FR2925070A1 - Milieu d'enrichissement selectif de bacteries productrices de bsle avec un acide boronique - Google Patents
Milieu d'enrichissement selectif de bacteries productrices de bsle avec un acide boronique Download PDFInfo
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Abstract
La présente invention concerne un procédé de détection directe de bactéries productrices de beta-lactamase à spectre étendu (BLSE) et/ou de bactéries carbapénème résistantes dans un échantillon comprenant (i) l'inoculation, avec ledit échantillon, d'un milieu de culture comprenant au moins un antibiotique sélectif des bactéries productrices de BLSE et/ou au moins un antibiotique sélectif des bactéries carbapénème résistantes, et au moins un acide boronique inhibiteur de céphalosporinase, (ii) l'incubation dudit milieu de culture dans des conditions permettant la croissance des bactéries productrices de BLSE et/ou des bactéries carbapénème résistantes, et (iii) la détection des colonies formées sur ledit milieu de culture correspondant aux bactéries productrices de BLSE et/ou aux bactéries carbapénème résistantes.
Description
MILIEU D'ENRICHISSEMENT SELECTIF DE BACTERIES PRODUCTRICES DE BSLE AVEC UN ACIDE BORONIQUE DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention concerne un procédé de détection spécifique et directe de bactéries productrices de BLSE ((3-lactamase à spectre étendu) dans un échantillon mettant en oeuvre un milieu d'enrichissement sélectif pour bactéries productrices de BLSE comprenant au moins un antibiotique sélectif des bactéries productrices de BLSE et au moins un inhibiteur de cephalosporinase.
ART ANTERIEUR Les 13-lactamases sont des enzymes produites par certaines bactéries, lesquelles enzymes confèrent une résistance aux antibiotiques de la famille des 13-lactames. Parmi ces 13-lactamases, on trouve les pénicillinases, les céphalosporinases et les (3-lactamases à spectre étendu (BSLE).
Concernant les (3-lactamases à spectre étendu (B.L.S.E.), il s'agit d'enzymes apparues à la suite de modifications survenues sur les plasmides qui codent pour les TEM1, TEM2, SHV1 ou SHV2 et sont appelées TEM3 à TEM9 ou SHV3 à SHV5. Depuis, d'autres types de BSLE sont apparus avec les BSLE de type GES, de type VEB,n de type PER et de type CTX-M. Ces BSLE présentent la capacité d'hydrolyser toutes les 13-lactamines et ceci jusqu'aux céphalosporines de 3ème génération (C3G). Ces BSLE sont pour la plupart plasmidiques, et donc facilement transférables d'une bactérie à l'autre, et également sensibles aux inhibiteurs de 13-lactamases. Les bactéries produisant de telles BLSE sont ainsi des bactéries mufti-résistantes, responsables d'infections nosocomiales souvent épidémiques, de détection et de traitement difficiles. Généralement, les bactéries productrices de BLSE appartiennent principalement aux genres et espèces tels que Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Escherichia coli, Acinetobacter principalement baumanii ou Pseudomonas principalement aeruginosa. De même, des phénomènes de résistance aux carbapénèmes posent aujourd'hui des problèmes similaires à ceux rencontrés avec les bactéries productrices de BSLE et de tels phénomènes de résistance émergent aujourd'hui de plus en plus parmi les bactéries productrices de BSLE. Bien évidemment, une telle résistance a des implications sur les thérapies de traitement des infections bactériennes avec des antibiotiques de la famille des 13- lactames dans la mesure où cette résistance bactérienne peut être suffisante pour entraîner l'échec de ces thérapies. Ainsi, si un patient infecté par une bactérie produisant une (3-lactamase est traité avec une céphalosporine, de nombreuses 13-lactamases reconnaîtront cette céphalosporine et la convertiront en un métabolite ne présentant que peu ou pas de potentiel antibiotique. L'identification d'échantillons de patients associés à une activité 13-lactamase, et spécifiquement BSLE, est donc particulièrement importante pour la prévention et le suivi épidémiologique des infections par des bactéries productrices de BSLE puisqu'elle permet de limiter le risque de traiter un patient avec des antibiotiques inappropriés et donc le risque de propagation de l'infection.
Il est donc important de disposer d'outils et de procédés de détection de ces bactéries qui combinent à la fois une bonne spécificité et sélectivité, et surtout une grande facilité d'usage de façon à pouvoir autant que possible simplifier les tests, voire les automatiser. Les méthodes actuelles de détection des bactéries productrices de BLSE consistent à utiliser un milieu de culture pour bactéries gram négative et à le supplémenter avec des antibiotiques sélectifs, les bactéries capables de donner des colonies étant alors potentiellement des bactéries productrices de BLSE. Pour obtenir une meilleure sensibilité, on emploie parfois un ensemble de deux milieux contenant chacun un antibiotique tels la cefotaxime et la ceftazidime.
Pour simplifier on peut aussi employer la seule cefpodoxime qui permet à elle seule d'obtenir une sensibilité satisfaisante. Toutefois, ces méthodes ne sont pas réellement spécifiques des bactéries productrices de BLSE. En effet, des microorganismes multi-résistants autres que les bactéries productrices de BLSE peuvent se développer sur le milieu et former des colonies caractéristiques. En particulier, ces méthodes de détection peuvent détecter en même temps des souches productrices à haut niveau, naturellement ou par acquisition de plasmides, de cephalosporinase (notées AmpC ou CASE+) qui résistent aussi aux mêmes antibiotiques.
Pour obtenir une détection spécifique des bactéries productrices de BLSE, il est donc nécessaire actuellement de confirmer le statut BLSE+ des colonies de bactéries obtenues sur le milieu partiellement sélectif. Ceci est généralement réalisé par la pratique de tests supplémentaires de caractérisation de présence de la BLSE dans la souche considérée, en général par la mise en évidence d'une synergie entre les céphalosporines de troisième génération et un inhibiteur de bêta lactamase, en général l'acide clavulanique (voir site du comité de l'antibiogramme de la Société Française de Microbiologie et articles nombreux sur les méthodes de caractérisation http://www.lahey.org/studies/), en utilisant dans certains cas comme inhibiteurs les acides boroniques.
Globalement, les méthodes de détection actuelles comportent donc deux étapes successives nécessaires pour obtenir une détection spécifique des bactéries productrices de BLSE. Cela conduit à une durée assez longue pour le dépistage et donc le diagnostic, augmentant ainsi le risque de la diffusion de la bactérie multirésistante dans les circuits et établissements de soins, et le risque d'erreur.
Ainsi, il existe actuellement un besoin important pour une technique de détection plus simple, plus spécifique, plus directe et plus rapide des bactéries productrices de BLSE, qui ne nécessite pas de combiner plusieurs tests consécutifs conduisant à un délai supplémentaire d'obtention des résultats et augmentant le risque de contaminations parasites ou d'erreur ainsi que le risque de la diffusion de la bactérie multi-résistante dans les circuits et établissements de soins. En outre, il serait souhaitable de pouvoir déterminer plus précisément l'identité, l'espèce et/ou le genre de la bactérie détectée, sans pour autant ajouter une étape supplémentaire. DESCRIPTION DE L'INVENTION De manière surprenante et inattendue, les inventeurs ont montré que l'utilisation combinée dans un même milieu sélectif d'antibiotiques sélectifs des bactéries productrices de BLSE et d'acides boroniques inhibiteurs de céphalosporinase permet d'isoler de façon sélective et directement (en une seule étape) les bactéries productrices de BLSE présentes dans un échantillon, le tout avec une sensibilité et une spécificité comparable à celles des tests antérieurs.Un tel milieu évite l'amplification simultanée de souches BLSE-exprimant une cephalosporinase (souches BLSE-CASE+) et permet d'effectuer une identification des bactéries productrices de BSLE en un temps bien inférieur aux tests existants dans l'art antérieur. De même, le procédé selon l'invention peut également être appliqué à la détection de souches carbapénèmes résistantes telles les bactéries KPC+ qui portent le gène KPC en évitant l'amplification simultanée de souches KPC-CASE+. Un objet de la présente invention consiste donc en un procédé de détection directe de bactéries productrices de (3-lactamase à spectre étendu (BLSE) et/ou de bactéries carbapénème résistantes dans un échantillon comprenant : a) l'inoculation, avec ledit échantillon, d'un milieu de culture comprenant au moins un antibiotique sélectif des bactéries productrices de BLSE et/ou au moins un antibiotique sélectif des bactéries carbapénème résistantes et au moins un acide boronique inhibiteur de céphalosporinase, b) l'incubation dudit milieu de culture dans des conditions permettant la croissance des bactéries productrices de BLSE et/ou des bactéries carbapénème résistantes, et c) la détection des colonies formées sur ledit milieu de culture correspondant aux bactéries productrices de BLSE et/ou aux bactéries carbapénème résistantes. La sensibilité importante obtenue par le procédé selon l'invention, comparable à celle obtenue avec les tests existants, mais en un temps bien inférieur et avec une seule étape, est pour le moins inattendue. En effet, la pression de sélection très importante résultant d'une telle combinaison (au moins un antibiotique sélectif des bactéries productrices de BLSE et/ou au moins un antibiotique sélectif des bactéries carbapénème résistantes, et au moins un acide boronique inhibiteur de céphalosporinase) dans un seul et même milieu de culture, suggérait plutôt une baisse importante de la sensibilité du fait de la perturbation de la croissance bactérienne associée à cette importante pression de sélection. De même, la spécificité importante obtenue par le procédé selon l'invention, comparable également à celle obtenue avec les tests existants est également des plus inattendue. Dans le cas de procédés utilisant des disques d'au moins un antibiotique sélectif des bactéries productrices de BLSE et/ou d'au moins un antibiotique sélectif des bactéries carbapénème résistantes, et d'au moins un acide boronique inhibiteur de céphalosporinase disposés sur milieu gélosé, la spécificité obtenue est fonction du diamètre d'inhibition autour des disques de diffusion que l'on prend en compte.
L'utilisation de ces antibiotiques, directement dans le milieu de culture et plus dans des disques diffuseurs positionnés sur le milieu gélosé, suggérait une perte de spécificité du fait de la plus grande difficulté à exclure des bactéries montrant une moindre sensibilité aux antibiotiques bien que non productrices de BSLE ou non résistante aux carbapénèmes.
Enfin, la combinaison d'agents antibiotiques multiples est souvent associée à une moindre stabilité de ces agents. Les inventeurs ont montré là encore de façon surprenante que, à défaut d'instabilité, la combinaison de ces différents agents antibiotiques dans le milieu de culture bénéficiait d'une stabilité supérieure à deux mois.
Généralement, les bactéries productrices de BLSE appartiennent principalement aux genres Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Escherichia (e.g. E. coli), Acinetobacter (e.g. A. baumanii) ou Pseudomonas (e.g. P. aeruginosa). De préférence, les bactéries productrices de BLSE détectés par le procédé selon l'invention appartiennent aux genres Klebsiella (e.g. K. pneumonae) et Escherichia (e.g. E. coli). Par procédé de détection directe , on entend un procédé qui ne comprend pas d'étape préalable d'isolement des différentes souches bactériennes présentes dans l'échantillon, de préférence un procédé qui ne comprend pas d'étape préalable d'isolement de chacune des souches bactériennes présentes dans l'échantillon. En effet, le procédé selon l'invention évite l'étape d'isolement de colonies de bactéries candidates pouvant ensuite être soumises à un test plus précis de confirmation de statut BLSE+, et permet la détection directe, en une seule étape, de telles bactéries BLSE+. Il s'applique donc à un échantillon brut comprenant un mélange de bactéries. Par échantillon , on entend le mélange de différentes souches bactériennes appartenant à des espèces voire à des genres distincts. A titre d'exemple, ledit échantillon correspond au mélange d'au moins deux souches bactériennes différentes, de préférence d'au moins cinq souches bactériennes différentes et, de manière particulièrement préférée, d'au moins dix souches bactériennes différentes. Ledit échantillon correspond avantageusement à un échantillon biologique liquide, comme de la salive, du sang, ou de l'urine, solide, comme des fèces, ou, également, à un dérivé d'un échantillon biologique liquide ou solide (fèces, etc.) tel qu'une pré-culture d'un tel échantillon biologique liquide ou solide.
Avantageusement, ledit échantillon est un échantillon biologique liquide ou solide. Selon un premier mode de réalisation préféré, le procédé selon l'invention est un procédé de détection directe de bactéries carbapénème résistantes dans un échantillon utilisant un milieu de culture comprenant au moins un antibiotique sélectif des bactéries carbapénème résistantes et au moins un acide boronique inhibiteur de céphalosporinase. Les antibiotiques sélectifs des bactéries carbapénèmes résistante utilisables 5 dans le procédé selon l'invention sont bien connus de l'homme du métier. A titre d'exemple, on peut citer : méropénème, ertapénème et imipénème. La quantité efficace d'antibiotique sélectif des bactéries carbapénèmes résistante peut être déterminée simplement par l'homme du métier au regard de ses connaissances générales. 10 Selon un deuxième mode de réalisation préféré, le procédé selon l'invention est un procédé de détection directe de bactéries productrices de 13-lactamase à spectre étendu (BLSE) dans un échantillon utilisant un milieu de culture comprenant au moins un antibiotique sélectif des bactéries productrices de BSLE et au moins un acide boronique inhibiteur de céphalosporinase. 15 Les antibiotiques sélectifs des bactéries, particulièrement des entérobactéries, productrices de BLSE utilisables dans le procédé selon l'invention incluent notamment les céphalosporines de deuxième et troisième génération et les antibiotiques apparentés aux céphalosporines, comme les céphamycines. Parmi les céphalosporines de deuxième et troisième génération et également les antibiotiques 20 apparentés aux céphalosporines, comme les céphamycines, on peut citer : cefuroxime, cefprozil, cefoxitine, cefamandole, céfotiam, cefotétan, cefmetazole, cefocinide, ceforanide, cefpodoxime, cefixime, cefotaxime, ceftizoxime, ceftriaxone, ceftazidime, cefmenoxime, cefodizime, cefoperazone, cefsulodin, cefatamet, ceftibuten, moxalactam ou latamoxef, notamment sous forme de sels (sodiques). 25 L'homme du métier peut obtenir des listes de tels composés, notamment sur Internet au site www.biam2.org ou www.fpnotebook.com. De préférence, les antibiotiques sélectifs des bactéries productrices de BLSE utilisables dans le procédé selon l'invention incluent les céphalosporines de troisième génération, lesquelles céphalosporines sont choisies dans le groupe consistant en la ceftriaxone, le céfotaxime, le ceftizoxime, la ceftazidime, la céfopérazone, le cefsulodin, le ceftibuten, la céfixime, le céfatamet et la cefpodoxime. Pour la détection des bactéries productrices de BLSE, les antibiotiques sélectifs les plus utilisés sont la ceftazidime (CAZ), le cefotaxime (CTX) et la 5 cefpodoxime (CPD). Ainsi, selon un mode de réalisation particulier du procédé selon l'invention, ledit au moins un antibiotique sélectif des bactéries productrices de BLSE est choisi parmi le ceftazidime (CAZ), le cefotaxime (CTX) et la cefpodoxime (CPD). Avantageusement encore, ledit au moins un antibiotique sélectif des bactéries 10 productrices de BLSE est la cefpodoxime (CPD). La quantité efficace d'antibiotique sélectif des bactéries productrices de BLSE peut être déterminée simplement par l'homme du métier au regard de ses connaissances générales. Ainsi, lorsque la cefpodoxime est l'unique antibiotique sélectif des bactéries 15 productrices de BLSE dans le milieu de culture, sa concentration dans le milieu de culture est avantageusement comprise entre 0,2 et 10 mg/L. Les acides boroniques, qui sont des inhibiteurs de céphalosporinases sont bien connus de l'homme du métier. De tels acides boroniques sont notamment décrits dans BEESLEY et al. (Biochem.J., vol.209, p :229-233, 1983). A titre d'exemple de 20 tels acides boroniques, on peut citer l'acide 3-aminophényl boronique, l'acide 3-nitrophényl boronique, l'acide 2-thiophényl boronique et l'acide benzothiophène-2-boronique. A titre d'exemple, et lorsque l'acide boronique est l'unique inhibiteur de cephalosporinase dans le milieu de culture, sa concentration dans le milieu de culture 25 est avantageusement comprise entre 10 et 2000 mg/L, préférentiellement entre 30 et 300 mg/L.
Selon un troisième mode de réalisation préféré du procédé selon l'invention, le milieu de culture comprend un autre inhibiteur de céphalosporinase tel que la cloxacilline. Selon un quatrième mode de réalisation préféré du procédé selon l'invention, 5 le milieu de culture ne comprend que de l'acide boronique à titre d'inhibiteur de céphalosporinase. Par milieu de culture on entend un milieu de culture permettant la croissance de bactéries productrices de BSLE et/ou de bactéries carbapénème résistantes. De préférence, ledit milieu de culture est un milieu de culture gélosé, lequel 10 milieu de culture est, à titre d'exemple, à base d'agarose. Les conditions d'incubation permettant la croissance des bactéries sont bien connues de l'homme du métier détectant habituellement des bactéries productrices de BLSE et/ou de bactéries carbapénème résistantes, et ne sont pas différentes de celles des méthodes traditionnelles. 15 En outre, le milieu de culture utilisé dans le procédé selon l'invention peut avantageusement comprendre au moins une substance réagissant spécifiquement avec un genre de bactéries particulier. Notamment, de telles substances incluent les agents chromogènes, qui sont des agents incolores portant un chromophore libéré après hydrolyse avec une enzyme 20 spécifique d'un genre ou d'un groupe de genres, ou d'une espèce de bactérie particulière. Ainsi, en présence d'une bactérie exprimant l'enzyme permettant l'hydrolyse de l'agent chromogène, le chromophore est libéré et colore la colonie de bactérie d'une couleur donnée. La coloration d'une colonie de cette couleur permet alors à l'utilisateur d'identifier d'un seul coup d'oeil le genre de la colonie 25 bactérienne. Ainsi, dans un mode de réalisation avantageux du procédé selon l'invention, le milieu utilisé comprend en outre au moins un agent chromogène portant un chromophore libéré après hydrolyse avec une enzyme spécifique d'un genre ou d'une espèce de bactérie particulière. Par exemple, parmi les enzymes dont l'activité est utilisable dans le cadre de la présente invention, on peut citer notamment : la 13-D-glucuronidase ou la R-D- galactosidase, positive chez Escherichia coli ; la (3-D-glucosidase, positive chez Klebsiella, Enterobacter, Serratia et Citrobacter ; et/ou une désaminase, positive chez Proteus, Providencia et Morganella. Pour ce qui concerne les chromophores dont on souhaite obtenir la libération par la mise en oeuvre d'une activité enzymatique d'une ou plusieurs souche(s) de microorganismes à détecter, on peut citer : 0-nitrophényl, P-nitrophényl, ChloroNitrophényl, Hydroxyphényl, Nitroanilide, Phénolphtaléine et thymophtaléine, Hydroxyquinoline, Cyclohexenoesculétine, Dihydroxyflavone, Catéchol, Résazurin, résofurin, VBzTM, VLM, VLPr, VQM, Indoxyl, 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl, 5-bromo-6-chloro-3-indoxyl, 6-chloro-3-indoxyl, 6-fluoro-3- indoxyl, 5-lodo-3-indoxyl, N-Méthylindoxyl, ou d'autres (cf. catalogue BIOSYNTH. ou GLYCOSYNTH, www.biosynth.com et www.glycosynth.co.uk). Lorsqu'un ou plusieurs agents chromogènes sont utilisés, il est donc possible en outre et toujours en une seule étape de culture d'amplifier sélectivement les bactéries productrices de BLSE, à l'exclusion des bactéries BLSE- CASE+, et en même temps de déterminer plus précisément l'espèce ou le genre de bactéries auquel correspondent les différentes colonies sélectionnées. Un deuxième objet de l'invention concerne un milieu de culture, susceptible d'être mis en oeuvre dans un procédé de détection directe de bactéries productrices de (3-lactamase à spectre étendu (BLSE) et/ou de bactéries carbapénème résistantes dans un échantillon tel que décrit précédemment. Avantageusement, ledit milieu de culture est un milieu de culture gélosé. Selon un premier mode de réalisation préféré, ledit milieu de culture est destiné à la détection directe de bactéries productrices de 13-lactamase à spectre étendu (BLSE) dans un échantillon et comprend au moins un antibiotique sélectif des bactéries productrices de BLSE et au moins un acide boronique inhibiteur de céphalosporinase. Selon un deuxième mode de réalisation préféré, ledit milieu de culture est destiné à la détection directe de bactéries de bactéries carbapénème résistantes dans un échantillon et comprend moins un antibiotique sélectif des bactéries carbapénème résistantes et au moins un acide boronique inhibiteur de céphalosporinase. Les exemples qui suivent sont fournis à titre d'illustration et ne sauraient limiter la portée de la présente invention.
EXEMPLES 1) Validation du procédé selon l'invention : Différentes souches de bactéries ont été cultivées dans trois conditions différentes : -groupe 1 : milieu CHROMAGAR ORIENTATION en présence de cefpodoxime à 2mg/L ; - groupe 2 : milieu CHROMAGAR ORIENTATION en présence de cefpodoxime à 2mg/L + acide boronique 40mg/L (acide benzothiophene-2-boronique) ; et -groupe 3 : milieu CHROMAGAR ORIENTATION en présence de cefpodoxime à 2mg/L + acide boronique 100mg/L (acide 3-aminophenyl boronique). Les souches de bactéries testées pouvaient être productrices de BLSE (notées BLSE+) et/ou productrices de cephalosporinase (notées CASE+ ou AmpC). Les résultats de croissance de colonies sont présentés dans le Tableau 1 ci- 25 dessous: Tableau 1 : Détection de bactéries productrices de BLSE par la méthode traditionnelle (groupe 1) ou par le procédé selon l'invention (groupes 2 et 3) 20 Groupe 1 Groupe 2 Groupe 3 E. Coli Asq + + + BLSE+ Acinetobacter N° + + + 79 CASE+ BLSE + E. Coli - - - ATCC25922 sensible Acinetobacter N° + -/+ -/+ 80 CASE+ E. coli 17154 + -1+ -1+ Am pC Les résultats montrent que le procédé selon l'invention permet d'identifier plus sélectivement les bactéries BSLE+ par rapport aux bactéries CASE+. En vue de tester l'efficacité de la détection de bactéries productrices de BSLE de type CTX-M, 124 souches de bactéries différentes ont été utilisées, dont 66 comprenaient avec le gène CTX-M et certaines souches étaient positives pour ampC Ces souches de bactéries ont été cultivées dans deux autres conditions différentes : - groupe 4 : milieu CHROMAGAR ECC en présence de cefotaxime à 2mg/L + acide boronique 64mg/L (acide benzothiophene-2-boronique) ; et - groupe 5 : milieu CHROMAGAR ECC en présence de cefotaxime à 4mg/L + acide boronique 64mg/L (acide benzothiophene-2-boronique).
Les résultats de croissance de colonies sont présentés dans le Tableau 2 ci- dessous : Tableau 2 : Détection de bactéries productrices de BLSE de type CTX-M par le procédé selon l'invention (groupes 4 et 5) Groupe 4 Groupe 5 66 Souches CTX-M 65 62 (= sensibilité 98.5%) (= sensibilité 93.9%) 55 Souches non-CTX-M 9 3 (= spécificité 83.6%) (= spécificité 94.5%) Ces résultats montrent que le procédé selon l'invention permet de détecter spécifiquement les bactéries BLSE+ (BLSE+CASE- ou BLSE+CASE+), à l'exclusion des bactéries BLSE- productrices de cephalosporinase (BLSE-CASE+). La stabilité du milieu prêt à l'emploi a été étudiée et le milieu du groupe 4, aussi désigné CHROMagar ECC CTX-M, montre une stabilité supérieure à 2 mois. Le test de stabilité consistait à étudier dix souches de type AmpC qui restaient inhibées et de souches résistant à des niveaux variables à la cefotaxime qui restaient détectables. 2) Mise en oeuvre du procédé selon l'invention Différents échantillons de fèces de patients souffrant d'infections bactériennes sont prélevés. Lesdits échantillons sont étalés directement sur boîte de pétri milieu gélosé CHROMAGAR ECC en présence de cefotaxime à 4mg/L + acide boronique 64mg/L (acide benzothiophene-2-boronique).
Après incubation pendant 18 à 24 heures, l'analyse visuelle des boîtes de pétri permet d'identifier directement celles comprenant des bactéries productrices de BSLE. Ainsi, le procédé selon l'invention permet, en une seule étape de culture, de détecter spécifiquement les bactéries BLSE+, sans nécessité d'une seconde étape de confirmation de leur statut BLSE+, puisque les bactéries BLSE- productrices de cephalosporinase (BLSE-CASE+) ne sont pas amplifiées.
Claims (14)
1. Procédé de détection directe de bactéries productrices de P-lactamase à spectre étendu (BLSE) dans un échantillon comprenant : i. l'inoculation, avec ledit échantillon, d'un milieu de culture comprenant au moins un antibiotique sélectif des bactéries productrices de BLSE et au moins un acide boronique inhibiteur de céphalosporinase, ii. l'incubation dudit milieu de culture dans des conditions permettant la croissance des bactéries productrices de BLSE, et iii. la détection des colonies formées sur ledit milieu de culture correspondant aux bactéries productrices de BLSE.
2. Le procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit échantillon est un mélange d'au moins deux souches bactériennes différentes, de préférence d'au moins cinq souches bactériennes différentes.
3. Le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit au moins un antibiotique sélectif des bactéries productrices de BLSE est une céphalosporine de troisième génération choisie dans le groupe consistant en la ceftriaxone, le céfotaxime, le ceftizoxime, la ceftazidime, la céfopérazone, le cefsulodin, le ceftibuten, la céfixime, le céfatamet et la cefpodoxime.
4. Le procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que ledit au moins un antibiotique sélectif des bactéries productrices de BLSE est choisi parmi 25 la ceftazidime (CAZ), le cefotaxime (CTX) et la cefpodoxime (CPD).
5. Le procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que ledit au moins un antibiotique sélectif des bactéries productrices de BLSE est la cefpodoxime (CPD).
6. le procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la concentration de cefpodoxime dans le milieu de culture est comprise entre 0,2 et 10 mg/L.
7. Le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que ledit au moins un acide boronique inhibiteur de cephalosporinase est choisi dans le groupe comprenant l'acide 3-aminophényl boronique, l'acide 3-nitrophényl boronique, l'acide 2-thiophényl boronique et l'acide benzothiophène-2-boronique.
8. Le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la concentration en acide boronique dans le milieu de culture est comprise entre 10 et 2000 mg/L, préférentiellement 30 et 300 mg/L.
9. Le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que ledit milieu de culture est un milieu de culture gélosé.
10. Le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé 15 en ce que ledit milieu de culture comprend en outre au moins un agent chromogène portant un chromophore libéré après hydrolyse avec une enzyme spécifique d'un ou plusieurs genres ou espèces de bactéries particulières.
11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que ledit agent chromogène est sensible à l'activité d'au moins une enzyme choisie parmi la p-D-20 glucuronidase, la f3-galactosidase, la (3-D-glucosidase, ou une désaminase.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 ou 11, caractérisé en ce que le chromophore qui est libéré par hydrolyse enzymatique est choisi parmi 0-nitrophényl, P-nitrophényl, ChloroNitrophényl, Hydroxyphényl, Nitroanilide, Phénolphtaléine, Thymophtaléine, Hydroxyquinoline, 25 Cyclohexenoesculétine, Dihydroxyflavone, Catéchol, Résazurin, Résofurin, VBzTM, VLM, VLPr, VQM, Indoxyl, 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl, 5-bromo-6-chloro-3-indoxyl, 6-chloro-3-indoxyl, 6-fluoro-3-indoxyl, 5-lodo-3-indoxyl et NMéthylindoxyl.
13. Un milieu de culture, susceptible d'être mis en oeuvre dans un procédé de détection selon l'une quelconque des revendications 1 à 12.
14. Le milieu de culture selon la revendication 13, caractérisé en ce que ledit milieu de culture est un milieu de culture gélosé.
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