FR2887030A1 - Dispositif planaire avec adressage de puits automatise par electromouillage dynamique - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un procédé d'analyse d'un liquide d'une goutte (2) comportant :- la mise en contact d'une goutte de ce liquide avec une surface hydrophobe (8),- le déplacement de la goutte sur cette surface par électromouillage, afin de l'amener en un site (24, 26, 28) de mesure d'activité électrique, dans lequel est disposée une solution conductrice (42),- la mesure de ladite activité électrique.

Description

DISPOSITIF PLANAIRE AVEC ADRESSAGE DE PUITS AUTOMATISÉ

PAR ELECTROMOUILLAGE DYNAMIQUE

DESCRIPTION

DOMAINE TECHNIQUE ET ART ANTÉRIEUR La présente invention se rapporte à un procédé et un dispositif de mesure de l'activité électrique d'une ou plusieurs cellules biologiques et notamment à un dispositif permettant de mesurer en parallèle l'activité électrique d'une pluralité de cellules biologiques.

Pour étudier les activités électriques des cellules, la technique du patch-clamp a été proposée par Sakmann et Neher en 1981. Mais, récemment, des alternatives ont été recherchées pour augmenter le taux de réussite de cette mesure et augmenter le nombre de données accessibles.

Le document W004/038409 décrit un dispositif pour réaliser de telles mesures. Ce dispositif est de type planaire, en silicium.

La puce réalisée met en oeuvre un système de conduits permettant l'aspiration de fluides. Plus précisément ce dispositif comporte des canaux destinés à être connectés à des capillaires eux-mêmes connectés à des moyens d'aspiration de liquide situés en dehors de la puce. Le système est donc complexe, non compact.

Par ailleurs, les volumes aspirés sont difficilement contrôlables, et sont importants, de l'ordre de quelques microlitres.

Dans ce type de dispositif, les volumes de fluide sont conditionnés par des cavités, réalisées par exemple en silicium ou par les polymères réalisant l'étanchéité des chambres inférieures et supérieures.

Il faut donc remplir individuellement chaque site de mesure d'une solution adaptée à la mesure d'activité électrique des canaux ioniques et comportant une suspension cellulaire. Le volume de fluide est, là encore, important et la miniaturisation limitée par les standards des équipements de dispense. Cette contrainte limite aussi les possibilités d'intégration car chaque site doit être accessible à des moyens de dispense macroscopique.

Le document WO 02/03058 décrit un dispositif dans lequel des échantillons de liquide sont transportés de manière continue dans un canal et amenés à un site de mesure de type patch clamp . Ce site est lui-même muni de conduits d'aspiration et de pompes pour y positionner les volumes de fluide à analyser.

Tous ces dispositifs utilisent des canaux et des capillaires.

Or ces éléments posent certains problèmes techniques: les volumes de fluide sont élevés, ce qui est particulièrement pénalisant lorsque l'on utilise des produits très onéreux telles que des toxines ou des médicaments ou autres principes actifs. Se posent en outre des difficultés de connexion, des problèmes d'isolation électrique des chambres, des problèmes d'étanchéité, et même de fragilité dans le cas des capillaires. Il existe également un risque de bouchage lors d'agrégats ou de sédimentation des cellules.

Il se pose donc le problème de réaliser un dispositif plus compact, permettant de travailler sur des volumes de fluide plus petits, en particulier de l'ordre du picolitre.

Il se pose également le problème d'intégrer des fonctions de type transport des volumes de fluide à analyser avec les moyens permettant d'analyser ces fluides.

EXPOSÉ DE L'INVENTION L'invention concerne d'abord un procédé d'analyse d'une goutte d'un milieu liquide comportant: - la mise en contact d'une goutte de liquide avec une surface hydrophobe, - le déplacement de la goutte sur cette 15 surface par électromouillage, afin de l'amener en un site de mesure d'activité électrique, dans lequel est disposée une solution conductrice, - la mesure de ladite activité électrique. Selon un mode de réalisation, la goutte peut être confinée, au moins lors de son déplacement, entre ladite surface hydrophobe et un substrat supérieur.

Avant déformation, la goutte peut être, ou pas, confinée par le substrat supérieur.

Avantageusement, le déplacement est obtenu par activation d'une pluralité d'électrodes, situées sous la couche hydrophobe.

Les gouttes de liquide à analyser peuvent être formés à partir d'un ou de plusieurs réservoirs. 10

L'invention concerne également un dispositif d'analyse d'une goutte d'un milieu liquide comportant: - un premier substrat comportant une couche 5 hydrophobe, - des moyens formant au moins un site d'analyse ou de mesure d'activité électrique, - des moyens pour déplacer une goutte, sur cette surface, par électromouillage, afin de l'amener 10 sur ledit site d'analyse.

Un deuxième substrat peut être disposé en regard de la couche hydrophobe, permettant de former une configuration fermée.

Ce deuxième substrat peut comporter en 15 outre une couche hydrophobe superficielle, et éventuellement une électrode.

Les moyens pour déplacer une goutte, sur la couche hydrophobe, par électromouillage, comportent avantageusement une pluralité d'électrodes sous cette couche hydrophobe.

Au moins un site d'analyse ou de mesure d'activité électrique est exempt de couche hydrophobe, et présente une couche hydrophile, ainsi que des moyens de mesure d'activité électrique.

Un capot ou un substrat peut former avec le dispositif une chambre, en communication, par un orifice de la couche hydrophile, avec la surface de la couche hydrophobe.

Au moins un des sites d'analyse ou de 30 mesure d'activité électrique peut être entouré d'une portion de la couche hydrophobe.

Les gouttes peuvent avoir un volume compris entre par exemple 1 pl et 10 pl.

La mesure d'activité électrique peut être réalisée sur une cellule unique contenue dans la goutte. Ce peut être une mesure sur un canal de cellule.

La goutte peut contenir des cellules de types différents ou au moins un type de cellule et un type de toxine.

Selon un mode de réalisation particulier, au moins une substance, par exemple un agent actif tel qu'une drogue, lyophilisée est disposée sur le trajet de la goutte vers un site de mesure. Un mélange de la substance avec le liquide de la goutte peut donc avoir lieu lorsque la goutte arrive en contact avec ladite substance. Ce mélange peut ensuite être emmené ers le site de mesure.

Au moins un réservoir peut être prévu pour stocker un liquide à analyser ou dont l'activité 20 électrique est à mesurer.

Des moyens permettent de former une goutte de liquide à partir d'un tel réservoir.

Dans le cas d' une pluralité de sites d'analyse ou de mesure, au moins un réservoir commun à cette pluralité de sites d'analyse ou de mesure peut être prévu, pour former des gouttes pouvant être amenées à des sites d'analyse différents de cette pluralité de sites d'analyse.

L'invention concerne également un dispositif comportant une matrice de sites de mesure d'électrophysiologie sur un substrat muni de moyens pour amener aux sites de mesure des gouttes de liquides à analyser, par exemple des gouttes de tampon physiologique contenant des cellules ou des médicaments.

Ces gouttes peuvent donc être amenées de manière automatique à partir d'un ou plusieurs réservoirs.

Selon la présente invention, le procédé de dispense des fluides (suspensions cellulaires, drogues, liquide de vidange) met en oeuvre un déplacement de gouttes par électromouillage dynamique sur un diélectrique, par opposition à des déplacements de flux continus dans des canaux en microfluidique discrète.

L'invention concerne un procédé et un dispositif permettant de réaliser des mesures d'électrophysiologie, mettant en oeuvre un électromouillage dynamique de très faible quantité de réactifs. Deux à plusieurs réservoirs peuvent être réalisés.

Le pas de ces réservoirs pourra être celui d'une plaque à puits.

A partir de ces réservoirs, des séries de gouttes peuvent être générées et acheminées, de façon contrôlée, pour amener aux puits de mesure les suspensions cellulaires, dans un premier temps et, dans un second temps, les drogues dont on veut mesurer l'impact sur le comportement des canaux ioniques.

7 BRÈVE DESCRIPTION DES FIGURES

- Les figures 1A - 1C représentent le principe de déplacement de gouttes, par électromouillage, - la figure 2 représente une configuration fermée de dispositif de déplacement de gouttes, - les figures 3A et 3B représentent une configuration mixte de dispositif de déplacement de gouttes, - les figures 4 et 5A - 5B représentent un dispositif de déplacement de gouttes, dans lequel le capot supérieur est muni d'une électrode, - la figure 6 représente une vue de dessus d'un dispositif selon l'invention, avec plusieurs sites de mesure, - la figure 7 représente une vue détaillée d'un site de mesure d'un dispositif selon l'invention.

- les figures 8A - 8D représentent un puits ou un réservoir de liquide; les figures 9A - 9C représentent des étapes d'un procédé avec drogue lyophilisée.

EXPOSÉ DÉTAILLÉ DE MODES DE RÉALISATION PARTICULIERS Un dispositif selon l'invention met en oeuvre un dispositif de déplacement ou de manipulation de gouttes de liquide, par électromouillage, et des moyens de mesure d'activité électrique du liquide, contenu dans ces gouttes ou de cellules contenues dans ces gouttes.

Ces moyens comportent un site, ou un puits, dans lequel une mesure de cette activité, à l'aide de moyens de type électrodes, va pouvoir être réalisée.

Un dispositif selon l'invention est représenté schématiquement en vue de dessus en figure 6. Des sites de mesure 24, 26, 28 y sont représentés, disposés sur, ou intégrés dans, une plaque 250 de manipulation et de transport de gouttes par électromouilllage.

Le dispositif obtenu est donc compact, permettant la formation et l'acheminement de faibles volumes de liquide à des sites de mesure ne nécessitant donc pas de moyens tels que des conduits d'aspiration de fluide.

Un premier mode de réalisation d'un dispositif de déplacement et de manipulation de gouttes mis en oeuvre dans le cadre de l'invention, de type système ouvert, est illustré sur les figures 1A - 1C.

Ce mode de réalisation met en oeuvre un dispositif de déplacement ou de manipulation de gouttes de liquide reposant sur le principe de l'électromouillage sur un diélectrique.

Des exemples de tels dispositifs sont décrits dans l'article de M. G. Pollack, A.D. Shendorov, R.B. Fair, intitulé Electro-wetting-based actuation of droplets for integrated microfluidics , Lab Chip 2 (1) (2002) 96-101.

Les forces utilisées pour le déplacement de gouttes de liquide sont alors des forces électrostatiques.

Le document FR 2 841 063 décrit un dispositif mettant en oeuvre, en outre, un caténaire en regard des électrodes activées pour le déplacement.

Le principe de ce type de déplacement est synthétisé sur les figures 1A 1C.

Une goutte 2 repose sur un réseau 4 d'électrodes, dont elle est isolée par une couche diélectrique 6 et une couche hydrophobe 8 (figure 1A). On a donc un empilement hydrophobe et isolant.

Le caractère hydrophobe de cette couche signifie que la goutte a un angle de contact, sur cette couche, supérieur à 90 .

Les électrodes 4 sont elles-mêmes formées en surface d'un substrat 1.

Lorsque l'électrode 4-1 située à proximité de la goutte 2 est activée, à l'aide de moyens 14 de commutation, dont la fermeture établit un contact entre cette électrode et une source de tension 13 via un conducteur commun 16, la couche diélectrique 6 et la couche hydrophobe 8 entre cette électrode activée et la goutte sous tension agissent comme une capacité.

La contre-électrode 10 permet un éventuel déplacement par électromouillage à la surface de la surface hydrophobe; elle maintient un contact électrique avec la goutte pendant un tel déplacement. Cette contre-électrode peut être soit un caténaire comme dans FR - 2 841 063, soit un fil enterré soit une électrode planaire dans le capot d'un système confiné (un tel système confiné est décrit plus loin).

En système ouvert, si il n'y a pas de déplacement, il est possible d'étaler la goutte sur la surface hydrophobe, sans contre-électrode. C'est par exemple le cas si la goutte peut être amenée sur la surface hydrophobe par un système de dispense classique, les électrodes 4-1, 4-2 servant uniquement à étaler ou déformer la goutte à l'endroit où elle a été déposée.

La goutte peut ainsi être éventuellement déplacée de proche en proche (figure 1C), sur la surface hydrophobe 8, par activation successive des électrodes 4-1, 4-2,... etc, le long du caténaire 10.

Il est donc possible de déplacer des liquides, mais aussi de les mélanger (en faisant s'approcher des gouttes de liquides différents), et de réaliser des protocoles complexes.

Les documents cités ci-dessus donnent des exemples de mises en oeuvre de séries d'électrodes adjacentes pour la manipulation d'une goutte dans un plan, les électrodes pouvant en effet être disposées de manière linéaire, mais aussi en deux dimensions, définissant ainsi un plan de déplacement des gouttes.

La figure 2 représente un autre mode de réalisation d'un dispositif de déplacement ou de manipulation de gouttes pouvant être mis en oeuvre dans le cadre de l'invention, de type système fermé ou confiné.

Sur cette figure, des références numériques identiques à celles des figures 1A - 1C y désignent des mêmes éléments.

Ce dispositif comporte en outre un substrat supérieur 100, de préférence également recouvert d'une couche hydrophobe 108. Cet ensemble peut être éventuellement transparent, permettant une observation par le haut.

Les figures 3A et 3B, sur lesquelles des références numériques identiques à celles de la figure 2 y désignent des éléments identiques ou similaires, représentent un système mixte de déplacement ou de manipulation de gouttes, dans lequel une goutte 2 est initialement en milieu ouvert (figure 3A), l'activation d'électrodes 4-1, 4-2, 4-3 permettant un aplatissement de la goutte (figure 3B), en système fermé, dans une zone où le système est muni d'un capot, comme illustré ci-dessus en liaison avec la figure 2.

La figure 4 représente une variante du système fermé, avec un capot conducteur 100, comportant une électrode ou un réseau d'électrodes 112, ainsi qu'une éventuelle couche isolante 106 (cette dernière est optionnelle) et une couche hydrophobe 108.

Le caténaire 10 des figures précédentes est remplacé, dans ce mode de réalisation, par l'électrode 112. L'activation de cette électrode 112 et des électrodes 4 permet de déplacer la goutte dans la position voulue puis de l'étirer ou de la déformer.

Les figures 5A et 5B, sur lesquelles des références numériques identiques à celles de la figure 4 y désignent des éléments identiques ou similaires, représentent un système mixte, dans lequel une goutte 2 est initialement en milieu ouvert (figure 5A), l'activation d'électrodes 4-1, 4-2, 4-3 permettant un aplatissement de la goutte (figure 5B), en système fermé, dans une zone où le système est muni d'un capot, comme illustré ci-dessus en liaison avec la figure 4.

Un dispositif selon l'invention peut en outre comporter des moyens qui vont permettre de commander ou d'activer les électrodes 4, par exemple un ordinateur type PC et un système de relais connectés au dispositif ou à la puce, tels les relais 14 de la figure 1A, ces relais étant pilotés par les moyens de type PC.

Typiquement, la distance entre un éventuel conducteur 10 (figures 1A - 5B) d'une part et la surface hydrophobe 8 d'autre part est par exemple comprise entre 1 pm et 10 pm ou entre 1}gym et 50 pm.

Ce conducteur 10 peut se présenter par exemple sous la forme d'un fil de diamètre compris entre 10 pm et quelques centaines de pm, par exemple 200 pm. Ce fil peut être un fil d'or ou d'aluminium ou de tungstène ou d'autres matériaux conducteurs.

Lorsque deux substrats 1, 100 sont utilisés (figures 2 - 5B), ils sont distants d'une distance comprise entre, par exemple, 10 pm et 100 pm ou 500 pm.

Quel que soit le mode de réalisation considéré, une goutte de liquide 2 pourra avoir un volume compris entre, par exemple, 1 picolitre et quelques microlitres, par exemple entre 1 pl et 100 pl ou 1 pl ou 5 pl ou 10 pl.

En outre chacune des électrodes 4 aura par exemple une surface de l'ordre de quelques dizaines de pm' (par exemple 10 pm') jusqu'à 1 mm', selon la taille des gouttes à transporter, l'espacement entre électrodes voisines étant par exemple compris entre 1 pm et 10 pm.

La structuration des électrodes 4 peut être obtenue par des méthodes classiques des micro- technologies, par exemple par photolithographie.

Des procédés de réalisation de puces incorporant un dispositif selon l'invention peuvent être directement dérivés des procédés décrits dans le document FR - 2 841 063.

Des conducteurs, et notamment des conducteurs 110 peuvent être réalisés par dépôt d'une couche conductrice et gravure de cette couche suivant le motif approprié de conducteurs, avant dépôt de la couche hydrophobe 108.

Les électrodes peuvent être réalisées par dépôts d'une couche métallique (par exemple en un métal choisi parmi Au, Al, ITO, Pt, Cr, Cu) par photolithographie. Le substrat est ensuite recouvert d'une couche diélectrique, par exemple en Si3N4 ou en SiO2. Enfin un dépôt d'une couche hydrophobe est effectué, comme par exemple un dépôt de téflon réalisé à la tournette.

Un tel dispositif de déplacement de gouttes peut mettre en oeuvre un réseau bidimensionnel d'électrodes qui vont permettre, de proche en proche, de déplacer des liquides dans ou sur un plan, de les mélanger, afin de réaliser des protocoles complexes.

Dans le cas du mode de réalisation avec caténaires 10 (figures 1A -3B), un ensemble bidimensionnel (2D) de ces caténaires peut être réalisé audessus de l'ensemble 2D d'électrodes 4. Dans le cas du mode de réalisation avec contre-électrode 112 incorporée dans le capot 100 (figures 4 - 5B), cette contre - électrode peut aussi avoir une structure bidimensionnelle.

La figure 6 représente un dispositif selon l'invention, avec sites ou chambres de mesure.

Ce dispositif comporte d'abord un dispositif bidimensionnel de déplacement et de manipulation de gouttes, par exemple du type tel qu'exposé ci-dessus, et dont seules les électrodes du substrat inférieur sont représentées schématiquement et désignées, là encore, par la référence 4.

Les références 22 et 21 désignent plusieurs réservoirs, par exemple un réservoir de cellules 22 et un ou plusieurs réservoir de drogues ou d'agents actifs 21. On utilise le terme agent actif pour désigner une toxine ou une drogue.

Un seul réservoir peut dans certains cas être suffisant. Il est également possible de ne pas utiliser de réservoir et d'amener les volumes de liquide à analyser par d'autres moyens, par exemple une pipette.

Le système peut en outre comporter un site 26 de mesure unique ou une pluralité de sites 24, 26, 28.

Les réservoirs 21, 22 sont avantageusement compatibles avec un format de plaques à puits (8, 96, 384, 1586 puits). Ils sont avantageusement intégrés au dispositif. Un exemple de réalisation de ces réservoirs sera donné plus loin en liaison avec les figures 8A - 8D.

La figure 7 représente une portion du dispositif de la figure 6, au voisinage d'un puit de mesure 26, en coupe le long d'un axe AA'.

Le substrat inférieur est muni de ses électrodes d'activation 4, tandis que le substrat supérieur 100 est représenté de manière simplifiée, sans sa contre - électrode.

La structure de déplacement de gouttes décrite ci-dessus repose sur un substrat ou une couche 30 hydrophile d'épaisseur comprise entre 0, 1}gym et 20}gym, par exemple un diélectrique tel que SiO2 ou Si3N4 Les électrodes pour le déplacement par électromouillage peuvent être réalisées sur cette couche 30.

Ce substrat ou cette couche comporte une ouverture 31, d'un diamètre de quelques}gym, compris par exemple entre 1}gym et 2}gym ou 5} gym. Cette ouverture est par exemple réalisée par lithographie et gravure sélective. En fonction des diamètres et des profondeurs à graver on pourra utiliser la gravure humide sèche (attaque par gaz (SF6 par exemple) dans un plasma) ou la gravure humide (avec par exemple une solution de HF ou de H3 PO4) . Ce substrat ou cette couche 30 repose sur un substrat 32 d'épaisseur par exemple comprise entre 100}gym et 1 mm, par exemple en silicium ou en verre ou en un polymère, qui comporte lui-même une ouverture 33 plus large que l'ouverture 31.

Un substrat ou un capot inférieur 34, par exemple en polycarbonate ou en époxy ou un circuit imprimé définit avec le substrat 32 une chambre 40 pouvant contenir un liquide 42, en particulier une solution conductrice telle que du PBS ( phosphate buffered saline ).

Ce liquide 42 peut avoir été préalablement amené goutte à goutte, par électromouillage, comme les gouttes 2 le sont par la suite lors d'une mesure.

Une électrode de mesure 261 en face arrière peut être placée contre le substrat 32 ou contre le substrat 30, de manière à être en contact avec un liquide 42 présent dans la cavité 40. Cette électrode va permettre d'appliquer, avec l'électrode 260, une différence de potentiel dans le milieu liquide 42 présent dans la cavité. Des conducteurs, non représentés sur la figure, permettent d'appliquer la tension voulue entre les deux électrodes 260, 261. Cette tension est par exemple pilotée ou commandée par les moyens qui permettent de commander ou d'activer les électrodes 4, par exemple un ordinateur de type PC disposant des interfaces appropriées. Ces conducteurs vont permettre également de mesurer la variation de tension entre les électrodes 260, 261 lorsqu'une goutte 2 de liquide est amenée par électromouillage sur le site de mesure et est mélangée au liquide 42. Cette variation peut être mémorisée dans des moyens de mémorisation d'un dispositif qui permettra ensuite de traiter et d'analyser les données ainsi prélevées lors des mesures.

En fait, dans le cas de mesures de type patch clamp , ce sont plutôt des cellules qui sont amenées, dans une goutte, à un site de mesure, les électrodes 260, 261 permettant de faire une mesure sur une cellule individuelle.

A partir du réservoir contenant la drogue à étudier ou le tampon physiologique qui contient les cellules, des gouttes 2 calibrées sont réalisées par électromouillage dynamique, en configuration capotée (figures 2 - 5B) ou non (figures 1A - 1C).

Comme déjà indiqué, on peut également déposer des gouttes sur le dispositif à l'aide de moyens tels qu'une pipette.

Les gouttes 2 se déplacent dans un milieu non conducteur 16, par exemple de l'huile ou de l'air.

Selon un exemple d'utilisation, les chambres ou sites de mesure 24, 26, 28 sont d'abord remplies de solutions physiologiques conductrices contenant des cellules amenées par exemple du réservoir 22. Puis on créée des nano-gouttes de drogues, par exemple à partir des réservoirs 21, que l'on achemine par électromouillage vers les sites 240, 260, 280 de mesure.

Les gouttes déplacées ou amenées peuvent être composées d'une solution conductrice (solution tampon pour les cellules) ou non. Les drogues, ou les agents actifs, peuvent être diluées dans des solutions de faible conductivité (ordre de grandeur de quelques mS/m, par exemple 1 mS/m) mais le liquide de la goutte au niveau du site de mesure est d'une conductivité d'ordre de grandeur 1 Siemens/m ou comprise entre 0,5 Siemens/m et 2 Siemens/m.

Comme déjà indiqué ci-dessus, les électrodes 4 servant à l'électromouillage, ainsi que les électrodes 260 servant à la mesure d'électrophysiologie, sont sur une membrane diélectrique 1, 30 dont le revêtement 6, 8 est hydrophobe et passivé dans les zones de déplacement des gouttes.

Par contre, dans les zones de mesure telle que la zone 26, le revêtement (en fait: la couche 30) est hydrophile et non passivé, l'électrode de mesure 260 étant en contact avec le liquide de la solution conductrice 42. Une goutte 2, amenée sur le site de mesure 26, va modifier les propriétés du liquide localisé sur ce site.

Selon l'invention, une ou plusieurs chambres de mesure sont réalisées ou intégrées dans un dispositif de transport de gouttes par électromouillage. L'électromouillage permet d'amener des gouttes dans ces chambres. Des moyens de pompage permettent d'assurer une dépression entre la chambre supérieure et la chambre inférieure, afin de capturer une cellule sur l'orifice 31.

Afin d'isoler électriquement un fragment de membrane, on amène, par électromouillage, les cellules - dans une goutte - dans une des chambres de mesure. Alors que les cellules sédimentent, on modifie les pressions entre la chambre 40 et la partie du dispositif située du côté des électrodes 260; une dépression est ainsi créée entre les chambres inférieure et supérieure. Les cellules sont alors attirées sur le trou (unique) 31 de la membrane 30 de diélectrique. Une seule cellule sera finalement étudiée. Une fois la membrane de la cellule sur le trou 31, celle-ci se déforme, puis s'invagine dans le trou. La résistance électrique mesurée au niveau du contact cellule/diélectrique 30 peut être alors de l'ordre du Giga-Ohm. Cette résistance permet de visualiser, par exemple sur un amplificateur de patch , des courants de l'ordre du pico-ampère. Ces courants résultent du passage des ions au travers des protéines canal de la cellule.

Les figures 8A - 8D représentent comment 10 peut être réalisé un réservoir tel que les réservoirs 21 ou le réservoir 22.

Un liquide 200 à dispenser est déposé dans un puits 120 de ce dispositif (figure 8A). Ce puit est par exemple réalisé dans le capot supérieur 100 du dispositif. La partie inférieure, représentée de manière schématique sur les figures 8A - 8D, est par exemple similaire à la structure des figures 1A-1C. Si on n'utilise pas une configuration avec un capot supérieur, la configuration ouverte laisse la possibilité de verser un liquide tel que de l'huile sur toute la surface. On peut ensuite dispenser une goutte et la déplacer ensuite par électromouillage.

3 électrodes 4-1, 4-2, 4-3, similaires aux électrodes 4 de déplacement de gouttes de liquide, sont 25 représentées sur les figures 8A - 8D.

L'activation de cette série d'électrodes 4-1, 4-2, 4-3 conduit à l'étalement d'une goutte à partir du puits 120, et donc à un segment liquide 201 comme illustré sur la figure 8C.

Puis, on coupe ce segment liquide en désactivant une des électrodes activées (électrode 4-2 sur la figure 8C). On obtient ainsi une goutte 2, comme illustré sur la figure 8D.

On utilise donc une série d'électrodes 4-1, 4-2, 4-3 pour étirer du liquide du réservoir 120 en un doigt 201 (figures 8B et 8C) puis pour couper ce doigt 201 de liquide (figure 8D) et former une goutte 2 qui va pouvoir être emmenée vers tout site de mesure comme décrit ci-dessus.

On peut appliquer ce procédé en insérant des électrodes telles que les électrodes 4 - 1 entre le réservoir 120 et une ou plusieurs électrode 4 2 dite électrode de coupure.

L'invention offre de multiples avantages.

Elle permet d'abord une dispense unique, à partir d'un réservoir, des drogues et des cellules, ou de tout agent actif, au lieu d'une dispense puits par puits comme dans les dispositifs connus de patch clamp planaires.

Elle permet également l'utilisation de 20 volumes de réactifs extrêmement réduits, de l'ordre du picolitre (par exemple entre 0,5 pl et 1 pl ou 2 pl ou pl), sans volume mort, et le contrôle des concentrations. En outre il n'y a pas d'évaporation qui risquerait d'influencer la viabilité des cellules. Les zones des mesures sont isolées électriquement dans la chambre

supérieure et dans la chambre inférieure. Il y a indépendance électrique des puits, ce qui rend les conditions de test (drogues, tampon et cellules) strictement indépendantes.

Il est possible de prélever des quantités de drogue dans les réservoirs avec un incrément 30 variable, par exemple de l'ordre de 64 nana litres et avec contrôle des concentrations. La concentration est contrôlée par dilutions successives à partir d'un réservoir de concentration connue.

On peut également mentionner la possibilité de changement de tampon 42, et/ou d'électrodes pour étudier d'autres canaux que les BK sur des cellules sauvages ou malades. Les BK sont des canaux potassiques, que l'on peut sur-exprimer dans des cellules génétiquement modifiées. La solution conductrice 42 optimale résulte de la prise en compte du type de canaux et du jeu d'électrodes 260, 261 utilisé.

Il est également possible d'étudier les cycles pour les toxines à effets réversibles. Les toxines d'intérêt vont avoir un effet inhibiteur ou activateur sur les protéines canal. Cet effet peut être réversible; par exemple, en diminuant la concentration de toxine dans la solution conductrice on va progressivement retrouver une activité des canaux (le nombre de canaux inhibés va diminuer).

Il est également possible d'étudier les actions combinées des mélange de toxines, afin de vérifier si leurs actions sont, ou pas, compatibles et/ou synergiques.

Selon un autre exemple d'utilisation, il est possible de faire rouler les cellules en fond de goutte 2 pour augmenter la probabilité de capture . Une des difficultés du patch clamp planaire provient de la capture d'une cellule sur le trou 31 dans la membrane cellulaire 30. On accroît cette probabilité de capture par des mouvements ou par l'agitation des gouttes. On maintient une agitation modérée des gouttes, limitant ainsi les problèmes d'adhérence intempestifs.

Un autre exemple d'application consiste en la possibilité d'embarquer sur la puce des toxines lyophilisées stockées dans de l'huile. Une goutte 2 de solution tampon sera amenée sur la toxine lyophilisée afin la mettre en solution. La goutte de toxine ainsi créée sera fusionnée à une autre goutte 2 contenant les cellules. Jusqu'ici les toxines étaient apportées à la chambre de mesure dans des gouttes à partir d'un réservoir de fluide. Ici, il s'agit d'apporter les toxines lyophilisées sous la forme d'une pastille qui serait maintenue dans l'huile sur la puce - sur un site distinct du site de mesure et remise en solution par mise en contact avec une goutte.

Les figures 9A - 9C représentent des étapes d'un procédé avec drogue lyophilisée.

Sur ces figures, des références numériques identiques à celles de la figure 7 y désignent des éléments identiques ou similaires.

Une drogue lyophilisée 39 est disposée sur le trajet d'une goutte 2 en direction d'un site de mesure (figure 9A).

Lorsqu'elle arrive sur la drogue lyophilisée 39, la goutte stationne environ quelques secondes, ce qui va permettre de mettre la drogue en solution dans la goutte (figure 9B).

Puis, la goutte, contenant la drogue en solution, est amenée vers le site de mesure (figure 9C).

Sur ces figures 9A - 9C, une seule drogue lyophilisée 39 est représentée, mais il peut y avoir plusieurs pastilles lyophilisées, de natures différentes. La goutte sera orientée, par exemple par son trajet par électromouillage, vers la pastille sélectionnée.

Il est ainsi possible de modifier la nature du tampon en place au niveau d'un site de mesure. On peut ainsi, notamment, inhiber ou activer des canaux ioniques de la membrane cellulaire.

On peut, par un procédé adapté, minimiser le collage des cellules sur le diélectrique 30. Par exemple, des greffages de poly(éthylène glycol) permettent de limiter l'adsorption hydrophobe de protéines (voir l'article de B. Balkrishnan et al., Biomaterials, vol. 26, p. 3495 - 3502) .

D'une manière générale, l'invention permet d'effectuer une mesure de type patch-clamp sur un volume de l'ordre du picolitre (par exemple comprise entre 0,5 pl et 5 pl, par exemple 1 pl ou 2 pl), ce qui est, de plusieurs ordres de grandeur, inférieur au volume nécessaires dans les dispositifs connus.

Claims (24)

REVENDICATIONS

1. Procédé d'analyse d'un liquide d'une goutte (2) comportant: -la mise en contact d'une goutte de ce liquide avec une surface hydrophobe (8), - le déplacement de la goutte sur cette surface par électromouillage, afin de l'amener en un site (24, 26, 28) de mesure d'activité électrique, dans lequel est disposée une solution conductrice (42), - la mesure de ladite activité électrique.

2. Procédé selon la revendication 1, la goutte étant confinée, au moins lors de son déplacement, entre ladite surface hydrophobe (8) et un substrat supérieur (100).

3. Procédé selon la revendication 2, la goutte n'étant, avant déformation, pas confinée par le substrat supérieur.

4. Procédé selon la revendication 2, la goutte étant, avant déformation, confinée par le substrat supérieur.

5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, mettant en oeuvre un dispositif d'électromouillage, comportant un premier substrat recouvert de ladite couche hydrophobe (8), et une pluralité d'électrodes (4) disposées sous cette couche hydrophobe, le déplacement étant obtenu par activation de ces électrodes (4).

6. Procédé selon l'une des revendications 1

à 5, les gouttes étant formés à partir d'un ou de plusieurs réservoirs (21, 22).

7. Procédé selon l'une des revendications 1

à 6, les gouttes ayant un volume compris entre 1 pl et 10 pl.

8. Procédé selon l'une des revendications 1

à 7, la mesure d'activité électrique étant réalisée sur une cellule unique contenue dans la goutte (2).

9. Procédé selon la revendication 8, la mesure étant une mesure sur un canal de cellule.

10. Procédé selon l'une des revendications 20 1 à 9, la goutte contenant des cellules de types différents ou au moins un type de cellule et un type de toxine.

11. procédé selon l'une des revendications 25 1 à 10, comportant au moins une substance lyophilisée (39) disposée sur le trajet de la goutte (2) vers un site de mesure.

12. Dispositif d'analyse d'une goutte (2) 30 d'un milieu liquide comportant: - un premier substrat comportant une couche hydrophobe (8), des moyens (24, 26, 28, 240, 260, 280, 261) formant au moins un site d'analyse ou de mesure d'activité électrique, - des moyens pour déplacer une goutte, sur cette surface, par électromouillage, afin de l'amener sur ledit site d'analyse.

13. Dispositif selon la revendication 12, comportant en outre un deuxième substrat (100), disposé en regard de la couche hydrophobe.

14. Dispositif selon la revendication 13, le deuxième substrat comportant en outre une couche hydrophobe superficielle (108).

15. Dispositif selon la revendication 13 ou 14, le deuxième substrat comportant en outre une électrode (112).

16. Dispositif selon l'une des revendications 13 à 15, les moyens pour déplacer une goutte, sur la couche hydrophobe (8), par électromouillage, comportant une pluralité d'électrodes (4) sous cette couche hydrophobe.

17. Dispositif selon l'une des revendications 13 à 16, au moins un site d'analyse ou de mesure d'activité électrique (24, 26, 28) étant exempt de couche hydrophobe, et présentant une couche hydrophile (30), ainsi que des premiers et deuxième moyens (260, 261) de mesure d'activité électrique.

18. Dispositif selon la revendication 17, un capot ou un substrat (34) formant avec le dispositif une chambre (40), en communication, par un orifice de la couche hydrophile (31), avec la surface de la couche hydrophobe (8).

19. Dispositif selon l'une des revendications 18, comportant en outre des moyens de pompage pour engendrer une dépression dans la chambre (40).

20 Dispositif selon l'une des revendications 13 à 19, au moins un des sites d'analyse ou de mesure d'activité électrique (24, 26, 28) étant entouré d'une portion de la couche hydrophobe (8).

21. Dispositif selon l'une des revendications 13 à 20, comportant en outre au moins un réservoir (21, 22) pour stocker un liquide à analyser ou dont l'activité électrique est à mesurer.

22. Dispositif selon la revendication précédente, comportant des moyens (120, 4-1, 4-2, 4-3) pour former une goutte (2) de liquide à partir d'un réservoir (21, 22).

23. Dispositif selon l'une des revendications 13 à 22, comportant une pluralité de sites d'analyse ou de mesure (24, 26, 28).

24. Dispositif selon l'une des revendications 21 ou 22, comportant une pluralité de sites d'analyse ou de mesure (24, 26, 28), et au moins un réservoir (21, 22) commun à cette pluralité de sites d'analyse ou de mesure, pour former des gouttes pouvant être amenées à des sites d'analyse différents de cette pluralité de sites d'analyse.