FR2893417A1 - Procede de caracterisation d'un element biochimique presentant une activite biologique, par analyse des signaux electromagnetiques de basses frequences - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne le domaine de la caractérisation de matériel biochimique, par l'analyse des signaux électromagnétiques générés après forte dilution ainsi que les traitements électromagnétiques associés, visant la modification substantielle ou la destruction de ces matériels biochimiques.

Description

PROCEDE DE CARACTERISATION D'UN ELEMENT BIOCHIMIQUE PRESENTANT UNE

ACTIVITE BIOLOGIQUE, PAR ANALYSE DES SIGNAUX ELECTROMAGNETIQUES DE BASSES FREQUENCES La présente invention concerne le domaine de la caractérisation de matériel biochimique, par l'analyse des signaux électromagnétiques générés après forte dilution ainsi que les traitements thérapeutiques associés, visant la modification substantielle ou la destruction de ces matériels biochimiques. Etat de l'art : Les techniques actuelles de détection de virus et de bactéries reposant 10 sur le principe de détection de la reconnaissance d'antigènes par des anticorps sont bien connues (billes de latex, kit elisa). Plus récemment, les méthodes dites de PCR (polymérise chain reaction) permettent d'identifier de manière extrêmement sensible, l'ADN ou l'ARN de germes, par la duplication à grande échelle de certaines de leurs séquences d'ADN 15 caractéristiques. Par contre ces deux méthodes s'avèrent impuissantes à la détection des formes nouvelles d'infection, notamment celles portées par les mycoplasmes telles que décrites notamment dans le brevet WO 02/089744. Ces formes inédites d'infectivité ont fait par ailleurs l'objet de publications Montagnier L, Berneman D, 20 Guetard D et al."Inhibition de l'infectiosite de souches prototypes du VIH par des anticorps dirigés contre une séquence peptidique de mycoplasme. "Comptes Rendus de L'Académie des Sciences 1990; 311(III) : 425-430; Balter M."Montagnier pursues the Mycoplasma-AIDS link." Research News. Science 1991: 251-271. 25 La présente invention permet de détecter ces formes, que l'on baptisera dans la suite de ce document nanoformes et ainsi d'approfondir la détection d'agents infectieux sous des formes latentes dans un grand nombre de pathologies notamment, en présence de traitements qui vont conduire à la sélection de ces formes.

Typiquement, dans le cas du suivi du traitement d'un patient HIV, notamment traité sous trithérapie, ces méthodes sont inopérantes pour connaître précisément l'état de séropositivité. Cette carence constitue une perte substantielle de fiabilité dans les tests de détection de virus ou de leur activité virale associée, notamment, et par exemple, dans les processus de collecte du sang pour les instances hospitalières. En outre, tout laisse penser que ces formes infectieuses pourraient parfaitement s'avérer être à l'origine ou la cause des maladies dites nosocomiales La présente invention a pour objectif la mise au point d'une technologie nouvelle capable de détecter et caractériser, non pas des molécules, mais des micro-organismes et/ou leurs traces infectieuses par l'émission de signaux électromagnétiques de basse fréquence (SEM), aussi bien dans des cultures in vitro que dans des fluides biologiques, provenant de l'homme, d'animaux ou de plantes.

Ces technologies s'appliquent notamment à la détection de germes infectieux impliqués dans des maladies chroniques, aussi bien qu'au suivi thérapeutique de patients dont le traitement aboutit à la sélection et au maintien de ces germes. La présente invention permet de détecter et caractériser des agents infectieux présents sous des formes latentes dans un grand nombre de pathologies (notamment HIV), y compris en présence de traitements qui vont conduire à la sélection de ces formes. Selon un premier aspect, l'invention concerne un procédé de caractérisation d'un élément biochimique présentant une activité biologique, se trouvant dans un 25 milieu biologique, ledit procédé comportant les étapes suivantes: a. prédiluer un échantillon de milieu biologique pour obtenir un milieu dilué; b. filtrer au moins une fois le milieu dilué pour obtenir un milieu filtré; c. diluer le milieu filtré pour obtenir une solution diluée ; d. homogénéiser ladite solution diluée par agitation forte e. acquérir les signaux électromagnétiques de basse fréquence émis par ladite solution diluée et homogénéisée, f. enregistrer lesdits signaux sur un support informatique approprié ; g. analyser lesdits signaux.

On entend, dans le cadre de la présente invention, par l'expression élément biochimique présentant une activité biologique toute forme apte à manifester, dans un milieu donné (en général dans l'eau ou une solution aqueuse), les propriétés biologiques caractéristiques d'une molécule ou d'une cellule ou d'un microorganisme, source, en l'absence de cette dernière ou ce dernier.

L'échantillon est filtré à travers un filtre présentant une porosité inférieure à 100 nanomètres, et en particulier une porosité comprise entre 20 nanomètres et 100 nanomètres. Avantageusement, l'étape c de dilution consiste en une dilution comprise entre 10-2 et 10"20 et en particulier comprise entre 10-2 et 10-9.

Selon un mode de réalisation préféré, le procédé comporte une étape de centrifugation après l'étape d'agitation forte d. Ladite étape d'acquisition e desdits signaux électromagnétiques de basse fréquence émis par ladite solution diluée comprend une étape d'excitation de ladite solution par un signal électromagnétique d'excitation défini qui est d'amplitude et de fréquence fixes connues. On procède selon un mode de réalisation préféré à une excitation de la solution par un bruit blanc ou un signal de fréquence et d'amplitude déterminées, pendant l'acquisition des signaux électromagnétiques. Le procédé selon l'invention permet d'enregistrer la signature caractérisant 25 un élément biochimique donné, et à la comparer avec les signatures préalablement enregistrées d'éléments biochimiques connus. Pour obtenir une signature caractéristique d'un élément biochimique, on procédé, dans un mode de réalisation du procédé, au filtrage de la dite fréquence fixe connue pendant la lecture desdits signaux électromagnétiques émis par ladite solution diluée. Dans un autre mode de réalisation, on procède à la soustraction du signal ambiant capté. Le procédé selon l'invention comprend en outre : - une étape d'enregistrement de ladite signature obtenue pour ledit élément biochimique; - et une étape de comparaison de ladite signature avec des signatures des éléments biochimiques connus, préalablement enregistrées ; - une étape de décomposition de la signature obtenue en couples fréquence-amplitude par transformation de Fourier ; - une étape de tri desdits couples fréquence-amplitude par ordre inverse d'importance selon leur amplitude ; l'étape de comparaison ne compare que les n premiers couples fréquence-amplitude avec les n premiers couples fréquence-amplitude des signatures préalablement enregistrées ; étape de production d'un indice de rapprochement correspondant à la moyenne des amplitudes pour la liste des fréquences considérées ; - une étape d'identification des plages de dilution dans lesquelles ledit signal est positif ; - une étape d'identification des plages de dilution dans lesquelles ledit signal est positif h heures après la réalisation de l'étape d'identification, avec h allant de 1 à 24. Selon un deuxième aspect, l'invention concerne l'utilisation du procédé selon l'invention pour obtenir un effet d'inhibition biologique sur un élément biochimique donné, par l'application audit élément d'un signal d'inhibition aléatoire, déterminé ou fonction de la signature dudit élément biochimique connu. Dans un mode de réalisation, le signal d'inhibition est composé par le signal de l'élément biochimique dont la phase est décalée de z degrés, avec z pouvant aller de 0 à 2 it (3,1416). Dans un autre mode de réalisation, ledit signal d'inhibition est constitué par 30 les principales fréquences émises par l'élément biochimique en inversion de phase.

Lorsque l'élément biochimique est dilué à un niveau de dilution 10-X, ledit signal d'inhibition est un signal d'inhibition enregistré à partir de ce même élément dilué à un niveau de dilution 10-Y, avec Y strictement inférieur à X. Dans une variante de réalisation, le signal d'inhibition est un signal 5 d'inhibition synthétique produit par application d'un même niveau d'amplitude à toutes les fréquences du spectre considéré. Dans une autre variante de réalisation, ledit signal d'inhibition est un signal d'inhibition synthétique produit par application d'un niveau d'amplitude aléatoire à toutes les fréquences du spectre considéré. 10 L'effet d'inhibition selon l'invention est obtenu par l'application, par périodes alternatives, à un élément chimique connu, d'un signal d'inhibition synthétique produit par application des signaux selon un type précité, suivie d'une étape de mesure, jusqu'à leur disparition, des signaux électromagnétiques émis en retour par ledit élément biochimique. 15 L'invention concerne encore un équipement pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, comportant un capteur pour l'acquisition des signaux électromagnétiques émis par une solution obtenue à l'étape d du procédé, un circuit de traitement desdits signaux pour le calcul d'une signature d'un élément biochimique analysé et un circuit de comparaison de la signature ainsi calculée 20 avec des signatures enregistrées préalablement et figurant dans une base de données ; un circuit de production de signaux d'inhibition. L'équipement selon l'invention comprend en outre au moins une des caractéristiques suivantes, prise isolée ou en combinaison : - les capteurs sont situés en regard des différentes strates de sédimentation 25 du milieu biologique à enregistrer ; - l'un des capteurs, dit capteur de contrôle, est éloigné de l'élément biochimique à caractériser ; - le capteur de contrôle est connecté au canal gauche de la carte son de l'ordinateur ; - un autre capteur, dit capteur pour l'acquisition des signaux électromagnétiques émis par un élément, est connecté au canal droit de la carte son de l'ordinateur ; l'équipement de capture pour l'acquisition des signaux électromagnétiques émis par un élément biochimique, est séparé de l'équipement distant de comparaison des signaux ; - les signaux électromagnétiques reçus de l'équipement de capture sont comparés à une base de signatures enregistrées préalablement dans ledit équipement distant ; - l'équipement distant est muni d'un module d'émission de commandes vers l'équipement de capture ; - le capteur pour l'acquisition des signaux électromagnétiques émis par un élément biochimique est connecté au canal micro d'un terminal de téléphonie mobile ; - le circuit destiné à produire des signaux d'inhibition est connecté au canal écouteur d'un terminal de téléphonie mobile. L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description détaillée qui suit et des dessins annexés correspondant à des exemples non limitatifs de réalisation, dans lesquels : - la figure 1 représente schématiquement le protocole préparatoire d'un échantillon ; - la figure 2 représente une vue schématique de l'équipement d'acquisition des signaux ; - les figures 3 et 4 représentent des vues des signaux électriques générés 25 par le solénoïde en présence d'une source émettrice (M. Pirum) après filtration respectivement de 0,02 micromètre et de 0,1 micromètre ; - la figure 5 représente un histogramme en trois dimensions de la distribution des longueurs d'onde détectées par le solénoïde en l'absence de source émettrice (bruit de fond) ; 30 - la figure 6 représente un histogramme en trois dimensions de la distribution des longueurs d'onde détectées par le solénoïde en présence d'une source émettrice (M. Pirum) après filtration de 0,02 micromètre ; - la figure 7 représente l'analyse de Fourier du bruit de fond (les harmoniques du courant électrique d'alimentation non filtrées) de la figure 5 ; - la figure 8 représente l'analyse de Fourier du signal généré par le solénoïde en présence d'une source émettrice (M. Pirum) de la figure 6 ; - la figure 9 représente une vue schématique du dispositif d'amplification pour l'application d'un signal précédemment enregistré. Dans ce qui suit, on conviendra que : - le milieu biologique au sens de l'invention comprend le milieu de culture in vitro des microorganismes (bactéries, virus tel que le virus du SIDA, le virus de la grippe aviaire, le virus présumé de la polyarthrite rhumatoïde) ou, pour les prélèvement effectués in vivo : le plasma prélevé sur héparine ; l'urine ; le sperme ; la salive ; le liquide lacrymal ; - les éléments biochimiques présentant une activité biologiques sont gardés dans des milieux de culture filtrés pour enlever tout organisme vivant (filtres de 0,45pm, puis 0,lpm ou 0,02pm pour les bactéries, respectivement de 0,45pm, puis 0,02pm pour les virus). Les signaux électromagnétiques sont enregistrés sur ordinateur et 20 donnent lieu à diverses formes de représentations : - globaux, en amplitude sur 6 secondes ; - positifs (+), s'ils comprennent deux fois le bruit de fond ; - en analyse de Fourier (histogramme en 2D) ; - en analyse de Fourier (histogramme en 3D). 25 Le principe de la méthode est le suivant : le milieu biologique (par exemple un plasma provenant du sang humain) est d'abord prédilué au centième dans un liquide physiologique (milieu RPMI 16/40 ou milieu physiologique), il est ensuite filtré (étape b) par un filtre, par exemple un filtre de 0,45 pm (micromètre) pour éliminer toutes bactéries de taille classique.

Le filtrat est filtré à nouveau, sur des filtres de 0,1 pm, ou par des filtres de 0,02 pm (20nm). Le filtrat résultant est ensuite dilué (étape c) de 10 en 10, par exemple 0,1 ml filtrat + 0,9 ml du milieu déjà utilisé pour la première dilution au centième, par exemple dans tubes plastique de 1,5m1 stériles et obturables par un bouchon. Entre chaque dilution, le tube de la dilution précédente est homogénéisé (étape d) pendant minimum 15 secondes dans un appareil de type Vortex, à la puissance maximum. Toutes ces opérations sont effectuées dans une hotte à flux laminaire de classe 100, l'opérateur portant vêtements et gants stériles pour éviter toute 10 contamination extérieure. Puis chaque tube contenant une dilution, est déposé sur la cellule de lecture sensible de 0 à 20000 hertz, placée sur une table en un matériau non conducteur. Chaque échantillon est lu pendant 6 secondes (étape e) deux fois de suite, chaque lecture étant saisie séparément afin de permettre une duplication 15 des résultats (figure 4). Afin de rendre le plus lisible possible le signal caractéristique émis par l'échantillon, on peut avantageusement émettre un signal d'activation, composé d'une fréquence et d'une amplitude connues. Cette fréquence sera filtrée au moment de la lecture. Les signaux électriques produits par la cellule de lecture, et issus des 20 ondes électromagnétiques qui ont traversé le tube, sont enregistrés (étape f) sur ordinateur grâce à une carte audio, compressés puis amplifiés 500 fois, avant d'être enregistrés et mesurés sur ordinateur suivant un logiciel original spécifiquement adapté. Ce logiciel est capable d'enregistrer et de représenter sous différentes formes graphiques, une compression globale des signaux (Figure 4) 25 pouvant montrer une différence d'amplitude par rapport à un bruit de fond ambiant (Figure 3). Cette différence d'amplitude pouvant atteindre un rapport de deux ou trois par rapport au bruit de fond. Les principales fréquences composant le signal sont ensuite classées, en trois dimensions, avec affichage en nuances de gris arbitraires en fonction des 30 plages de fréquences (Figure 5). Enfin, par une décomposition de Fourier, permettant de mettre en évidence les principales harmoniques composantes du signal (Figures 7 et 8). Les informations numériques issues de la transformation de fourrier sont stockées dans une base de données. Afin de diminuer le bruit de fond et d'augmenter la spécificité des signaux, il est recommandé d'effectuer les mesures, dans un local qui ne soit pas trop perturbé par des signaux radio électriques, par exemple provenant de téléphones portables. Dans une variante avantageuse de l'invention décrite en figure 2, on disposera de capteurs d'activité électromagnétique 1 en regard de chacune des strates de sédimentation dans le tube que l'on veut enregistrer. Ces différents capteurs seront sélectionnés par le commutateur 4 en fonction de la couche de liquide biologique que l'on voudra enregistrer après centrifugation. De même, afin de filtrer plus facilement le bruit électromagnétique ambiant, on ajoutera au dispositif un capteur distant 5 du milieu à enregistrer, de sorte que le signal final qui sera enregistré sur les supports d'enregistrement de l'ordinateur 3 sera constitué de la différence entre le signal acquis sur l'un des capteurs de 1 et le bruit ambiant capté 5. La description est complétée par les essais de réalisation suivants, relatifs: - au mycoplasme Mycoplasma pirum ; - au virus du SIDA, souche IIIB (LAI) ; - à la bactérie Escherichia Coli K12 ; - au plasma d'un patient souffrant d'une maladie neurologique dont l'origine supposée, mais non prouvée, serait l'agent de Lyme, Borrelia Borgendorfi. Expérience 1 : Application à une culture de M.pirum en cellules CEM.

Une culture de M.pirum en cellules CEM est préparée dans un milieu de culture rpmi 1640+10% de sérum de veau foetal. Les cellules en bon état, montrent la présence d'agrégats typiques liés à la présence de M.pirum. La suspension est centrifugée en basse vitesse pour éliminer les cellules. Le surnageant est filtré sur filtre Millipore PEVD 0,45p, puis le filtrat est filtré à nouveau sur filtre Whatman 0,02p ou Millipore 0,1p.

On compare avec un surnageant de cellules CEM non infectées, filtré dans les mêmes conditions. Les solutions sont diluées de 10 en 10 en rpmi complet sous hotte à flux laminaire jusqu'à 10-7. On traite au Vortex (puissance maximum) pendant 15 secondes chaque solution avant la dilution suivante.

La détection des signaux est réalisée avec un équipement dont la figure 2 représente une vue schématique. L'équipement comprend une cellule de lecture 1 sensible de 0 à 20000 hertz, placée sur une table en bois. Les solutions à lire sont distribuées dans des tubes en plastique 2 Eppendorf (nom commercial) de 1,5 ml. Le volume de liquide est en général de 1mI, dans quelques cas de 0,3 à 0,5 ml, sans qu'une différence de réponse soit notée. Chaque échantillon est lu pendant 6 secondes, deux fois de suite, chaque lecture étant saisie séparément. L'origine des signaux, correspondant aux différents niveaux de sédimentation dans le tube, est sélectionnée selon le commutateur 4. En effet, à chaque strate de sédimentation, correspond une cellule de lecture composée d'un fil en cuivre émaillé de longueur et de diamètre similaire. Les signaux électromagnétiques sont transformés en signaux électriques avant d'être amplifiés grâce à une carte audio 6 située dans l'ordinateur 3. Le bruit électromagnétique ambiant est capté par une cellule 5 éloignée du tube contenant la source à enregistrer 2. Des logiciels appropriés situés dans l'ordinateur 3 effectuent les traitements de filtrage nécessaires (par exemple soustraction du bruit ambiant obtenu sur la cellule 5 et déduit du signal enregistré sur la cellule 1, donnent une représentation visuelle des enregistrements ainsi obtenus : - une représentation globale brute en amplitude (figure 4). Un bruit de fond (-) (figure 3) est observé, transformé en moyenne. Un signal électromagnétique est détecté, défini alors comme (+), lorsque l'amplitude dépasse au moins 1,5 fois le bruit de fond. En général l'amplitude détectée est le double du bruit de fond (++), parfois le triple : il sera appelé signal électromagnétique ou signature électromagnétique (SEM). - une analyse par histogramme en trois dimensions (figure 6) ; - une décomposition en fréquences individuelles par transformation de Fourier (figure 8). Expérience 2 : Comportement de la source de SEM en centrifugation à l'équilibre de densité en gradient de saccharose 20-70% en PBS 5 sans Ca++ ni Mg++. On procède à une centrifugation pendant 2h à 35000 tours par minutes à +4 C. On part du premier filtrat 0,02p conservé pendant une nuit à +4 C. On vérifie qu'il est toujours positif juste avant la centrifugation. Après cette centrifugation, on collecte 12 fractions à partir du fond 10 du tube. La mesure des indices de réfraction permet de déterminer le gradient de densité. On regroupe ensuite les fractions 2 à 2. On les dilue jusqu'à 10-' en milieu RPMI 16/40 + sérum de veau à concentration de 10%. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 1. Pool 1-2 densité 1,26-1,28 Pool 3-4 densité 1,25-1,26 (-) à toutes dilutions Non dilué (-) 10-1 (-) 10-2 (+) 10 3 (-) 10 4 (++) 10 5 (++) 10 6 (++) 10' (-) Tableau 1 La négativité des fractions les moins diluées peut s'expliquer par une auto-interférence des signaux émis par des sources trop nombreuses. On 20 vérifie cette auto-inhibition en mélangeant 0,1 millilitre du non dilué à 0,4 ml de la 155 dilution 10-4 : après vortex, on observe effectivement une extinction du signal qui devient négatif. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 2. Pool 5-6 Pool 7-8 densité 1,21-1,225 densité 1,165- 1,194 Non dilué (-) Non dilué (-) 10-1 (-) 10-1 (-) 10-2 (_) 10-2 (-) 10 3 (-) 10 3 (-) 10-4 (-) 10-4 (-) 10-5 (++) 10-5 (++) 10-6 (++) 106 (++) 10-7 (+) 10-7 (++) Pool 9-10 densité 1,112-1,114 Pool 11-12-13 (haut) Non dilué à 10-' (-) Non dilué à 10-7 (-) Tableau 2 On constate que la source des signaux électromagnétiques se comporte comme un polymère de grande taille (mais <0,02p) et de densité située 10 entre 1,16 et 1,26. Il existe par ailleurs un effet de zone qui n'avait pas été vu avec la préparation brute non centrifugée. Il y a auto-interférence pour les dilutions jusqu'à 10-4 au pic d'activité (5-6 et 7-8). Expérience 3 : Application à une culture de cellules CEM infectées 15 VIH l/IIIB Cette expérience porte sur une culture de cellules CEM infectées par le VIH 1/IIIB, préparé en deux temps de culture : - 4 jours : début de l'effet cyto-pathogène (CPE) - 6 jours : effet CPE ++ Elle est comparée avec une culture témoin de CEM non infectée. Le protocole opératoire comporte les étapes suivantes : - filtration du surnageant à 0,45 micromètre - puis filtration à 0,02 micromètre - dilution du filtrat de 10 en 10 jusqu'à 10-' en milieu RPMI + sérum de veau - agitation forte au vortex 15 secondes à chaque étape de dilution. Résultats : 1) avec la culture de 4 jours, on n'observe aucun signal au-dessus 15 du bruit de fond. Il n'y a pas de différence avec le témoin CEM non infecté jusqu'à dilution 10-' 2 ) avec la culture infectée de 6 jours : 101 à 10"5 (-) 10-6 (++) 20 10-' (++) 10-8 (++) 10-9 1015 (-) On refait une expérience d'auto-interférence : 0,1 ml de la solution 10"1 (négative) + 0,4 ml de la solution 10"' 25 (positive) : cette dernière devient négative. Il y a donc bien auto-interférence aux faibles dilutions. 3) Analyse en gradient de densité Le surnageant de la culture positive filtré à 0,02 micromètre est centrifugé à l'équilibre de densité en gradient de saccharose 20-70% à 35000 tours 30 par minute en rotor BECKMANN (nom commercial) SW56 à 4 C.

Un surnageant témoin de cellules CEM non infectées est traité de la même façon. Après centrifugation, 13 fractions sont collectées et regroupées 2 à 2. Les indices de réfraction de certaines fractions sont déterminées avec un réfractomètre ABBE (nom commercial) pour déterminer le gradient de densité. Les fractions de 400 ml sont diluées en milieu RPMI 16/40 plus sérum de veau. Des dilutions successives sont effectuées de 10 en 10 à partir de ces fractions. On constate que les groupes de densité 1,23 û 1,24 et densité 1,19-1,21 sont très positifs jusqu'à la dilution 10-7. Le groupe de densité 1,15-1,16 donne des signaux positifs jusqu'à la dilution 10-7. Le groupe du haut du tube ne donne pas de signaux, quelle que soit la dilution. Les groupes de fraction de base du tube (densité 1,25 à 1,28) donnent de signaux positifs à seulement quelques dilutions.

Contrairement à M. pirum, il y a auto-interférence pour le filtrat de départ et pas d'auto-interférence à partir des fractions du gradient. La majorité des signaux dans ce cas se concentre, comme chez M. pirum, dans les fractions de densité de 1,19 à 1,26, avec cependant une épaule vers les fractions plus légères de 1,16.

Expérience 4 : Essai d'inactivation de la source de SEM de M. Pirum On place dans un tube Eppendorf un millilitre d'un filtrat 0,02 micromètre de M. Pirum à la dilution 10-1 Ce tube est placé dans un solénoïde alimenté pendant 10 minutes par le signal électrique brut enregistré précédemment sur une préparation de M. Pirum à la même dilution, après amplification. La figure 9 représente une vue schématique de l'équipement, comportant un ordinateur 3 muni d'une carte son 4 dont la sortie est reliée à un amplificateur 10 d'une puissance maximale de 60 watt, dans l'exemple décrit. Le signal amplifié est appliqué à un solénoïde flexible 11 dans lequel est plongé le tube Eppendorf 12. Le signal appliqué est mesuré avec un équipement 13. Différents types de signaux amplifiés sont appliqués pendant 10 minutes à la suspension de M. Pirum qui donnait un signal positif : a) Ce même signal, mais amplifié : le signal de départ reste positif. Par contre, un tube témoin contenant le filtrat 0,02 micromètre des cellules CEM non infectées qui était négatif, devient positif. Ceci suggère que l'on peut transmettre les signaux électromagnétiques dans un milieu non activé, sous réserve que le spectre initial n'ait pas été modifié. b) Si l'on choisit dans le spectre des signaux électromagnétiques émis par les nanostructures de M. Pirum les fréquences de plus grande intensité (179, 374, 624, 1000, 2000 Hertz), le signal reste également positif, après application de ces fréquences amplifiées. c) Par contre, si l'on applique ces mêmes signaux, mais en inversion de phase, la positivité SEM disparaît. Ceci est également le cas lorsqu'on utilise la totalité des SEM émis par M. Pirum en inversion de phase. d) Il est également possible de neutraliser les signaux par allo- interférence, c'est-à-dire par des signaux provenant d'un autre micro-organisme (colibacille). Expérience 5 : analyse du plasma de sujets atteints par différentes infections (VIH, urétrite à Uréaplasma urolyticum, polyarthrite rhumatoïde). Cette analyse indique que ces plasmas, une fois filtrés et dilués convenablement, sont émetteurs de signaux analogues à ceux émis par les mêmes micro-organismes in vitro, à l'exception de la polyarthrite où la cause infectieuse n'a pas encore été identifiée. En particulier, dans le cas de sujets atteints de Sida et traités par trithérapie anti-rétrovirale, ces signaux sont émis par de hautes dilutions du plasma (jusqu'à 10-16), suggérant qu'ils existent en abondance après disparition de la charge virale plasmatique et pourraient contribuer à l'infection résiduelle persistant au traitement. CONCLUSION GENERALE Des micro-organismes de nature différente, tels que des rétrovirus (VIH), des bactéries sans parois rigides proches des Grarn + (M.pirum), des bactéries avec parois rigides Gram û (E.coli) produisent des nanostructures persistant dans des solutions aqueuses. Après l'étape indispensable de filtration, qui va éliminer les particules physiques des micro-organismes, ces nanostructures (de taille inférieure à 100 nanomètres) émettent des signaux électromagnétiques complexes de basses fréquences qui peuvent être enregistrés et numérisés. Les mêmes résultats peuvent être obtenus à partir du plasma de sujets infectés par ces micro-organismes. Ces nanostructures diffèrent des micro-organismes qui les ont générés par leur large spectre de densité, et leur sensibilité à la congélation. Les signaux qu'elles émettent peuvent être neutralisés parauto-interférence avec les signaux préalablement enregistrés et inversés en phase, ou par allo-interférence avec les signaux provenant d'autres micro-organismes. 25 30 35

Claims (4)

REVENDICATIONS

1 - Procédé de caractérisation d'un élément biochimique présentant une 5 activité biologique, se trouvant dans un milieu biologique, ledit procédé comportant les étapes suivantes: a. prédiluer le milieu biologique pour obtenir un milieu dilué; b. filtrer au moins une fois le milieu dilué pour obtenir un milieu filtré; c. diluer le milieu filtré pour obtenir une solution diluée ; 10 d. homogénéiser ladite solution diluée par agitation forte e. acquérir les signaux électromagnétiques de basse fréquence émis par ladite solution diluée et homogénéisée, f. enregistrer lesdits signaux sur un support informatique approprié ; g. analyser lesdits signaux. 15

2 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite étape de filtration utilise un filtre présentant une porosité inférieure ou égale à 100 nanomètres, de préférence comprise entre 20 nanomètres et 100 nanomètres.

3 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le niveau de dilution de ladite étape de dilution est compris 20 entre 10-2 et 10-20 , de préférence compris entre 10-2 et 10-9.

4 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comporte une étape de centrifugation après l'étape d'agitation forte. - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ladite étape d'acquisition desdits signaux électromagnétiques de basse 25 fréquence émis par ladite solution diluée comprend une étape d'excitation de ladite solution par un signal électromagnétique d'excitation défini. 6 - Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que le signal électromagnétique d'excitation défini de ladite solution est d'amplitude et de fréquence fixes connues. 30 7 -Procédé selon l'une des revendications 5 ou 6 caractérisé en ce que l'on procède au filtrage du signal électromagnétique d'excitation défini après la lecture desdits signaux électromagnétiques émis par la solution diluée, afin d'obtenir une signature caractéristique de l'activité biologique de ladite solution diluée. 8 - Procédé selon la revendication 7 caractérisé en ce qu'il comprend en outre : une étape d'enregistrement de ladite signature obtenue pour ledit élément biochimique; et une étape de comparaison de ladite signature avec des signatures des éléments biochimiques connus, préalablement enregistrées. 9 - Procédé selon la revendication 8 caractérisé en ce qu'il comprend une étape de décomposition de la signature obtenue en couples fréquence-amplitude par transformation de Fourier. 10 - Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il comprend 15 une étape de tri desdits couples fréquence-amplitude par ordre inverse d'importance selon leur amplitude. 11 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 10, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de production d'un indice de rapprochement correspondant à la moyenne des amplitudes pour la liste des 20 fréquences considérées. 12 - Procédé selon l'une quelconque des revendications 5 à 11, caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'identification des plages de dilution dans lesquelles ledit signal est positif. 13 - Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il comprend 25 une étape d'identification des plages de dilution dans lesquelles ledit signal est positif h heures après la réalisation de l'étape d'identification, avec h allant de 1 à 24.