明的范围内。此外，应该懂得，第二级扩增区域580可在有或没有核酸萃取以及第一级PCR扩增区域的状况下使用。最后，应该懂得，第二级扩增区域580可供这里所述的任何容器实施例使用。

示例1：嵌套的多重PCR

在图5的容器110中运行一组反应，容器110位于与仪器800相似，但设置为用于容器110的仪器上。为显示细胞溶解和两级核酸扩增的效率，在对数生长期，各50μL的酿酒酵母和裂殖酵母活物培养液与100μL来自健康供体的鼻咽吸出的样本相混合，以形成样本，然后与200μL溶解缓冲剂(6M盐酸胍，15%TrinX100,3M醋酸钠)相混合。然后将溶解缓冲剂中的400μL样本的300μL注射到容器110的室192a中。

制造的容器110具有密封在三瓣区鼓泡122中的0.25g的ZS珠。在容器110的制造期间，如下面论述的那样，还将第二级引物点滴在鼓泡181和182中。容器110进行如下装填：

115a 上述样本和溶解缓冲剂，

115b 溶解缓冲剂中的磁珠，

115d-e 清洗缓冲剂(10mM柠檬酸钠)，

115g 洗脱缓冲剂(10mM氨基丁三醇，0.1mM乙二胺四醋酸)

115h 第一级PCR缓冲剂：

0.2mM dNTP

0.3μM 各种引物：

Sc1：设置为用于结合在RNA和酿酒酵母的MEX67p上的扩增YRA1核蛋白的一部分的引物。该引物设置为用于扩增内含子，使得cDNA(通过M-MLV逆转录的mRNA)的扩增产生180bp扩增子。

Sc2：设置为用于扩增酿酒酵母的MRK1糖原合酶激酶3(GSK-3)同系物的cDNA的121bp区域的引物。

Sc3：设置为用于扩增酿酒酵母的RUB1泛素样蛋白的cDNA的213bp区域的引物。

Sp1：设置为用于扩增裂殖酵母的suc 1-周期蛋白依赖激酶调节亚基的cDNA的200bp区域的引物。

Sp2：设置为用于扩增裂殖酵母的sec l4-细胞因子家族的cDNA的180bp区域的引物。

带3mM的MgCl2(没有BSA)的PCR缓冲剂

50单位的M-MLV

4.5单位的Taq：抗体

100单位的RNAseOut

115j-k第二级PCR缓冲剂

0.2mM的dNTP

IXLCGreen^®+(爱达荷技术公司)

带2mM的MgCl2(带BSA)的PCR缓冲剂，

4.5单位的Taq

115l 第二级PCR缓冲剂，其带有第一级扩增子的样本。

在制造期间，第二级鼓泡181和182用嵌套的第二级引物来点滴。各个鼓泡用一对引物以一定的数量进行点滴，从而导致最后大约0.3μM的浓度，一旦与第二级PCR缓冲剂进行再水合的话。第二级嵌套引物如下：

Sc1：设置为用于扩增Sc1cDNA第一级扩增子的80bp片段的引物。

Sc2：设置为用于扩增Sc1cDNA第一级扩增子的121bp片段的引物。

Sc3：设置为用于扩增Sc1cDNA第一级扩增子的93bp部分的引物。

Spl：设置为用于扩增Sc1cDNA第一级扩增子的99bp部分的引物。

Sp2：其设置为用于扩增Sc1cDNA第一级扩增子的96bp部分的引物。

在用于任何靶标的第一级和第二级引物对之间没有重叠。每对引物被点滴到一个负控制鼓泡181和两个第二级鼓泡182中，所以各个第二级扩增将以复制形式运行，各个复制带有负控制。

在装填之后，与入口通道115a相关联的柱塞的激励使样本移动至三瓣区鼓泡122，与入口通道115b相关联的柱塞的激励使磁珠移动至储槽101，与入口通道115d-e相关联的柱塞的激励使清洗缓冲剂移动至储槽102和103，与入口通道115g相关联的柱塞的激励使洗脱缓冲剂移动至储槽104，与入口通道115h相关联的柱塞的激励使第一级PCR缓冲剂移动至储槽105，与入口通道115j-k相关联的柱塞的激励使第二级PCR缓冲剂移动至储槽106和107，并且与入口通道1151相关联的柱塞的激励使正控制(第二级PCR缓冲剂，其带有之前制备的第一级扩增子的样本)移动至储槽108。在这个当前示例中，与入口通道115a和115b相关联的柱塞在将容器110装填到仪器中之前被下压。在运行期间，所有其它柱塞相继在仪器中被下压，并且根据需要使流体移动至储槽102至108。

一旦容器110被放置到仪器中，就在ZS珠存在的状况下击打十分钟，如上所述。一旦细胞溶解完成，就压缩储槽101，并迫使核酸结合的磁珠从储槽101进入三瓣区鼓泡122中，其中珠被柔和混合，并容许静置5分钟。

然后使样本-珠混合物移动至鼓泡144，其中磁珠通过磁体的激励而被捕获。一旦磁体被伸出，与鼓泡144相邻的囊受到加压，以迫使流体返回三瓣区鼓泡122。然后如上所述，利用来自储槽102和103的清洗溶液清洗捕获的珠。在清洗之后，珠通过磁体的激励而被再次捕获在鼓泡144中，并且储存在储槽104中的洗脱缓冲剂移动至鼓泡144中，其中在2分钟静置之后，从珠洗脱的核酸然后移动至鼓泡161中，如上面论述的那样。

在鼓泡161中，核酸样本与来自储槽105的第一级PCR主混合物相混合。样本然后在40℃保持10分钟(在此期间M-MLV将mRNA转换成cDNA)，然后在94℃保持2分钟(使M-MLV不活动，并从Taq除去抗体)。然后热循环是20个10秒94℃和20秒65℃的循环。

在第一级扩增之后，利用来自储槽106的第二级PCR主混合物而使样本稀释至大约100倍。然后使样本移动至鼓泡182，其之前用第二级引物进行点滴，如上面论述的那样。第二级PCR缓冲剂从储槽181被移动至负控制鼓泡181，并且正控制混合物从储槽108被移动至鼓泡183。样本在94℃下变性30秒，然后用45个5秒94℃和20秒69℃的循环进行扩增。

在图11中可看出，所有靶标扩增子和正控制显示扩增作用，而没有负控制显示扩增作用。各个样本以复制形式运行。复制均显示相似的扩增作用(数据未显示)。

应该懂得，酿酒酵母和裂殖酵母靶标仅仅是说明性的，而且其它靶标也在本发明的范围内。

示例2：高密度PCR

上面的示例使用图5的容器110。容器110具有五个负控制鼓泡181、五个正控制鼓泡183和十个低容积样本鼓泡182。图6的容器210将低容积样本鼓泡282的数量增加至18个。然而，图12中所示的容器510的高密度阵列581可具有120或更多个第二级井582。这种在第二级反应数量方面的增加可实现一组广泛的潜在诊断和人识别应用，而不需要增加容器和其仪器的尺寸。这里描述各种示例。

在一个示例中，已知的是，用于公共呼吸性病毒的标准商业免疫荧光化验可检测七种病毒：腺病毒、PIV1、PIV2、PIV3、RSV、流行性感冒A和流行性感冒B。作为说明，更完整的名单将包括用于附加五个病毒的化验：冠状病毒、人偏肺病毒、BOCA病毒、鼻病毒和非HRV肠病毒。对于高度变异病毒，例如腺病毒或HRV，需要使用多个引物来瞄准病毒血统的所有分支(作为说明，分别4个外部和4个内部引物组)。对于其它病毒例如冠状病毒，具有4个不同的血统(229E、NL63、OC43、HU1)，其不因季节而不同，但它们已经足够完全地分化，使得需要单独的引物组。说明性的完整的呼吸性病毒名单还将瞄准SARS冠状病毒、可能的鸟类流行性感冒HA和N亚型病毒、以及可能的其它病毒。最后，某些呼吸性病毒显示这种高的序列变化率，使得有益的是，为各个这样的病毒产生不止一个嵌套的PCR化验，从而最大限度地减小由于在引物下的序列变化而做出错误否定结果的机会。当包含这里所述的所有引物组时，这种呼吸性病毒名单在第二级扩增中可能具有80或更多特定的扩增子。高密度阵列581可以很容易地在单个容器510中适应这种名单。

容器510的高密度阵列581的第二种应用是确定与感染的病人隔离的抗多种药物的菌的特征和抗菌素耐药谱。目前方法需要若干天静置微生物，并经验性地测试单独的抗药性曲线。在接收结果所花费的时间期间，医生将时常管理广谱抗菌素，其导致抗多种药物的菌的增加。已经研究出PCR引物来检测抗菌素抗性的遗传定子(抗菌素抗性基因本身)。然而因为这些基因的某些大量变异原因，对于完全确定抗性曲线需要大量扩增子。Hujer等人描述62种PCR化验的名单来识别不动杆菌属隔离体中存在的抗性基因。同样，高密度阵列581可以很容易地在单个容器中适应这种名单。

高密度阵列的应用的第三示例是在人体鉴定的领域，例如用于人体残骸的法庭鉴定和用于亲权测试。人体鉴定的市场大多数被分析短串联重复序列(STR)的系统占据。这种分析通常要求按尺寸分开重复，例如利用毛细管电泳。用于这个目的专用实验室设备通常不是现场便携式的。在使用单核苷酸多态性(SNP)进行鉴定测试方面的兴趣日益增长，因为现在有一大套技术用于鉴定SNP，并且这些技术某些可顺应现场使用。Sanchez等人已经发布一组52个井-表征的SNPs，其总地给予偶然匹配两个个体非常低的几率(至少5.0x10^-19的平均匹配几率)。实际上，对于各个SNP可能采用两个扩增子来精确地测定各个位点(参见例如Zhou等人的文献)。因而一个带有104个第二级井582的容器510可完全单独地测定所有52个SNP位点。

应该懂得，通过将来自不同诊断应用的化验组合到一个容器中可获得成本和工作流的优点。例如完整的呼吸性病毒名单可与细菌鉴定名单组合。这些组合可简化制造，因为只有较少类型的容器要组装。它们还可简化最终用户的工作，因为只有较少特定类型的容器需要储备在诊所中，并且还减少对于具体临床样本使用错误容器的机会。对于某些应用，这些优点可抵消制造具有更多对引物的容器的增加的成本。因而一个带有100个或更多个第二级井582的容器510可用于适应多个化验名单。

示例3：过程控制

用于高度多重化验的控制可能是有问题的，尤其在临床诊断环境中，其中质量必须与每次测试的成本相匹配。容器510的高密度阵列582潜在地增加这个问题，因为可在单个运行中进行化验的诊断靶标的数量增加。这里论述各种类型的控制。

说明性的过程控制包括在将样本注射到容器中之前使完好的微生物，例如包含RNA靶标的微生物混合到病人样本中。这种靶标可能是完好的RNA噬菌体(MS2或Qβ)或完好的植物RNA病毒(烟草花叶病毒)或存在于完好酵母中的mRNA。专用于RNA靶标的外部引物将存在于第一级PCR中，并且包含内部引物的井582将存在于高密度阵列中。在这个井582中的扩增产物的检测确认该过程的所有步骤都正确工作。第二级后的扩增熔化曲线还可用于判在尺寸上设置作正确的特定产物。从扩增曲线确定的交点(“Cp”)可用于给予试剂的完整性的定量测量。例如，该Cp可同来自运行于不同时间的相同批次的其它容器的Cp进行比较。虽然使用完好的微生物，但是应该懂得，如果溶解测试不重要的话，那么可使用净化的或隔离的核酸。在其它情形中，可能需要使用该控制来仅仅测试该分析的后面步骤。例如，将自然或合成的核酸模板与同源引物一起加入高密度阵列的井中，这可用于测试第二级PCR反应，并且在第一级PCR扩增混合物中和第二级扩增区域的井582中将核酸模板与合适的引物加入第一级PCR中，这将测试第一级和第二级PCR反应。

上述这种过程控制不会测试特定于靶标扩增子的引物的完整性。测试特定引物的完整性的正控制的一个示例使用核酸的混合物，例如合成的RNA，因为稳定性和变异性时常可受到更好的控制，并且这些序列由于环境污染而不能存在，其中混合物包含用于特殊容器中存在的各个引物的核酸。在诊断环境中，这种正控制可在用于测试病人样本的容器运行结束时使用。混合物从例如用于病人样本的相同批次注射到容器中，并且通过所有靶标扩增子提供正结果来限定成功。负控制可以相同的方式进行；在用于测试病人样本的容器运行结束时，可将水或缓冲剂注射到容器中，并且通过所有靶标扩增子提供负结果来限定成功。

单独的工作流和诊断实验中的规程可用于确定在上述控制容器运行之前运行的病人样本容器的数量。不管如何频繁地或很少地运行控制容器，这些控制都增加整个系统的时间和成本。出于这个原因，有用的是将控制设于容器的内部。高密度阵列581的结构容许以下对负控制的新颖方法。在这个示例中，核酸，作为说明性的合成扩增子被加入到高密度阵列581的其中一个井582a中。扩增这个序列的引物被加入到这个井582a中，并加入到两个跨阵列间隔开的其它井582b和582c中。作为说明，扩增子序列和引物是人工的，并经过设计，使得使用的引物不会偶然地扩增另一靶标。

当在仪器800中运行清洁的未被污染的容器510时，包含合成靶标的井582a将产生扩增子，并因此被称为正的。包含相对应的引物的两个其它井582a、582b不应扩增样本中的任何事物，并因而被称为负的。容器510可进行进一步的处理，用于附加控制。作为说明，使高密度阵列保持抵靠着加热器888的囊880/882然后被减压，并使井582的内容物混合。在一个说明性的方法中，井582的内容物进行如下混合：加热器888用于使高密度阵列的温度在缓冲剂的沸点上面和下面循环较短的时间(例如10秒85℃然后20秒105℃的三个循环)。在高密度阵列581的井582中所产生的蒸汽气泡应迫使井582的内容物进入到第二级扩增区域鼓泡580中。可选地，第二级扩增区域580的内容物可通过利用囊使液体从容器510的一端移动至另一端而与容器510的剩余内容物相混合。这些步骤的目的是使特定的污染控制扩增子与任何特定的靶标扩增子在整个容器中进行混合。

如果用户在容器已经以这种方式运行之后偶然地打开容器，那么特定靶标扩增子和污染控制扩增子将被释放。如果痕量的这些核酸污染后面运行的容器，那么仪器可检测到污染事件，因为只包含专用于合成扩增子的引物的井582b、582c将记录正分。仪器中的柔性件将警告用户，并且运行结果将被标记为存疑。

在用于控制污染的另一方法中，在运行结束时，可添加DNA降解化学物或酶以毁坏第一级和第二级PCR反应的基本所有DNA产物。作为说明，这可按照与上述污染检测方法相似的方式进行，通过第二级阵列的内容物加热至局部沸点温度以上，因而从阵列851的井582中抽吸出扩增的样本，使加热的液体与稀释的第一级反应的内容物混合，在冷却或不冷却混合物的状况下通过例如入口通道515k添加等分DNA降解物质，以及容许DNA降解反应进行静置，直至基本上所有在PCR反应中所产生的DNA已经遭到破坏时为止。这可利用DNAases、酸或氧化剂来完成，这在本领域中是已知的。

应该懂得，这里所述的任何污染控制都可独立地或以其任何组合使用。

示例4：容器装填

图16显示装填站600。如图所示，图12的容器510已经加载到装填站600的槽610中，使得只有容器510的配件590是可见的。如图所示，装填站600设有用于保持样本管瓶650的样本管瓶容座602以及用于保持水合管瓶670的水合管瓶容座604。然而应该懂得，容座和管瓶用于帮助工作流，并且仅仅是说明性的。其它容器和其它装置的其它设置和使用也在本公开的范围内。

样本被吸移或以其它方式装填到样本管瓶650中。如下面更详细论述的那样，根据工作流，样本管瓶650可已经包含用于接收生物样本的缓冲剂或其它流体652，或者操作员可将合适的缓冲剂中的生物样本添加至样本管瓶650中。可选地，可在单独的安瓿中提供缓冲剂，其中分配合适数量的缓冲剂。类似地，水合管瓶670可预装填水、缓冲剂或其它流体672，或者操作员可用这种流体装填水合管瓶670。

说明性的配件590包括注射端口541，其作为说明成形于配件590的第二表面595附近。如图所示，注射端口541定位在样本注射开口563中，样本注射开口563设置为用于通过配件590的第一表面594而接收中空转移容纳器，例如中空注射器。在这个说明性的设置中，注射端口541受到保护，以免意外的刺穿，并且不会打开，直至中空转移容纳器放置到样本注射开口563中。类似地，说明性的配件590包括第二注射端口588，其作为说明成形于配件590的第二表面595附近，并定位在水合流体注射开口583中，水合流体注射开口583类似于样本注射开口563进行设置。如这个说明性的实施例中设置的那样，注射端口541用于接收有待测试的样本，该样本将移动到室592a中，或者直接进入溶解鼓泡522中(图12)，并且第二注射端口588设置为用于接收水合流体672(如图18中所示)，例如水或缓冲剂，该水合流体672将移动至室592b至592l，以便后续移动穿过入口通道515b至515l。应该懂得，注射端口541和588以及开口563和583的布置是说明性的，而且其它设置也在本公开的范围内。

如图17中最佳所示，说明性的样本管瓶650按照与许多中空注射器相似的布置包括顶表面662、管瓶本体654和插管655。在这个说明性的实施例中，替代在许多中空注射器中所发现的柱塞，样本管瓶650设有固定在顶表面662上的密封件656以及用于穿过顶表面662，从而用于密封管瓶本体654的盖658。在说明性的实施例中，密封件656是可剥离的密封件，其可被操作员剥离。然而，应该懂得，该密封件可具有各种不同的设置，例如本领域中已知的螺帽或脆弱密封件。或者，可省略单独的密封件，并且样本管瓶650可设有关闭管瓶本体654的盖658，从而要求操作员在使用之前打开盖658。另外，如果样本管瓶650是预装填样本缓冲剂或其它流体652而提供的，或者如果管瓶本体654需要在使用之前相对任何外部环境保持密封，例如保持无菌的话，才会需要任何类型的密封件。在一个备选实施例中，可提供没有密封件656的空的样本管瓶，并且操作员将灌注，吸移、插入拭子、用勺舀入固体或半固体材料，或者以其它方式通过顶表面662中的开口657来将流体和/或其它材料转移到管瓶本体654中。

根据有待测试的样本类型，样本管瓶650可设有过滤器646，其作为说明定位在管瓶本体654的底表面686上或其附近。如图所示，过滤器646通过O形环644保持在合适位置。然而应该懂得，过滤器646可通过粘合剂、通过焊接、通过压配合、或通过其它方法而保持在合适位置，这在本领域中是已知的。当插管655插入到样本注射开口563中，并将样本抽吸到容器510中时，样本材料在其被拉过过滤器646和进入插管655中时进行过滤。虽然过滤材料的选择依赖于样本类型和粒径，但是用于各种生物样本的合适的过滤器包括Pall 100μm绝对滤芯聚丙烯喷熔介质和Millipore 80μm聚丙烯网过滤器。大多数注射器过滤器设计为用于排除某一尺寸的微生物，从而从滤液中除去那些微生物。不同于这种预先存在的过滤器，这基于其排除在粪便、土壤、粉末等等中所发现的较大颗粒同时容许大约60μm直径或更小的靶标微生物(例如细菌、病毒、原生动物和真菌微生物)穿过过滤器的能力而选择些说明性的过滤器。另外，说明性的过滤材料是惰性的(即不会与微生物或核酸结合)，并且相对不容易阻塞的。应该懂得，这些说明性的过滤器是为样本进行选择的，该样本包括原生动物作为靶标微生物(高达大约60μm)。因为某些容器设置可能仅用于较小靶标的测试，所以可能需要具有小孔径的过滤器，例如具有用于细菌和真菌的1-10μm孔径的过滤器，以及如果只要检测病毒颗粒的话则小于1μm孔径的过滤器。当然，更大孔径的过滤器仍可用于过滤较小的靶标。对于具有大量可能堵塞流体系统的颗粒物质，例如土壤、粪便和粉末的样本类型，这种过滤器可能是特别有用的。此外，应该懂得，孔径基于有待过滤的材料进行选择，而且其它孔径也在本发明的范围内。

如图所示，底盖664设有六边形部分666，其设置为用于配合到六边形的样本管瓶容座602中。虽然部分666和样本管瓶容座在说明性的实施例中是六边形的，但是应该懂得，可使用其它形状，而且可提供六边形或其它配合的或互锁的形状来帮助操作员除去底盖664。或者，操作员可通过其它方法除去底盖664，例如利用两个手从管瓶本体654上扭转底盖664。底盖654可被压配合到、旋拧到或以其它方式固定到管瓶本体654上。

在说明性的实施例中，底盖664设有底座648，由此使插管655的底端659延伸到底座648中。作为说明，插管655的底端659紧密地配合到底座648中，使得底座648在插管655的开口底端659周围提供不透气的密封。可选地，在底盖664和管瓶本体654之间提供排气口649。

现在转到图18，水合管瓶670可类似于样本管瓶650进行设置。然而，可能需要将水合管瓶670预装填水合流体672，并将水合流体672预密封在水合管瓶670中，如图18中所示。如图18中所示，说明性的样本管瓶670按照与样本管瓶650相似的布置由顶表面682、管瓶本体674和插管675组成。然而，说明性的水合管瓶670的盖678的舌片680已经压配合到顶表面682的开口677中，并且盖678可被密封在顶表面682上，从而防止水合管瓶670的打开。这种布置仅仅是说明性的，并且应该懂得，这里可设想其它将水合流体672密封在水合管瓶670中的方法。作为说明，可使管瓶本体674和插管675完全或基本完全装满的流体，所以操纵或旋转水合管瓶670将不会允许空气进入插管675中。或者，某些空气或其它气体可能存在于管瓶本体674中，并且操作员可将水合体保持在竖直位置，以防止空气进入插管675中。在又一备选实施例中，可能是在压力下提供空气，并且底盖684的移除将导致水合流体被迫穿过插管675。如图所示，没有为水合管瓶670提供过滤器，但如果需要可提供一个。

可提供底盖684以保持任何可能从插管675滴落的流体，以及防止插管675中的水合流体672的污染。在底盖684中可提供擦拭器683，以便从插管675的底部擦去过量的流体。擦拭器683的圆锥形状还可在后续操纵和处置期间有助于将滴液保持在底盖684中。在说明性的实施例中，底盖684设有六边形部分686，用于与六边形的水合管瓶容座604相配合，但是如上面参照样本管瓶650所述，其它形状也是可行的。水合管瓶670的六边形部分686和六边形的水合管瓶容座604可具有与样本管瓶650的六边形部分666和六边形的样本管瓶容座602不同的尺寸和/或不同的形状，使得只有样本管瓶650将易于配合到样本管瓶容座602中，并且只有水合管瓶670将易于配合到水合管瓶容座604中，从而减少操作员搞混样本管瓶650和水合管瓶670的机会，从而通过端口541和588注射正确的流体。另外，样本管瓶650和注射开口563可部分地或完全以匹配的特定颜色来提供，例如红色，同时水合管瓶670和注射开口583可部分地或完全以不同的匹配的特定颜色来提供，例如蓝色，从而在端口541和588中提供正确流体方面为操作员提供视觉帮助。为进一步最大限度地减小将错误液体插入到错误注射开口中的风险，插管655的直径可不同于插管675的直径，并且样本注射开口563和水合流体注射开口583的直径可类似地不同。其它设置也在本公开的范围内。

作为说明，为装填容器510，操作员将在装填站600将样本管瓶650放置到样本管瓶容座602中，并将水合管瓶670放置到水合管瓶容座604中。容器510还将放置到槽610中。操作员将根据指示除去密封件656，并将样本放置到管瓶本体654中的样本缓冲剂中。样本将按照任何适合于样本类型的方式放置到样本缓冲剂中，包括插入拭子，吸移流体样本，使血液从病人直接滴落到管瓶本体中，以及利用可选的旋流或其它混合方式将固体或半固体样本例如粪便放置到管瓶本体中，这在本领域中是标准的。根据样本类型和所需的靶标核酸，样本缓冲剂可包含一种或多种添加剂或稳定剂，例如朊酶、RNAse、RNAse抑制剂等等。作为附加或备选，这些添加剂可提供于容器510中。优选在旋流或混合之前，操作员通过开口657放置盖658的舌片660从而关闭样本管瓶650。舌片660的插入会对包含在管瓶本体654中的空气加压。作为说明，舌片660具有比插管655的体积相等或更大的体积。作为说明，当底盖664被移除时，在底座648和插管655的底端659之间不透气的密封被破坏，并迫使基本上所有的空气离开插管655。如果舌片660的体积大于插管655的体积，这将有助于确保最大量的空气从插管655中移出。被迫进入和潜在地穿过插管655的流体数量方面的任何溢流都可被捕获在底盖664中，并通过擦拭器663从插管655的底部除去。通过完全或基本上完全填充插管655，最大限度地减小在装填容器时容器510中的气泡的数量。一个或多个排气口649可有助于底盖664与水合管瓶650的分离。

因为底盖664设有六边形部分666，其设置为用于配合到六边形的样本管瓶容座602中，所以操作员可以很容易地在底盖与容座602接合时扭开底盖654，从而暴露出插管655。插管655然后插入到样本注射开口563中，并被推入，以打开注射端口541中。作为说明，容器590的内部真空(或者容器的相对于大气压力或容器的外部压力而言减小的内部压力)迫使样本穿过过滤器(如果存在的话)，在来自管瓶本体的压力或没有压力的状况下，可用于将样本抽吸到容器510中，例如抽吸到配件590的室592a中，以便后续移动到溶解室522中。通过确保插管655基本上填充流体652，应最大限度地减小从样本管瓶650移动到容器510中的空气或其它气体的数量，从而最大限度地减小气泡的尺寸和数量。此外，当使用现有技术的带柱塞的注射器，并且容器590的内部真空抽吸流体时，柱塞沿着注射器被拉下，从而平衡注射器的内部压力。在图16-17的实施例中，因为在各个管瓶本体的顶部的开口是密封的，所以当来自容器590的内部真空从管瓶中抽吸流体时，管瓶也将经历负压力，并可使样本脱气，并从容器590中抽吸出某些剩余气泡。然后从样本注射开口563撤回插管655，并根据规程处置样本管瓶650和底盖664。因为管瓶本体处于负压力下，所以当插管655被撤回时，已经收集在注射端口541附近的气泡可能从容器510中抽吸出来，进一步减少容器中的空气气泡。

类似地，操作员从水合管瓶670上扭下底盖684，从而暴露出插管675。如果水合管瓶670的内容物处于压力下，那么当插管675与底座692分离时，少量的水合流体可能泄漏到底盖684中。一个或多个排气口693可有助于底盖684与水合管瓶670的分离。然后将插管675插入到水合注射开口583中，并被推入，以打开注射端口588中。来自配件590内部的真空可用于将水合流体抽吸到容器510中，作为说明，抽吸到室592b-592l中，以便后续移动到容器510的各种鼓泡中。插管675从水合注射开口583上移除，容器510从装填站600上移除，并放置到仪器800中，然后起动运行。应该懂得，管瓶的移除仅仅是说明性的。如果仪器和管瓶的设置允许，管瓶可永久地插入在注射端口中，从而变成容器的封闭系统的一部分，并最大限度地减小来自样本的污染。在这样一个实施例中，可能不需要密封棒。

在上面论述的样本管瓶650的说明性的实施例中，舌片660具有与插管655的体积相等或更大的体积。在容器具有1ml的填充容积的一个典型的实施例中，管瓶本体654可设有1.5ml样本流体652和位于样本流体上面的1ml体积的空气645。因而，空气是管瓶本体容积的40%。然而应该懂得，可使用其它空气百分比，包括10%、20%、30%、50%、60%、70%、80%以及之间的数量。当通过开口657插入舌片660时，样本流体上面的空气被压缩例如大约50%，但在40-60%、30-70%、20-80%和10-90%范围内的压缩都是可行的。应该懂得，空气和样本流体的体积选择依赖于样本的尺寸、插管的直径、是否需要在运行流体反应之前移除管瓶以及许多其它因素。例如，舀出的或拭去的样本可能需要明显更大体积的样本流体，而不管流体系统的填充容积如何。

说明性的管瓶本体654和674是圆柱形的。但是，因为这些说明性的管瓶不设有柱塞，所以要理解，管瓶本体不必具有圆形横截面，并且任何管瓶本体形状都在本发明的范围内。

图19-21显示装填站600和管瓶650、670的一个备选实施例，其中相似数字表示相似的部件。如图19中所示，装填站800可能类似于装填站600，其中样本管瓶容座802和水合管瓶容座804以及用于接收容器510的槽810都与图12中所示是相似的。然而，根据至少一个实施例，在装填站600和装填站800之间，容座的形状和位置显著不同。例如，在至少一个实施例中，同装填站600的容座602、604相比，容座802和804更靠近容器510。利用这个减少的距离，在装填容器510时发生滴液的机会较少。此外，如图20-21中最佳所示，样本管瓶850的底盖864设有四个相对较短的鳍片867，其配合在样本管瓶容座802的四个匹配个槽803中，并且水合管瓶870的底盖884设有两个相对较长的鳍片887，其配合在水合管瓶容座804的两个匹配的槽805中。这些鳍片替代管瓶650和670的六边形部分666和686。底盖864上较大数量的鳍片867防止样本管瓶850放置在水合管瓶容座804中，并且底盖884上的较长的鳍片887防止水合管瓶870放置在样本管瓶容座802中。然而应该懂得，不同尺寸和数量的鳍片的使用仅仅是说明性的，而且不同的键连接系统也在本公开的范围内。如上面参照装填站600所述，装填站800的容座802、804可用于帮助从其相应的管瓶本体854、874上扭下底盖684、884，从而有助于装填过程。

虽然样本管瓶650、850和水合管瓶670、870在说明性的示例中用于容器590的装填，但是应该懂得，这些装填管瓶适合于装填这里公开的任何容器。它们还适合于装填其它流体或微流体装置，尤其那些设置为利用真空或吸力将液体抽吸到流体装置中的流体装置。

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虽然已经参照优选实施例详细地描述本发明，但是变化和修改存在于以下权利要求所描述和所限定的本发明的范围和精神中。

Claims (30)

1.一种中空管瓶，包括：

管瓶本体，其具有位于一端的顶表面、位于相对端的底表面，以及其之间的限定内部管瓶容积的外壁，所述顶表面具有开口，

插管，其从所述底表面延伸，并具有第一端、第二端和其之间的限定插管体积的外表面，所述第一端与所述内部管瓶容积处于流体连通，以及

盖，其具有舌片，所述舌片在尺寸上设置为可密封地关闭所述顶表面的开口，所述舌片还具有大于或等于所述插管体积的体积；

其中，所述舌片放置到所述顶表面的开口中以可密封地关闭所述开口，从而对所述内部管瓶容积进行加压。

2.根据权利要求1所述的中空管瓶，其特征在于，还包括可移除的底盖，其在尺寸和形状上设置为相对于外部环境可操作地密封所述插管的第二端。

3.根据权利要求2所述的中空管瓶，其特征在于，所述底盖的移除会造成加压流体被迫进入所述插管中。

4.根据权利要求3所述的中空管瓶，其特征在于，所述舌片体积大于所述插管体积，并且所述底盖的移除容许流体从所述插管中流出。

5.根据权利要求3所述的中空管瓶，其特征在于，所述管瓶本体还包含一定体积的空气，并且所述舌片具有足以使所述空气压缩20-80%的体积。

6.根据权利要求5所述的中空管瓶，其特征在于，所述舌片具有足以将所述空气压缩50%的体积。

7.根据权利要求4所述的中空管瓶，其特征在于，所述底盖设置为用于捕获所流出的流体。

8.根据权利要求1所述的中空管瓶，其特征在于，还包括过滤器，其定位在所述管瓶本体的底表面附近，所述过滤器设置为用于当流体传送到所述插管中时过滤流体。

9.根据权利要求8所述的中空管瓶，其特征在于，所述过滤器具有在1μm至10μm之间的孔径。

10.根据权利要求8所述的中空管瓶，其特征在于，所述过滤器具有的孔径的直径足以容许真菌、病毒、原生动物和/或细菌微生物穿过它而进入所述插管中，但足够小以捕获较大的颗粒物质。

11.根据权利要求8所述的中空管瓶，其特征在于，所述过滤器具有至少60μm的孔径。

12.根据权利要求8所述的中空管瓶，其特征在于，所述过滤器具有至少80μm的孔径。

13.根据权利要求8所述的中空管瓶，其特征在于，所述管瓶缺乏柱塞。

14.一种中空管瓶，包括：

管瓶本体，其具有相对于外部环境被一个或多个外壁密封的内部管瓶容积，

插管，其从所述管瓶本体的底表面延伸，并具有第一端和第二端，所述第一端和第二端被外表面连接起来，并限定内部插管体积，所述第一端与所述内部管瓶容积处于流体连通，

可移除的底盖，其具有第一端，所述底盖的第一端在尺寸和形状上设置为当所述底盖固定到所述插管的第二端上时，相对于外部环境可移除地密封所述插管的第二端，

其中设置在所述内部管瓶容积中的流体处于压力下，并且所述底盖的移除使所述插管的第二端暴露于外部环境中，从而迫使流体穿过所述插管；

所述管瓶本体还包括开口和具有舌片的盖，其中借助于通过所述开口放置所述舌片来相对于外部环境密封所述内部管瓶容积和对所述内部管瓶容积加压。

15.根据权利要求14所述的中空管瓶，其特征在于，所述底盖具有与所述底盖的第一端相对的第二端，所述底盖的第二端在尺寸和形状上设置为与相对应的移除容座对接。

16.根据权利要求15所述的中空管瓶，其特征在于，所述底盖设有擦拭器，所述擦拭器设置为用于将来自所述插管的滴液保持在所述底盖中。

17.根据权利要求14所述的中空管瓶，其特征在于，所述流体是水合流体。

18.根据权利要求14所述的中空管瓶，其特征在于，所述中空管瓶不包含柱塞。

19.一种容器装填站，包括：

槽，其设置为用于接收所述容器，

一个或多个容座，各个容座设置为用于接收根据权利要求1-18中任一项所述的中空管瓶，其中各个容座在形状上设置为与所述中空管瓶的相应的底盖的形状相匹配，从而有助于所述底盖的移除。

20.根据权利要求19所述的容器装填站，其特征在于，包括至少两个容座，其中第一容座在尺寸和形状上设置为用于接收第一底盖，并且第二容座在尺寸和形状上设置为用于接收第二底盖。

21.根据权利要求20所述的容器装填站，其特征在于，所述第一底盖在尺寸或形状上设置为不同于所述第二底盖。

22.根据权利要求20所述的容器装填站，其特征在于，所述第一底盖设有第一数量的第一尺寸的鳍片，并且所述第二底盖设有第二数量的第二尺寸的鳍片，其中所述第一数量大于所述第二数量，并且所述第一尺寸小于所述第二尺寸。

23.根据权利要求19所述的容器装填站，其特征在于，各个中空管瓶缺乏柱塞。

24.一种用于对流体系统进行装填的方法，包括：

提供根据权利要求1-18中任一项所述的中空管瓶，

开启所述插管的第二端，由此所述管瓶本体中的压力迫使流体进入所述插管中，

将所述插管的第二端放置到所述流体系统中，由此使所述流体系统处于真空下，且

容许真空从所述中空管瓶中抽吸流体，其中所述流体还由于所述管瓶本体中的气体的膨胀而被驱动穿过所述插管并进入所述流体系统中。

25.根据权利要求24所述的方法，其特征在于，一旦压力差从所述中空管瓶抽吸出流体，那么所述中空管瓶经历负压力，并且所述负压力使已经从所述中空管瓶抽吸出的流体脱气。

26.根据权利要求24所述的方法，其特征在于，还包括从所述流体系统移除所述插管的第二端。

27.根据权利要求26所述的方法，其特征在于，所述移除步骤从所述流体系统中抽吸出空气气泡。

28.根据权利要求24所述的方法，其特征在于，所述气体是空气。

29.根据权利要求24所述的方法，其特征在于，所述管瓶本体还包括过滤器，其设置为用于在流体进入所述插管之前过滤流体。

30.根据权利要求29所述的方法，其特征在于，所述过滤器具有的孔径足够大以容许原生动物通过，但足够小以捕获较大的颗粒物质。