FR2927075A1 - Molecules comprenant un squelette bis-(heteroaryl)maleimide, et leur utilisation dans l'inhibition d'enzymes - Google Patents

Abstract

L'invention concerne des molécules possédant une structure bis-(hétéroaryl)maléimide, et présentant des caractéristiques inhibitrices d'enzymes à poche catalytique comprenant des acides aminés invariants D, D et E ou D, D et D, telles que les transposases, les recombinases RAG ou les intégrases rétrovirales.L'invention concerne également l'utilisation de ces molécules pour l'inhibition in vitro, ex vivo ou in vivo de transposases, de recombinases RAG et d'intégrases rétrovirales, telles que l'intégrase du virus VIH, ainsi que l'utilisation de ces molécules dans le traitement des pathologies associées à ces enzymes chez un hôte animal ou humain, en particulier dans le traitement du SIDA.

Description

MOLECULES COMPRENANT UN SQUELETTE BIS-(HETEROARYL) MALEIMIDE, ET LEUR UTILISATION DANS L'INHIBITION D'ENZYMES DDEIDDD.

DOMAINE TECHNIQUE [001] L'invention concerne le domaine des inhibiteurs d'enzymes à poche catalytique comprenant des acides aminés invariants D, D et E ou D, D et D, telles que les transposases ou les intégrases rétrovirales, ainsi que l'utilisation de ces inhibiteurs dans des tests in vitro, ou dans le traitement des pathologies associées à ces enzymes chez un hôte animal ou humain. L'invention se rapporte également à un système de criblage de tels inhibiteurs, en particulier in vitro dans des cellules eucaryotes.

ART ANTERIEUR [002] Les transposases et les intégrases rétrovirales sont des enzymes qui favorisent le déplacement de segments d'ADN au sein d'un même génome ou entre des génomes. Ces enzymes, bien qu'elles proviennent d'organismes différents, possèdent des domaines catalytiques structurellement similaires. Ainsi, des études cristallographiques ont montré qu'en dépit de l'absence de similitude de leurs séquences polypeptidiques, la structure du coeur (ou poche) catalytique, notamment l'emplacement d'une triade de résidus DDE/D invariants, est largement superposable pour au moins trois transposases (MuA, Tn5 et MOS1) (10, 12) et au moins deux intégrases (VIH-1 et ASV) (12, 13). Dans toutes ces enzymes, le rôle de la triade catalytique est de faciliter la catalyse en coordonnant les ions métalliques nécessaires à celle-ci. II a d'ailleurs été récemment démontré que la transposase Tn5 peut être utilisée pour identifier des inhibiteurs de l'intégrase du VIH-1 (14, 15). [003] Les transposons à ADN sont des éléments transposables de classe II qui correspondent à des segments d'ADN discrets qui sont naturellement susceptibles de se déplacer à l'intérieur des génomes (pour une synthèse, voir (1)). De plus, l'expérience a montré que certains d'entre eux présentent une grande capacité à se déplacer dans des espèces faiblement apparentées à l'hôte à l'intérieur duquel ils ont été initialement isolés. Ces propriétés ont permis de développer des outils basés sur des transposons pour la mutagenèse insertionnelle et la transgénèse germinale dans des organismes modèles, et potentiellement pour la thérapie génique. Les transposons Most (2), Himarl (3), Minos (4), PiggyBac (5), Sleeping Beauty (6) et To12 (7) ont été sélectionnés comme principaux candidats pour le développement de tels outils (transposons tools). [4] Most est un élément de 1286 pb, terminé par des répétitions inversées (ITR) de 28 pb. Mos1 contient un seul cadre de lecture ouvert codant pour MOS1 (une transposase de 345 acides aminés) et se déplace à l'intérieur du génome de ses hôtes par un mécanisme de type couper- coller. L'ensemble du mécanisme se compose de quatre étapes principales : [1 et 2] homodimérisation de MOS1, et assemblage du complexe synaptique, [3] excision de Most, et [4] reconnaissance de la cible et insertion de Most dans un nouveau locus (Figure 2). Cette activité repose sur une triade d'acides aminés, DD34D, qui chélatent les cations nécessaires à la catalyse (10). La transposase de Most appartient à la grande famille des enzymes DDE (11). Dans ce groupe, les transposases mariner constituent une exception, car elles comportent une triade DDD. [5] La compréhension de l'activité des transposases et le contrôle de l'efficacité de la transposition dans le cadre des transposon tools passent par l'identification de molécules capable d'inhiber l'activité de ces enzymes. Or, à ce jour, aucun de ces composés n'est disponible pour les transposases mariner. [6] L'intégrase rétrovirale (codée par le gène pol d'un rétrovirus) est une enzyme qui assure l'intégration du génome viral (rétrotranscrit sous forme d'un ADN double brin) dans le génome de la cellule infectée (ADN cible). En effet, l'intégrase assure deux fonctions enzymatiques dans le processus d'intégration : le clivage de l'ADN et le transfert de brin. Ainsi, l'intégrase (IN) reconnaît et fixe le site viral att situé à l'extrémité des LTR (long terminal repeat) rétroviraux, et catalyse l'excision de deux paires de base dans la partie 3' de ces LTR. Une fois clivé, l'ADN viral est importé, via un complexe protéines/ADN (PIC ou pre integration complex) dans le noyau de la cellule hôte, où l'intégrase clive alors l'ADN cible pour former des extrémités 5' libres qui sont liées aux parties 3' OH libres de l'ADN viral. Aucune spécificité, vis-à-vis de la séquence nucléotidique de l'ADN cible, où a lieu le clivage et l'intégration de l'ADN viral, n'a été identifiée. [007] Le domaine catalytique des intégrases rétrovirales contient la triade invariante de motif DD-35-E, comprenant respectivement les résidus D64, D116 et E152 dans le cas de l'intégrase de VIH-1 ou D64, D121 et E157 dans le cas du virus de sarcome de Roux (RSV). [008] Compte tenu de leur rôle dans les pathologies rétrovirales, la compréhension des mécanismes liés à l'activité des intégrases rétrovirales conduisant à l'intégration des rétrovirus dans les cellules infectées, qu'elles soient d'origine animale ou humaine, ainsi que l'identification de molécules capables d'inhiber in vivo, dans un but thérapeutique, reste une priorité de santé publique.

[009] II existe donc un réel besoin pour l'identification de molécules capables d'inhiber les transposases, mais également les intégrases rétrovirales. Ces molécules sont utilisables aussi bien pour la compréhension des mécanismes des étapes d'excision et d'intégration que dans le traitement des symptômes associés à l'infection d'animaux ou de patients par des rétrovirus. La recherche de ces molécules nécessite également la caractérisation d'un système de criblage d'inhibiteurs d'enzymes DDE/DDD capable de fonctionner aussi bien en milieu procaryote qu'en milieu eucaryote, afin de garantir que les molécules ainsi identifiées présentent des activités inhibitrices susceptibles d'être explorées en vue d'applications en thérapie.

DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION

[010] La présente invention vise des molécules qui ont en commun une structure bis-(hétéroaryl)maléimide et répondent à la formule I suivante : RI R2 ùAr' Àr2ùR3

[11] Au sein de la formule (I), le groupe R1 est choisi dans le 15 groupe contenant un hydrogène, un alkyle linéaire ou ramifié, un alkenyle, un alcynyle, un cycloalkyle, un héterocyclyl, un hétéroaryl, un héteroaralkyle, un héteroalkoxy, un carboxyle, un alkoxycarbonyle, un tétrazolyle, un acyle, un arylsulfonyl et un heteroarylsulfonyl. [12] Dans un mode de réalisation particulier, R' est H. 20 [013] Dans un autre mode de réalisation, RI est un groupement phényl, éventuellement substitué tel que le 4-hydroxyphényl. [014] Dans un autre mode de réalisation, R' a la formule suivante : COOEt 10 (I) 25 [015] Au sein de cette formule (I), le groupe R2 et le groupe R3 sont choisis, indépendamment l'un de l'autre, dans le groupe constitué d'un atome d'hydrogène, d'un acide carboxylique (de préférence Cl à C5), d'un 30 cyano, d'une oxime, d'un éther d'oxime, d'un tétrazole, d'un ester, d'un amide substitué ou non, d'un acide (de préférence Cl à C5), d'un diacide (de préférence Cl à C5), d'un acide cycloalkylcarboxylique (notamment C5 ou C6), d'un aryl substitué ou non, et d'un héteroaryl substitué ou non. [16] Dans un mode de réalisation particulier, R2 ou R3 est COOH. [17] Dans un autre mode de réalisation, R2 ou R3 est CH=CH- COH. [18] Au sein de cette formule (I), Ar' et Ar2, sont choisis, indépendamment l'un de l'autre, et sont constitués d'un cycloalkyle (C5 ou C6) substitué ou non, d'un héteroaryl substitué ou non, d'un aryl substitué ou non, d'un héteroalkyl linéaire ou ramifié. Le cycloalkyle peut également comporter un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi N, O et S. [19] Dans un mode de réalisation particulier, Ar' ou Ar2 est un furanne. [20] Dans le cadre de la présente demande, le terme substitué représente un halogène, un éther, un hydroxyl, une fonction carboxylique, un carboxamide, un ester, une cetone, un aryl, un héteroaryl, un alkyl linéaire ou ramifié, un cycloalkyl, une aminé ou une aminé substituée. [21] Il est explicitement exclu dans le cadre de la présente invention que les groupements R', et R2 et R3 soient ensemble un atome d'hydrogène (H) dans le composé de formule (I). [22] Dans un mode de réalisation particulier, R2 et R3 sont identiques, et la molécule selon l'invention possède la formule (la) suivante : dans laquelle R', R2, Ar' et Ar2 sont tels que définis ci-dessus.30 [023] Dans un mode de réalisation particulier, Ar' et Ar2 sont identiques et la molécule selon l'invention répond à la formule (lb) suivante : R' R2 ùAr' Ar' ùR3 dans laquelle R', R2, R3 et Ar' sont tels que définis ci-dessus. [024] Dans un autre mode de réalisation de l'invention, R2 et R3 d'une part, et Ar' et Ar2 d'autre part, sont identiques, et la molécule selon l'invention répond à la formule (Ic) suivante : R' R2 ùAr' Ar' ùR2 dans laquelle R', R2 et Ar' sont tels que définis ci-dessus. [025] Une molécule particulière de l'invention est une molécule dans laquelle Ar' et Ar2 sont un furanne, et qui possède la formule (II) suivante : R dans laquelle RI, R2 et R3 sont tels que définis ci-dessus. [026] Dans un mode de réalisation particulier, la molécule de formule (II) possède des groupements R2 et R3 identiques, et répond à la formule (Ila) suivante : dans laquelle RI et R2 sont tels que définis ci-dessus. [027] Les modes de réalisation particulier définis dans la présente demande, en particulier en relation avec la formule (I) s'appliquent également de la même façon aux formules (la), (lb), (Ic), (II) et (Ila).

15 [028] Dans un mode de réalisation particulier, la molécule de l'invention selon la formule (I), (la), (lb), (Ic), (II) ou (Ila) est N-substituée , c'est-à-dire que le groupement R', dans la définition donnée ci-dessus, est autre qu'un atome d'hydrogène. Dans ce cas, la nature des groupements R2 et R3 est choisie parmi les possibilités données ci-dessus. 20 [029] Dans un autre mode de réalisation, alternatif au précédent, la molécule de l'invention selon la formule (I) (la), (lb), (Ic), (Il) ou (Ila) n'est pas N-substituée (et est donc qualifiée de molécule non-N-substituée ), c'est-à-dire que le groupement RI est un atome d'hydrogène. Dans ce cas, les groupements R2 et R3 répondent, indépendamment l'un de l'autre, à 25 l'une des possibilités données ci-dessus, à l'exception de l'atome d'hydrogène (dans la mesure où RI, R2 et R3 ne peuvent être ensemble un atome d'hydrogène). [030] Un exemple de synthèse de molécules particulières selon l'invention est présenté à la Figure 11. Ainsi, la demande vise également 30 toute molécule répondant à la formule (I), et obtenue selon une synthèse similaire ou identique.10 [31] L'invention vise également les molécules, décrites dans la présente demande, sous forme de sels physiologiquement acceptables. Des exemples de sels physiologiquement acceptables incluent des sels basiques tels que des sels de métaux alcalins (par exemple sodium ou potassium) ou des sels de métaux alcalino-terreux (par exemple, calcium), des sels basiques organiques et des sels d'acides aminés. Les modes de réalisation définis ou illustrés par référence aux molécules (I), (la), (lb), (Ic), (Il) ou (Ila) s'appliquent également aux sels physiologiquement acceptables de ces molécules. [32] Les molécules de l'invention, répondant à la définition donnée ci-dessus, présentent des propriétés inhibitrices d'au moins une enzyme DDE/DDD, en particulier mesurées par une activité inhibitrice observée in vitro. Des modalités d'expériences permettant de vérifier l'activité inhibitrice des molécules de l'invention sur des enzymes DDE/DDD, en particulier sur des transposases et/ou des intégrases rétrovirales, sont données dans les exemples ci-dessus. [33] Par l'expression enzyme DDE/DDD , on entend dans le cadre de la présente demande, toute enzyme ayant une activité phosphatidyltransférase et qui possède un site enzymatique catalytique formé par les trois acides aminés D, D et E (enzyme DDE) ou D, D et D (enzyme DDD). Dans un mode de réalisation particulier, les enzymes DDE/DDD sont des enzymes qui favorisent le déplacement d'un segment d'ADN au sein d'un génome ou entre des génomes. Cette expression englobe les transposases (bactériennes ou eucaryotes) et/ou les intégrases rétrovirales et/ou les recombinases RAG. [34] Dans un mode de réalisation particulier, l'enzyme DDE/DDD est une transposase d'origine procaryote, en particulier d'origine bactérienne, telle que MuA, Tn5 et Tn10. Dans un autre mode de réalisation, l'enzyme DDE/DDD est une transposase d'origine eucaryote telle qu'une transposase de la famille des Tcl/mariner (dont un exemple est la transposase MOS1 ou la transposase Sleeping Beauty) ou une transposase de la famille hAT (dont un exemple est la transposase Hermes). [035] Dans un autre mode de réalisation de l'invention, l'enzyme DDE/DDD est une intégrase d'origine rétrovirale, en particulier une intégrase codée par le gène pol d'un retrovirus. Des rétrovirus, pouvant être ciblés par les molécules inhibitrices de l'intégrase de l'invention, appartiennent au genre Alpharetrovirus, Betaretrovirus, Gammaretrovirus, Deltaretrovirus, Lentivirus, et Spumavirus. [036] Des lentivirus particulièrement intéressants sont listés dans le tableau I suivant : Lentivirus Tableau I : liste de lentivirus [37] Dans un mode de réalisation particulier, l'intégrase rétrovirale 15 ciblée par les molécules de l'invention provient d'un rétrovirus à tropisme animal ou humain. [38] Dans un mode de réalisation particulier, l'intégrase rétrovirale ciblée par les molécules de l'invention provient d'un lentivirus à tropisme humain, tels que le virus VIH (Virus de l'Immunodéficience Humaine), en 20 particulier l'isolat VIH-1 et/ou l'isolat VIH-2 (rétrovirus cytopathogènes). [39] Des molécules particulières, inhibant l'activité enzymatique d'enzymes DDE/DDD, en particulier de transposases ou d'intégrases rétrovirales, sont les molécules ayant l'une des formules (III) à (VI) 25 suivantes : virus de l'immunodeficience humaine 1 [VIH-1] virus de I'immunodeficience humaine 2 [VIH-2] Simian immunodeficiency virus [SIV] Bovine immunodeficiency virus [BIV] Equine infectious anemia virus [EIAV] Feline immunodeficiency virus Caprine arthritis encephalitis virus [CAEV] Visna/maedi virus [VISNA] 10 H HOOC -O hl t! ~> COOH OH HOOC 10 15 COOH (V) et 20 25 OHC 30 [40] L'invention vise également une composition comprenant au moins une molécule telle que définie dans le cadre de la présente demande, et en particulier au moins une molécule répondant à la formule (I), (la), (lb), (Ic), (Il), (lia) ci-dessus, ou à l'une des formules (III) à (VI) ci- dessus. [41] Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la composition comprend au moins 2 molécules différentes choisies parmi les formules (I) à (VI). [42] Dans un mode de réalisation particulier, la composition est une composition thérapeutique ou pharmaceutique, c'est-à-dire qu'elle est adaptée à une administration chez un animal ou un patient. [43] Dans un mode de réalisation particulier, la composition de l'invention comprend également un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Par véhicule , on entend toute substance qui permet la formulation des molécules de l'invention au sein d'une composition. Dans un mode de réalisation particulier, le véhicule est une substance ou une combinaison de substances pharmaceutiquement acceptable(s), c'est-à-dire approprié pour l'utilisation de la composition en contact avec un être vivant (par exemple un animal, en particulier un mammifère non-humain, et par exemple un être humain), et est donc préférentiellement non toxique. De tels véhicules pharmaceutiquement acceptables sont par exemple de l'eau, une solution saline, des solvants miscibles dans l'eau, des sucres, des lieurs, des excipients, des pigments, des huiles végétales ou minérales, des polymères solubles dans l'eau, des agents tensio-actifs, des agents épaississants ou gélifiants, des agents cosmétiques, des agents conservateurs, des agents alcalinisants ou acidifiants .... [44] Dans un mode de réalisation particulier, la composition de l'invention, en plus de comprendre au moins une molécule de l'invention, et optionnellement un ou des véhicule(s) pharmaceutiquement acceptable(s), comprend en outre un composé additionnel biologiquement actif dans le traitement des symptômes liés à l'infection par un rétrovirus, en particulier un composé additionnel biologiquement actif dans le traitement des symptômes liés au Syndrome d'ImmunoDéficience Acquise (SIDA). Le terme additionnel indique dans le cadre de la présente composition, que le composé est différent des molécules définies dans la présente demande, en particulier différent d'une molécule répondant à la formule (I) ci-dessus. [45] A titre d'exemple de composé additionnel biologiquement actif dans le traitement des symptômes liés au Syndrome d'ImmunoDéficience Acquise, on citera (a) les inhibiteurs de protéases, (b) les inhibiteurs nucléosidiques de reverse transcriptase, (c) les inhibiteurs nonnucléosidiques de reverse transcriptase, (d) les inhibiteurs nucléotidiques de reverse transcriptase, (e) les inhibiteurs nucléotidiques et nucléosidiques, (f) les inhibiteurs d'intégrase et (g) les inhibiteurs de fusion et (h) les interleukines. [46] L'invention concerne également l'utilisation d'au moins une molécule décrite dans la présente demande pour inhiber in vitro l'activité des enzymes DDE/DDD, en particulier les transposases ou les intégrases rétrovirales. Par in vitro , on entend un test d'inhibition réalisé en dehors d'un organisme vivant entier, c'est-à-dire aussi bien un test réalisé en tube qu'un test réalisé sur culture de cellules procaryotes ou eucaryotes.

[47] L'invention concerne également une molécule ou une composition selon l'invention pour l'utilisation comme médicament. [048] Ainsi, on peut envisager l'utilisation des molécules ou compositions de l'invention pour inhiber l'activité enzymatique des enzymes DDE/DDD, en particulier l'activité des transposases ou des intégrases rétrovirales selon la définition donnée dans la présente demande. C'est pourquoi l'invention vise également une molécule ou une composition décrite dans la présente demande, pour utilisation en tant qu'inhibiteurs d'enzymes DDE/DDD. Dans ce cadre thérapeutique, les molécules, seules ou utilisées sous forme d'une composition, sont N-substituées ou non-N-substituées. [49] Dans un mode de réalisation particulier, les enzymes DDE/DDD sont des transposases ou des recombinases RAG. Dans un mode de réalisation particulier, les molécules ou compositions de l'invention sont utilisées pour inhiber ex vivo l'activité des transposases ou recombinases RAG. [50] Dans un autre mode de réalisation, les enzymes DDE/DDD sont des intégrases provenant de rétrovirus, en particulier de lentivirus, à tropisme animal ou humain. Du fait de leur implication dans la propagation du Syndrome d'ImmunoDéficience Acquise (SIDA), les rétrovirus de type VIH, tels que ceux des types VIH-1 et/ou VIH-2 (quel que soit leur sous-type), les intégrases de ces rétrovirus sont des cibles particulièrement intéressantes pour l'utilisation des molécules de l'invention. [051] L'invention se rapporte également à une molécule ou à une composition selon l'invention, pour l'utilisation dans le traitement des pathologies ou des symptômes associés et/ou consécutifs à une infection par un rétrovirus, en particulier consécutifs à une infection par un rétrovirus à tropisme animal ou à tropisme humain tel que VIH. [052] Dans le cadre de la présente demande, par traitement , on entend aussi bien l'effet curatif (disparition du rétrovirus par exemple) obtenu avec au moins une molécule ou une composition de l'invention, que l'amélioration des symptômes observés chez l'animal ou le patient (et consécutifs ou liés à la présence d'un rétrovirus) ou l'amélioration de l'état du patient. Ainsi, le terme traitement s'applique à l'infection par le rétrovirus tout comme aux symptômes ou aux pathologies découlant de l'infection par ce rétrovirus. Ainsi, une méthode, comprenant l'administration d'un composé ou d'une composition de l'invention à un animal ou un patient en ayant besoin, pour le traitement des pathologies ou des symptômes associés ou consécutifs à une infection par un rétrovirus, fait également partie de l'invention. [53] Par animal , on entend en particulier un mammifère non-humain. [54] Dans un mode de réalisation particulier, la demande concerne une molécule ou composition selon l'invention pour une utilisation dans la diminution, voire la suppression, de la réplication rétrovirale. L'effet de la molécule ou de la composition selon l'invention sur la diminution, voire la suppression, de la réplication du rétrovirus peut être mis en évidence par l'évolution de la charge virale plasmatique, chez l'hôte infecté. [55] Dans un autre mode de réalisation, la demande vise une molécule de l'invention ou une composition la comprenant dans le traitement des symptômes et/ou de l'infection consécutifs à une infection par le VIH, et en particulier dans le traitement du Syndrome d'ImmunoDéficience Acquise (SIDA). Avantageusement, le traitement discuté dans cette demande est approprié aux isolats VIH-1 et/ou VIH-2.

Dans le cas du traitement d'une infection par l'isolat VIH-1, le traitement s'applique aussi bien aux isolats du groupe O qu'aux isolats du groupe M, et en particulier pour les isolats du groupe M, aux clades A, B, C, D, E, F, G et H. L'efficacité du traitement des pathologies ou des symptômes liés au SIDA par la molécule ou la composition de l'invention peut être déterminée par l'évolution du nombre de Lymphocytes T CD4+, cellules cibles principales du virus VIH, optionnellement en combinaison avec le calcul de l'évolution de la charge virale plasmatique.

[56] Dans les utilisations thérapeutiques ou méthodes thérapeutiques décrites ci-dessus, la molécule ou la composition selon l'invention peut être sous forme solide (cachet, poudre, gélule, pilule, suppositoire, comprimé à libération accélérée, comprimé gastrorésistants, comprimé à libération prolongée) ou liquide (sirop, solution injectable, collyre). Ainsi, suivant sa forme galénique, la molécule ou la composition de l'invention peut être administrée par voie orale, transmuqueuse-buccale, vaginale, rectale, parentérale (intraveineuse, intramusculaire ou sous-cutanée), transcutanée (ou transdermique ou percutanée) ou cutanée. [57] Fait également partie de l'invention, l'utilisation d'une molécule ou d'une composition selon l'invention, dans la fabrication d'un médicament pour le traitement des symptômes et/ou de l'infection consécutifs à une infection par un rétrovirus, en particulier le VIH, et en particulier pour le traitement du Syndrome d'ImmunoDéficience Acquise.

[58] Dans un autre aspect, l'invention porte également sur l'utilisation du système MOS1 (transposon Most) en tant qu'outil de transfert d'ADN ( transposon tool ), en particulier en thérapie génique. [59] Dans le cadre de la présente demande, le système MOS1 comprend les éléments suivants : (a) la protéine MOS1 (acides aminés de 1 à 345), en particulier fusionnée à la Maltose-Binding protein ou MBP (afin d'en accroître la stabilité, mais sans en modifier l'activité) ou un mutant avantageux de la protéine MOS1. (b) le transposon, éventuellement délété d'une partie de sa séquence et/ou porteur d'un transgène d'intérêt. [060] Dans un mode de réalisation particulier, le transfert d'ADN est réalisé dans des cellules eucaryotes ; les cellules issues de ce transfert pourront être utilisées pour des applications ex-vivo, comme par exemple en thérapie génique, ou pour l'obtention de cellules usines (cellules productrices d'une protéine d'intérêt économique ou médical). [061] Les molécules selon l'invention peuvent donc être utilisées pour arrêter la réaction de transfert, provoquée par la mise en contact d'un système MOS1 tel que décrit ci-dessus avec les cellules à transformer. L'avantage des molécules de l'invention est par conséquent de pouvoir contrôler et d'éviter les réactions en cascade du système MOS1.30 DESCRIPTION DES DESSINS [062] Figure 1: Structure des composés 1 à 10 sélectionnés. [063] Figure 2: Modèle du mécanisme de transposition de Most. [064] Figure 3: Essai d'excision sur le composé 9. (a) Des essais d'excision in vitro ont été réalisés en utilisant pBC-3T3 surenroulé (SC) et diverses concentrations du composé 9 comme indiqué en haut de la figure. (-) : absence de transposase ; (D) : DMSO. Les marqueurs de poids moléculaire de l'ADN (MW) sont indiqués dans la marge de gauche en kbp. Les différents produits sont indiqués à droite : OC (cercle ouvert), L (linéaire = 4,6 kb), SC (surenroulé). Le transposon excisé (3T3 = 1,2 kb) et le squelette plasmidique (pBC = 3,4 kb) sont également indiqués. (b) Courbe de la valeur d'IC50 ; les pourcentages d'inhibition de l'excision (ordonnés) ont été déterminés en fonction de la concentration (en M) du composé 9 (abscisse). [065] Figure 4: Assemblage des complexes transposase-ITR par EMSA (Electrophoretic-mobility shift assay). Un EMSA a été réalisé avec MBP-MOS1, en utilisant l'ITR30 comme sonde et les 10 composés (1 à 10 de la Figure 1) sélectionnés. (-) : absence de transposase ; (0) sans composé ; (D) : DMSO Les différents complexes (SEC1, SEC2, PEC1, PEC2), le complexe de capture de la cible (TCC) et l'ADN non lié (sonde libre) sont indiqués. SEC1 a été formé par une seule transposase fixée sur une seule ITR. Ce complexe passe pour résulter de la dissociation des complexes moléculaires supérieurs ((18) et communications personnelles).

SEC2 a été formé par un dimère de transposase fixé sur une seule ITR, PEC1 a été formé par un dimère de transposase fixé sur une paire d'ITR, et PEC2 a été formé par un tétramère de transposase fixé sur une paire d'ITR. [066] Figure 5: Essai du composé 6 sur l'excision. Des essais d'excision in vitro ont été réalisés en utilisant pBC-3T3 surenroulé (SC) et diverses concentrations du composé 6 comme indiqué en haut de la figure; (D) : DMSO. Les marqueurs de poids moléculaire de l'ADN (MW) sont indiqués dans la marge de gauche en kbp. Les différents produits sont indiqués à droite : OC (cercle ouvert), L (linéaire = 4,6 kb), SC (surenroulé). Le transposon excisé (3T3 = 1,2 kb) et le squelette plasmidique (pBC = 3,4 kb) sont également indiqués. [67] Figure 6: Effet du composé 6 sur l'assemblage de complexes MOS1-ITR. Un EMSA a été réalisé avec MBP-MOS1, en utilisant l'ITR30 comme sonde et diverses concentrations du composé 6 comme indiqué en haut de la figure. (-) : absence de transposase ; (0) sans composé. Les différents complexes (SEC1, SEC2, PEC1, PEC2) et l'ADN non lié (sonde libre) sont indiqués. SEC1 a été formé par une seule transposase fixée sur une seule ITR. Ce complexe passe pour résulter de la dissociation des complexes moléculaires supérieurs. SEC2 a été formé par un dimère de transposase fixé sur une seule ITR, PEC1 a été formé par un dimère de transposase fixé sur une paire d'ITR, et PEC2 a été formé par un tétramère de transposase fixé sur une paire d'ITR. [68] Figure 7: Réactions de transfert de brin de MOS1 en présence du composé 1. Des essais ont été effectués en utilisant MBPMOS1, l'ITR30 marquée, pBC- SK comme plasmide cible et diverses concentrations du composé 1 (en pM) comme indiqué en haut de la figure. No Tpase : absence de transposase ; (D) : DMSO. Les produits d'intégration sont indiqués à droite : OC (cercle ouvert), L (linéaire). [69] Figure 8: Réactions de transfert de brin de MOS1. Courbe de la valeur d'IC50 ; les pourcentages d'inhibition de l'excision (ordonnés) ont été déterminés en fonction de la concentration (en M) du composé 1 (abscisse). La valeur IC50 obtenue est reprise dans le tableau III. [70] Figure 9: Activités de maturation en 3' et de transfert de brin de l'intégrase du VIH-1 en présence du composé 4 ; des essais ont été effectués en utilisant l'intégrase du VIH-1, un duplex oligonucléotidique imitant l'extrémité de la LTR U5 et diverses concentrations du composé 4 (en pM) comme indiqué en haut de la figure. No Int : absence d'intégrase ; (D) : DMSO ; (21-mer) : brin transféré ; (19-mer) : produit de maturation en 3'. Les produits de transfert de brin sont indiqués à droite. [71] Fiqure 10: Activités de maturation en 3' et de transfert de brin de l'intégrase du VIH-1 en présence du composé 4. Courbe de la valeur d'IC50 ; les pourcentages d'inhibition du transfert de brin (ligne) et d'inhibition de la maturation (pointillés) ont été déterminés en fonction de la concentration (en M) du composé 4 (abscisse). [72] Fiqure 11: Exemple simplifié d'une méthode de synthèse des molécules de l'invention.

EXEMPLES

[073]A. Matériel et Méthodes [074] Composés [075] Pour cette étude, cent huit composés ont été fournis par le laboratoire SPOT EA 3857 (Laboratoire de synthèse et physicochimie organique et thérapeutique) de l'Université François Rabelais de Tours, France. Les dérivés de bis-(hétéroaryl)maléimide (1-4 de la Figure 1) ont été synthétisés par le laboratoire du professeur Marie-Claude Viaud- Massuard comme décrit dans la littérature (25). Vingt composés ont été achetés auprès de ChemBridge ou d'InterBioscreen, et ont été décrits antérieurement comme des inhibiteurs de la transposase Tn5 (14). Vingt-sept composés ont été décrits comme des inhibiteurs de l'intégrase du VIH-1 : seize sont des intercalateurs d'ADN, gracieusement offerts par le Dr Vladimir Ryabinin (Institut de biologie moléculaire, Koltsovo, Russie), cinq sont de nouvelles thiazolothiazépines (26), quatre sont des G-quartets (27-30), et les deux derniers sont l'acide 3,5-dicaféoylquinique (31) et l'inhibiteur d'intégrase 3 (Merck). Les composés actifs sont représentés sur la figure 1. Tous les composés ont été remis en suspension dans du DMSO. [76] Protéines [77] La transposase MOS1 pleine longueur [acides aminés 1 à 345] et le domaine de dimérisation de MOS1 [acides aminés 1 à 85] ont été produits et purifiés sous la forme d'une protéine de fusion liée à la protéine de liaison au maltose (MBP) comme décrit antérieurement (8). Les termes transposase , MOS1 et Tnp utilisés ici désignent une seule sous-unité de la protéine Most.

[78] Essais de transposition in vitro [079] Les réactions de transposition in vitro ont été réalisées en utilisant pBC-3T3 à la fois comme ADN donneur et comme cible, comme cela avait été fait antérieurement pour des essais de transposition dans des bactéries (16). Les mélanges réactionnels de transposition contenaient 10 mM de Tris-HCI (pH 9), 50 mM de NaCl, 0,5 mM de dithiothréitol, 20 mM de MgCl2, 0,5 mM d'EDTA, 100 ng de BSA, 80 nM de MBP-MOS1 et 600 ng de pBC-3T3 surenroulé dans un volume de 20 pl. Des inhibiteurs (concentration finale 80 pM) ou du DMSO ont été ajoutés aux mélanges réactionnels avant la transposase. Les réactions se sont déroulées librement pendant 30 min à 30°C, puis 10 pl de solution d'arrêt (SDS 0,4 %, protéinase K 0,4 pg/pl) ont été ajoutés, et les mélanges réactionnels ont été incubés à 37°C pendant 30 min supplémentaires, puis à 65°C pendant 10 mn. Les produits ont été extraits au phénol-chloroforme, et précipités dans l'éthanol avec 1 pg d'ARNt de levure à l'aide de techniques classiques. 10 % du mélange réactionnel a été cotransformé avec 0,01 ng de pBS-SK(-), utilisé comme contrôle positif de la transformation (Stratagene) dans 45 pl de cellules électrocompétentes d'Escherichia col/ JM109 (cuvette de 2 mm, 1,5 kV dans un MicroPulserTM de BioRad). Les bactéries ont été cultivées à 37°C pendant 1 heure dans du milieu SOC. Des dilutions appropriées de chaque réaction ont été étalées sur de la gélose LB-ampicilline (100 pg/ml) pour évaluer l'efficacité de transformation, et sur de la gélose LB-tétracycline (12,5 pg/ml) et de la gélose LB-chloramphénicol (80 pg/ml) pour évaluer la fréquence de transposition. La fréquence de transposition est le nombre de colonies TetR divisé par le nombre de colonies ChloramR. L'efficacité de transformation a été suivie à partir du nombre de colonies AmpR. L'effet des divers composés a été exprimé en calculant un facteur d'inhibition (IF) tel que IF = fréquence de transposition de contrôle (dans du DMSO) divisée par la fréquence de transposition obtenue avec le composé. Pour les dix médicaments les plus efficaces, chaque expérience a été répétée cinq fois. [080] Essais de retard de mobilité électrophorétique (EMSA) [81] L'ITR30 a été préparée et marquée comme décrit antérieurement (8), avec certaines modifications mineures : après marquage, l'ADN a encore été purifié sur un gel de polyacrylamide natif. Les réactions de liaison ont été réalisées dans 50 mM de NaCl, 0,5 mM de DU, 10 mM de Tris (pH 9), 5 % de glycérol et 100 ng de BSA. Chaque réaction de 20 pl contenait 0,2 pmol d'ITR30 marquée au 32P, 400 mM de MBP-MOS1 purifié, 5 mM d'EDTA, et 1 pl du composé testé (concentration finale 400 pM) ou de DMSO. Les mélanges ont été incubés à 30°C pendant deux heures. Les complexes ont été séparés en utilisant des gels discontinus de polyacrylamide natif à 4 à 6 %-TBE 0,25x (acrylamide/bisacrylamide 30 : 0,93) contenant 5 % de glycérol. Les gels ont été passés à 200 V pendant 3 heures, puis autoradiographiés.

[82] Essais d'excision in vitro et détermination de la CI50 [083] Ces essais ont été effectués dans les mêmes conditions que les essais de transposition in vitro, à l'exception du fait que l'incubation a été réalisée à 37°C au lieu de 30°C. Pour déterminer la CI50, une gamme de concentration de composé de 1000 à 0,8 pM a été utilisée comme indiqué dans le texte. Après incubation, la réaction a été interrompue en ajoutant 2 pl de tampon de chargement 10x, et les produits ont été directement chargés sur un gel de TAE 1x-agarose à 0,8 % contenant du bromure d'éthidium. La quantité de squelette libéré a été évaluée en utilisant le système GeneSnap (SynGene). Le pourcentage d'inhibition de l'excision a été tracé en fonction de la concentration de composé. Les données expérimentales ont été ajustées sur une courbe dose-réponse sigmoïde en utilisant le logiciel Prism. Chaque expérience a été répétée au moins deux fois.

[84] Réactions de transfert de brin de Most [85] Les réactions (40 pl) ont été réalisées dans 50 mM de Tris- HCI (pH 9), 0,1 mg/ml de BSA et 5 % de glycérol en présence de 10 nM de substrat ITR préalablement clivé et 80 nM de MBP-MOS1. Le substrat ITR préalablement clivé a été formé en hybridant les oligonucléotides NTS-3 et TS (NTS-3: 5'-GGTGTACAAGTATGAAATGTCGTTTCG-3' ; TS : 5'-AATTCGAAACGACATTTCATACTTGTACACCTGA-3'). TS a été radiomarqué à la position 5' avec la polynucléotide kinase T4 (Promega) et du a-[32P]ATP. Après 20 min à température ambiante, du MgCl2 (concentration finale 5 mM) et 200 ng de plasmide cible pBC-KS (Stratagene) par réaction ont été ajoutés pendant 1 heure à 30°C. Des inhibiteurs dilués dans du DMSO à 5 % ont été ajoutés lors de la formation des complexes et avant d'ajouter MgCl2 et le plasmide cible. Les réactions ont été interrompues avec 10 mM d'EDTA, et traitées avec 0,1 mg/ml de protéinase K, 0,1 % de SDS et 2 mM de CaCl2 à 45°C pendant 1 heure. Les réactions de transfert de brin ont été chargées et résolues sur un gel de TBE 1x-agarose à 0,8 %. Le gel a été coloré avec du bromure d'éthidium, puis séché et exposé à un écran au phosphore (phosphorimageur, STORM Molecular Dynamics). Les produits d'insertion ont été quantifiés en utilisant le logiciel Image Quant.

[86] Essais de maturation en 3' et de transfert de brin du VIH-1 [087] L'intégrase du VIH-1 a été purifiée comme décrit dans (32). 200 nM d'intégrase du VIH-1 ont été incubés en présence de 6,25 nM de duplex oligonucléotidique radiomarqué imitant l'extrémité de la LTR U5 dans un tampon contenant 20 mM de HEPES (pH 7,5), 10 mM de NaCl, 4 mM de DTT, 7,5 mM de MgCl2, 10 % de DMSO et diverses concentrations de médicaments. La réaction a été réalisée pendant 2 heures à 37°C, et les produits ont été séparés sur un gel d'urée à 18 %-acrylamide. Le gel a été balayé à l'aide d'un phosphorimageur, et analysé avec le logiciel Image Quant (Molecular Dynamics). Chaque expérience a été réalisée en double. [088] B. Résultats

[89] Identification d'inhibiteurs de MOS1 [90] Lors d'un premier essai d'identification d'inhibiteurs de la transposase de Most, une collection de 170 molécules a été criblée, en utilisant un essai de transposition in vitro. La première partie du panel testé était constituée d'inhibiteurs de la transposase Tn5 et de l'intégrase du VIH-1. Les autres composés, qui n'avaient jamais été testés comme inhibiteurs d'intégrase ou de transposase, étaient des dérivés hétérocycliques substitués. [091] L'essai de transposition a été réalisé en utilisant une protéine MOS1 purifiée fusionnée à la MBP et le plasmide pBC-3T3 portant un transposon pseudo-Mosl. Dans cet essai, pBC-3T3 a été utilisé comme donneur de pseudo-Mosl, ou comme cible pour l'intégration du transposon (16). Les événements de transposition ont été révélés par marquage par promoteur. La concentration des médicaments utilisés pour le criblage initial était de 80 NM. Les 10 meilleurs composés présentaient un facteur d'inhibition (IF) supérieur à 25 (plus de 96 % d'inhibition) à comparer à l'expérience de contrôle effectuée en l'absence d'inhibiteur, mais en présence de DMSO (Tableau Il).30 Composés Fréquences de Facteurs d'inhibition transposition DMSO 4x10-4 1 1 1,09x10"6 367 2 1,2x10-6 33 3 4,01x1 0-6 100 4 5,37x10-6 75 8,38x10"6 48 6 1,01x10"5 40 7 4,85x10"6 82,5 8 5,04x1 0"6 79 9 1,64x1 0"5 25 2,76x10-6 145 5 Fréquence de transposition et facteur d'inhibition 10 des Tableau II: meilleurs composés (1 à 10 de la Figure 1) ; les valeurs de la fréquence de transposition et des facteurs d'inhibition sont la moyenne d'au moins cinq expériences. Les facteurs d'inhibition sont le rapport entre la fréquence de transposition obtenue avec du DMSO et celle obtenue avec chacun des composés 1 à 10. [092] Les structures de ces inhibiteurs sont représentées sur la Figure 1. Les composés 1 à 4 sont des dérivés de bis- 10 (hétéroaryl)maléimide, et constituent des inhibiteurs des enzymes DDE/D inconnus jusqu'ici. Les composés 5 et 6 sont des N-méthylpyrrolepolyamides, connus pour interagir avec l'ADN (synthèse dans (17)). Le composé 7 est un dérivé de bis-coumarine qui s'est également révélé être un inhibiteur de la transposase Tn5 et de l'intégrase du VIH- 1 (14). Les composés 8, 9 et 10 sont respectivement un dérivé de cinnamoyle, un dérivé d'acide benzoïque et une thioxothiazolidine substituée par un acide carboxylique. Ces trois composés (8, 9 et 10) avaient déjà été identifiés comme inhibiteurs de la transposase Tn5 (14). [93] Activité des inhibiteurs sur l'excision du transposon [94] Pour mieux caractériser l'activité inhibitrice de ces dix composés et leurs mécanismes d'action sur la transposition de Most, la capacité des composés chimiques à inhiber l'excision du transposon a été testée in vitro, en utilisant le transposon pBC-3T3 comme plasmide donneur. MOS1 déclenche l'excision du transposon à partir du plasmide donneur, générant deux fragments d'ADN linéaire, le transposon (1,2 kb) et le squelette plasmidique (3,4 kb). Après excision, le transposon peut être réinséré dans une cible. L'activité d'excision du médicament a été mesurée en quantifiant le squelette plasmidique, car il s'agit d'un produit final de la réaction. L'activité du composé 9 est présentée sur la figure 3a. En l'absence de médicament, la transposase libérait le transposon du plasmide donneur (ligne 8). À la concentration la plus élevée de médicament (1 mM), l'excision du transposon était totalement supprimée (ligne 2). [95] Pour déterminer la concentration de médicament nécessaire pour inhiber 50 % de la réaction (CI50), les pourcentages d'inhibition mesurés à partir de deux expériences indépendantes ont été tracés en fonction de la concentration de médicament (figure 3b). Des expériences similaires ont été réalisées avec les neuf autres composés chimiques, et les valeurs CI50 correspondantes sont reprises dans le tableau III. 30 Composés IC50 liaison (pM) Assemblage de CI50 Exe. complexes (pM) 1 >400 + 18< CI50 <54 2 15 - 12< CI50 <15 3 30 - 7< CI50 <13 4 12 - 9< CI50 <18 <50 nM - 5< CI50 <12 6 <50 nM - 4< CI50 <22 7 ND - 86< CI50 <91 8 ND - 36< CI50 <44 9 ND +/- 138< CI50 <166 ND - 29< CI50 < 39 Tableau III : Effet de chacun des composés sur différentes étapes du transposon Most ; Les valeurs IC50 pour la liaison MOS1-ITR et pour l'excision de Most sont indiquées en pM, sauf indication contraire. Les effets sur l'assemblage de complexes MOS1-ITR sont indiqués par (+) : 5 complexes observés, (-) : absence de complexes et (+1-) : traces de SEC1. ND : non déterminé.

[96] Les composés 2 à 6 étaient les meilleurs inhibiteurs de l'excision, avec des valeurs CI50 de l'ordre de 10 pM. Un deuxième 10 ensemble de médicaments, avec des valeurs CI50 allant de 35 pM (composé 10) à 150 pM (composé 9), comprenait les inhibiteurs de Tn5. Enfin, le bis-furyl-maléimide (composé 1), le meilleur inhibiteur caractérisé dans l'essai de transposition initial, inhibait l'excision avec une CI50 comprise entre 18 et 54 pM. Cette valeur CI50 suggère que ce composé pourrait également agir sur des étapes ultérieures de la transposition. [97] Ces résultats indiquent que les composés 1 à 10 ont un impact sensible sur l'excision du transposon. Les inhibiteurs de la transposase Tn5 (composés 7 et 10) bloquent la formation du complexe synaptique de Tn5 (14), tandis que les composés 5 et 6 sont de puissants inhibiteurs de la protéine de liaison à l'ADN (synthèse dans (17)). Les données de la littérature et ces résultats suggèrent fortement que ces composés pourraient agir au niveau de la formation de complexes transposase-ITR, une étape qui se déroule avant l'excision. [098] Activité des inhibiteurs sur l'assemblage de complexes MOS-ITR [099] La capacité des dix molécules à inhiber l'apparition de complexes formés in vitro entre MOS1 et l'ITR 3' (8) a été testée, en utilisant la technique de retard de mobilité sur gel (EMSA). Des complexes MOS1-ITR ont été formés avec une ITR 3' radiomarquée (ITR30) en présence d'une concentration de 400 pM de molécule. Cette concentration est au moins 2,5 fois plus élevée que la valeur CI50 la plus haute qui a été mesurée pour les dix composés. [0100] Ces données initiales indiquent que des complexes étaient toujours observés en présence du composé 1 (figure 4, ligne 4), mais que le motif était modifié, ce qui suggère que le médicament interagit avec les complexes. Par opposition, les complexes étaient totalement déstabilisés en présence des composés 2, 3, 4, 7, 8 et 10, et presque entièrement supprimés (90 % d'inhibition) en présence du composé 9, qui présentait la valeur CI50 la plus élevée pour l'activité d'excision. Seules des traces du complexe abortif SEC1 ont été détectées. Les données observées ici pour les composés 7 à 10 sont tout à fait conformes avec le mode d'action de ces molécules sur l'assemblage des complexes de la transposase Tn5 et de l'intégrase du VIH-1 (14). Enfin, une concentration de 400 pM des composés 5 et 6 induisait une précipitation des substrats ITR et des complexes de transposase dans les puits, probablement par agglomération ou neutralisation de la charge de l'ADN. Une précipitation similaire du substrat ITR seul a également été observée à des concentrations élevées des médicaments 5 et 6 en PAGE native (non présenté). [0101] Des interactions entre l'ADN et les composés 5 et 6 ont aussi été constatées avec le substrat plasmidique lors de l'essai d'excision (Figure 5). Pour confirmer le mécanisme d'action des médicaments 5 et 6, les expériences ont été répétées en réduisant leur concentration. Ces composés bloquaient totalement la formation des complexes spécifiques transposase-ITR à de faibles concentrations (40 nM, Figure 6).

Conformément à ce que l'on sait des N-méthylpyrrole-polyamides (17), ces données indiquent donc que les composés 5 et 6 se lient à l'ITR, agissant ainsi comme concurrents de MOS1. [0102] Des expériences similaires ont été réalisées en utilisant les nouveaux inhibiteurs de transposase (composés 2 à 4), et celles-ci ont montré que ces inhibiteurs bloquent la formation des complexes spécifiques transposase-ITR avec une valeur CI50 similaire à celle de l'excision (Tableau III). [0103] II a donc été décidé de confirmer que les molécules, qui inhibent la formation de complexes, n'inhibent pas la formation de dimères de MOS1, étape qui est supposée se former avant liaison à l'ITR (18). En utilisant une forme tronquée de MOS1 (Tnp[1-85]), la dimérisation a été mesurée par des expériences de fixation de glutaraldéhyde, comme décrit antérieurement (18). Tous les composés testés n'ont pas pu inhiber la formation de dimères de Tnp[1-85] à la concentration de 500 pM (non présenté), ce qui exclut l'hypothèse selon laquelle ces composés peuvent inhiber la formation de complexes en déstabilisant le domaine de dimérisation N-terminal. Ces résultats suggèrent que ces inhibiteurs agissent plus vraisemblablement au niveau de l'interaction ITR-MOS1. Les données pour les composés 5 à 10 étant conformes au mécanisme d'action de ces composés sur la transposase Tn5 et l'intégrase du VIH-1, l'étude a été concentrée sur les nouveaux composés 1 à 4.

[0104] Effet des composés 1 à 4 de la Figure 1 sur les réactions de transfert de brin [0105] Nous avons préalablement montré que trois des nouveaux composés (composés 2 à 4) empêchent l'assemblage de complexes MOS- ITR, alors que le composé 1 agit au niveau de l'excision de Most. Les réactions d'excision et de transfert de brin sont étroitement apparentées. [0106] Le composé 1 a donc été testé pour vérifier s'il inhibait également la réaction de transfert de brin. Des ITR préalablement clivées ont été marquées sur l'extrémité 5' du brin de transfert, et utilisées pour former les complexes de transfert de brin. L'inhibiteur a été ajouté avant la formation de complexes MOS1-ITR. Les événements de transposition dans un plasmide cible ont été détectés après résolution des produits de la réaction sur un gel d'agarose (Figure 7). Le pourcentage d'inhibition a été déterminé pour quatre expériences indépendantes, et tracé en fonction de la concentration de médicament (Figure 8). Le composé 1 inhibait la réaction de transfert de brin avec une valeur CI50 comprise entre 19 et 45 pM. Il présentait également les propriétés d'un inhibiteur catalytique ; il ne pouvait pas empêcher l'assemblage de complexes MOS1-ITR à des concentrations qui inhibaient à la fois la réaction d'excision et la réaction de transfert de brin.

[0107] Effet des inhibiteurs sur les activités de maturation en 3' et de transfert de brin de l'intégrase du VIH-1 [0108] Les précédents résultats ont démontré que les inhibiteurs de Tn5 et de l'intégrase du VIH-1 peuvent également inhiber MOS1. Pour vérifier si le nouveau groupe d'inhibiteurs (composés 1 à 4) est également susceptible de bloquer l'intégrase du VIH-1, l'activité du composé 4 a été testée contre les activités de maturation en 3' et de transfert de brin de l'intégrase du VIH-1. L'essai a été réalisé comme décrit antérieurement (19) ; les résultats sont présentés à la Figure 9. Les pourcentages d'inhibition mesurés dans deux expériences indépendantes ont été tracés en fonction de la concentration de composé 4 (Figure 10). Le composé 4 inhibait la maturation en 3' avec une CI50 de 70 pM, et l'activité de transfert de brin avec une CI50 de 7 pM, autrement dit ce composé était 10 fois plus actif contre l'activité de transfert de brin. Il s'agissait également d'un excellent inhibiteur de l'intégrase du VIH-1. Ceci démontre que les dérivés de bis-(furanyl)-N-maléimide constituent un nouveau groupe d'inhibiteurs avec une activité croisée contre la transposase de Most et l'intégrase du VIH-1. En conséquence, MOS1 peut être considéré comme un nouveau substitut pour l'identification d'inhibiteurs de l'intégrase du VIH-1.

Discussion [0109] Identification d'inhibiteurs de MOS1 [0110] La disponibilité d'inhibiteurs spécifiques est très importante pour l'analyse et le contrôle de mécanismes élaborés tels que la transposition. Pour la première fois, la présente demande caractérise des composés chimiques qui inhibent la transposition de mariner, l'élément transposable le plus répandu chez les eucaryotes. Le mécanisme d'action des inhibiteurs les plus efficaces, identifiés en détail en criblant un panel de 170 composés, a été étudié. Un premier groupe était constitué de composés qui avaient déjà été identifiés comme inhibiteurs de transposase (Tn5) ou d'intégrase (VIH-1) (composés 5 à 10 de la Figure 1). Tous ces inhibiteurs bloquaient la formation de complexes MOS1-ITR. Le deuxième groupe se composait d'une nouvelle famille de molécules présentant d'excellentes activités inhibitrices à la fois contre la transposase MOS1 et l'intégrase du VIH-1 (composés 1 à 4 de la Figure 1). [0111] La cible des composés permet d'établir une distinction entre les composés 5 et 6, qui se lient à l'ADN, et les autres composés, qui sont privés de la capacité de liaison à l'ADN. Les composés 7 à 10 présentaient un mécanisme d'action similaire sur MOS1 et la transposase Tn5. Ils inhibaient la formation des complexes, probablement en perturbant l'un des domaines de reconnaissance d'ADN de la transposase. Les inhibiteurs de Tn5 étaient moins efficaces contre la transposition de Most, ce qui peut refléter des différences entre les mécanismes de reconnaissance de l'ADN et d'organisation des complexes. Les composés 5 et 6 sont des polyamides en épingle à cheveux composés d'un N-méthylpyrrole-polyamide raccordé par un lieur acide y-aminobutyrique (tour y) et lié au sillon mineur d'ADN (17). Ils sont spécifiques d'une courte séquence constituée de trois (composé 6) ou quatre (composé 5) paires A/T. Ces séquences sont présentes à l'extréminté mais également à l'intérieur du substrat ITR. Un seul N-méthylpyrrole sans tour y de liaison était également actif contre la transposition de MOS1 (IF - 20). II s'agissait également d'excellents inhibiteurs de la formation de complexes (CI50 de la liaison < 40 nM), mais ils étaient moins efficaces en présence d'ADN non spécifique. Dans l'essai d'excision, la quantité d'ADN était 160 fois plus élevée que dans l'essai de retard sur gel, et l'activité des composés chutait d'un facteur 250 (CI50 de l'excision = 10 pM).

[0112] Les dérivés de bis-(hétéroaryl)maléimide constituent un nouveau squelette d'inhibiteurs des enzymes DDE [0113] Le panel des composés testés dans le cadre de cette demande en tant qu'inhibiteurs de MOS1 était principalement constitué de molécules hétérocycliques substituées par des groupes hydroxyle. Des petites molécules de ce type ont d'ailleurs été identifiées antérieurement comme d'efficaces inhibiteurs de l'intégrase du VIH-1 (20). Parmi l'ensemble des molécules testées dans le cadre de cette demande, 21 étaient des dérivés de bis-(hétéroaryl)maléimide. Les inhibiteurs les plus efficaces mis en évidence étaient tous organisés autour d'un squelette bis-(hétéroaryl)maléimide (composés 1 à 4 de la Figure 1). II a été mis en évidence que les squelettes non substitués étaient inefficaces, ce qui suggère que le squelette bis-(hétéroaryl)maléimide lui-même n'est pas le pharmacophore (données non présentées). La N-substitution du groupe maléimide et/ou la substitution du groupe hétéroaryle avaient toutes deux un impact majeur sur le mécanisme d'action et l'efficacité des composés. Les composés 2, 3 et 4, qui sont tous N-substitués, inhibaient l'assemblage de complexes MOS1-ITR avec des valeurs CI50 très similaires à celles de l'excision. Par opposition, le composé 1, qui n'est pas N-substitué, n'inhibait pas l'assemblage de complexes MOS1-ITR, même si les différences de motif de migration suggèrent que le composé 1 peut modifier la structure des complexes. Ce composé était tout à la fois actif contre les activités d'excision et de transfert de brin, et affichait des valeurs CI50 légèrement supérieures à celles des composés 2, 3 et 4. Les composés de cette famille ne se lient pas à l'ADN (21), mais ils ciblent probablement la transposase ou les complexes transposase-ADN. Il existe deux explications possibles à la différence radicale de mécanisme d'inhibition entre le composé 1 et les autres dérivés de maléimide. Premièrement, la cible du médicament peut être différente, à cause de la substitution par un groupe aromatique du N-maléimide (composés 2 à 4), ce qui pourrait expliquer la différence de mécanisme d'inhibition. Deuxièmement, les quatre composés pourraient tous avoir une cible similaire, mais la substitution aromatique volumineuse du N-maléimide perturbe la liaison à l'ADN, alors que le composé non-N- substitué tolère la présence d'ADN. [0114] Comme cible, la poche catalytique DDD de la transposase MOS1 constitue un excellent candidat pour expliquer le changement majeur de mécanisme d'inhibition et d'activité croisée de ces composés contre l'intégrase du VIH-1, car elle renferme des résidus catalytiques similaires et se lie à l'intersection des deux substrats d'ADN impliqués dans la réaction. Les composés dotés d'un squelette susceptible de se lier à cette région pourraient présenter des phénotypes inhibiteurs différents, devenant des inhibiteurs spécifiques de la formation de complexes, de l'excision ou du transfert de brin en conséquence de différences mineures de substitution de leur squelette. [0115] Des cibles différentes des composés pourraient également expliquer les différents phénotypes de cette famille de composés. Des mutations ponctuelles dans le domaine N-terminal de HIMAR1 (une transposase mariner apparentée à MOS1) illustrent la façon dont des changements dans les interactions transposase-ITR peuvent avoir des conséquences pléiotropiques. Certaines mutations déstabilisent complètement les complexes transposase-ITR, alors que d'autres permettent aux complexes de se former, mais inhibent la première ou la deuxième réaction de clivage de brin (22). Ceci implique que les composés qui ciblent l'interaction domaine N-terminal/ITR pourraient refléter le phénotype des mutations du domaine N-terminal. L'identification de la/des cible(s) de cette famille de composés est déjà en cours, car elle apparaît comme essentielle aux futurs développements et à la compréhension du mécanisme d'action de ces inhibiteurs sur la transposition de Most et le processus d'intégration du VIH-1. [0116] Activité croisée des inhibiteurs des enzymes DDE [0117] La capacité d'un composé à inhiber des enzymes apparentées sur le plan des mécanismes (activité croisée) est illustrée par les composés qui inhibent l'intégrase du VIH-1, l'ASV et d'autres intégrases rétrovirales apparentées (23). En outre, les inhibiteurs d'intégrase de type dicétoacide (5 CITEP et L-708 906) sont également actifs contre les recombinases RAG faiblement apparentées (24), bien que l'activité de cet inhibiteur soit fortement réduite (facteur 100). Plus récemment, un criblage d'inhibiteurs de la transposase Tn5 a été utilisé pour identifier des composés actifs contre l'intégrase du VIH-1 (14). [0118] Les travaux présentés dans la présente demande constituent une nouvelle démonstration de l'activité croisée entre les inhibiteurs des transposases Tn5 et MOS1, et pour la première fois entre MOS1 et l'intégrase du VIH-1. L'activité croisée de la nouvelle famille d'inhibiteurs identifiée montre que MOS1 constitue un excellent substitut pour un criblage d'inhibiteurs. Ce substitut est très intéressant pour les raisons suivantes. Premièrement, la transposition de MOS1 fonctionne dans un environnement eucaryote, comme l'intégrase, ce qui ouvre la possibilité d'un test d'inhibition dans des cellules eucaryotes.

Deuxièmement, la structure du domaine catalytique de MOS1 est très similaire à celle des intégrases rétrovirales de l'ASV et du VIH-1 (9, 10).

Troisièmement, le processus catalytique de clivage de l'ADN dans la transposition est similaire à la réaction de maturation d'une intégrase rétrovirale, la réaction du clivage du deuxième brin imitant l'activité de maturation en 3' de l'intégrase (il n'y a pas d'intermédiaire inter-brin ou en épingle à cheveux dans ces deux réactions). Jusqu'ici, le transpososome de Tn5 a été utilisé comme modèle de l'intégrasome rétroviral, mais le transposome mariner pourrait constituer un nouveau modèle, probablement meilleur, de l'organisation de l'intégrasome du VIH-1. Néanmoins, il faut garder à l'esprit que ces deux modèles (Mos1 et VIH-1) affichent des différences sensibles, telles la structure et la configuration de leur domaine de liaison à l'ADN, la nature du substrat d'ADN donneur, et la réaction de clivage de l'ADN (réaction de clivage des deux brins contre réaction de clivage d'un seul brin), ce qui signifie que les deux systèmes ne sont pas totalement interchangeables. Dans cette perspective, l'utilisation de médicaments d'activité croisée offrira un outil intéressant pour détecter les similitudes et les différences entre ces deux enzymes.

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Claims (42)

REVENDICATIONS

1. Molécule, comprenant une structure bis-(hétéroaryl)maléimide, de formule (I) : dans laquelle: - RI est choisi dans le groupe constitué d'un hydrogène, d'un alkyle linéaire ou ramifié, d'un alkenyle, d'un alcynyle, d'un cycloalkyle, d'un héterocyclyl, d'un hétéroaryl, d'un héteroaralkyle, d'un héteroalkoxy, d'un carboxyle, d'un alkoxycarbonyle, d'un tétrazolyle, d'un acyle, d'un arylsulfonyl et d'un heteroarylsulfonyl ; - R2 et R3 sont choisis, indépendamment l'un de l'autre, dans le groupe constitué d'un atome d'hydrogène, d'un acide carboxylique, d'un cyano, d'une oxime, d'un éther d'oxime, d'un tétrazole, d'un ester, d'un amide substitué ou non, d'un acide, d'un diacide, d'un acide cycloalklcarboxylique, d'un aryl substitué ou non, et d'un héteroaryl substitué ou non; - Ar' et Ar2, sont choisis, indépendamment l'un de l'autre, et sont constitués d'un cycloalkyle substitué ou non, d'un héteroaryl substitué ou non, d'un aryl substitué ou non, d'un héteroalkyl linéaire ou ramifié ; et dans laquelle il est exclu que R', R2 et R3 soient ensemble H.

2. Molécule selon la revendication 1, dans laquelle R2 et R3 sont identiques, de formule (la) : R2 ùA ri Àr2ùR2 36 RI O_, .N. ,.O (la)

3. Molécule selon la revendication 1, dans laquelle Ar' et Ar-2 sont identiques, de formule (lb) : RI R2 ùAr1 Art ùR3

4. Molécule selon la revendication 1, dans laquelle R2 et R3 d'une part, et Art et Ar-2 d'autre part, sont identiques, de formule (Ic) RI R2 ùAr1 Ar' ùR2

5. Molécule selon la revendication 1, dans laquelle Art et/ou Ar2 est un groupement furanne.

6. Molécule selon la revendication 5, dans laquelle Art et Ar2 sont un groupement furanne, de formule (Il)

7. Molécule selon la revendication 6, dans laquelle R2 et R3 sont identiques, de formule (Ila)R

8. Molécule selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans laquelle R2 et/ou R3 est COOH.

9. Molécule selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans laquelle R2 et/ou R3 est CH=CH-CHO.

10. Molécule selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, dans laquelle RI est un groupement phenyl, éventuellement substitué.

11. Molécule selon la revendication 10, dans laquelle R' est le 4-hydroxyphenyl.

12. Molécule selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, dans laquelle RI est COOEt

13. Molécule selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, dans laquelle RI est H.

14. Molécule selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisée en ce qu'elle est N-substituée.

15. Molécule selon la revendication 13, caractérisée en ce qu'elle n'est pas N-substituée.

16. Molécule selon l'une quelconque des revendications ci-dessus choisie dans le groupe constitué des formules (III) à (VI) suivantes : HOOC OH HOOC CH3-CH2-CO OHC , et

17. Molécule selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, possédant in vitro une activité inhibitrice des enzymes DDE/DDD.

18. Composition caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une molécule inhibitrice selon l'une quelconque des revendications 1 à 17.

19. Composition selon la revendication 18, caractérisée en ce qu'elle comprend de plus un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

20. Composition selon l'une quelconque des revendications 18 à 19, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un composé additionnel biologiquement actif dans le traitement des symptômes liés au Syndrome d'ImmunoDéficience Acquise.

21. Utilisation d'une molécule selon l'une quelconque des revendications 1 à 17 pour l'inhibition in vitro de l'activité des enzymes DDE/DDD.

22. Utilisation selon la revendication 21, dans laquelle les enzymes DDE/DDD sont des transposases, telles que MuA, Tn5 et MOS1.

23. Utilisation selon la revendication 21, dans laquelle les enzymes DDE/DDD sont des intégrases rétrovirales, telle que celle du virus VIH-1.

24. Utilisation d'une molécule selon l'une quelconque des revendications 1 à 17 pour l'inhibition ex vivo de transposases.

25. Molécule selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, pour utilisation en tant qu'inhibiteur d'enzymes DDE/DDD.

26. Molécule selon la revendication 25, pour utilisation en tant qu'inhibiteur d'intégrases rétrovirales.

27. Molécule selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, pour utilisation comme médicament.

28. Molécule selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, pour utilisation dans la diminution, voire la suppression, de la réplication rétrovirale.

29. Molécule selon la revendication 28 dans laquelle le rétrovirus est un lentivirus.

30. Molécule selon la revendication 29, dans laquelle le lentivirus est un lentivirus à tropisme humain, tel que le virus VIH (Human Immunodeficiency Virus).

31. Molécule selon la revendication 30, dans laquelle le virus VIH est un isolat VIH-1 ou un isolat VIH-2.

32. Molécule selon la revendication 29, dans laquelle le lentivirus est un lentivirus à tropisme animal, tel qu'un lentivirus choisi dans le groupe constitué d'un virus CAEV (Caprine Arthritis Encephalitis Virus), d'un virus EIAV (Equine Infectious Anaemia Virus), d'un virus VISNA, d'un virus SIV (Simian Immunodeficiency Virus) ou d'un virus FIV (Feline Immunodeficiency Virus).

33. Molécule selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, pour utilisation dans le traitement des symptômes et/ou de l'infection consécutifs à une infection par le VIH.

34. Molécule selon la revendication 33, pour utilisation dans le traitement du Syndrome d'ImmunoDéficience Acquise.

35. Composition selon l'une quelconque des revendications 18 à 20, pour utilisation comme médicament.

36. Composition selon l'une quelconque des revendications 18 à 20, pour utilisation dans la diminution, voire la suppression, de la réplication rétrovirale.

37. Composition selon l'une quelconque des revendications 18 à 20, pour utilisation en tant qu'inhibiteur de l'intégrase d'un rétrovirus, en particulier d'un lentivirus.

38. Composition selon la revendication 36 ou 37, dans laquelle le rétrovirus est le virus VIH, en particulier l'isolat VIH-1 ou l'isolat VIH-2.

39. Composition selon l'une quelconque des revendications 18 à 20, pour utilisation dans le traitement du Syndrome d'ImmunoDéficience Acquise.

40. Composition selon l'une quelconque des revendications 35 à 39, pour administration sous forme de solide (cachet, poudre, gélule, pilule, suppositoire, comprimé à libération accélérée, comprimé gastrorésistants, comprimé à libération prolongée) ou liquide (sirop, solution injectable, collyre).

41. Composition selon l'une quelconque des revendications 35 à 39, pour administration par voie orale, transmuqueuse-buccale, vaginale, rectale, parentérale (intraveineuse, intramusculaire ou sous-cutanée), transcutanée (ou transdermique ou percutanée) ou cutané.

42. Utilisation d'une molécule selon l'une quelconque des revendications 1 à 17 ou d'une composition selon l'une quelconque des revendications 18 à 20, dans la fabrication d'un médicament pour le traitement des symptômes et/ou de l'infection consécutifs à une infection par le VIH, en particulier pour le traitement du Syndrome d'ImmunoDéficience Acquise.