FR2888241A1 - Methode d'obtention d'un profil genetique specifique d'une variete de ble a l'aide de couples d'amorces. - Google Patents

Methode d'obtention d'un profil genetique specifique d'une variete de ble a l'aide de couples d'amorces. Download PDF

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Abstract

La présente invention concerne un ensemble de couples d'amorces, comprenant au moins 5 couples d'amorces, lesdits couples étant choisis dans le but d'obtenir un ensemble de fragments d'ADN spécifique d'une variété végétale de blé. Cet ensemble est utilisé dans une méthode d'obtention d'un profil génétique d'une variété végétale de blé et dans une méthode de discrimination de variétés végétales de blé par comparaison du ou des profil(s) obtenu(s) avec des profils de variétés connues.

Description

2888241 1
METHODE D'OBTENTION D'UN PROFIL GENETIQUE SPECIFIQUE D'UNE VARIETE DE BLE A L'AIDE DE COUPLES D'AMORCES [0001] La présente invention concerne un ensemble de couples d'amorces, comprenant au moins 5 couples d'amorces, lesdits couples étant choisis dans le but d'obtenir un ensemble de fragments d'ADN spécifique d'une variété végétale de blé c'est-à-dire représentatif de son identité variétale. L'invention porte également sur un ensemble de fragments d'ADN amplifiés par un ensemble de couples d'amorces selon l'invention.
2] L'invention fournit également un kit d'obtention d'un ensemble de fragments d'ADN spécifique d'une variété végétale de blé comprenant un ensemble de couples d'amorces selon l'invention. Dans un mode de réalisation particulier, ces couples d'amorces sont présentés sous forme d'une composition unique.
3] L'invention porte encore sur une méthode d'obtention d'un profil génétique spécifique d'une variété végétale de blé c'est-à-dire représentatif de son identité variétale, comprenant l'amplification simultanée d'au moins 5 loci d'une solution d'acides nucléiques obtenue à partir d'un produit dérivé de blé, au sein d'un unique mélange réactionnel, par un ensemble de couples d'amorces selon l'invention, conduisant à l'obtention d'un ensemble de fragments d'ADN amplifiés, et la détection de l'ensemble formé par lesdits fragments d'ADN amplifiés et ainsi l'obtention d'un profil génétique. Fait également partie de l'invention, une méthode de discrimination de variétés végétales de blé comprenant une méthode d'obtention d'un profil génétique selon l'invention et la comparaison du ou des profil(s) obtenu(s) avec des profils de variétés connues.
4] Le blé est une céréale dont les utilisations sont nombreuses, et notamment dans la fabrication de farines destinées à l'alimentation. La qualité, qui peut varier considérablement d'une variété à l'autre, est déterminée par plusieurs facteurs et entre autres le contenu en protéines totales ou la force boulangère (essai de panification). Ainsi, la valeur d'une farine résultant d'une variété de blé particulière détermine si la variété végétale testée peut être utilisée dans la fabrication de farine destinée à la fabrication du pain, seule ou en mélange, et dans quelle proportion. Par conséquent, il est nécessaire de pouvoir identifier avec certitude la nature de la variété végétale utilisée notamment dans la fabrication de farines ou de produits à base de farines, d'une part, pour s'assurer de sa qualité et, d'autre part, dans le respect de la réglementation sanitaire et alimentaire.
5] L'identification de variétés végétales a longtemps reposé sur des techniques telles que la visualisation directe du grain ou la croissance de la plante, ou plus récemment sur l'électrophorèse protéique. Cependant, l'utilisation de ces techniques se trouve limitée par la présence sur le marché européen, et plus particulièrement français, d'un grand nombre de variétés végétales de blé, dont l'identité génétique est proche.
6] Le brevet EP 0 835 324 liste 233 couples d'amorces en indiquant qu'elles sont utilisables pour l'amplification de loci de blé de l'espèce Triticum aestivum. Ce brevet indique, au paragraphe 8, que les couples listés amplifient des fragments ayant un degré de polymorphisme (couples polymorphes) élevé entre les différentes variétés et permettent de détecter plusieurs allèles par locus. Cependant, aucun test expérimental ni résultat ne viennent confirmer ces allégations, mettant ainsi en doute que l'ensemble des couples cités dans le brevet soit utilisable afin d'obtenir plusieurs allèles par locus. Les résultats ci-dessous (Tableau 8) montreront qu'un certain nombre de ces couples n'est pas approprié pour l'amplification de loci de blé dans la mesure où ils sont soit monomorphes, soit faiblement polymorphes. Ceci est confirmé dans la publication de Roder et al. (Genetics 149: 2007-2003; August 1998) qui, tout en listant 279 couples d'amorces, indique qu'un nombre important d'entre eux (environ 70%) n'est pas fonctionnel (page 2008), c'est-à-dire non adapté à des analyses génétiques, parce que l'amplification conduit à l'obtention d'un nuage de bandes (smear), de fragments de taille incorrecte ou de fragment de taille unique (page 2009, deuxième colonne). Cette publication vise à effectuer une carte génétique des microsatellites du blé.
7] Il convient également de rapporter que le paragraphe 10 du brevet EP 0 835 324 mentionne qu'il est possible ainsi de différencier presque toutes les lignées de blé européennes, sans qu'il soit fait référence à aucune de ces lignées. De plus, la demande ne donne pas de précision quant au nombre de marqueurs et au nombre de réaction d'amplification nécessaires, pour discriminer les différentes variétés végétales de blé.
8] Il est à noter dans ce brevet, tout comme dans la publication de Roder et al., qu'il est procédé à l'amplification d'un seul couple d'amorces par volume réactionnel, comme en témoigne le paragraphe 14 de la demande EP 0 835 324 qui indique que les réactions PCR sont mélangées, avant la séparation des fragments sur gel. Les mêmes conclusions peuvent être apportées vis-à-vis de Roder et al. qui mentionne, dans le paragraphe Polymerase chain reaction and fragment analysis , 3 températures d'hybridation (50, 55 ou 60 C) suivant le microsatellite utilisé. Ainsi, le fait que chaque marqueur microsatellite ait une température d'hybridation différente d'une part et que chaque couple soit amplifié indépendamment dans un volume réactionnel d'autre part, complique la procédure d'identification par de multiples étapes, chacune étant une source potentielle d'erreurs, et la rend longue et coûteuse.
9] Il existe donc un réel besoin pour une technique d'identification de variétés végétales de blé avec un nombre limité d'étapes, rapide et bon marché par rapport aux techniques existantes, sans cependant réduire la certitude des résultats. La présente invention se propose de résoudre ces problèmes par l'utilisation d'un faible nombre de couples d'amorces permettant l'obtention d'un profil génétique spécifique, et ainsi de discriminer au moins 50 variétés végétales de blé.
0] La présente invention concerne un ensemble de couples d'amorces, dans lequel au moins 5 couples d'amorces, constitués chacun d'une amorce sens et d'une amorce antisens, sont choisis parmi les couples illustrés dans le Tableau 1 ci-dessous. Par conséquent, l'ensemble de couples d'amorces selon l'invention peut comprendre plus de 5 couples, dont au moins 5 couples sont choisis parmi ceux du Tableau 1. II est également envisageable d'utiliser un ensemble de couples d'amorces qui comprend ou consiste en 6, 7 ou 8 couples choisis parmi ceux du Tableau 1. L'expression constitués d'une amorce sens et d'une amorce antisens signifie que chaque couple (désigné par les majuscules A à x) identifié dans le Tableau 1 correspond à une seule paire d'amorces à savoir la paire SEQ ID NO:1 / SEQ ID NO:2 pour le couple A, la paire SEQ ID NO:3 / SEQ ID NO:4 pour le couple B, et ainsi de suite. II n'est pas envisageable de mélanger les amorces de différents couples. En effet, chaque couple permet l'amplification d'un locus déterminé.
1] Dans la présente invention, les définitions suivantes sont utilisées: Par le terme locus (au pluriel, des loci), on entend la position de la région amplifiée par le couple d'amorces dans le génome du blé. A un locus donné correspondent des allèles , c'est-à-dire des formes différentes de l'ADN du même locus, en terme de composition nucléotidique (remplacement d'une ou plusieurs bases par d'autres) ou en terme de taille (insertion ou délétion d'une ou plusieurs paires de bases, nombre variable de répétions contenues au locus). Un locus est dit polymorphe lorsque qu'il présente au moins deux allèles observés entre plusieurs génomes, et monomorphe lorsqu'il présente un seul type d'allèle. L'amplification d'un locus donné permet d'obtenir des fragments d'amplification (ou amplicons ou fragments d'ADN amplifiés), représentatifs des différents allèles présents au locus.
2] Dans un mode de réalisation particulier, les couples d'amorces selon l'invention correspondent à des loci hautement polymorphes chez le blé c'est-à-dire que l'amplification d'un génome de blé produit des fragments amplifiés présentant des tailles variables. Dans un autre mode de réalisation préféré, les loci amplifiés sont des microsatellites, c'est à dire que chaque locus présente des répétitions dont le nombre est variable d'une variété végétale à l'autre. Ainsi, les couples d'amorces choisis selon l'invention amplifient un locus présentant un nombre d'allèles par locus supérieur à 3. Le nombre d'allèles par locus est préférentiellement compris entre 3 et 10.
3] Dans un mode de réalisation particulier, le nombre d'allèles par locus est déterminé sur au moins 10, 20, 30, 40 ou 50 variétés végétales. Ainsi, un locus polymorphe selon la définition donnée ci-dessus convient aux fins de la présente invention lorsqu'il a été identifié au moins 3 allèles après amplification d'au moins 36 variétés végétales testées. Dans un autre mode de réalisation particulier, le nombre d'allèles attaché à un couple d'amorces de l'invention est supérieur ou égal à 3, 4, 5, 6, 7 ou 8.
4] Le blé tendre (Triticum aestivum) est une espèce hexaploïde, c'est à dire qu'il présente 3 génomes diploïdes différents (génomes A, B et D). Ainsi, l'amplification d'un locus donne 2 fragments d'ADN amplifiés (provenant des deux chromosomes d'une même paire) dont la taille peut être identique ou différente. Dans une variété pure, les deux chromosomes d'une paire considérée sont identiques; après amplification d'un locus, on obtient donc deux fragments de même taille. En revanche, dans une variété hybride, les deux chromosomes d'une paire considérée peuvent être différents; on obtient donc soit des fragments de taille différente, soit des fragments de taille identique (lignées parentes présentant un allèle de même taille).
Seq ID NO Couple Amorce sens
GGA TTG GAG TTA AGA GAG AAC CG GCA GAG CCT GGT TCA AAA AG TGC TCT TTG GCG AAT ATA TGG CGC ACC ATC TGT ATC ATT CTG TGC CTG GCT CGT TCT ATC TC AAC TTG CAA AAC TGT TCT GA ATC GCA TGA TGC ACG TAG AG TCA GTG GGC AAG CTA CAC AG CGT ACT CCA CTC CAC ACG G TCA TAC GGG TAT GGT TGG AC GAG TCC TGA TGT GAA GCT GTT G TCA AAA CAT AAA TGT TCA TTG GA CCA TTT CAC CTA ATG CCT GC GCA AGA AGC AAC AGC AGT AAC CCA ACC GTG CTA TTA GTC ATT C AAT AGA GCC CTG GGA CTG GG GCT TGA GAC CGG CAC AGT GCA AGA AGC AAC AGC AGT AAC ATG ACC CTT CTG CCA AAC AC ATG GAG ATA TTT GGC CTA CAA C GCA ATC TTT TTT CTG ACC ACG GTG AAG CAG ACC CAC AAC AC GTG CTT GCT GAG CTA TGA GTC TTC CTC ACT GTA AGG GCG TT
Amorce antisens
GCA GAG TGA TCA ATG CCA GA CGC CTC TAG CGA GAG CTA TG
GTT CAA AAC AAA TTA AAA GGC CC TGG TCG TAC CAA AGT ATA CGG CTA GCT TAG CAC TGT CGC CC TAT TTG AAG CGG TTT GAT TT ACA TGC ATG CCT ACC TAA TGG AAA ACT TAG TAG CCG CGT CGG TCC AAG TGC TAC CTT TC CAC CCC CTT GTT GGT CAC CTC ATT GGG GTG TGT ACG TG TCA ACC GTG TGT AAT TTT GTC C AAT AAA ACC ATG AGC TCA CTT GC CAG ATG CTC TTC TCT GCT GG CAA TGC AGG CCC TCC TAA C GAA GGA CGA CAT TCC ACC TG CGA GAC CTT GAG GGT CTA GA CAG ATG CTC TTC TCT GCT GG ATC GAC CGG GAT CTA GCC CTT GAC TTC AAG GCG TGA CA ATG TGC ATG TCG GAC GC GAC GGC TGC GAC GTA GAG GTG CCA CGT GGT ACC TTT G CAG CCT TAG CCT TGG CG
Seq ID NO Tableau 1: Couples d'amorces (toutes les amorces se lisent selon une orientation de 5' vers 3') rn [0015] Dans un mode de réalisation particulier, les couples d'amorces de l'ensemble selon l'invention sont choisis pour amplifier des loci qui ne sont pas liés génétiquement, c'est-à-dire que la ségrégation d'un locus est indépendante de celle d'un autre locus. Ceci est atteint en choisissant a) des loci présents sur des chromosomes de génomes différents, b) des loci présents sur différents chromosomes d'un même génome ou c) des loci présents sur un même chromosome mais à une distance génétique suffisamment élevée pour que la transmission des loci lors d'un phénomène de méiose soit indépendante.
6] Les couples d'amorces de l'ensemble de l'invention sont choisis afin d'obtenir avec ces seuls couples d'amorces un ensemble de fragments qui s'avère spécifique pour chaque variété végétale de blé. Par spécifique , on entend que chaque variété végétale de blé donne, après amplification, avec un ensemble de couples d'amorces selon l'invention un ensemble unique de fragments d'ADN qui est caractéristique de ladite variété et qui peut donc permettre de l'identifier parmi d'autres. En d'autres termes, cet ensemble de fragments d'ADN ainsi obtenu n'est retrouvé chez aucune autre variété végétale de blé d'un groupe de variétés choisies. En d'autres termes, une variété végétale de blé peut être caractérisée par un ensemble de fragments d'ADN.
7] A l'heure actuelle, les ensembles de couples d'amorces selon l'invention permettent d'identifier avec certitude une variété végétale de blé parmi les variétés végétales de blé connues en France et en Europe, et particulièrement parmi les variétés végétales de blé citées dans le tableau 2 suivant. Chaque variété végétale citée dans le tableau 2 donne, après amplification conformément aux conditions de l'invention, un ensemble de fragments d'ADN spécifique et unique, permettant ainsi à l'aide d'un nombre minimum de couples d'amorces de discriminer ces variétés entre elles.
8] Ainsi, un ensemble selon l'invention comprenant ou consistant en 5 couples d'amorces permet d'identifier une variété végétale de blé parmi au moins 50 variétés végétales connues. Il est bien entendu que l'ensemble de couples d'amorces selon l'invention est capable de discriminer une variété parmi des groupes de variétés végétales moins importants en nombre, c'est-à-dire au moins 20, au moins 30 ou au moins 40 variétés végétales. Dans un mode de réalisation particulier, 5 couples d'amorces choisis dans le tableau 1 sont capables de discriminer une variété végétale de blé parmi au moins 50 variétés végétales connues, et particulièrement parmi les 50 variétés végétales de blé du Tableau 2.
ALTRIA CAPHORN GALIBIER ORVANTIS ROYSSAC
ALLISTER CATALAN GUADALUPE PAINDOR SCIPION
ANDALOU CEZANNE ISENGRAIN PIKO SEMAFOR
APACHE CHARGER LANCELOT PR22R28 SHANGO
ASTRAKAN CRACKLIN LIMES PARADOR SIDERAL
AUBUSSON CLAIRE MACRO PULSAR SOISSONS
AUTAN COURTOT MALACCA PYTAGOR SPONSOR
BALTIMOR CROUSTY NIRVANA QUATUOR THESEE
BASTIDE E9715 OCCITAN RASPAIL TP506
CAMP REMY EVEIL ORNICAR RECITAL VIVANT
Tableau 2: Variétés végétales pures susceptibles d'être discriminées avec un ensemble de couples d'amorces selon l'invention.
9] Parmi, les ensembles de couples d'amorces selon l'invention, on citera tout particulièrement un ensemble comprenant ou consistant en les couples d'amorces suivants: a) A, B, L, P, U et W cités dans le tableau 1 ci-dessus, b) X, B, S, V et W, c) A, B, S, U et W, d) X, B, L, U et W, e) X, B,P,UetW,f)X,C,S,UetW,g)A,C,S,UetW,h)X,C,L,UetW,i)X, C,P,UetW,j)X,B,U, W,SetP,k)A,C,U,W,LetOetl)A,B,W,Uet L. Est compris dans l'invention, un ensemble comprenant 5 couples d'amorces selon le Tableau 1 et éventuellement au moins un autre couple répondant aux mêmes exigences d'hétérozygotie. Un tel ensemble permet de discriminer toutes les variétés végétales de blé, et au moins 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 1000 ou 2000 variétés végétales de blé (pures et/ou hybrides) d'un groupe prédéterminé.
0] Les couples d'amorces sont choisis pour le nombre important d'allèles qu'ils génèrent après amplification de l'ADN de blé (marqueurs hautement polymorphes). Ainsi, les couples du Tableau 1, lorsqu'ils sont associés dans des ensembles d'au moins 5 couples, sont capables de générer un nombre important de fragments ADN de taille variable. Ainsi, après amplification avec un ensemble de couples d'amorces selon l'invention, il apparaît possible d'obtenir jusqu'à 10000 ensembles de fragments d'ADN théoriques, se différenciant par le nombre de fragments qu'ils contiennent et/ou par la taille des fragments. II est donc parfaitement envisageable d'utiliser les ensembles de couples d'amorces selon l'invention pour discriminer une variété végétale de blé parmi au moins 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 1000 ou 2000 variétés végétales de blé (pures et/ou hybrides). La possibilité de discriminer autant de variétés végétales de blé peut être réalisée aussi bien avec des ensembles de couples d'amorces consistant en 5 couples, ou comprenant 5 couples, et de préférence consistant en 6 ou 7 couples d'amorces.
1] La présente invention englobe également le remplacement d'au moins un des 5 couples choisis parmi le Tableau 1 par un autre couple d'amorces répondant aux mêmes exigences que celles s'appliquant aux couples du Tableau 1, à savoir une forte hétérozygotie et un grand nombre d'allèles. De même, l'ensemble d'amorces selon l'invention comprend, en plus des couples d'amorces choisis dans le Tableau 1, au moins un couple d'amorces permettant l'amplification d'un locus de blé, et qui répond aux exigences citées ci-dessus.
2] Dans un mode de réalisation préféré, les amorces selon l'invention comprennent, attaché à l'extrémité 5', un polynucléotide dit universel. Le terme universel , dans la présente demande, signifie que ce polynucléotide présente la même séquence nucléotidique (taille et composition) pour toutes les amorces utilisées au sein d'un même ensemble de couples d'amorces selon l'invention. Le polynucléotide universel est choisi pour ne s'apparier ni à l'une quelconque des amorces de l'ensemble de couples d'amorces selon l'invention, ni aux produits d'amplification résultants (fragments d'ADN amplifiés), ce qui dans les deux cas réduirait l'efficacité de l'amplification et altérerait la composition de l'ensemble de fragments d'ADN obtenu. Un tel polynucléotide possède par exemple la séquence suivante: CCAGGACGTTGTAAAACGAC (Seq ID N 57).
3] Le polynucléotide universel peut être attaché en 5' des amorces sens d'un même ensemble, en 5' des amorces antisens d'un même ensemble ou indifféremment en 5' des amorces sens ou antisens.
L'attachement en 5' répond à une contrainte lors de l'amplification, puisque l'amplification est réalisée à partir de l'extrémité 3' des amorces; par conséquent, alors que les amorces s'hybrident à l'acide nucléique à amplifier, le polynucléotide universel se retrouve lors de l'amplification non-hybridé à l'ADN. Dans un mode réalisation préféré, le polynucléotide universel est fixé à l'amorce de façon covalente.
4] Dans un mode de réalisation particulier, les couples d'amorces sont choisis pour pouvoir être amplifiés au sein d'un même volume réactionnel, c'est-à-dire que plusieurs amplifications avec des couples d'amorces différents sont réalisées au sein d'une même composition.
5] La présente invention concerne également un ensemble de fragments d'ADN amplifiés par un ensemble de couples d'amorces selon l'invention, et plus particulièrement un ensemble de fragments d'ADN amplifiés spécifique, selon la définition ci-dessus, d'une variété végétale de blé. Dans un mode de réalisation particulier, l'ensemble de fragments d'ADN amplifiés selon l'invention est spécifique d'une variété végétale parmi au moins 10, au moins 20, au moins 30, au moins 40, au moins 50, au moins 60, au moins 70, au moins 80, au moins 90, au moins 100, au moins 200, au moins 300, au moins 400, au moins 500, au moins 1000 ou au moins 2000 variétés végétales de blé connues, et particulièrement parmi les 50 variétés végétales de blé pures du tableau 2. Ainsi, chaque variété végétale de blé citée dans le Tableau 2 est caractérisée par un ensemble de fragments d'ADN amplifiés qui lui est propre, c'est-à-dire que cet ensemble n'est retrouvé à l'identique chez aucune autre variété végétale du Tableau 2.
6] Un ensemble de fragments d'ADN amplifiés est considéré comme différent d'un ou de plusieurs autre(s) ensemble(s) lorsqu'au moins un des paramètres ci-dessous est vérifié : [0027] - un ensemble présente au moins un fragment qui a une taille différente de la taille des fragments des autres ensembles. Ceci résulte de la nature des allèles amplifiés qui sont de préférence des allèles qui possèdent un nombre de répétions nucléotidiques variables; ainsi, une variété végétale peut présenter a) un fragment de taille particulière qui lui est caractéristique, c'est-à- dire que ce fragment n'est pas retrouvé chez une autre variété du groupe des variétés considérées ou bien b) une combinaison de fragments particulière qui n'est pas retrouvée chez une autre variété du groupe des variétés considérées; [0028] - le nombre de fragments d'ADN détectés est différent entre les ensembles; ceci résulte en partie du fait que bien que le nombre de loci amplifiés soit le même d'une variété végétale à l'autre, les variétés de blé peuvent présenter des allèles identiques ou différents, en terme de taille, entre les 2 chromosomes d'une même paire. Ceci conduit lors de l'étape de détection à la mise en évidence d'un nombre plus ou moins grand de fragments, selon l'identité ou non en terme de taille des fragments. Ainsi pour deux loci, on peut avoir les combinaisons suivantes: - locus A: 2 fragments de taille identique et locus B: 2 fragments de taille identique; on détecte donc deux fragments.
- locus A ou locus B: 2 fragments de taille identique et respectivement locus B ou locus A: 2 fragments de taille différente; on détecte donc trois fragments.
- locus A: 2 fragments de taille différente et locus B: 2 fragments de taille différente; on détecte donc quatre fragments.
2888241 12 [0029] - un ensemble présente, pour une taille particulière une intensité différente (plus ou moins importante) par rapport à l'intensité d'un autre ensemble (pour un fragment de même taille). Ainsi, deux fragments migrant à la même position correspondant à la même taille donneront une intensité double par rapport à une intensité reflétant la présence d'un seul fragment. L'intensité reflète ici la quantité de fragment d'une certaine taille, dépendamment ou indépendamment de sa séquence nucléotidique. On peut en effet envisager l'amplification de deux loci qui donneraient des allèles dont les tailles se chevaucheraient. Peu importe dans ce cas la séquence nucléotidique du fragment dans la mesure où l'intensité est révélatrice d'une différence dans la composition des deux ensembles et reflète ainsi la nature différente des deux variétés végétales.
0] C'est ainsi que des ensembles de fragments d'ADN amplifiés présentant un de ces paramètres ou une combinaison d'au moins deux de ces paramètres permettent de discriminer à partir d'un faible nombre de loci un grand nombre de variétés végétales dans la mesure où les couples d'amorces sont choisis pour refléter de façon optimale les différences existantes dans le génome des variétés de blé à tester par rapport au groupe de variétés de référence.
1] Dans un mode de réalisation préféré, un ensemble de fragments d'ADN amplifiés est tel qu'obtenu par amplification du génome d'un grain de blé d'une variété donnée, au moyen d'un ensemble comprenant ou consistant en les couples d'amorces suivants: a) A, B, L, P, U et W cités dans le tableau 1 ci-dessus, b) X, B, S, V et W, c) A, B, S, U et W, d) X, B, L, V et W, e) X, B, P, V et W, f) X, C, S, V et W, g) A, C, S, U et W, h) X, C, L, U et W, i) X, C, P, U et W, j) X, B, U, W, S et P, k) A, C, U, W, L et O et I) A, B, W, U et L. Par génome d'un grain de blé , on entend l'ADN d'une cellule végétale d'un grain de blé. L'expression génome d'un grain de blé couvre également tout acide nucléique issu de l'ADN d'un grain de blé d'une variété donnée, tel que l'ADN génomique, l'ARN, l'ADNc.
2] La présente invention concerne également des ensembles de fragments d'ADN ainsi amplifiés qui sont représentés par un profil génétique tel que représenté aux Figures 2 et 3. Par profil génétique , on entend toute représentation d'un ensemble de fragments d'ADN amplifiés, permettant de détecter le nombre de fragments, leur taille, leur quantité et/ou leur intensité, au sein de cet ensemble. Alors que l'ensemble de fragments d'ADN amplifiés représente le résultat de l'amplification par les couples d'amorces selon l'invention, le profil génétique représente le résultat de la détection de cet ensemble, par tout moyen approprié, qui finalement permet de distinguer un ensemble de fragments d'ADN amplifiés par rapport à un autre ou d'autres ensemble(s).
3] Fait également partie de l'invention, un kit d'obtention d'un ensemble de fragments d'ADN amplifiés selon l'invention. Ce kit comprend un ensemble de couples d'amorces selon l'invention, et particulièrement un ensemble de couples d'amorces comprenant au moins 5 couples choisis parmi ceux du Tableau 1. Dans un mode de réalisation préféré, un ensemble de couples d'amorces selon l'invention est l'ensemble comprenant ou consistant en les couples d'amorces suivants: a) A, B, L, P, U et W cités dans le tableau 1 ci-dessus, b) X, B, S, V et W, c) A, B, S, U et W,d)X,B, L,VetW,e)X,B,P,VetW,f)X,C,S,VetW,g)A,C,S,Uet W, h) X, C, L, U et W, i) X, C, P, U et W, j) X, B, U, W, Set P, k) A, C, U, W, LetOetl)A,B,W,UetL.
4] Le kit comprend également au moins une solution servant de marqueur de taille, afin d'identifier la taille des fragments amplifiés. Ce marqueur de taille est constitué de fragments dont la taille est connue et qui servent ainsi de référence pour déterminer la taille des fragments d'ADN amplifiés. On peut aussi choisir des marqueurs de taille commerciaux, préférentiellement marqués, tel que le RDyeTM 700 infrared dye 50-350 sizing standard (Science Tec)... De façon préférée, on choisira comme marqueur de taille un ensemble de fragments d'ADN amplifié à partir de l'ADN d'une variété végétale connue, optionnellement marqué. L'avantage d'un tel marqueur de taille par rapport à un marqueur de taille commercial résulte du fait que certains fragments servant de référence présentent des tailles identiques aux fragments dont la taille est à déterminer, puisque l'origine des fragments est identique, à savoir une variété végétale de blé.
Avantageusement, on utilisera plusieurs ensembles de fragments d'ADN amplifiés comme référence. Dans ce cas, on choisira des ensembles couvrant un large éventail en terme de tailles minimale ou maximale, mais aussi des ensembles possédant des fragments dont l'incrémentation de taille est régulière. Ainsi sont préférés, les ensembles de fragments d'ADN amplifiés à partir d'une variété végétale de blé, obtenus avec des ensembles de couples d'amorces suivants: a) A, B, L, P, U et W cités dans le tableau 1 ci-dessus, b) X, B, S, V et W, c) A, B, S, U et W, d) X, B, L, V et W, e) X, B, P, V et W, f) X, C, S, V et W, g) A, C, S, U et W, h) X, C, L, U et W, i) X, C, P, U et W, j) X, B, U, W, S et P, k) A, C, U, W, L et O et I) A, B, W, U et L. De façon avantageuse, on utilisera le même ensemble de couples d'amorce pour l'identification des variétés végétales et pour la réalisation du ou des marqueur(s) de taille. Dans un mode de réalisation préférée, les variétés végétales de blé choisies pour réaliser ces marqueurs de taille sont au moins une variété végétale de blé parmiPytagor, Andalou, Isengrain, Bastide, Charger, Thésée, Claire, Crousty et/ou Altria.
5] Dans le kit selon l'invention, l'ensemble de couples d'amorces peut se présenter sous la forme de compositions en nombre égal au nombre d'amorces constituant l'ensemble de couples d'amorces; dans ce cas, l'utilisateur du kit est libre de combiner les différentes amorces dans des concentrations ou rapports entre amorces qu'il souhaite. Dans un autre mode de réalisation, l'ensemble de couples d'amorces peut se présenter sous la forme d'une composition unique, c'est-à-dire que les amorces sont regroupées au sein d'une seule et même composition, la concentration de chaque amorce, et le rapport de chaque amorce par rapport aux autres étant prédéfinis. Les amorces dans la composition de l'invention peuvent se présenter sous forme liquide ou sous forme lyophilisée.
6] Le kit peut optionnellement comprendre les réactifs nécessaires à l'amplification, et particulièrement à l'amplification en chaîne par polymérase (ACP ou PCR). Ainsi, peuvent faire partie du kit selon l'invention une polymérase, de préférence une polymérase thermostable telle que la Taq polymérase, et/ou des desoxyribonucléotide triphosphates (dNTP) dont un peut éventuellement être marqué.
7] Le kit selon l'invention peut également comprendre un polynucléotide dont la séquence nucléotidique est complémentaire (polynucléotide complémentaire) de celle d'un polynucléotide universel attaché à la partie 5' des amorces de l'invention. Le kit peut également comprendre un manuel divulguant les profils génétiques obtenus pour chaque variété végétale pouvant être testée et/ou les spécificités des profils de ces variétés.
8] Les amorces selon l'invention ou le polynucléotide complémentaire peuvent éventuellement être marqués de façon radioactive, fluorescente, enzymatique, chemoluminescente.
9] L'invention se rapporte également à une méthode d'obtention d'un profil génétique spécifique d'une variété végétale. Les termes profil génétique et spécifique sont ici utilisés conformément aux définitions données ci-dessus. La méthode de l'invention comprend: a. l'amplification simultanée d'au moins 5 loci d'une solution d'acides nucléiques obtenue à partir d'un produit dérivé de blé, au sein d'un unique mélange réactionnel, par un ensemble de couples d'amorces selon l'invention, conduisant à l'obtention d'un ensemble de fragments d'ADN amplifiés, et b. la détection de l'ensemble formé par lesdits fragments d'ADN amplifiés et l'obtention d'un profil génétique.
0] Par "produit dérivé de blé", on entend notamment les matières premières (grain ou malt de blé), les produits de première transformation (par exemple la farine de blé), les produits de seconde transformation (boulangerie, pâtisserie, viennoiserie, traiteur) et les produits finis (pain, bière). Par malt de blé , on entend un grain de blé germé. L'obtention d'une solution d'acides nucléiques peut par exemple consister en l'extraction de l'ADN.
1] Dans un mode de réalisation particulier, la méthode de l'invention est réalisée sur une solution d'acides nucléiques obtenue à partir d'un produit dérivé de blé, tel qu'un grain de blé, du malt de blé, du broyat de grains ou de malt de blé, de la farine de blé, du pain, de la bière ou tout produit de la boulangerie, viennoiserie, pâtisserie, traiteur.
2] Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, l'amplification est réalisée par amplification en chaîne par polymérase (ACP ou PCR), bien que toute méthode permettant l'amplification d'un locus à l'aide d'amorces puisse également être utilisée.
3] L'expression amplification simultanée , signifie que l'amplification des différents loci est réalisée en même temps, c'est-àdire suivant un programme d'amplification identique quel que soit le locus amplifié. Ainsi, le temps des différentes étapes d'une ACP, à savoir la dénaturation, l'hybridation et l'élongation, sont identiques pour tous les couples d'amorces utilisés.
4] L'expression unique mélange réactionnel signifie que les différents couples d'amorces sont utilisés au sein d'un même volume, permettant ainsi l'amplification de plusieurs loci dans une unique procédure d'amplification (communément appelée amplification multiplex). Ainsi, en plus d'être réalisée avec un programme identique en termes de temps de dénaturation, d'hybridation et d'élongation, l'amplification est également réalisée à des températures d'hybridation identiques pour tous les couples d'amorces, puisque les amorces sont contenues dans une unique composition. Plus particulièrement, l'efficacité d'une amplification dépend en grande partie de la stabilité de l'hybridation des amorces avec l'acide nucléique cible, ladite stabilité étant dépendante de la température utilisée pendant l'étape d'hybridation. En effet, c'est la composition nucléotidique des amorces qui détermine la température optimale théorique d'hybridation, celle-ci pouvant cependant se révéler différente dans les conditions expérimentales.
5] La détermination d'ensembles de couples d'amorces appropriés pour la méthode d'obtention d'un profil génétique spécifique d'une variété végétale a donc fait appel à une sélection, en plusieurs étapes successives, de quelques couples d'amorces parmi un grand nombre de couples d'amorces potentiels: [0046] 1 ère étape: sélection de couples d'amorces amplifiant des loci polymorphes; toutes les amorces, que ce soit celles décrites dans l'art antérieur ou celles capables potentiellement d'amplifier un locus de variété végétale de blé, ne conviennent pas forcément dans la présente méthode (Tableau 8). En effet, un nombre non-négligeable de couples d'amorces amplifient des loci monomorphes (un seul fragment) ou donnent des fragments de taille incorrecte ou une pluralité de fragments réalisant un nuage (smear). Pour la méthode de l'invention, n'ont été retenus que les couples d'amorces amplifiant des loci présentant un fort taux d'hétérozygotie, c'est-à-dire présentant un grand nombre d'allèles, comme expliqué ci-dessus. Le caractère polymorphe d'un locus amplifié par un couple d'amorces déterminé dépend du génome contenant ledit locus, et donc des variétés végétales testées. Il n'est donc pas possible de prévoir, avant la réalisation de l'amplification, quels sont les loci qui seront polymorphes dans les variétés végétales à discriminer. En effet, un locus pourrait être faiblement polymorphe dans un groupe de variétés végétales qui proviendraient d'une lignée commune, mais être fortement polymorphes pour des variétés végétales d'origine différente. Le choix des couples d'amorces ne se fait donc pas en fonction des résultats d'amplification sur une seule variété végétale, mais plutôt en fonction d'un groupe de variétés végétales donné considéré comme groupe de référence.
7] 2ème étape: sélection de couples d'amorces amplifiant à une température d'hybridation expérimentale déterminée; parmi les couples d'amorces sélectionnées à la première étape, il convient de déterminer ceux qui non seulement sont susceptibles d'amplifier à une température d'hybridation commune, mais aussi sont susceptibles de donner une amplification efficace en terme de qualité (taille de fragments correcte et absence de fragments additionnels qui pourraient résulter de la modification de la température théorique) et en terme de quantité finale de fragments.
8] 3ème étape: sélection de couples d'amorces amplifiant au sein d'un même volume réactionnel. II est essentiel de préciser à ce stade que la réaction d'amplification requiert une stoechiométrie (proportions des différents réactifs participant à la réaction) assez stricte et n'autorise pas de très grandes variations dans la concentration des différents réactifs (acide nucléique cible, amorces, enzyme, dNTP, sels..) . Ainsi, alors que deux couples d'amorces peuvent donner une amplification d'un loci efficace lorsque les amplifications sont réalisées dans des volumes réactionnels séparés, l'utilisation de ces mêmes couples d'amorces dans un unique volume réactionnel peut conduire à une diminution de l'efficacité de l'amplification d'un des deux loci ou des deux loci.
9] La réalisation d'une amplification multiplex impose les contraintes suivantes; il s'agit d'éviter d'une part les phénomènes de compétition entre amorces, c'est-à-dire l'hybridation (même incomplète) de deux amorces à la même séquence nucléique cible, et d'autre part l'hybridation des amorces entre elles ou avec un des produits d'amplification. En effet, toute hybridation d'une amorce à une autre séquence que la séquence cible altère, c'est-à-dire diminue, l'amplification normalement attendue entre les deux amorces du couple, et peut éventuellement conduire à l'amplification de fragments de taille incorrecte.
0] Les inventeurs ont dans la présente invention identifié des couples d'amorces qui, lorsqu'ils sont utilisés ensemble au sein d'un même volume réactionnel, sont capables d'amplifier efficacement leur locus, et permettent ainsi d'obtenir un ensemble de fragments d'ADN spécifique d'une variété végétale de blé. Ces couples d'amorces, résumés dans le tableau 1, ont montré, selon plusieurs combinaisons possibles d'au moins 5 couples d'amorces, une amplification efficace d'au moins 5 loci d'une variété végétale de blé. Un ensemble de couples d'amorces préféré pour la méthode de l'invention est un ensemble comprenant ou consistant en les couples d'amorces suivants: a) A, B, L, P, U et W cités dans le tableau 1 ci-dessus, b) X, B, S, V et W, c) A, B, S, U et W, d) X, B, L, V et W, e) X, B, P, V et W, f) X, C, S, V et W, g) A, C, S, U et W, h) X, C, L, U et W, i) X, C, P, U et W, j) X, B, U, W, S et P, k) A, C, U, W, L et O et l) A, B, W, U et L. [0051] Les autres contraintes imposées par une amplification multiplex sont les suivantes: [0052] - il convient de s'assurer qu'au sein d'un même volume réactionnel, chaque réaction d'amplification (c'est à dire chaque réaction d'un couple d'amorces), pourra être correctement réalisée en présence d'une quantité suffisante (non limitative) de réactifs. Par conséquent, les proportions des différents réactifs doivent être adaptées au nombre de couples d'amorces. Ainsi, dans un mode de réalisation préféré, la concentration finale de chaque amorce permettant la réaction d'amplification est comprise entre 10 nM et 1 pM, et particulièrement entre 50 et 500 nM. Dans un autre mode de réalisation préféré, qui peut être dépendant ou indépendant du précédent, la concentration finale d'ADN sur lequel est réalisée l'amplification est comprise entre 10 et 20 ng/pI.
3] - enfin, on sait qu'il existe une grande variabilité d'efficacité dans la réaction d'amplification entre différents couples d'amorces, provenant probablement, entre autres, de la séquence nucléotidique particulière de la séquence cible à amplifier. Ainsi, dans le cas d'un ensemble de couples d'amorces utilisé dans un seul volume réactionnel, il convient d'adapter la proportion des concentrations des différents couples d'amorces entre eux, afin de favoriser une efficacité aussi identique que possible de toutes les réactions d'amplification. Ainsi, les ensembles de couples d'amorces selon l'invention permettent une amplification efficace aussi bien en terme de qualité qu'en terme de quantité.
2888241 20 [0054] L'expression détection de l'ensemble formé par lesdits fragments d'ADN amplifiés signifie que les fragments d'ADN amplifiés sont identifiés selon des paramètres permettant de distinguer un ensemble de fragments d'ADN amplifiés d'un autre ensemble. De tels paramètres sont par exemple le nombre de fragments, leur taille, leur quantité, leur intensité, leur charge, leur structure tridimensionnelle, . ...
5] Dans un mode de réalisation particulier, la détection des fragments d'ADN amplifiés par l'amplification multiplex requiert leur séparation et leur visualisation. La séparation peut être réalisée selon un unique paramètre, ou bien selon la combinaison d'au moins deux paramètres, par exemple choisis parmi les paramètres suivants: la taille, la charge, la structure tridimensionnelle....
6] Dans un exemple de réalisation, les fragments sont séparés selon leur taille, par migration électrophorétique; les méthodes suivantes bien connues de l'homme du métier peuvent être utilisées afin de séparer les fragments d'ADN amplifiés obtenus dans le cadre de la présente invention: le gel d'électrophorèse (électrophorèse sur gel d'agarose ou sur un gel d'acrylamide) ou les techniques d'électrophorèse capillaire.
7] A titre d'exemple, la migration éléctrophorétique est effectuée sur un gel d'acrylamide, et de façon préférée sur un gel hautement résolutif et/ou en conditions dénaturantes (permettant la séparation des deux brins d'ADN d'un fragment amplifié).
8] La détection (sans séparation) ou la visualisation (après séparation) peut être réalisée par n'importe quelle technique connue, et notamment à l'aide de molécules qui se fixent à l'ADN (traceurs) ou s'intercalent dans l'ADN (agents intercalants) radioactifs, fluorescents, chemoluminescents et enzymatiques. II est ainsi possible de détecter ou visualiser l'ensemble de fragments à l'aide de bromure d'éthidium. Alternativement, la détection ou la visualisation des fragments d'amplification est réalisée par fluorescence, soit à l'aide d'un fragment nucléotidique marqué par fluorescence ou par l'intermédiaire des amorces sens ou antisens, auxquelles est liée une molécule fluorescente.
9] Dans un mode de réalisation préféré, la détection ou la visualisation est réalisée à l'aide d'un fragment nucléotidique marqué par fluorescence, qui est complémentaire d'un polynucléotide universel localisé en 5' de l'amorce sens. Par exemple, le fragment marqué par fluorescence est complémentaire de la séquence CCAGGACGTTGTAAAACGAC (Seq ID N 57). L'utilisation d'un seul fragment nucléotidique marqué (par opposition à une pluralité d'amorces sens ou antisens marquées) permet de réduire les coûts de détection, puisqu'une seule molécule est utilisée pour la détection de l'ensemble des fragments d'ADN amplifiés. Dans un mode de réalisation particulier, le fragment nucléotidique marqué par fluorescence possède, liée en 5', une molécule émettant dans l'infrarouge à 800 nm.
0] De plus, la méthode d'obtention d'un profil génétique selon l'invention peut optionnellement comprendre des étapes supplémentaires: [0061] (1) une étape d'extraction de l'ADN à partir d'un produit dérivé de blé (matières premières, produits de transformation ou finis), l'étape d'extraction précédant l'étape d'amplification simultanée multiplex. Dans un mode de réalisation particulier, l'extraction de l'ADN est réalisée par lyse chimique et/ou thermique et/ou enzymatique.
2] (2) une étape de broyage du grain de blé, précédant celle d'extraction, par exemple une étape de broyage mécanique, qui peut être réalisée sans addition de tampon.
3] Afin de rendre la présente méthode d'obtention encore plus rapide, on peut envisager de réaliser l'étape d'amplification, sans purification de l'ADN, c'est à dire directement après une étape optionnelle de broyage et une étape de lyse.
4] La méthode utilisée ci-dessus répond aux problèmes posés initialement, dans la détection d'une variété végétale de blé, à savoir la rapidité, le coût, et la certitude des résultats.
5] Ainsi, l'utilisation d'un ensemble de couples d'amorces au sein d'un unique volume réactionnel accélère la préparation des échantillons pour l'amplification dans la mesure où l'analyse de l'ADN d'une variété végétale requiert une seule réaction d'amplification, et rend sans objet les opérations de mélange des différents produits d'amplification, qui peuvent de plus être source d'erreurs et de contaminations. De plus l'absence de purification de l'ADN après son extraction n'altère pas l'efficacité et la qualité des amplifications, mais réduit de nouveau le temps nécessaire à l'obtention d'un profil génétique spécifique d'une variété végétale. Par conséquent, en réduisant le nombre d'étapes au stade de l'amplification mais également lors des étapes optionnelles antérieures, la méthode est plus rapide et permet d'obtenir un profil génétique environ 8 à 10 heures après le prélèvement du produit dérivé de blé.
6] Le coût s'en trouve également diminué du fait de l'utilisation d'un seul volume réactionnel pour l'amplification d'au moins 5 loci ce qui réduit, d'une part, la quantité de réactifs nécessaires et, d'autre part, la consommation de matériel utilisé. Enfin, le coût peut encore être diminué par l'utilisation d'une molécule marquée unique lors de l'étape de détection ou de visualisation.
7] La présente demande se rapporte également à une méthode de discrimination de variétés végétales de céréales, notamment de variétés de blé, comprenant une méthode d'obtention d'un profil génétique selon l'invention, et une étape c. de comparaison du ou des profil(s) obtenu(s) avec des profils de variétés connues, notamment les profils de variétés d'un groupe déterminé, considéré comme groupe de référence. Ainsi, la méthode de discrimination comprend: a. l'amplification simultanée d'au moins 5 loci d'une solution d'acides nucléiques obtenue à partir d'un produit dérivé de blé, au sein d'un unique mélange réactionnel, par un ensemble de couples d'amorces selon l'invention, conduisant à l'obtention d'un ensemble de fragments d'ADN amplifiés, b. la détection de l'ensemble formé par lesdits fragments d'ADN amplifiés et l'obtention d'un profil génétique, et c. la comparaison du ou des profil(s) obtenu(s) avec des profils de variétés connues.
8] Cette méthode peut comprendre les étapes optionnelles mentionnées ci-dessus pour la méthode d'obtention d'un profil génétique. Toutes les caractéristiques particulières décrites pour la méthode d'obtention d'un profil génétique s'appliquent également à la présente méthode. Dans un mode de réalisation préféré, la méthode de discrimination de variétés végétales de céréales selon l'invention permet de discriminer au moins 10, au moins 20, au moins 30, au moins 40, au moins 50, au moins 60, au moins 70, au moins 80, au moins 90, au moins 100, au moins 200, au moins 300, au moins 400, au moins 500, au moins 1000 ou au moins 2000 variétés végétales de blé, c'est à dire qu'il est possible de distinguer, avec certitude, une variété végétale de blé parmi un ensemble de 50 variétés végétales de blé connues (pures et/ou hybrides), et plus particulièrement parmi les 50 variétés végétales de blé du Tableau 2.
9] Par comparaison du ou des profil(s) obtenu(s) avec des profils de variétés connues , on entend toute technique qui permet de déterminer, à partir d'un profil génétique obtenu selon l'invention, l'identité de la variété à l'origine du grain de blé ayant donné ce profil. Dans un mode de réalisation préféré, le profil génétique dont l'origine est à déterminer est comparé à des profils génétiques de référence, déterminés par la méthode selon l'invention ou contenus dans une base de données et associés au nom d'une variété végétale de blé. Ainsi, chaque variété végétale est caractérisée par un profil génétique spécifique, tel que représenté sur les Figures 2 et 3. Tout profil génétique dont l'origine est à déterminer peut être comparé aux profils de référence par tous paramètres pertinents tels que ceux cités ci-dessus, et entre autres le nombre de fragments, leur taille, leur quantité et/ou leur intensité. Dans un mode de réalisation, un profil 2888241 24 génétique sera considéré comme identique à un profil génétique de référence lorsque ces profils ont le même nombre de fragments, et ces fragments ont exactement la même taille.
0] L'invention concerne également l'utilisation d'un ensemble de couples d'amorces selon l'invention pour discriminer des variétés végétales de blé. L'utilisation d'un ensemble de couples d'amorces permet de discriminer au moins 10, au moins 20, au moins 30, au moins 40 et avantageusement au moins 50, au moins 60, au moins 70, au moins 80, au moins 90, au moins 100, au moins 200, au moins 300, au moins 400, au moins 500, au moins 1000 ou au moins 2000 variétés végétales de blé (pures et/ou hybrides), et plus particulièrement les 50 variétés végétales de blé listées dans le Tableau 2.
1] L'utilisation de l'ensemble de couples d'amorces selon l'invention s'applique aux variétés végétales selon la définition de l'article premier de la Convention internationale pour la protection des obtentions végétales (UPOV) et/ou à toute plante de l'espèce Triticum aestivum qui ne répond pas à la définition d'une variété végétale selon la Convention UPOV.
2] Une quantité de grains de blé peut également être hétérogène quant à sa composition. Il est ainsi souhaitable de déterminer le nombre et/ou la nature des variétés végétales présentes au sein de cette quantité. Après prélèvement d'un échantillon représentatif de la quantité initiale, les méthodes explicitées ci-dessus sont appliquées indépendamment à chaque grain de blé constituant l'échantillon représentatif. L'identification de la variété végétale correspondant à chaque grain par les méthodes de l'invention permet ainsi: a) de déterminer le caractère homogène (une seule variété végétale) ou hétérogène (au moins deux variétés végétales) de la quantité de grains de blé initiale, et/ou b) de mettre en évidence une variété végétale qui ne fait pas partie du groupe de variétés de référence choisi, et/ou c) de mettre en évidence une plante qui ne répond pas à la définition d'une variété végétale (dans la mesure où une telle plante peut ne donner aucun fragment ou donner des fragments de taille aberrante après amplification), et/ou d) de distinguer des variétés végétales pures de variétés végétales hybrides.
DESCRIPTION DES FIGURES
3] Figure 1: Description du principe d'amplification avec un polynucléotide universel et du marquage des fragments au cours de l'amplification.
4] Figure 2: Exemple de profils génétiques de variétés végétales, obtenus avec un ensemble de couples d'amorces selon l'invention consistant en 6 couples d'amorces A, B, L, P, U et W cités dans le Tableau 1 ci-dessus. De gauche à droite, on retrouve les variétés végétales suivantes: Piste Variété 1 Andalou 2 Charger 3 Ornicar 4 Shango Vivant 6 Pytagor 7 Occitan 8 Cracklin 9 Astrakan Apache 11 Altria 12 Isengrain 13 Baltimor 14 Semafor Quatuor 16 Pulsar 17 Recital 18 Galibier 19 Galibier Sponsor Piste Variété 28 Inconnu 29 Apache Apache 31 Apache 32 Apache 33 Sideral 34 Nirvana Eveil 36 Catalan 37 Aubusson 38 Macro 39 Guadalupe Caphorn 41 Paindor 42 Bastide 43 Courtot 44 Limes PR22R28 46 Parador 47 Thesee Piste Variété Piste Variété 21 Soissons 48 Cezanne 22 Soissons 49 Claire 23 Sideral 50 Claire 24 Nirvana 51 Orvantis Eveil 52 Autan 26 Catalan 53 Raspail 27 Apache [0075] Figure 3: Exemple de profils génétiques de variétés végétales, obtenus avec un ensemble de couples d'amorces selon l'invention consistant en 5 couples d'amorces A, B, W, U et L (Figure 3A) ou X, B, W U et S (Figure 3B) cités dans le Tableau 1 cidessus.
A: 1: Astrakan; 2: Cracklin; 3: Soisson; 4: Limes; 5: Pytagor; 6: Eveil 7: Orvantis; 8: Nirvana; 9: Parador; 10: Bastide.
B: 1: Altria; 2: Charger; 3: Isengrain; 4: Shango; 5: PR22R28.
EXEMPLES
6] Principe: Un échantillon, après homogénéisation et réduction, est constitué de 40 grains d'une même variété de céréale ou d'une pluralité (au moins 2) variétés végétales. Les 40 grains sont broyés individuellement et subissent une lyse chimique, thermique et enzymatique. Après une brève centrifugation, l'ADN de chaque grain de l'échantillon en solution dans le surnageant est amplifié à l'aide d'au moins 5 couples d'amorces ciblant 5 loci microsatellites génétiquement non-liés et présentant un haut degré de polymorphisme. L'étape d'amplification est réalisée en présence d'un polynucléotide universel fluorescent permettant de marquer les fragments (Figure 1). Ceux-ci sont séparés par électrophorèse en gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes et le gel est révélé en temps réel par un analyseur génétique. Les profils génétiques sont analysés à l'aide d'un logiciel de traitement d'image et comparés à une banque de données comprenant les profils préétablis. Un nom de variété est ainsi attribué à chaque grain. La composition variétale de l'échantillon de départ est déduite de ces résultats.
7] Etape 1: Sélection de l'échantillon [0078] L'échantillon pour analyse doit être homogénéisé et réduit selon la méthode BIPEA BE103D 8909, Méthode d'échantillonnage en vue d'une analyse grain par grain. Le matériel utilisé est un diviseur à rifle. La masse de la fraction du souséchantillon à obtenir est calculée avec la formule suivante: m = (P x N x 10) / 1000, où : [0079] P = poids de 1000 grains estimé et N = nombre de grains à prélever pour réaliser l'électrophorèse. Il faut obtenir avant la division finale une fraction ayant un poids le plus proche possible du double du poids théorique à obtenir soit, dans cet exemple, 40 g.
0] Un sous-échantillon de 40 grains est ensuite sélectionné dans l'échantillon avec le Numigral Il. Cet appareil permet de faire un échantillonnage statistique en prélevant un grain sur 10 dans un échantillon.
1] Etape 2: Broyage des grains Le broyage grain par grain est réalisé en plaques format 96 en Teflon . Après ajout d'un grain et de 2 billes en tungstène ou en acier par puits, la plaque est fermée à l'aide d'une plaque de perçage en plexiglas munie de cônes en métal (un par puits). Avec le broyeur Mixer Mill 301 (Retsch) muni d'un adaptateur à plaques, les grains de blé sont broyés pendant 2 fois 10 minutes à une fréquence de 30 mouvements par seconde.
2] Etape 3: Extraction de l'ADN [0083] 3.1 Moutures et farines [0084] L'ADN des moutures et des farines est extrait avec le kit Nucleospin Food (Macherey Nagel), utilisé selon les informations du fournisseur. Le dosage de l'ADN est réalisé par fluorimétrie (Versafluor, Biorab) avec le kit de dosage distribué par Interchim (PicoGreen DSDNA quantification kit, Molecular Probes) et utilisé selon les informations du fournisseur.
2888241 28 [0085] 3.2. Grain par grain [0086] La technique utilisée pour extraire l'ADN repose sur une adsorption du lysat de l'échantillon brut sur un papier filtre spécialement traité pour lyser les cellules et adsorber l'ADN (papier FTA, Whatman).
Après broyage à sec des échantillons, ceux ci sont additionnés de 150 pl d'eau ou de tampon de lyse (Tris HCI pH 8.0 10 mM; NaCl 150mM, EDTA 2mM, SDS 1%) et de protéinase K (Macherey Nagel). Après une incubation de 30 minutes à 65 C, les échantillons sont additionnés de RNAse et d'a-amylase (Sigma-Aldrich), et incubés 15 minutes à température ambiante.
Après une brève centrifugation, 5 pl du surnageant de chacun des échantillons est appliqué sur une carte CloneSaver (whatman), et laissé à sécher pendant 1 heure sous une hotte à flux laminaire. Une rondelle de 2 mm de diamètre est découpée et placée dans un microtube de 200 pl. Les rondelles sont lavées 2 fois avec 100 pl d'eau qualité biologieMoléculaire, 2 fois avec 100 pl d'éthanol absolu et 2 fois avec 100 pl d'eau qualité biologie moléculaire. Les tubes sont ensuite placés, ouverts, à 50 C pendant l h afin de sécher les rondelles de papiers.
7] Etape 4: Préparation d'un ensemble de couples d'amorces [0088] 4.1. Sélection des couples d'amorces Dans les 3 tableaux suivants (3A à 3C), est indiquée en minuscule la séquence du polynucléotide universel, et en majuscule la séquence propre à chaque amorce.
NOM SEQUENCE SEQ ID
A sens cacgacgttgtaaaacgacGGATTGGAGTTAAGAGAGAACCG 49 B sens cacgacgttgtaaaacgacGCAGAGCCTGGTTCAAAAAG 50 L sens cacgacgttgtaaaacgacTCAAAACATAAATGTTCATTGGA 51 U sens cacgacgttgtaaaacgacGCAATCTTTTTTCTGACCACG 52 W sens cacgacgttgtaaaacgacGTGCTTGCTGAGCTATGAGTC 53 A antisens GCAGAGTGATCAATGCCAGA 2 B antisens CGCCTCTAGCGAGAGCTATG 4 L antisens TCAACCGTGTGTAATTTTGTCC 24 U antisens ATGTGCATGTCGGACGC 42 W antisens GTGCCACGTGGTACCTTTG 46 Tableau 3A: Séquence nucléotidique des amorces utilisées dans un 25 ensemble de 5 couples d'amorces selon l'invention.
NOM SEQUENCE SEQ ID
X sens cacgacgttgtaaaacgacTTCTCACTGTAAGGGCGTT 54 B sens cacgacgttgtaaaacgacGCAGAGCCTGGTTCAAAAAG 50 S sens cacgacgttgtaaaacgac ATG ACC CTT CTG CCA AAC AC 55 U sens cacgacgttgtaaaacgacGCAATCTTTTTTCTGACCACG 52 W sens cacgacgttgtaaaacgacGTGCTTGCTGAGCTATGAGTC 53 X antisens CAGCCTTAGCCTTGGCG 48 B antisens CGCCTCTAGCGAGAGCTATG 4 S antisens,ATC GAC CGG GAT CTA GCC 38 U antisens ATGTGCATGTCGGACGC 42 W antisens GTGCCACGTGGTACCTTTG 46 Tableau 3B: Séquence nucléotidique des amorces utilisées dans un ensemble de 5 couples d'amorces selon l'invention.
Tableau 3C: Séquence nucléotidique des amorces utilisées dans un ensemble de 6 couples d'amorces selon l'invention.
9] 4.2. Préparation d'une composition unique contenant l'ensemble de couples d'amorces [0090] Chaque amorce se présente sous la forme d'une composition de concentration initiale de 1 mM. Les amorces sont mélangées au sein d'une composition unique, c'est à-dire qu'un volume variant entre 1 et 10 pl selon l'amorce est ajouté dans une composition de volume final de 1 ml. La concentration finale de chaque amorce au sein de cette composition peut ainsi varier entre 1 et 10 pM, selon l'amorce. A cette solution, est également ajouté un polynucléotide complémentaire du polynucléotide universel lié en 5' des amorces sens, pour permettre la détection des fragments d'ADN amplifiés, dont la concentration finale varie entre 10 et 20 pM, et est avantageusement 20 pM.
NOM SEQUENCE SEQ ID
A sens B sens L sens P sens U sens W sens A antisens B antisens L antisens P antisens U antisens W antisens cacgacgttgtaaaacgacGGATTGGAGTTAAGAGAGAACCG 49 cacgacgttgtaaaacgacGCAGAGCCTGGTTCAAAAAG 50 cacgacgttgtaaaacgacTCAAAACATAAATGTTCATTGGA 51 cacgacgttgtaaaacgacAATAGAGCCCTGGGACTGGG 56 cacgacgttgtaaaacgacGCAATCTTTTTTCTGACCACG 52 cacgacgttgtaaaacgacGTGCTTGCTGAGCTATGAGTC 53 GCAGAGTGATCAATGCCAGA 2 CGCCTCTAGCGAGAGCTATG 4 TCAACCGTGTGTAATTTTGTCC 24 GAAGGACGACATTCCACCTG 32 ATGTGCATGTCGGACGC 42 GTGCCACGTGGTACCTTTG 146 [0091] Etape 5: PCR multiplex [0092] 5.1 Préparation des réactifs d'amplification [0093] Les différents réactifs permettant l'amplification multiplex sont mélangés dans les proportions indiquées dans le Tableau 4 suivant. Les volumes s'entendent pour l'amplification de l'ADN d'un grain de blé. La concentration de l'ADN de blé est indiquée en génome (Go), 1 Go étant égal à une concentration d'ADN de 17 pg/pl.
Mélange Concentration finale ADN (1000 Go/pl) 1 pl 1000 Go MgCl2 (25 mM) 0,4 pl 2 mM Master Mix (Multiplex Qiagen) 2,5 pI 0,5 X Mélange Amorces/Poly. Compl. suivant la concentration finale souhaitée Eau qsp 10 pl / Tableau 4: Préparation du mélange réactionnel pour une réaction 10 d'amplification multiplex dans 10 pI final.
4] A ces réactifs d'amplification, est ajouté le mélange amorces/sonde préparé selon le point 4.2 ci-dessus de manière à obtenir une concentration finale en amorce au sein du volume réactionnel variant entre 25 nM et 1 pM.
5] Les tableaux 5A à 5C suivants indiquent les concentrations optimales d'amorces et du polynucléotide complémentaire (Poly. compl.) au sein du volume réactionnel ([réaction]) dans la réalisation du procédé de l'invention, et plus particulièrement pour les conditions de préparation indiquées ci-dessus.
Amorces [réaction] A sens 25 nM à 100 nM A antisens B sens 250 nM à 750 nM B antisens W sens W antisens U sens 100nMà500nM U antisens L sens 50 nM à 250 nM L antisens Poly. compl. 250 nM à 1 pM Tableau 5A: Concentration finale optimale des amorces, au sein d'un mélange réactionnel d'amplification, de l'ensemble défini au tableau 3A.
Amorces [réaction] X sens 100 nM à 500 nM X antisens B sens B antisens W sens W antisens U sens U antisens S sens 200 nM à 500 nM 1 S antisens Poly. compl. 250 nM à 1 pM Tableau 5B: Concentration finale optimale des amorces, au sein d'un mélange réactionnel d'amplification, de l'ensemble défini au tableau 3B.
Amorces [réaction] A sens 25 à 100 nM A antisens B sens 250 à 750 nM B antisens W sens W antisens U sens 100 à 500 nM U antisens L sens 1 L antisens P sens 50 à 250 nM P antisens Poly. compl 250 nM à 1 pM Tableau 5C: Concentration finale optimale des amorces, au sein d'un mélange réactionnel d'amplification, de l'ensemble défini au tableau 3C.
6] 5.2. Programme PCR [0097] 10 pl de mélange réactionnel de PCR sont ajoutés directement dans chacun des tubes. Les tubes sont ensuite scellés et le milieu réactionnel est incubé selon le programme d'amplification (Tableaux 6 et 7) préconisé par le fournisseur de l'enzyme. L'appareil utilisé est soit le thermocycleur Master Cycle (Eppendorf) soit GeneAmp 9700 (Applied Biosystem).
Etape Durée Température 1 15 min 95 C 2 1 min 95 C 3 1 min 30 sec 56 à 60 C 40 cycles 4 1 min 72 C 2 min 72 C 6 1 min 20 C Tableau 6: Programme d'amplification d'un ensemble de couples d'amorces selon l'invention. Pour chaque ensemble de couples d'amorces spécifique est déterminée une température d'hybridation (indiquée ici en gras).
Ensemble de couple d'amorces Température d'hybridation ( C) A, B, W, U et L 60 X,B,W,UetS 60 A,B,W,U,LetP 56 Tableau 7: Température d'hybridation (en C) utilisée en fonction des différents ensembles de couples d'amorces [0098] Etape 6: Détection de l'ensemble de fragments d'ADN amplifiés [0099] 6.1. Séparation des fragments [00100] Après l'amplification, les fragments sont additionnés de 10% de solution de dépôt (Formamide 80%, EDTA 10 mM, Bleu de bromophénol, 2 mg/ml) et dénaturés par chauffage à 95 C, 2 minutes. La séparation en fonction de la taille est réalisée par électrophorèse en gel de polyacrylamide dénaturant (USB RapidGel 6% Ultrapure, Amersham) (Dimensions du gel 25 cm X 15 cm X 0,2 mm) (paramètres de migration: 1500V, 40 mA, 40W, 50 C). L'appareil utilisé est un analyseur génétique LiCor NEN2 Global Controler System.
[00101] 6.2 Visualisation des fragments [00102] Marquage IRD 800 (système à 3 amorces) : un polynucléotide universel est inséré en 5' de chacune des amorces sens. L'amplification est réalisée en présence d'un troisième polynucléotide, complémentaire du polynucléotide universel. Ce troisième polynucléotide est modifié en 5' par l'ajout d'une molécule fluorescente émettant dans l'infrarouge à 800 nm. Lors des cycles d'amplification, la molécule fluorescente, par incorporation aux fragments d'amplification, sert à marquer ces fragments. Le principe du marquage est schématisé sur la Figure 1.
[00103] Durant la migration des fragments d'ADN amplifiés, le laser Infrarouge de l'analyseur génétique balaie le bas du gel à travers une fenêtre de 3 x 15 cm et collecte les informations de fluorescence qui sont numérisée sous le format TIFF.
[00104] Etape 7: Comparaison du ou des profils avec des profils de référence [00105] L'image du gel est analysée à l'aide du logiciel Bionumerix, qui compare les profils obtenus à une banque de profils préétablis sur les variétés végétales de blé pures connues.
RESULTATS
[00106] A. Couples d'amorces monomorphes ou faiblement polymorphes [00107] Afin de déterminer les couples d'amorces appropriés pour la réalisation d'un ensemble de couples d'amorces utilisable au sein d'une réaction multiplex et permettant de discriminer un grand nombre de variétés végétales, le caractère polymorphes des loci ont été testés. Les marqueurs listés dans le Tableau 8 se sont révélés monomorphes lorsqu'une amplification a été réalisée sur les 36 variétés végétales suivantes, c'est-à- dire que dans toutes ces variétés l'amplification n'a produit qu'un fragment de taille unique ALTRIA, CAPHORN, ORVANTIS, VIVANT, CATALAN, GUADALUPE, PAINDOR, ANDALOU, CEZANNE, ISENGRAIN, SEMAFOR, APACHE, CHARGER, ASTRAKAN, CRACKLIN, LIMES, PARADOR, SHANGO, AUBUSSON, CLAIRE, SIDERAL, AUTAN, COURTOT, PYTAGOR, SOISSONS, NIRVANA, QUATUOR, SPONSOR, BASTIDE, OCCITAN, RASPAIL, THESEE, CAMP REMY, EVEIL, ORNICAR, RECITAL. De plus, deux couples d'amorces parmi ceux testés ont montré un polymorphisme dans seulement quelques variétés, ce qui n'apparaît pas suffisant afin de discriminer au moins 50 variétés végétales de blé.
[00108] B. Couples d'amorces ne conduisant pas à une amplification efficace dans les conditions multiplex retenues [00109] De plus, certains couples d'amorces, bien qu'ils présentent un caractère polymorphe, n'ont pas été considérés dans la mesure où leur utilisation au sein d'ensemble de couples d'amorces selon l'invention ne permettait pas une amplification efficace, dans un même volume réactionnel, avec tous les couples d'amorces de cet ensemble. Ceci s'explique notamment par la température d'hybridation propre à chaque couple, les éventuels phénomènes de compétition entre amorces et l'hybridation des amorces entre elles ou avec un produit d'amplification et l'absence d'amplification lorsque certaines amorces sont utilisées dans des conditions multiplex (stoechiométrie). Ces amorces sont indiquées dans le
Tableau 8.
Amorce sens Séquence Amorce antisens Séquence Statut F.TA. MS.183 CTA AAC ACG ACA GCG GTG G R.TA.MS.183 GAT ATG TGA GCA GCG GTC AG NA F.TA. MS.185 CGG TAG TTT TTA GCA AAG AG R.TA.MS.185 CCT TAC AGT TCT TGG CAG AA NA F.TA. MS.187 GCA CCC ACA TCT TCG ACC R.TA.MS.187 TGC TGC TGG TCT CTG TGC NA F. TA.MS.188 CTA AAC ACG ACA GCG GTG G R.TA. MS.188 GAT ATG TGA GCA GCG GTC AG NA F.TA. MS.190 AAG ATG GAC GTA TGC ATC ACA R.TA. MS.190 GCC ATA TTT GAT GAC GCA TA NA F.TA.MS.191 GGC AGA GCA GCG AGA CTC R.TA.MS.191 CAA GTG GAG CAT TAG GTA CAC G NA F.TA.MS.192 GGG ATT GCA TAT GAG ACA ACG R.TA.MS. 192 TGC CAT GGT TGT AGT AGC CA NA F. TA. M S.194 GCA TCT GGT ACA CTA GCT GCC R. TA. M S.194 TCA TGG ATG CAT CAC ATC CT 3 NA F.TA.MS.195 GGG TGG GAG AAA GGA GAT G R.TA.MS.195 MA CCA TCC TCC ATC CTG G NA F.TA.MS.197 CGC ACC ATC TGT ATC ATT CTG R.TA.MS.197 TGG TCG TAC CAA AGT ATA CGG NA F.TA. MS.198 CAA TAG TTC TGT GAG AGC TGC G R.TA.MS.198 CCA ACC CAA ATA CAC ATT CTC A NA F.TA.MS.199 ACA AAC AGA AAA TCA AAA CCC G R.TA. MS.199 ATC CAT CGC CAT TGG AGT G NA F.TA.MS.200 CAT CCC TAC GCC ACT CTG C R.TA. MS.200 MT GGT ATC TAT TCC GAC CCG NA F. TA. M S.202 AAT CAC AAC AAG GCG TGA CA R. TA.MS.202 CAG GGT GGT GCA TGC AT NA F.TA.MS.203 GGT GGT ATG GAC TAT GGA CAC T R.TA.MS.203 TTT GCA TGG AGG CAC ATA CT NA F.TA.MS.204 GCC CGG TCA TGT AAA ACG R.TA.MS.204 TTT CAG TTT GCG TTA AGC TTT G NA F.TA.MS.205 AAT TCA ACC TAC CAA TCT CTG R.TA.MS.205 GCC TAA TAA ACT GAA AAC GAG NA F.TA. MS.206 TTC AGT GGT AGC GGT CGA G R.TA.MS.206 CCG ACA TCT CAT GGA TCC AC NA F.TA.MS.207 CAA ATG GAT CGA GAA AGG GA R.TA.MS.207 CTG CCA TTT TTC TGG ATC TAC C NA F.TA.MS.210 CAC CGA CGG TTT CCC TAG AGT R.TA. MS.210 GGT GAG TGC AAA TGT CAT GTG NA F.TA. MS.211 TGC CTG GCT CGT TCT ATC TC R.TA. MS. 211 CTA GCT TAG CAC TGT CGC CC NA F.TA. MS.212 AAC TTG CAA AAC TGT TCT GA R.TA.MS.212 TAT TTG MG CGG TTT GAT TT NA F.TA. MS.213 ACG GCG AGA AGG TGC TC R.TA. MS.213 CAT GAA AGG CAA GTT CGT CA NA F.TA.MS.214 ATC TTA GCA TAG MG GGA GTG GG R.TA.MS.214 TTC TGC ACC CTG GGT GAT NA F.TA.MS.215 ATA GTG TGT TGC ATG CTG TGT G R.TA.MS 215 TCT AAT TAG CGT TGG CTG CC non
Tableau 8
Amorce sens Séquence Amorce antisens Séquence Statut F.TA.MS.216 AGG GGA TAT GTT GTC ACT CCA R.TA.MS.216 TTA TGT GAT TGC GTA CGT ACC C non F.TA.MS. 217 TCA CCG TGG TCA CCG AC R.TA.MS.217 CCA CCG AGC CGA TAA TGT AC non F. TA.MS.218 CGT ATC ACC TCC TAG CTA AAC TAG R.TA.MS.218 AGC CTT ATC ATG ACC CTA CCT T non F.TA.MS.219 ATC GCA TGA TGC ACG TAG AG R.TA.MS.219 ACA TGC ATG CCT ACC TAA TGG non FTA.MS.220 TCA GTG GGC AAG CTA CAC AG R.TA.MS.220 MA ACT TAG TAG CCG CGT non F.TA.MS.221 GGG TTC CTA TCT GGT MA TCC C R.TA. MS.221 GAC ACA CAT GTT CCT GCC AC non F.TA.MS.222 CGT ACT CCA CTC CAC ACG G R.TA.MS.222 CGG TCC MG TGC TAC CTT TC non F.TA.MS.224 GAG TCC TGA TGT GAA GCT GTT G R.TA.MS.224 CTC ATT GGG GTG TGT ACG TG non F.TA.MS.226 CCA TTT CAC CTA ATG CCT GC R.TA.MS.226 AAT MA ACC ATG AGC TCA CTT GC non F.TA. MS.227 GCA AGA AGC AAC AGC AGT AAC R.TA.MS.227 CAG ATG CTC TTC TCT GCT GG non F.TA.MS.230 GCT TGA GAC CGG CAC AGT R.TA.MS.230 CGA GAC CTT GAG GGT CTA GA non F.TA.MS.311 GCA AGA AGC AAC AGC AGT AAC R.TA.MS.311 CAG ATG CTC TTC TCT GCT GG non F.TA.MS.313 GGT TTT CTT TCA GAT TGC GC R.TA.MS.313 CGT TGT CTA ATC TTG CCT TGC non F.TA.MS.317 GAC CAA GAT ATT CAA ACT GGC C R.TA.MS.317 AGC TCA GCT TGC TTG GTA CC non F.TA.MS.330 ATG GAG ATA TTT GGC CTA CM C R.TA.MS.330 CTT GAC TTC MG GCG TGA CA non F.TA.MS.331 TGC AGT GGT CAG ATG TTT CC R.TA.MS.331 CTT TTC TTT CAG ATT GCG CC non F.TA.MS. 333 AGT GGC TGG GAG AGT GTC AT R.TA.MS.333 GCC CAT TAC CGA GGA CAC pauvre F.TA.MS.337 ACG CCA GTT GAT CCG TAA AC R.TA.MS.337 GAC ATC AAT AAC CGT GGA TGG pauvre Tableau 8 (suite) : couples d'amorces non utilisables pour former un ensemble de couples d'amorces selon l'invention. NA: non approprié pour une amplification multiplex; non: caractère monomorphe du locus; pauvre: caractère polymorphe dans un nombre de variétés restreint.
[00110] C. Exemple de profils obtenus avec des ensembles de couples d'amorces selon l'invention [00111] Les tableaux 9A à 9C suivants listent le nombre d'allèles obtenus avec les ensembles de couples d'amorces cités ci-dessus, ainsi que la taille respective de ces allèles, et le nombre de profils théoriques que l'on peut obtenir en considérant que le procédé de l'invention est appliquée à des variétés pures, c'est-à-dire présentant deux allèles de même taille.
Amorces Longueur des Nombre Nombre de profils fragments d'allèles théoriques A 85 pb à 121 pb 8 3600 B 148pbà172pb 6 U 178 pb à 184 pb 5 W 221 pb à 233 pb 5 L 255 pb à 273 pb 3 Tableau 9A: Nombre de profils génétiques théoriques avec l'ensemble de 10 couples d'amorces défini au tableau 3A.
Amorces Longueur des Nombre Nombre de profils fragments d'allèles théoriques X 99pbà123pb 14 18900 B 148 pb à 172 pb 6 U 178 pb à 184 pb 5 W 221 pb à 233 pb 5 S 211 pbà273pb 9 Tableau 9B: Nombre de profils génétiques théoriques avec l'ensemble de couples d'amorces défini au tableau 3B.
Amorces Longueur des Nombre Nombre de profils fragments d'allèles théoriques A 85 pb à 121 pb 8 14400 B 148pbà172pb 6 U 178 pb à 184 pb 5 W 221 pbà233pb 5 L 255pbà273pb 3 P 310pbà340pb 4 Tableau 9C: Nombre de profils génétiques théoriques avec l'ensemble de couples d'amorces défini au tableau 3C.
[00112] Le nombre de profils génétiques théoriques, calculé en fonction du nombre d'allèles par couple d'amorces, varie selon les 3 ensembles de couples d'amorces cités entre 3600 et 18900 pour une variété pure. Ceci reflète la possibilité de discriminer un grand nombre de variétés végétales, si ce n'est toutes les variétés végétales existantes, et à tout le moins les 50 variétés végétales identifiées dans le tableau 2. Il est bien entendu que le nombre de profils génétiques théoriques est bien plus grand lorsque l'amplification est réalisée sur des variétés hybrides, dans la mesure où une variété hybride peut présenter deux allèles de taille différente pour un même locus.
[00113] La Figure 2 représente un exemple de gel d'électrophorèse obtenu avec un ensemble de 6 couples d'amorces selon l'invention, à savoir les couples P, L, W, U, B et A. Le gel comprend 53 pistes correspondant à 47 variétés végétales. Les variétés végétales Apache, Galibier, Nirvana, Soissons et Claire ont été déposées plusieurs fois pour s'assurer de l'homogénéité de la migration sur l'ensemble du gel. Avec l'ensemble de couples d'amorces utilisé, toutes les variétés végétales sur lesquelles a été réalisée l'amplification présentent un profil génétique spécifique, c'est-à-dire qu'aucune des variétés végétales ne présente un profil identique à une autre variété utilisée. Ces résultats confirment d'une part que, de par la sélection de couples d'amorces appropriés, il est possible de discriminer au moins 50 variétés végétales avec un faible nombre de couples d'amorces (au moins 5 couples), et d'autre part que l'amplification d'au moins 5 couples dans des conditions multiplex (au sein d'un même volume réactionnel) permet d'obtenir, dans des variétés pures, un fragment d'amplification unique par locus amplifié. Ceci valide donc le caractère sûr, rapide et bon marché de la méthode par rapport aux méthodes de discrimination conventionnelles [00114] Le gel de la Figure 2 a permis également de déterminer que l'ADN amplifié et déposé à la piste 28 ne provenait pas d'une variété végétale qui faisait partie du groupe des 50 variétés végétales du tableau 2.
En effet, après migration et comparaison du profil génétique de cette variété avec les profils génétiques de référence des 50 variétés végétales du tableau 2, il est apparu que celui-ci présentait une composition différente dans l'ensemble de fragments d'ADN amplifiés. Ceci confirme donc que la méthode de la présente invention permet non seulement de discriminer des variétés végétales d'un groupe prédéterminé mais aussi d'identifier une variété végétale exclue de ce groupe.
[00115] La figure 3 présente des exemples de gels obtenus sur 10 et 5 variétés végétales avec des ensembles de 5 couples d'amorces de l'invention. Ainsi, la méthode de l'invention peut être réalisée avec aussi peu que 5 couples d'amorces; Cette figure démontre qu'une PCR multiplex est réalisée dans les conditions définies ci-dessus avec les amorces sélectionnées et définies dans le tableau 1.

Claims (31)

REVENDICATIONS
1. Ensemble de couples d'amorces, dans lequel au moins 5 couples d'amorces, constitués d'une amorce sens et d'une amorce antisens, sont 5 choisis parmi les couples suivants: Couple Amorce sens Seq Amorce antisens Seq
ID ID
A GGA TTG GAG TTA AGA GAG AAC CG 1 GCA GAG TGA TCA ATG CCA GA 2 B GCA GAG CCT GGT TCA AAA AG 3 CGC CTC TAG CGA GAG CTA TG 4 C TGC TCT TTG GCG AAT ATA TGG 5 GTT CAA AAC AAA TTA AAA GGC CC 6 D CGC ACC ATC TGT ATC ATT CTG 7 TGG TCG TAC CAA AGT ATA CGG 8 E TGC CTG GCT CGT TCT ATC TC 9 'CTA GCT TAG CAC TGT CGC CC 10 F AAC TTG CAA AAC TGT TCT GA 11 TAT TTG AAG CGG TTT GAT TT 12 GÎATC 13 ACA TGC ATG CCT ACC TAA TGG 14
GCA TGA TGC ACG TAG AG
H TCA GTG GGC AAG CTA CAC AG 15 AAA ACT TAG TAG CCG CGT 16 I CGT ACT CCA CTC CAC ACG G 17 CGG TCC AAG TGC TAC CTT TC 18 J TCA TAC GGG TAT GGT TGG AC 19 CAC CCC CTT GTT GGT CAC 20 K GAG TCC TGA TGT GAA GCT GTT G 21 CTC ATT GGG GTG TGT ACG TG 22 L TCA AAA CAT AAA TGT TCA TTG GA 23 TCA ACC GTG TGT AAT TTT GTC C 24 M CCA TTT CAC CTA ATG CCT GC 25 AAT AAA ACC ATG AGC TCA CTT GC 26 N GCA AGA AGC AAC AGC AGT AAC 27 CAG ATG CTC TTC TCT GCT GG 28 O CCA ACC GTG CTA TTA GTC ATT C 29 CAA TGC AGG CCC TCC TAA C 30 P AAT AGA GCC CTG GGA CTG GG 31 GAA GGA CGA CAT TCC ACC TG 32 Q GCT TGA GAC CGG CAC AGT 33 CGA GAC CTT GAG GGT CTA GA 34 R GCA AGA AGC AAC AGC AGT AAC 35 CAG ATG CTC TTC TCT GCT GG 36 S ATG ACC CTT CTG CCA AAC AC 37 ATC GAC CGG GAT CTA GCC 38 T ATG GAG ATA TTT GGC CTA CAA C 39 CTT GAC TTC AAG GCG TGA CA 40 U GCA ATC TTT TTT CTG ACC ACG 41!ATG TGC ATG TCG GAC GC 42 V GTG AAG CAG ACC CAC AAC AC 43 GAC GGC TGC GAC GTA GAG 44 W GTG CTT GCT GAG CTA TGA GTC 45 GTG CCA CGT GGT ACC TTT G 46 X TTC CTC ACT GTA AGG GCG TT 47 CAG CCT TAG CCT TGG CG 48
2. Ensemble de couples d'amorces selon la revendication 1 qui consiste en 5 couples d'amorces.
3. Ensemble de couples d'amorces selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, dans lequel le nombre d'allèles par locus amplifié par lesdits couples d'amorces dans une quelconque variété végétale de blé est supérieur ou égal à 3 et de préférence supérieur ou égal à 5.
4. Ensemble de couples d'amorces selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel les loci sont non-liés génétiquement.
5. Ensemble de couples d'amorces selon l'une quelconque des 10 revendications 1 à 4, permettant d'obtenir un ensemble de fragments d'ADN spécifique d'une variété végétale de blé parmi des variétés végétales de blé connues constituant un groupe de référence.
6. Ensemble de couples d'amorces selon l'une quelconque des 15 revendications 1 à 5 permettant d'obtenir un ensemble de fragments d'ADN spécifique d'une variété végétale de blé parmi au moins 50 variétés végétales de blé connues constituant un groupe de référence.
7. Ensemble de couples d'amorces selon l'une quelconque des 20 revendications 1 à 6, choisi parmi les combinaisons de couples d'amorces suivantes: a) A, B, L, P, U et W, b)X,B,S,VetW, c) A, B, S, U et W, d) X, B, L, U et W, e)X,B,P,UetW, f)X,C,S,UetW, g)A,C,S,UetW, h) X, C, L, U et W, i) X, C, P, U et W, j) X, B, U, W, Set P, k) A, C,U,W,LetOet I) A, B, W, U et L.
8. Ensemble de couples d'amorces selon l'une quelconque des 5 revendications 1 à 7 dans lequel chaque amorce sens possède, attaché en 5', un polynucléotide universel.
9. Ensemble de couples d'amorces selon la revendication 8, dans lequel le polynucléotide universel possède la séquence CCAGGACGTTGTAAAACGAC (Seq ID N 57).
10. Ensemble de fragments d'ADN tel qu'obtenu par amplification à partir de l'ADN de blé d'une variété donnée, au moyen d'un ensemble de couples d'amorces, dans lequel au moins 5 couples d'amorces sont choisis parmi les couples désignés A à x de l'une quelconque des revendications 1 à 9, ledit ensemble de fragments d'ADN étant spécifique d'une variété végétale de blé.
11. Ensemble de fragments d'ADN selon la revendication 10, ledit ensemble de fragments d'ADN étant spécifique d'une variété végétale de blé parmi au moins 50 variétés végétales de blé connues constituant un groupe de référence.
12. Ensemble de fragments d'ADN selon l'une quelconque des revendications 10 à 11, lesdits fragments étant amplifiés par un ensemble de couples d'amorces choisi parmi: a) A, B, L, P, U et W, b) X, B, S, V et W,c)A,B,S, UetW,d)X,B,L,UetW,e)X,B,P,UetW,f)X,C,S,Uet W, g) A, C, S, U et W, h) X, C, L, U et W, i) X, C, P, U et W, j) X, B, U, W, S etP,k)A,C,U,W,Let0etl)A, B,W,UetL.
13. Kit d'obtention d'un ensemble de fragments d'ADN spécifique d'une variété végétale de blé comprenant: a. un ensemble de couples d'amorces, dans lequel au moins 5 couples d'amorces sont choisis parmi les couples A à x de l'une
quelconque des revendications 1 à 9, et
b. au moins une solution servant de marqueur de taille pour lesdits fragments.
14. Kit selon la revendication 13, dans lequel une solution servant de marqueur de taille est un ensemble de fragments amplifiés par les couples d'amorces (A à x) spécifique d'une variété végétale de blé, et préférentiellement d'au moins une variété végétale choisie parmi Pytagor, Andalou, Isengrain, Bastide, Charger, Thésée, Claire, Crousty et/ou Altria.
15. Kit selon l'une quelconque des revendications 13 à 14, dans lequel l'ensemble de couples d'amorces est choisi parmi: a) A, B, L, P, U et W, b) X, B, S, V et W, c) A, B, S, U et W, d) X, B, L, U et W, e) X, B, P, U et W, f) X, C, S, U et W, g) A, C, S, U et W, h) X, C, L, U et W, i) X, C, P, U etW,j)X,B,U,W,SetP,k)A,C,U,W,LetOetl)A,B,W,UetL.
16. Kit selon l'une quelconque des revendications 13 à 15, dans lequel les au moins 5 couples d'amorces sont présentés sous forme d'une composition unique.
17. Kit selon l'une quelconque des revendications 13 à 16, comprenant en outre au moins une solution d'ADN d'une variété végétale de blé connue.
18. Kit selon l'une quelconque des revendications 13 à 17, comprenant en outre les réactifs nécessaires à l'amplification: une 2888241 44 polymérase et des désoxyribonucléotides tri-phosphates ou dNTP (dGTP, dATP, dTTP et dCTP).
19. Kit selon l'une quelconque des revendications 13 à 18, 5 comprenant en outre un polynucléotide complémentaire dudit polynucléotide universel.
20. Kit selon la revendication 19, dans lequel le polynucléotide complémentaire est marqué.
21. Méthode d'obtention d'un profil génétique spécifique d'une variété végétale de blé comprenant: a. l'amplification simultanée d'au moins 5 loci d'une solution d'acides nucléiques obtenue à partir d'un produit dérivé de blé, au sein d'un unique mélange réactionnel, par un ensemble de couples d'amorces selon l'une quelconque des revendications 1 to 9, conduisant à l'obtention d'un ensemble de fragments d'ADN amplifiés, et b. la détection de l'ensemble formé par lesdits fragments d'ADN 20 amplifiés et l'obtention d'un profil génétique.
22. Méthode d'obtention d'un profil génétique selon la revendication 21, dans laquelle la solution d'acides nucléiques est obtenue à partir d'un grain ou de malt de blé, de broyat de grains ou de malt de blé, de farine de blé, de pain, de bière ou de tout produit de la boulangerie, viennoiserie, pâtisserie, traiteur.
23. Méthode d'obtention d'un profil génétique selon l'une quelconque des revendications 21 à 22, dans laquelle l'amplification est réalisée par 30 réaction de polymérisation en chaîne (PCR).
24. Méthode d'obtention d'un profil génétique selon l'une quelconque des revendications 21 à 23, dans laquelle la concentration finale de chaque amorce permettant la réaction d'amplification est comprise entre 10 nM et 1 pM.
25. Méthode d'obtention d'un profil génétique selon l'une quelconque des revendications 21 à 24, dans laquelle la concentration finale d'ADN sur lequel est réalisée l'amplification est comprise entre 10 et 20 ng/pl.
26. Méthode d'obtention d'un profil génétique selon l'une quelconque des revendications 21 à 25 dans laquelle la détection desdits fragments d'ADN amplifiés requiert leur séparation puis leur visualisation.
27. Méthode d'obtention d'un profil génétique selon la revendication 26, dans laquelle lesdits fragments d'ADN amplifiés sont séparés selon un critère de taille.
28. Méthode d'obtention d'un profil génétique selon la revendication 27, dans laquelle lesdits fragments d'ADN amplifiés sont séparés par migration électrophorétique.
29. Méthode d'obtention d'un profil génétique selon l'une quelconque des revendications 21 à 28 dans laquelle la détection ou la visualisation des fragments d'amplification est réalisée par fluorescence.
30. Méthode de discrimination de variétés végétales de céréales comprenant une méthode d'obtention d'un profil génétique selon l'une quelconque des revendications 21 à 29, et une étape c. de comparaison du ou des profil(s) obtenu(s) avec des profils de variétés connues.
31. Méthode de discrimination de variétés végétales de céréales selon la revendication 30 permettant de discriminer au moins 50 variétés végétales de blé.
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