FR2929802A1 - Utilisation de bacillus thuringiensis et sphaericus pour stimuler la production des composes phenoliques - Google Patents

Abstract

L'invention concerne l'utilisation des bactéries ou des protéines de Bacillus thuringiensis var kurstaki de Barjac et Lemille (sérotype 3a et 3b) déposé à l'ATCC sous le N° 33679 ; de Bacillus thuringiensis var israelensis de Barjac (sérotype H14) déposé à l'ATCC sous le N° 35646 ; de Bacillus sphaericus déposé à l'ATCC sous le N° 10208, comme stimulateurs de la production des composés phénoliques à propriétés organoleptiques et des défenses naturelles des plantes entières contre les pathogènes des cultures des types fongiques et/ou bactériens et/ou viraux, par application foliaire, racinaire ou par injection.

Description

-1- UTILISATION DE BACILLUS THURINGIENSIS ET SPHAER/CUS POUR STIMULER LA PRODUCTION DES COMPOSES PHENOLIQUES DESCRIPTION DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention concerne une nouvelle utilisation de bactéries, de protéines (delta-endotoxines) ou de peptides issus de souches de Bacillus thuringiensis var kurstaki (Btk), Bacillus thuringiensis var israelensis (Bti) et Bacillus sphaericus (Bsph) comme stimulateurs de la production des composés phénoliques à propriétés organoleptiques, par application foliaire, racinaire ou par injection, notamment chez la vigne. Elle concerne également le procédé d'obtention desdits composants, la composition qui les incorpore et son utilisation.

ARRIERE PLAN TECHNOLOGIQUE Les composés phénoliques sont étudiés sous l'angle oenologique, comme des supports d'arôme et de couleur, et participant à la structure du vin. Les recherches menées au cours des dernières années ont démontré que les polyphénols sont aussi de puissants antioxydants, permettant à l'organisme de lutter contre les agressions de l'oxygène, en particulier contre les radicaux libres oxygénés, qui sont à l'origine d'un grand nombre de maladies (cardiovasculaires, cancers, problèmes inflammatoires ou arthrite rhumatoïde). Les composés phénoliques du vin présentent de nombreuses propriétés : -les anthocyanes, pigments rouges sont responsables de la couleur des vins, -les tanins sont responsables des propriétés gustatives qui donnent au vin ses caractéristiques d'astringence (Bate Smith ,1954 ; Haslam, 1980). Ils sont extraits au cours de la fermentation et de la macération (Freitas, 1995). Dans les vins, ces composés phénoliques sont en constante évolution au cours de la vinification, de l'élevage et du vieillissement (Peyron et al, 1994). La teneur globale de ces substances mais aussi leur structure dans les grains leur confère une aptitude à l'extraction (dénommé extractibilité ) lors de leur passage dans le vin. Ainsi dans les vins de Bordeaux qui ont pour vocation à être gardés , les polyphénols jouent un rôle très important. De même pour les anthocyanes dans les vins de Bourgogne issus de variétés Pinot Noir, faiblement producteurs de couleur.

Toutes méthodes capables de favoriser la production de ces composés dans la vigne sont donc importantes et dignes d'intérêt économique. Il a été démontré dans la littérature scientifique que plusieurs substances de nature et de structures chimiques diverses possèdent la propriété cle stimuler la production de composés phénoliques à propriétés organoleptiques. On peut notamment citer les sucres tels que les laminarines issues d'algues, les phosphites issus de synthèse organiques, les lipides tels que la lipoxyline et les acides aminés non naturels tels que l'Aib, le Gaba, etc Par ailleurs, les bactéries de l'espèce Bacillus thuringiensis (Bt) sont maintenant bien connues pour les toxines insecticides qu'elles produisent et pour leurs utilisations. Les principales composantes de cette activité sont attribuées aux delta-endotoxines suivantes : les protéines du cristal (Cry) et les toxines cytolytiques (Cyt).

Le Brevet FR2879402 (B2B) fait état des propriétés élicitrices des trois bactéries Btk, Bti et Bsph et deux de leurs delta-endotoxines. Dans la présente invention les revendications portent non plus sur des actions stimulatrices des défenses naturelles des plantes, mais sur leurs propriétés à stimuler la production des composés phénoliques ayant des propriétés organoleptiques intéressantes.

RESUME DE L'INVENTION La particularité de l'invention réside à la fois dans le mode et le mécanisme d'action des souches de Bacillus thuringiensis var kurstaki (Btk), Bacillus thuringiensis var israelensis (Bti) et Bacillus sphaericus (Bsph) et / ou de protéines issues de ces bactéries ainsi que dans leur actions physiologiques sur les plantes.

En effet, selon l'invention, il ne s'agit plus ici d'utiliser les bactéries, les protéines ou peptides de Bacillus thuringiensis var kurstaki (Btk), Bacillus thuringiensis var israelensis (Bti) et Bacillus sphaericus (Bsph) pour leurs propriétés fongicides ou stimulatrices des défenses naturelles des plantes entières mais pour leur capacité à accroître la production de composés phénoliques à propriétés organoleptiques, et notamment sur la vigne. La spécificité de l'invention repose sur l'utilisation : - des bactéries, des protéines ou des peptides issus du clone Bacillus thuringiensis var kurstaki de Barjac et Lemille (sérotype 3a et 3b) déposé à I'ATCC (American Type Cultur Collection) sous le numéro 33679, - des bactéries, des protéines ou des peptides issus du clone Bacillus thuringiensis var israelensis de Barjac (sérotype H14), déposé à I'ATCC sous le numéro 35646, - des bactéries , des protéines ou des peptides du clone Bacillus sphaericus Meyer and Neide, déposé à I'ATCC sous le numéro 10208. La présente invention a donc pour objet un procédé de stimulation de la production de composés phénoliques à propriétés organoleptiques.

Selon l'invention, l'utilisation de ces composés est essentiellement destinée à la viticulture, à l'arboriculture et au maraîchage mais pourrait s'appliquer à d'autres végétaux notamment les grandes cultures. Le procédé selon l'invention est en outre caractérisé en ce que : - les bactéries, les protéines ou les peptides sont incorporées à un véhicule autorisé en agriculture de type mouillant et pénétrant ; - la composition se présente sous la forme liquide, notamment sous la forme de solution aqueuse ; - la composition se présente sous la forme solide, notamment sous la forme de poudres, granulés ou en enrobage de semences. La composition obtenue est utilisée par application foliaire, racinaire ou par injection, pour accroître la concentration des composés phénoliques à propriétés organoleptiques. Le procédé selon l'invention est également caractérisé en ce que l'application desdits composés est réalisée avec une fréquence de 10 à 15 jours, cas le plus courant en agriculture. En utilisant la présente invention, la concentration des composés phénoliques à propriétés organoleptiques est accrue et plus particulièrement des phytoalexines telles que le resvératrol (trans-3,5,4-trihydroxystilbène) ainsi que les anthocyanidines (3-0-(3 monoglucosides) dans le cas de la vigne. On peut aussi signaler les propriétés intéressantes des composés phénoliques, tels que les propriétés anti-oxydantes et oenologiques. En effet, les anthocyanes sont responsable de la couleur rouge du vin et les tanins de l'astringence et de la charpente de ces derniers.

Un repérage qualitatif des phytoalexines peut être effectué directement dans tout ou partie d'organismes par observation sous UV. En effet, le resvératrol possède une absorbance maximale à 308 nm et fluoresce en bleu sous cette longueur d'onde (Jeandet et al, 1997). De plus, la production de phytoalexines (stilbènes) peut être quantifié par des analyses HPLC en phase inverse.

Une illustration plus détaillée de l'invention est présentée à l'aide des exemples suivants qui ne sont en aucun cas destinés à limiter le cadre de cette invention. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION Exemple 1 : Obtention des bactéries de Bacillus thuringiensis var kurstaki (Btk), Bacillus thuringiensis var israelensis (Bti) et Bacillus sphaericus (Bsph) ainsi que des protéines et peptides.

Le procédé optimisé d'obtention de bactéries, de protéines ou de peptides de Bacillus thuringiensis var kurstaki (Btk), Bacillus thuringiensis var israelensis (Bti) et Bacillus sphaericus (Bsph) selon l'invention comprend les étapes suivantes : a) une phase de culture bactérienne consistant : - à utiliser comme milieu de culture, le milieu relativement simple (MS) dont la composition est la suivante : KH2PO4 (2,5 g/I) ; K2HPO4(2,5 g/I) ; (NH4)2HPO4 (lg/l) ; MgSO4, 7H2O (0,2 g/I); MnSO4, 7H2O (7 mg/I) ; Fe(SO4), 7H2O (0,01 g/I), CaCl2 (10 mg/I); à ajouter à cette solution saline standard, 1% (p/v) de D-glucose et à ajuster le pH à 7; - à stériliser ledit milieu par autoclavage à 120°C pendant 20 minutes ; - à mettre en culture en ensemençant une pré culture de bactéries en milieu MS pendant 15 heures à 30°C sous agitation ; - à placer les fioles contenant les bactéries en cultures à 37°C sous agitation rotative douce (150 rpm) pendant 5 à 7 jours ; b) une phase de séparation des bactéries et des protéines, réalisée à 4°C, consistant : - à centrifuger à 4500 rpm, pendant 30 minutes, le contenu de chaque fiole ; - à reprendre le culot dans NaCl 1M, lavé deux fois à l'eau distillée contenant 1 mM de phenylmethylsulfonyl fluoride et 10 mM EDTA puis resuspendu dans un volume d'eau déminéralisée ; - à purifier la partie protéique sur un gradient discontinu de sucrose selon la méthode de Thomas et Ellar (1983) [ultracentrifugation à 25 000 rpm et 48°C pendant 16 heures], la concentration en protéines étant déterminée par la méthode de Bradford après solubilisation alcaline de l'extrait et électrophorèse en conditions dénaturantes (SDS-PAGE) pour la détection des protéines selon la méthode déjà décrites par Thomas et Ellar (1983). Exemple 2 : Induction par Btk de la surexpression du gène STS (Stilbène Synthase) dans des cultures cellulaires de vigne. Des cultures cellulaires de V. vinifera L. cv. Chardonnay ont été obtenues à partir de cals matures placés dans un milieu Murashing et Skoog (MS) et agitées pendant 5 à 7 jours à 110 rpm, à l'obscurité, à 23°C et sous une hygrométrie de 35%. Les cellules sont dès lors en phase exponentielle et sont ensuite filtrées sur un filtre métallique (60 mesh = maillage de 50 m). Le repiquage des suspensions est effectué tous les 7 jours pendant la phase exponentielle dans du milieu MS frais.

Une culture cellulaire en phase de croissance exponentielle (5 à 7 jours) a été aliquotée par 20 mL dans des Erlenmeyers stériles de 150 mL. Parallèlement, une culture bactérienne fraîche en croissance exponentielle a été centrifugée 10 min à 4000 g, le culot de bactéries a été re-suspendu et ajusté à la concentration désirée dans du MgCl2 (10 mM). La suspension de bactéries a alors été dosée au spectrophotomètre, une D.O. de 0,1 à 600 nm correspondant à une concentration de 10' bactéries/mL. Ensuite, quelques soient les modalités, ce sont 200 pL de culture bactérienne qui ont été inoculés dans les cultures cellulaires. Le témoin a été réalisé par inoculation de 200 L de MgCl2 10 mM.

Les cultures cellulaires ont été broyées dans l'azote liquide et séparées en aliquots de 100 mg et les ARN ont été extraits selon le protocole Extract (Eurobio). Les PCR quantitatives ont été réalisées en suivant le kit et le protocole AbsoluteTM Max 2-step QRT-PCR SYBR Green (ABgene) et selon Bézier et al., 2002. L'étude a porté sur le gène déjà identifié chez Vitis vinifera L. lors d'une stimulation des polyphénols à savoir le gène STS (Stilbène Synthase). Tableau N°1 : Surexpression du gène de la Stilbène Synthase dans les cultures cellulaires de vigne. Gène Facteur d'induction par Btk MgCl2 3 STS 67 L'expression de STS est largement stimulée par Btk (plus de 20%), en comparaison avec les plants témoins (inoculés au MgCl2).

Exemple 3 : Induction par Btk de la surexpression du gène STS (Stilbène Synthase) dans des feuilles de vitroplants. Des plantules de Vitis vinifera L. cv. Chardonnay sont obtenues selon Martin et al., 1987 et Derckel et al., 1999. Les infections sur feuilles ont été faites par infiltrations. Ces feuilles ont été placées dans des pots en verre contenant 20 mL de MgCl2 (10 mM) avec 0,05% de Silwet (adjuvant) et 200 L de solution bactérienne à 10' bactéries/mL ou 200 L de MgCl2 (10 mM) pour le témoin. Deux témoins sont réalisés : témoin MgCl2 et témoin Escherichia coli, Ec (107bactéries/mL). Pour étudier par RT-qPCR l'expression de la STS dans les feuilles de vitroplants infectées, celles-ci ont été mises en survie. Pour cela elles ont été placées dans des boîtes de Pétri, la face supérieure sur du papier Whatman imbibé d'eau (Bézier et al., 2002). Le tout a été placé dans une chambre de culture à 26°C sous lumière blanche 200 mmol.m-2.s"' (néon de type TLD 36W/86S et grolux), avec une photopériode de 16/8 h, et une hygrométrie de 85%. Les prélèvements ont été réalisés 0 h, 24 h et 48h après infection et congelés dans de l'azote liquide. Les feuilles ont été broyées dans l'azote liquide et séparées en aliquots de 100 mg et les ARN extraits selon le protocole Plant RNA reagent (Irivitrogen). Les facteurs d'induction sont donnés en fonction de l'expression de STS chez la plante non traitée, à 24 et 48 heures post inoculation (hpi). Tableau N°2 : Surexpression du gène STS dans les feuilles de vigne. Facteur d'induction de STS Inoculum 24hpi 48hpi Témoin 1 (MgCl2) 8 4 Témoin 2 (Escherichia col!) 17 11 Bacillus thuringiensis kurstaki 35 16 L'infection par Btk induit une surexpression marquée du gène STS, supérieure à celle engendrée par les témoins bactéries (E. coli) à 24hpi comme à 48 hpi. Btk augmente donc chez la plante la production de Stilbène Synthase qui permettrait une meilleure production de polyphénols. Exemple 4a : Induction par Btk de la production de resvératrol dans les cultures cellulaires de vigne.

On a utilisé les mêmes cultures cellulaires, le même mode d'infection par Btk et les mêmes témoins que dans l'exemple 1. Après inoculation, ces cellules ont été observées sous UV pour détecter du resvératrol, dont la longueur d'onde d'absorbance maximale est 308nm (Jeandet et al., 1997). La fluorescence bleue observée avec les traitements Btk et Ec, comparés au témoin MgCl2, confirme que Btk et Ec induisent chez la plante une surproduction de resvératrol. Exemple 4b : Induction par les protéines isolées de Btk, et plus particulièrement Cry, de la production de resvératrol dans les cultures cellulaires de vigne. L'extraction des protéines Cry est réalisée par centrifugation de 800 mL de cultures bactériennes à 10000g, pendant 10 min. Le culot est repris dans du NaCl 1M, vortexé, et centrifugé pendant 10 min, à 10000g. Cette étape est répétée deux fois et le culot lavé 3 fois avec de l'eau purifié. Le culot est ensuite repris dans un 7 minimum de H20 purifié pour être déposé sur un gradient de saccharose (5mL 60% ; 3 mL 40% ; 5mL 30% ; 5mL 10%) et centrifugé pendant 30 min à 4500g. On prélève l'échantillon présent à l'interface 60%140%. La même extraction réalisée sur une culture d'E. coli nous servira de témoin Cry négatif. La présence de Cry pour Btk ou l'absence pour Ec dans les extraits obtenus par cette séparation a été estimée grâce au kit de détection fournit par Biofords. Les modalités testées sont : Cry ; Cry traitées à 100°C, Ec, Ec traitées à 100°C, saccharose à 60%. On inocule 5 mL de chacun des extraits ou de saccharose 60% pour 20 mL de cultures cellulaires.

Le prélèvement et la quantification du resvératrol se font comme suit : 5 mL de cultures sont prélevés Ohpi (heure post inoculation), 24hpi, 48hpi, 72hpi, 96hpi. Le milieu est séparé des cellules par filtration sous vide. Le milieu est lavé par deux volumes d'acétate d'éthyle. La phase acétate d'éthyle est mise à évaporer au rotavapor. L'extrait obtenu est récupéré par 1 mL de méthanol et sera analysé par HPLC en phase inverse afin de détecter et quantifier les stilbènes (Jeandet et al., 1997). Les stilbènes ont étés élués par un gradient linéaire d'acétonitrile variant de 10% (v/v) d'acétonitrile à 0 min, 85% (v/v) d'acétonitrile à 18 min, 85% (vlv) d'acétonitrile à 23 min, 10% (v/v) d'acétonitrile à 28 min et 10% (v/v) d'acétonitrile à 35 min.

L'acétonitrile et l'eau ont été filtrés sur une membrane de 0,45 m et dégazés sous vide. Le système utilisé comprend un contrôleur de gradient (modèle Waters 600), un injecteur automatique (modèle Waters 717 plus), un détecteur UV/visible à double longueur d'onde (modèle Waters 490E) et une colonne (250 mm x 4 mm, 5 m) en phase inverse Lichocart Merck C18 (Merck Clevenot Corp., Darmstadt, Germany). La colonne a été équilibrée 5 min avec 10% d'acétonitrile (10% v/v) avant le passage de l'échantillon. Le débit d'éluant a été de 1 mL/min. L'identification des stilbènes a été faite par comparaison des temps de rétention du standard (trans-resvératrol, Sigma) et des composés des échantillons à une longueur d'onde de 308 nm, qui correspond à la longueur d'onde maximale d'absorbation des stilbènes (Jeandet et al., 1997). La quantification a été faite par comparaison de l'aire des pics des composés élués avec l'aire des pics obtenus après avoir réalisé une gamme étalon de trans-resvératrol sur la colonne (2, 10, 20, 50, 100, 200 ng.mL-1) (Jeandet et al., 1997).

Tableau N°3: Quantité de trans-resvératrol produit par des cultures de vignes élicitées (exprimées en mg.L-1 de mileu de culture). Ohpi 24hpi 48hpi 72hpi 96hpi Cry 0 0 0 0 42,728 Cry 100°C 0 0 0,156 0,07 0,286 Ec 0 0 0 0 0 Ec 100°C 0 0 0 0 0 Saccharose 0 0 0 0 0 La production de resvératrol est optimale dans les cultures cellulaires au bout de 96hpi après inoculation avec Cry. Les témoins Ec, Ec 100°C nous montre que la stimulation de la production de polyphénols est spécifique de Btk et non dû à la présence de bactéries ou de motifs bactériens. Le témoin Cry 100°C conforte l'idée que cette molécule serait d'origine protéique, puisque celle-ci est complètement dénaturée à 100°C. Le témoin saccharose nous montre que c'est bien l'extrait contenu dans le gradient de saccharose et non le saccharose lui même qui stimule la production de polyphénols. Exemple 5 : Induction par Btk de la production de resvératrol dans les feuilles de vigne. Des feuilles de boutures végétatives obtenus à partir de sarments ont été infiltrées avec les cultures bactériennes à 107 bactéries/mL de Btk, Ec et MgCl2, puis pesées et broyées dans un mortier contenant du sable de Fontainebleau. Les différents extraits ont été repris dans du méthanol et ont ensuite été évaporés sous vide à 40°C au rotavapor. Le culot a été resuspendu dans du méthanol à raison de 20 mL de méthanol par mg.MF-1. La conservation de ces extraits a été faite sous vide par un gaz inerte, ici l'azote, à 4°C et à l'abri de la lumière. Une Chromatographie sur Couche Mince (CCM) a été réalisée sur plaque de silice avec du tampon de migration composé de chloroforme : acétate d'éthyle : acide formique dans les proportions 5:4:1. Les extraits méthanoliques de feuilles de vigne 24h après traitement Btk, Ec, MgCl2 ont été analysés par HPLC en phase inverse afin de détecter et quantifier les stilbènes (Jeandet et al., 1997).

Tableau N°4 : Quantité de trans-resvératrol dans des feuilles de vignes infectées. Traitement Quantité de trans-resvératrol (pglg de matière fraîche) Témoin (MgCl2) 12.8 Infection par Escherichia coli 134.4 Infection par Bacillus thuringiensis kurstaki 314.7 La CCM et l'HPLC ont permis de mettre en évidence la présence de polyphenols, et plus précisément de trans-resvératrol dans les traitements Btk et Ec. L'observation sous UV de la CCM confirme de façon qualitative la présence de polyphénols dans les traitements Btk et Ec. Les résultats de l'HPLC, indiquent que la quantité de trans-resveratrol est significativement supérieure dans le traitement Btk. Ces résultats valident la forte stimulation de la production de polyphénols, en l'occurrence le trans-resvératrol, chez les plantes infectées par Btk, en comparaison avec les témoins.

Exemple 6 : Induction par Btk de la production de polyphénols dans les baies de vigne en plein champs_ Une expérimentation agronomique en pleine vigne dans la région de St Emilion est réalisée sur le cépage Merlot de porte-greffe 161-49C. Le dispositif est celui des Blocs de Fisher à 4 répétitions.

Chaque parcelle élémentaire est constituée de 10 souches selon la ligne des rangs, un témoin non traité est inclus dans le dispositif. Les produits sont appliqués à l'atomiseur à dos (Sthil SR 400) en face par face, avec un débit théorique de 150 L/ha. Du stade grappes séparées au stade grappes fermées , 5 applications tous les 15 jours sont réalisées à partir d'une solution bactériennes en Btk à la concentration 107 bactéries/mL. Trois contrôles de maturité ont été effectués pour la modalité traitée avec la spécialité Btk seule ainsi que pour le témoin non traité. Ces contrôles ont été effectués en suivant le protocole CASV de la Chambre d'Agriculture de la Gironde. Les résultats d'analyses sont présentés dans le tableau suivant. - 10- Tableau n°5. Analyses de maturité (IPT et anthocyanes) des les baies de vigne. Contrôle 1 (6 sept.) Contrôle 2 (13 sept.) Contrôle 3 (20 sept.) Modalités IPT Anthocyanes IPT Anthocyanes IPT Anthocyanes Témoin non traité 16 192 16 199 16 232 Bacillus 19 242 19 251 19 246 thuringiensis kurstaki IPT = Indice de polyphénols totaux Anthocyanes : exprimées en mg/L Nous observons un niveau de maturité technologique supérieur pour la modalité traitée avec Btk par rapport au témoin non traité. Sur le plan phénolique (IPT), nous observons une richesse supérieure en anthocyanes et en polyphénols pour la modalité traitée avec Btk par rapport au témoin non traité. En début de maturation (cf. contrôle 1), la modalité traitée avec Btk présente un potentiel d'anthocyanes significativement supérieur au témoin non traité. Par contre, en fin de maturité (cf. contrôle 3), les écarts sont plus faibles et les 2 modalités ont des richesses en anthocyanes comparables. Ainsi, il semble donc que les traitements avec la spécialité Btk engendrent une précocité du début de maturation des raisins. Globalement, la modalité traitée avec Btk présente des maturités phénoliques et technologiques plus importantes que le témoin non traité, avec un potentiel polyphénolique supérieur.

Claims (10)

1. REVENDICATIONS1- Utilisation de bactéries, de protéines ou de peptides issus du clone Bacillus thuringiensis var kurstaki de Barjac et Lemille (sérotype 3a et 3b), déposé à la collection ATCC sous le numéro 33679, comme stimulateur de la production des composés phénoliques à propriétés organoleptiques.
2. 2- Utilisation de bactéries, de protéines ou de peptides issus du clone Bacillus thuringiensis var israelensis de Barjac (sérotype H14), déposé à la collection ATCC sous le numéro 35646, comme stimulateur de la production des composés phénoliques à propriétés organoleptiques.
3. 3- Utilisation de bactéries, de protéines ou de peptides du clone de Bacillus sphaericus Meyer and Neide, déposé à I'ATCC sous le numéro 10208, comme stimulateur de la production des composés phénoliques à propriétés organoleptiques.
4. 4- Procédé d'obtention d'une composition contenant des bactéries, des protéines ou des peptides, tels que définis dans l'une des revendications 1, 2 ou 3, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) une phase de culture bactérienne consistant : - à utiliser comme milieu de culture, le milieu relativement simple (MS) dont la composition est la suivante : KH2PO4 (2,5 g/I) ; K2HPO4(2,5 g/I) ; (NH4)2HPO4 (1g/l) ; MgSO4, 7H20 (0,2 g/l); MnSO4, 7H20 (7 mg/I) ; Fe(SO4), 7H20 (0,01 g/I), CaCl2 (10 mg/1); à ajouter à cette solution saline standard, 1% (p/v) de D-glucose et à ajuster le pH à 7; - à stériliser ledit milieu par autoclavage à 120°C pendant 20 minutes ; - à mettre en culture en ensemençant une pré culture de bactéries en milieu MS pendant 15 heures à 30°C sous agitation ; - à placer les fioles contenant les bactéries en cultures à 37°C sous agitation rotative douce (150 rpm) pendant 5 à 7 jours ; b) une phase de séparation des bactéries et des protéines, réalisée à 4°C, consistant : - à centrifuger à 4500 rpm, pendant 30 minutes, le contenu de chaque fiole ; - à reprendre le culot dans NaCl 1M, lavé deux fois à l'eau distillée contenant 1 mM de phenylmethylsulfonyl fluoride et 10 mM EDTA puis resuspendu dans un volume d'eau déminéralisée ; - à purifier la partie protéique sur un gradient discontinu de sucrose selon la méthode de Thomas et Ellar (1983) [ultracentrifugation à 25 000 rpm et 48°C pendant 16 heures], la concentration en protéines étant déterminée par la méthode- 12 - de Bradford après solubilisation alcaline de l'extrait et électrophorèse en conditions dénaturantes (SDS-PAGE) pour la détection des protéines selon la méthode déjà décrites par Thomas et Ellar (1983).
5. 5- Composition, telle qu'obtenue selon le procédé tel que défini à la revendication 4, caractérisée en ce que les bactéries, les protéines ou les peptides ainsi obtenus sont incorporés à un véhicule autorisé en agriculture de type mouillant et pénétrant.
6. 6- Composition, selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle se présente sous la forme liquide, notamment sous la forme de solution aqueuse.
7. 7- Composition, selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle se présente sous la forme solide, notamment sous la forme de poudres, granulés ou en enrobage de semences.
8. 8- Utilisation de la composition, selon la revendication 5, 6 ou 7, par application foliaire, racinaire ou par injection.
9. 9- Utilisation de la composition, selon la revendication 8, pour stimuler la production de composés phénoliques à propriétés organoleptiques.
10. 10- Utilisation de la composition, selon la revendication 8, pour accroître la production des composés phénoliques à propriétés organoleptiques suivants : - lorsqu'elle est appliquée à la tomate, l'acide chlorogénique, la tomatine et l'acide caféique ; - lorsqu'elle est appliquée à la pomme, l'épicatéchine et la procyanidine ; - lorsqu'elle est appliquée au blé, la catéchol et la L-DOPA ; - lorsqu'elle est appliquée aux feuilles de thé, la caféine et la théine ; - lorsqu'elle est appliquée au cacao, la catéchine.