FR2860517A1 - Procedes et outils pour la modification chromosomique de bacteries - Google Patents

Abstract

La présente demande concerne des procédés et outils pour modifier le chromosome de bactéries. Elle concerne en particulier des méthodes pour modifier de manière ciblée le génome de bactéries, par exemple en inactivant ou en remplaçant un gène cible. Les méthodes et outils de l'invention reposent sur la recombinaison homologue et sur l'utilisation d'un système de sélection et de contre-sélection particulièrement efficace, dérivé de la thymidine kinase. L'invention est applicable à de multiples espèces de bactéries, permettant par exemple d'analyser la fonction de gènes, de créer de nouvelles voies métaboliques et/ou de cribler des banques de gènes.

Description

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PROCEDES ET OUTILS POUR LA MODIFICATION
CHROMOSOMIQUE DE BACTERIES La présente demande concerne des procédés et outils pour modifier le chromosome de bactéries. Elle concerne en particulier des méthodes pour modifier de manière ciblée le génome de bactéries, par exemple en inactivant ou en remplaçant un gène cible. Les méthodes et outils de l'invention reposent sur la recombinaison homologue et sur l'utilisation d'un système de sélection et de contre-sélection particulièrement efficace.

L'invention est applicable à de multiples espèces de bactéries, permettant par exemple d'analyser la fonction de gènes, de créer de nouvelles voies métaboliques et/ou de cribler des banques de gènes.

L'accumulation des connaissances approfondies sur le métabolisme et la génétique de l'organisme bactérien Escherichia coli a été accompagnée et soutenue par l'élaboration de protocoles de manipulation du chromosome patiemment améliorés et optimisés. La plupart de ces protocoles sont basés sur les propriétés de recombinaison entre séquences homologues ; elles permettent de générer des délétions de gènes, d'intégrer des séquences hétérologues, d'échanger des allèles, etc. Bien que parfaitement maîtrisés dans les laboratoires de génétique, ces protocoles demandent du temps, offrent souvent un rendement décevant et présentent certaines limitations.

Les protocoles couramment utilisés pour obtenir la délétion d'un gène sont basés sur la possibilité de recombinaison homologue entre un brin d'ADN linéaire et le chromosome, dans une souche dont les propriétés de recombinaison sont altérées (souches recB recC sbcB). La sélection de l'événement de recombinaison est assurée par l'insertion en général d'une cassette de résistance à un antibiotique entre les séquences recombinantes, parfois par un marqueur métabolique permettant l'assimilation d'une nouvelle source nutritive, ou encore par l'introduction d'un marqueur conférant une coloration ou une fluorescence à la bactérie détectée par des moyens appropriés. L'accumulation de délétions multiples dans une même souche est limitée par le nombre de gènes de résistance disponibles.

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L'échange d'un allèle sauvage par un allèle modifié peut requérir une première étape d'intégration dans le chromosome d'une construction circulaire (plasmide) portant une séquence homologue, qui entraîne la présence sur le chromosome des deux allèles. Ce premier événement est sélectionné par l'intégration dans la construction d'une cassette de résistance à un antibiotique. L'échange allèlique est réalisé après un second événement de recombinaison entre les deux séquences homologues, qui élimine les séquences non homologues, dont la cassette de résistance. Le nouvel allèle doit être en conséquence sélectionnable directement.

Une méthode de recombinaison homologue chez E. coli a été décrite par Link (J.

Bacteriol. 1997,179:6228-6237). Cette méthode décrit l'utilisation d'un marqueur de sélection positive et d'un marqueur de sélection négative, le gène sacB. Bien que cette méthode améliore significativement l'état de l'art, les auteurs constatent néanmoins que le marqueur de sélection négative n'est pas absolu et peut conduire dans certains cas à l'isolement de clones non conformes à ce qui est attendu.

Les contraintes et limitations de ces protocoles exigent la mise au point de méthodes applicables à priori à tous les gènes et permettant la sélection positive d'événements de recombinaisons rares ainsi que la sélection directe de l'excision du gène marqueur.

Par ailleurs, le développement des programmes d'exploration des génomes qui ouvre l'accès à un nombre chaque jour plus large d'organismes, acclimatés au laboratoire et dont les séquences génomiques sont entièrement connues, réclame des méthodes transposables d'un organisme à un autre.

La présente invention fournit des méthodes de recombinaison tout à fait fiables et susceptibles d'être utilisées de façon automatisée. La sélection négative utilisée est basée sur la létalité conditionnelle induite par la thymidine kinase en présence d'un analogue de nucléoside. Un des avantages de ce marqueur tdk est qu'il peut aussi être un marqueur de sélection positive en présence de certains toxiques. La fonctionnalité de l'insertion chromosomique du gène tdk peut donc être vérifiée avant de procéder à la contre-sélection liée à ce même gène.

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La présente demande de brevet décrit notamment l'utilisation du gène tdk, codant pour une activité thymidine kinase et dont le produit de traduction phosphoryle des analogues de nucléosides tels l'azidothymidine, comme gène marqueur pour la sélection d'un événement de recombinaison génétique (crible positif) chez les bactéries, et dont la perte est sélectionnable directement par la résistance des bactéries à l'analogue de nucléoside (crible négatif). Cette méthode a été mise au point et validée dans différentes espèces de bactéries, notamment dans E. coli et dans Acinetobacter ADP1.

Un premier aspect de l'invention réside donc dans l'utilisation d'un gène codant une activité thymidine kinase comme marqueur de sélection d'événement de recombinaison chez les bactéries.

Un autre objet de l'invention concerne une méthode pour altérer de manière ciblée le génome d'une bactérie par double recombinaison homologue, comprenant : a) l'introduction, dans une bactérie déficiente pour l'activité thymidine kinase, d'une construction génétique comprenant (i) au moins une région ayant une séquence homologue à un segment sélectionné du génome de la bactérie, dont l'altération est souhaitée, ladite région possédant une longueur suffisante pour permettre la recombinaison homologue, (ii) un marqueur positif de sélection et (iii) un marqueur négatif de contre-sélection comprenant un gène codant un polypeptide ayant une activité thymidine kinase, b) la culture des bactéries dans des conditions de sélection vis-à-vis du marqueur positif et la sélection des bactéries exprimant le marqueur positif inséré dans leur chromosome, et c) la culture de bactéries obtenues à l'étape b) en présence d'un analogue de nucléoside métabolisé par la thymidine kinase, et la sélection des bactéries capables de survie ou de croissance en présence de cet analogue, lesdites bactéries possédant un génome altéré.

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De manière préférée, le marqueur positif de sélection confère la résistance à un composé antibiotique et/ou le marqueur négatif de contre-sélection est un gène tdk conférant une toxicité à un analogue de nucléoside et/ou l'analogue de nucléoside est l'AZT. Dans un mode particulier de mise en #uvre, le marqueur positif de sélection et le marqueur négatif de contre-sélection sont un seul et unique gène. L' altération peut porter sur toute partie du génome de la bactérie, comme par exemple un gène d'intérêt. La bactérie peut être toute bactérie transformable par un acide nucléique in vitro, comme par exemple E. coli, Acinetobacter, Pseudomonas, Bacillus, Helicobacter, Synechocystis, Methanobacterium, Methanococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Staphylococcus, Klebsiella, Xanthomonas, Agrobacterium, etc. De préférence, la construction génétique utilisée pour l'altération du génome ne se réplique dans la bactérie. Cette construction peut-être un fragment d'ADN circulaire ou linéaire.

Un autre objet de l'invention concerne un produit comprenant : - une construction génétique comprenant (i) une région ayant une séquence homologue à un segment sélectionné du génome d'une bactérie dont l'altération est souhaitée, ladite région possédant une longueur suffisante pour permettre la recombinaison homologue, (ii) un marqueur positif de sélection et (iii) un marqueur négatifde contre-sélection comprenant un gène codant un polypeptide ayant une activité thymidine kinase ; et - un analogue de nucléoside métabolisé par cette thymidine kinase.

L'invention concerne également une construction génétique recombinante, constituée par (i) une région ayant une séquence homologue à un segment sélectionné du génome d'une bactérie dont l'altération est souhaitée, ladite région possédant une longueur suffisante pour permettre la recombinaison homologue, (ii) un marqueur positif de sélection conférant la résistance à un composé antibiotique et (iii) un marqueur négatif de contre-sélection comprenant un gène codant un polypeptide ayant une activité thymidine kinase.

L'invention concerne encore des méthodes pour altérer des voies métaboliques ou pour créer de nouvelles voies métaboliques chez les bactéries, comprenant l'altération, dans

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une bactérie, d'un gène impliqué dans une voie métabolique en utilisant une méthode décrite ci-avant.

L'invention concerne encore des méthodes pour déterminer la fonction de gènes chez les bactéries, comprenant l'altération, dans une bactérie, d'un gène dont la fonction est à étudier, en utilisant une méthode décrite ci-avant, et l'analyse du phénotype de la bactérie ainsi obtenue. Au sens de l'invention, le phénotype désigne au sens large la morphologie, croissance, mobilité, division, l'expression de marqueurs de surface, la sécrétion de facteurs dans le milieu, la survie, etc.

L'invention est généralement applicable à la modification de tout gène ou région du génome de toute bactérie, est fiable et rapide, et fournit des nouveaux outils efficaces et puissants pour l'analyse génétique, la construction de génomes modifiés et la création de diversité génétique ou métabolique.

LEGENDE DES FIGURES Figure 1 : schématique d'une construction génétique de l'invention et du protocole d'échange allélique, appliqué au gène ileS de l'isoleucyl-tRNA synthétase de E. coli.

Figure 2 : Représentation schématique d'une construction génétique de l'invention et du protocole de remplacement de gène, appliqué au gène icd de l'isocitrate déhydrogénase de E.coli.

Figure 3 : schématique d'une construction génétique de l'invention et du protocole de délétion de gène, appliqué au gène cysN de la sulfurylase d'Acinetobacter ADP1.

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DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION Comme indiqué, l'invention porte sur des compositions et méthodes permettant de modifier le génome de bactéries de manière ciblée, par exemple pour inactiver un gène sélectionné. Les compositions et méthodes de l'invention reposent notamment sur la mise au point de constructions génétiques particulières et de gènes de sélection particuliers, assurant une grande efficacité et une application large de l'invention.

Construction Génétique Le terme construction génétique désigne toute molécule recombinante d'acide nucléique.

Il peut s'agir d'ADN simple-brin ou double-brin, de préférence double-brin, linéaire ou circulaire. La construction génétique peut être de type plasmide ou phage, ou un fragment d'ADN. Elle peut être construite par les techniques classiques de la biologie moléculaire, comprenant la ligation, le clonage, la synthèse artificielle, l'amplification, etc.

(i) Région d'Homologie La région d'homologie (i) est destinée à permettre l'insertion chromosomique ciblée de la construction génétique (ou d'une partie de celle-ci), par recombinaison homologue.

Cette région comprend donc une séquence homologue à un segment sélectionné du génome de la bactérie (par exemple un gène ou une région régulatrice), dont l'altération est souhaitée, et elle possède une longueur suffisante pour permettre la recombinaison homologue.

Le segment sélectionné du génome (et dont l'altération est souhaitée) peut être tout ou partie d'un gène (c'est-à-dire une région du génome codant pour un ARN ou une protéine), d'une région régulatrice (par exemple un promoteur, une terminateur, etc. ), d'une région non caractérisée, etc. On peut citer par exemple un gène d'une voie de biosynthèse d'un métabolite, d'un antibiotique, d'un acide aminé, d'une vitamine, d'une enzyme, d'une protéine de la membrane ou de la paroi de la bactérie, d'un gène impliqué

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dans la virulence d'une bactérie, d'un gène impliqué dans un système transporteur présent dans une membrane de la bactérie, etc.

L'altération peut consister par exemple en un échange allélique (c'est-à-dire la substitution de tout ou partie d'un gène par une copie altérée de celui-ci), un remplacement de gène (c'est-à-dire le remplacement de tout ou partie d'un gène par un gène différent) ou une délétion de tout ou partie d'un segment du génome.

La région d'homologie à un segment sélectionné du génome de la bactérie permet la recombinaison homologue au niveau de ce segment, et ainsi l'altération ciblée du génome. La région d'homologie doit être d'une longueur suffisante pour permettre la recombinaison homologue. Il est généralement admis qu'une région d'homologie de 30 bases au moins est suffisante chez les bactéries pour permettre la réalisation d'un événement de recombinaison. On préfère toutefois utiliser des régions d'homologies plus grandes, typiquement comprenant de 30 à 2000 bases, par exemple de 50 à 1000, typiquement de 80 à 800. Par ailleurs, le degré d'homologie doit être suffisant pour permettre la recombinaison homologue. De préférence, l'homologie (c'est-à-dire l'identité de séquence) est parfaite sur une portion au moins de la région d'homologie, ou au moins supérieure à 80%, de préférence à 85%, 90%, 95%, 97% ou 98%. Le degré d'homologie peut en effet affecter la sélectivité de la méthode et, surtout, son rendement.

On préfère donc que les régions d'homologies présentent un degré d'identité élevé, de préférence supérieur à 95% avec le segment ciblé. Il est entendu que la longueur et la composition de la région d'homologie peuvent être ajustées par l'homme du métier, en fonction du type d'altération recherché, de la bactérie considérée, et du type de construction génétique.

Ainsi, pour un échange allélique, la région d'homologie comprend typiquement la séquence d'une copie altérée d'une partie au moins du gène dont la modification est recherchée. Cette copie altérée comprend de préférence deux régions d'homologie parfaite avec le gène cible, permettant la double recombinaison homologue, encadrant une région altérée du gène cible, par exemple portant une ou plusieurs mutation(s), délétion (s) et/ou addition(s) d'un ou plusieurs résidus. Typiquement, l'altération du gène

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comprend une ou plusieurs mutations, ponctuelles ou non. Une mutation ponctuelle consiste en la substitution d'une base par une autre dans la séquence du gène (pouvant résulter en un changement de codon, par exemple résultant en un codon stop, non-sens, ou en un codon codant un acide aminé différent). Une mutation non ponctuelle consiste en la substitution de plusieurs bases consécutives dans la séquence du gène, pouvant résulter en un changement d'un ou plusieurs codons consécutifs. Une délétion consiste en la suppression d'une ou plusieurs bases, consécutives ou non, dans la séquence du gène. Cette délétion peut créer par exemple des codons stops ou non-sens, ou introduire un décalage du cadre de lecture. Des additions d'une ou plusieurs bases peuvent également être envisagées.

Dans le cas d'un remplacement (partiel ou total) ou d'une délétion (partielle ou totale) de gène, la région d'homologie se compose typiquement de deux sous-régions d'homologie ayant chacune une séquence homologue à un segment distinct du gène de la bactérie dont l'altération est souhaitée, et possédant chacune une longueur suffisante pour permettre la recombinaison homologue. Chacune de ces sous-régions est choisie de manière à encadrer la séquence du gène cible dont le remplacement ou la délétion est souhaité. Dans le cas d'un remplacement de gène, les deux sous-régions encadrent le marqueur positif de sélection (ii) ou tout autre acide nucléique qui sera inséré dans le gène cible, en remplacement de séquences du gène. Dans le cas d'une délétion de gène, les deux sous-régions encadrent un ensemble constitué du marqueur positif de sélection (ii) et du marqueur négatif de contre-sélection (iii).

La région d'homologie peut être définie à partir de la séquence du gène ou du segment ciblé dans le génome de la bactérie. Une fois que la région cible a été identifiée et que le type d'altération est déterminé, une région d'homologie (i) peut être préparée, typiquement par synthèse artificielle, ou par clonage et/ou amplification.

(ii) Marqueur Positif Le marqueur positif de sélection (ii) peut être tout gène (c'est-à-dire tout acide nucléique) codant un produit ARN ou polypeptide conférant à la cellule bactérienne le

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contenant la résistance à un composé toxique. Il s'agit de préférence d'un gène codant un produit conférant la résistance à un antibiotique. A titre d'exemples non limitatifs, on peut citer le gène kan conférant la résistance à la kanamycine, le gène neo conférant la résistance à la néomycine, le gène cat conférant la résistance au chloramphénicol, le gène aad conférant la résistance à la spectinomycine, le gène StreptR, conférant la résistance à la streptomycine, le gène aac conférant la résistance à l'apramycine ou le gène tdk conférant la résistance au trimethoprime en présence de thymidine en milieu riche. Ce dernier marqueur positif de sélection et les conditions dans lesquelles il opère constituent un autre objet particulier de la présente invention. En effet, la présente demande propose d'utiliser un gène tdk à la fois comme marqueur positif et négatif, fournissant ainsi des constructions génétiques simplifiées.

Le gène tdk codant pour l'activité thymidine kinase constitue chez E. coli, en présence de thymidine, un gène de résistance au trimethoprime. Le trimethoprime est un inhibiteur de la dihydrofolate réductase ; il provoque secondairement, par épuisement du stock intracellulaire de méthylène tétrahydrofolate (co-substrat avec le dUMP de la thymidilate synhthase), le blocage de la synthèse du thymidilate (dTMP) et entraîne la mort cellulaire par absence de la base T ( thyminless death ). Dans une souche de E. coli dont la fonction thymidilate synthase est déficiente (en présence de triméthoprime ou par inactivation du gène thyA), l'activité thymidine kinase permet la croissance cellulaire en présence de thymidine. En présence de trimethoprime, on procède à la sélection de bactéries résistantes en milieu riche de Muller Hinton (MH) additionné de thymidine. L'utilisation de tdk comme marqueur positif de sélection est applicable aux bactéries ayant une dihydrofolate réductase sensible au trimethoprime et une thymidilate synthase de type thyA.

Dans ce mode de réalisation particulier de l'invention, le marqueur positif de sélection (ii) et le marqueur négatif de contre-sélection (iii) sont représentés par un gène unique, codant un polypeptide à activité thymidine kinase, de préférence un gène tdk.

Lorsque le marqueur positif de sélection est un marqueur conférant la résistance à un composé toxique (par exemple un antibiotique), l'étape b) de la méthode comprend la

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culture des bactéries en présence du composé toxique et la sélection des cellules capables de survie et/ou de croissance sur ce milieu. Les concentrations utilisées pour le composé toxiques sont des concentrations non toxiques pour les cellules exprimant la résistance, mais toxiques pour les cellules qui n'expriment pas le marqueur. Ces concentrations sont connues de l'homme du métier et peuvent être adaptées, le cas échéant, comme illustré dans les exemples.

Alternativement le marqueur positif de sélection peut-être un marqueur métabolique permettant l'assimilation d'une nouvelle source nutritive, ou encore un marqueur conférant une coloration ou une fluorescence ou tout autre caractère physique à la bactérie qui sera sélectionnée après détection par des moyens appropriés.

(iii) Marqueur Négatif Le marqueur négatif de contre-sélection (iii) comprend un gène codant une activité thymidine kinase. Un gène codant une activité thymidine kinase désigne toute molécule d'acide nucléique codant un polypeptide ayant une activité de type thymidine kinase fonctionnelle dans la bactérie considérée. Une activité de type thymidine kinase se caractérise principalement par la capacité de phosphoryler un analogue de nucléoside, tel l'azidothymidine (AZT), en la forme monophosphate correspondante, dans le cas de l'AZT en azidothymidine 5 phosphate (AZT-MP). La molécule d'acide nucléique peut être un ARN ou un ADN, typiquement un ADN recombinant (e.g., ADNc) comprenant une séquence nucléique codant le polypeptide thymidine kinase. Différentes thymidine kinases ont été décrites dans la littérature, comme par exemple les thymidines kinases bactériennes, virales (notamment du virus de l'herpes simplex) ou de mammifère (par exemple humaine, bovine, etc. ). Le gène utilisé dans l'invention peut provenir de virus, de bactéries, d'archaebactéries, et d'eukaryotes tels que des champignons, plantes et animaux. Ce gène peut être un gène synthétique. Il peut s'agir d'une thymidine kinase de type sauvage, ou éventuellement modifiée dans sa structure pour améliorer ses propriétés, par exemple sa stabilité, son expression dans la bactérie, sa spécificité de substrat, son activité enzymatique, etc.

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De préférence, on utilise dans le cadre de la présente invention une thymidine kinase d'origine bactérienne, notamment provenant ou dérivée de E. coli, d'Haemophilus influenzae, de Streptococus gordonii (McNab, 1996, FEMS Microbiol Lett. 135:103-10) de l'homme (Wang, 2000, Biochem Pharmacol. 59 :1583-8), du virus de l'herpes humain (Cazaux, 1998, Cancer Gene Ther. 5:83-91) De manière particulièrement préférée, le marqueur négatif de contre-sélection utilisé dans l'invention est un gène codant pour une protéine possédant une activité thymidine kinase (E. C. 2. 7.1.21) et capable de catalyser la phosphorylation de l'azidothymidine (AZT) en azidothymidine 5 phosphate (AZT-MP), choisi préférentiellement parmi les gènes homologues au gène tdk de E. coli (Bockamp et al., Gene 1991, 101:9-14 ; Black, Mol. Microbiol. 1991,5:373-379) ou au gène tdk de Haemophilus influenzae (Fleischmann, Science, 1995, 269:496-512).

Agencement Les gènes marqueurs (ii) et (iii) présents dans la construction génétique doivent pouvoir s'exprimer dans l'hôte bactérien dans lequel la recombinaison homologue est effectuée, pour permettre la synthèse d'un produit actif et fonctionnel. Pour améliorer l'expression de ces gènes, l'un ou les deux sont donc généralement placés, dans la construction génétique, sous contrôle d'un promoteur transcriptionnel fonctionnel dans l'hôte. Un promoteur, identique ou de préférence différent, peut être utilisé pour chacun des deux gènes marqueurs, ou un promoteur unique dirigeant l'expression des deux gènes marqueurs, sous forme d'une unité bicistronique. Le ou les promoteurs utilisés peuvent être constitutifs ou régulés, c'est-à-dire actifs (ou activés) ou inactifs (ou inactivés) en présence ou en l'absence d'une substance (e. g., inducteur, répresseur, etc. ) ou d'une condition particulière (e. g., température, etc.).

De nombreux promoteurs fonctionnels dans les hôtes bactériens sont connus de l'homme du métier, et peuvent être utilisés dans le cadre de l'invention, comme par exemple le promoteur de l'opéron lactose (Plac), de l'opéron tryptophane, des promoteurs hybrides

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(par exemple Ptac) et/ou synthétiques, des promoteurs de phages (par exemple T5, T7), des promoteurs de gènes bactériens (par exemple ValS), etc.

L'agencement des éléments (i) à (iii) dans la construction génétique peut être adapté par l'homme du métier, et dépend généralement du type d'altération choisi (échange allélique, remplacement de gène, délétion, etc.). En général, le marqueur de sélection positif et le marqueur de sélection négatif peuvent être positionnés indifféremment en 5' ou en 3' l'un par rapport à l'autre, dans la même orientation transcriptionnelle ou dans une orientation opposée. Dans le cas d'un échange allélique, l'ordre respectif des éléments (i) à (iii) n'est pas critique pour la méthode de l'invention. Ainsi, pour une construction circulaire, on peut utiliser un agencement 5'->3' (i)-(ii)-(iii) ; (iii)-(ii)-(i) ; etc. Dans le cas d'un remplacement (total ou partiel) de gène, la région d'homologie est généralement sub-divisée en deux portions encadrant le gène (ii), et le gène (iii) peut être situé en 5' ou en 3' de cet assemblage. Dans le cas d'une délétion (totale ou partielle) de gène, la région d'homologie est généralement sub-divisée en deux portions encadrant les gènes (ii) et (iii), qui peuvent être agencés dans un ordre indifférent.

En plus des éléments mentionnés ci-dessus, la construction génétique peut, le cas échéant, comporter d'autres éléments, tels que une origine de réplication, des gènes marqueurs supplémentaires, etc. Lorsqu'elle contient une origine de réplication, celle-ci est de préférence conditionnelle (par exemple le réplicon de RK6) ou non-fonctionnelle dans la bactérie que l'on souhaite modifier. En effet, l'absence de réplication fonctionnelle limite la sélection positive aux événements d'insertion chromosomique par recombinaison homologue.

Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la construction génétique est un ADN circulaire, double-brin, par exemple un plasmide. Ce type de construction est particulièrement adapté pour les bactéries du genre E. coli. Elle peut être construite à partir de tout plasmide disponible dans le commerce, tels que les plasmides pBR322, pUC, pTL, pSH, etc. La taille globale du plasmide peut être adaptée par l'homme du métier pour être de préférence compatible avec la transformation de bactéries. Tout plasmide comportant les éléments (i) à (iii) décrits précédemment est compatible.

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Dans un autre mode de réalisation particulier de l'invention, la construction génétique est un ADN linéaire, de préférence double-brin. Un tel ADN linéaire peut être préparé in vitro par des techniques connues en soi, telles que synthèse artificielle, clonage, ligation et/ou amplification, etc. Dans une variante particulière de mise en #uvre, l'ADN linéaire est fabriqué in vitro par amplification simultanée d'un, de plusieurs, ou de l'ensemble des éléments (i) à (iii) en utilisant un mélange d'amorces oligonucléotidiques spécifiques et des matrices appropriées. De préférence, les matrices sont donc utilisées en mélange, et les amorces possèdent des séquences de recouvrement appropriées, permettant l'assemblage direct de la construction génétique comprenant les produits d'amplification (i), (ii) et/ou (iii). Cet aspect constitue un autre objet particulier de l'invention.

Bactéries et cultures : Comme indiqué, les méthodes de l'invention sont applicables aux bactéries. Compte tenu du système de sélection utilisé, les bactéries mises en #uvre dans l'invention sont typiquement déficientes pour l'activité thymidine kinase, c'est-à-dire qu'elles ne sont pas sensibles à l'analogue de nucléoside utilisé. Typiquement, une telle bactérie n'exprime pas de protéine tdk endogène fonctionnelle ou ne l'exprime pas suffisamment pour conférer une sensibilité aux concentrations d'analogue de nucléoside utilisées. La bactérie peut être naturellement déficiente pour l'activité tdk, comme c'est le cas par exemple de bactéries du genre Acinetobacter, ou peut être rendue déficiente par inactivation du gène tdk endogène comme c'est le cas pour E. coli.

Les bactéries utilisables pour l'invention peuvent être choisies parmi toute bactérie d'intérêt, qui soit transformable par un acide nucléique exogène. On peut mentionner notamment les bactéries cultivables telles que E. coli, Pseudomonas, Acinetobacter, Pseudomonas, Bacillus, Helicobacter, Synechocystis, Methanobacterium, Methanococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Staphylococcus, Klebsiella, Xanthomonas, Agrobacterium, etc.. Ces bactéries peuvent être cultivées dans des conditions bien connues de l'homme du métier, comme par exemple dans des milieux définis ou des milieux riches tels les milieux LB (Luria Bertani) ou MH (Muller Hinton).

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Les cultures sont typiquement réalisées dans des boîtes, flasques, poches, tubes, etc., de préférence en condition stérile.

Dans un mode de mise en #uvre préféré, la bactérie est une souche de E. coli ou une souche Acinetobacter, de préférence Acinetobacter calcoaceticus (ADP 1).

La construction génétique peut être introduite dans la bactérie par toutes techniques connues de l'homme du métier, généralement rassemblées sous les désignations transfection ou transformation . Ainsi, la construction peut être introduite in vitro (c'est-à-dire en culture) par électroporation, transfert conjugatif, précipitation au phosphate de calcium, micro-injection, etc. L'introduction peut également être réalisée en utilisant des agents facilitant l'introduction d'acide nucléique dans les cellules procaryotes, tels que des lipides cationiques ou des liposomes, des peptides cationiques, des polymères, des phages, etc. Il n'est pas essentiel pour la méthode de l'invention que l'introduction des constructions soit réalisée avec une efficacité très élevée, dans la mesure où une sélection est ensuite appliquée.

Après l'étape d'introduction, la seconde étape de la méthode a pour objectif de sélectionner l'insertion chromosomique, c'est-à-dire les cellules ayant intégré la construction génétique (ou une partie de celle-ci) dans leur génome. Cette sélection est généralement réalisée sur la base de l'expression du marqueur de sélection positif, c'est- à-dire, selon le type de marqueur positif, la résistance de la cellule à un composé toxique (par exemple un antibiotique), la capacité d'utiliser une source nutritive particulière, l'expression d'un marquage, etc. Pour cela, les bactéries sont cultivées dans des conditions de sélection vis-à-vis du marqueur positif, c'est à dire en présence du composé toxique, de la source nutritive, etc. et les cellules exprimant le marqueur de sélection sont sélectionnées. Dans le cas d'un marqueur de sélection conférant la résistance à un composé toxique (notamment un antibiotique), les cellules sont cultivées en présence du composé et sélectionnées sur la base de leur capacité de survie et/ou de croissance dans ce milieu de sélection. Dans la mesure où la construction génétique n'est pas capable de réplication autonome efficace dans la bactérie hôte, les cellules ainsi sélectionnées résultent bien d'une insertion chromosomique.

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La troisième étape de la méthode a généralement pour objectif d'exciser du génome de la bactérie les régions de la construction génétique non-essentielles à la modification recherchée. En particulier, dans le cas d'un échange allélique ou d'une délétion, il est important de pouvoir éliminer du génome des cellules la séquence des gènes marqueurs.

Dans le cas d'un remplacement de gène, il est également souhaitable d'éliminer les séquences autres que le marqueur positif. Pour ce faire, l'invention repose sur l'utilisation du marqueur de sélection négatif particulier, la thymidine kinase.

L'invention montre en effet que ce marqueur est fonctionnel dans les bactéries et particulièrement efficace pour la sélection de cet événement d'excision. Puisque le marqueur négatif de contre-sélection utilisé rend les cellules qui le contiennent et qui l'expriment sensibles à des analogues de nucléosides, notamment l'AZT, tandis que ces mêmes cellules, qui ne contiennent pas ce gène, sont résistantes à l'AZT, la culture des cellules en présence de l'analogue permet de sélectionner les cellules ayant perdu le marqueur négatif de contre-sélection.

Préférentiellement, l'analogue de nucléoside est l'AZT. Néanmoins, d'autres analogues peuvent être envisagés, tels que le gancyclovir (GCV), l'acyclovir, les dideoxynucléosides tels que la didéoxythymidine (ddT), la didéoxyinosine (ddl), la stavudine (d4T) etc. La toxicité de l'AZT et de ces autres analogues s'exerce principalement après leur transformation en dérivés triphosphates par le blocage de la réplication de l'ADN. Il est établi que l'AZT-triphosphate est substrat des ADN polymérases. Il est produit chez E. coli à partir de l'AZT par trois étapes de phosphorylation successives : par la thymidine kinase (tdk), la thymidilate kinase (tmk) et la nucléoside diphosphate kinase (ndp). L'utilisation de l'AZT comme composé de contre-sélection conditionnelle dans d'autres organismes que E. coli exige que ces trois étapes de phosphorylation aient effectivement lieu. Il est toujours possible pour des organismes dépourvus de l'activité tmk sur l'AZT-phosphate et/ou ndk sur l'AZTdiphosphate, d'intégrer sur le chromosome ou d'apporter en trans un élément comportant le gène tmk et/ou le gène ndk de E. coli par exemple, afin de remplir les conditions permettant la contre-sélection du gène tdk dans les étapes de recombinaisons homologues.

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Dans l'étape c) des méthodes de l'invention, les cellules sont donc cultivées en présence de l'analogue de nucléoside, à une concentration et pendant une période de temps suffisantes pour éliminer les cellules contenant et exprimant la thymidine kinase fonctionnelle. Cette culture peut être effectuée sous pression de sélection pour le marqueur positif de sélection (c'est-à-dire par exemple en présence du composé antibiotique lorsque le marqueur positif de sélection est un marqueur de résistance à un antibiotique) ou, en variante, sans pression de sélection pour le marqueur positif de sélection (c'est-à-dire par exemple en absence du composé antibiotique lorsque le marqueur positif de sélection est un marqueur de résistance à un antibiotique).

La capacité des cellules à pousser ou survivre en présence de l'analogue de nucléoside peut être vérifiée par toute technique connue de l'homme du métier, notamment comptage des cellules, observation morphologique, coloration au bleu trypan, etc.

Alternativement, l'échange d'un allèle sauvage par un allèle modifié ou la délétion de tout ou partie d'une région chromosomique (notamment d'un gène) peut requérir une première étape d'intégration dans le chromosome d'une première construction linéaire portant une cassette contenant les marqueurs positif de sélection et négatif de contresélection encadrés par deux régions d'homologie à des segments extrêmes (c'est-à-dire situés dans les régions 5' et 3') de l'allèle sauvage ou de la région à déléter, qui entraîne la présence sur le chromosome de l'allèle interrompu par la cassette. Ce premier événement est sélectionné par la résistance à un antibiotique apportée par la cassette intégrée. L'échange allèlique est réalisé après une seconde étape d'intégration dans le chromosome d'une seconde construction linéaire portant l'allèle modifié ou délété. Ce second événement est sélectionné par la résistance au pro-toxique (l'analogue de nucléoside) activé par le marqueur négatifde contre-sélection.

Dans un mode de réalisation particulier, la méthode de l'invention permet la réalisation d'un échange d'allèle ou une délétion d'une partie au moins d'un gène, et comprend : a) l'introduction, dans une bactérie déficiente pour l'activité thymidine kinase, d'un ADN linéaire comprenant un marqueur positif de sélection (ii) et un

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marqueur négatif de contre-sélection (iii) comprenant un gène codant un polypeptide ayant une activité thymidine kinase, l'ensemble constitué de (ii) et (iii) étant encadré par deux régions d'homologie à des segments extrêmes du gène à modifier ou à déléter, lesdites régions d'homologie possédant une longueur suffisante pour permettre la recombinaison homologue ; b) la culture des bactéries dans des conditions de sélection vis-à-vis du marqueur positif et la sélection des bactéries exprimant le marqueur positif, lesdites bactéries comprenant le marqueur positif inséré dans leur chromosome, et c) la culture de bactéries obtenues à l'étape b) en présence d'un analogue de nucléoside métabolisé par la thymidine kinase et d'un second ADN linéaire comportant l'allèle modifié ou délété du gène, et la sélection des bactéries capables de survie ou de croissance en présence de cet analogue, lesdites bactéries possédant un génome altéré.

Dans ce mode de mise en #uvre, la modification est réalisée en deux temps, tout d'abord par l'insertion, par double recombinaison homologue, d'une première construction, qui est ensuite échangée avec une seconde construction portant la modification souhaitée.

A l'issue de cette étape de sélection c), les cellules obtenues possèdent une modification de leur génome, ciblée au niveau de la région d'intérêt. La modification peut être contrôlée par toute technique connue, notamment PCR, hybridation in situ, etc. Les bactéries obtenues peuvent être utilisées pour l'analyse phénotypique, l'expression de protéines ou autres produits d'intérêt, la fabrication de métabolites, etc.

La méthode selon la présente demande est particulièrement avantageuse dans la mesure où elle est efficace, ne génère pas de faux positifs, et est applicable à une large panoplie de bactéries et de gènes cibles. Les exemples qui suivent servent à illustrer la méthode de l'invention, sans en limiter la portée. Le contenu de toutes les publications, brevets et demandes de brevets cités dans la présente description et dans les exemples est incorporé à la présente par référence.

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Exemple 1. Echange allélique au locus ileS d'E. coli codant pour l'isoleucyl-tRNA synthétase.

La technique basée sur l'utilisation de la thymidine kinase comme marqueur génétique pour la sélection d'échanges alléliques a été appliquée au gène ileS de l'isoleucyl-tRNA synthétase IleRS. Cette enzyme catalyse la formation de la liaison covalente entre la Lisoleucine et son ARN de transfert spécifique, le tRNAile. Le site actif de l'IleRS est capable d'activer des acides aminés isostériques avec la L-isoleucine, comme la Lvaline, et de les charger sur le tRNAile. Afin d' éviter l'accumulation de protéines défectueuses dans la cellule, les tRNAile portant un acide aminé autre que l'isoleucine sont reconnus par un second site actif de l'enzyme (site de correction ou d'editing) qui hydrolyse la liaison aminoacyl erronée.

Afin d'étudier les effets sur la viabilité des cellules bactériennes d'un taux d'erreur élevé lors de la biosynthèse des protéines, un allèle du gène ileS d'E. coli codant pour une synthétase défective dans sa capacité d'editing a été construit en remplaçant les acides aminés 241 à 250 par une série d'alanines (allèle ileSalall, plasmide pTLH33). Cet allèle muté a été intégré dans une construction plasmidique devant permettre son échange avec l'allèle chromosomique ileS. La construction de ce plasmide, pSH102, comprenait les étapes suivantes : Le gène tdk et la séquence promotrice du gène valS ont été amplifiés à partir de l'ADN chromosomique d'Haemophilus influenzae ; les paires d'oligonucléotides respectivement utilisées comme amorces dans les réactions d'amplification de ces séquences sont d'une part : tdkl.3 (5' CCCGTCGACTTAAATTTGACCGCACTTTTCTTTA : SEQ ID NO : 1) et tdkl.5 (5' ATGGCGAAACTCTACTTCTATTAC : SEQ ID NO : 2) pour le gène tdk, et d'autre part, ValS1.5 (5' CCCCTCGAGGATAAAGGTTATCATGTTG : SEQ ID NO : 3) et ValSl.3 (5' TAGAGTTTCGCCATTTATTTTTTCTCTTTATTATAA : SEQ ID NO : 4) pour la séquence promotrice du gène valS.

Les fragments d'ADN obtenus à l'étape précédente ont été rassemblés par PCR avec les oligonucléotides tdkl.3 et ValS1.5 (décrits ci-dessus) formant ainsi la cassette PvalSHItdkHI Cette cassette a été clonée dans le site Xhol du vecteur pEVL497 après

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digestion avec Xhol et Sali (plasmide pSH93). Le vecteur pEVL497 porte le gène cat qui confère la résistance au chloramphénicol et le réplicon conditionnel du plasmide R6K qui nécessite l'expression de la protéine Pi pour se maintenir et se propager dans les cellules (souche BW19610). Le gène ileSalall a été inséré dans le plasmide pSH93 entre les sites EcoRI et XmaI, donnant ainsi le plasmide pSH102. Le plasmide pSH102 a été introduit par transformation dans la souche d'E. coli +755 dont le gène tdk codant pour l'activité thymidine kinase est délété (marqueur #tdk ::kanr) ; des transformants ont été sélectionnés sur milieu Müller Hinton (MH) en présence de chloramphénicol (20 g/ml). La souche +755 n'exprimant pas la protéine Pi, les colonies résistantes au chloramphénicol (Cmr) portent le plasmide pSH102 intégré dans leur chromosome par recombinaison homologue au locus ileS. Ces clones Cmr ont été cultivés en milieu MH sans antibiotique pour permettre le second événement de recombinaison homologue. Les clones doubles recombinants ont été sélectionnés sur boites MH en présence d'AZT (30 M). Les clones résistants à l'AZT (AZTr) ont été testés pour leur sensibilité au chloramphénicol. Afin de distinguer parmi les clones AZTr Cms ceux qui portent l'allèle muté ileSalal 1 et ceux qui ont conservé l'allèle sauvage ileS, la sensibilité à la norvaline des doubles recombinants a été testée. La sensibilité à la norvaline indique la présence d'un allèle ileS dont l'editing est déficient. L'ADN chromosomique des clones sensibles à la norvaline a été extrait pour effectuer des amplifications d'ADN par PCR avec les deux paires d'oligonucléotides suivantes : la paire Ile3 (5' CGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGC : SEQ ID NO : 5) et Ile4 (5' GATTGCGCGTGATGAATTAACC : SEQ ID NO : 6), et la paire Ile2 (5' GTTGGCAGGCAGAGTCCACGGC : ID NO : 7) et Ile4 (5' GATTGCGCGTGATGAATTAACC : SEQ ID NO : 6).

Les résultats de ces amplifications par PCR, à savoir la détection d'un fragment amplifié avec la paire Ile3 et Ile4 d'une part, et l'absence d'un fragment amplifié avec la paire Ile2 et Ile4 d'autre part, ont permis de vérifier que, dans les quatre souches qui avaient été obtenues, le gène ileSalall était inséré à la place du gène ileSwt sur le chromosome.

Exemple 2. Délétion du gène icd d'E. coli codant pour l'isocitrate déhydrogénase.

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L'isocitrate déhydrogénase catalyse la décarboxylation oxidative de l'isocitrate en alphakétoglutarate, une réaction du cycle tricarboxylique. L'alpha-kétoglutarate est le précurseur de l'acide glutamique ; l'absence d'une activité isocitrate déhydrogénase entraîne de ce fait une auxotrophie pour l'acide glutamique.

Une délétion partielle du gène icd contenant le gène marqueur de résistance à la spectinomycine a été obtenue à l'aide de la construction plasmidique pEVL194. Ce plasmide, dérivé du plasmide pEVL497 (voir exemple 1), contenait le gène tdk d'E. coli précédé par le promoteur du phage T5 (pT5-tdk), cloné dans le site Kpnl, et la cassette de résistance aad à la spectinomycine clonée entre les sites BamHI et SphI. La cassette de résistance a été encadrée de séquences homologues au chromosome d'E. coli : en 5' par la région amont du codon d'initiation ATG du gène icd (350 paires de bases), cloné entre les sites EcoRI et BamHI, en 3' par la séquence correspondant aux nucléotides 603 à 1083 du gène icd clonée entre les sites SphI et NotI. Tous les éléments insérés dans le plasmide pEVL497 pour construire le plasmide pEVL194 ont été amplifiés par PCR à partir de matrices d'ADN et de paires d'oligonucléotides appropriées en rajoutant les sites de clonage utilisés.

Le plasmide pEVL194 a été introduit par transformation dans la souche d'E. coli +755 qui n'exprime pas d'activité thymidine kinase (marqueur #tdk ::kanr) et des transformants recombinants sélectionnés sur milieu Müller Hinton (MH) en présence de spectinomycine (20ug/ml). Les bactéries d'un clone résistant à la spectinomycine ont été cultivées en milieu MH additionné de spectinomycine (20ug/ml)et d'acide glutamique (1 mM) à 37 C avec agitation jusqu'à une OD600 de 0,2. Les bactéries contenues dans 10 ml de cette culture ont été concentrées et étalées sur boite MH additionnée de spectinomycine (20g/ml), d'acide glutamique (1 mM) et d'AZT (30 M). Les clones specr AZTr, obtenus après incubation à 37 C pendant 18h, ont été testés pour leur sensibilité au chloramphénicol et pour leur phénotype d'auxotrophie à l'acide glutamique. La conformité de la délétion du gène icd des bactéries Cms glu- specr a été vérifiée par PCR sur l'ADN chromosomique en utilisant des oligonucléotides appropriés.

Exemple 3. Délétion d'un gène chez Acinetobacter ADP1

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Acinetobacter ADP1est une bactérie Gram négatif, aérobie strict, ne sporulant pas, non pathogène, présente dans les sols et les eaux. Elle possède l'arsenal génétique pour de multiples voies métaboliques lui permettant d'utiliser des sources de carbone très diversifiées. Au laboratoire, Acinetobacter ADP1croît en milieu défini minéral avec une unique source de carbone et sans facteur de croissance additionnel. Cultivé dans les mêmes conditions de milieu (milieu minéral+glucose) et de température (33-35 C), Acinetobacter ADP1a un temps de génération plus court que Escherichia coli.

A ces avantages de culture, s'ajoutent les propriétés remarquables de compétence pour la transformation naturelle (transport actif dans les cellules de molécules d'ADN linéaires ou circulaires) et de fréquence élevée des événements de recombinaison.

Par ailleurs, Acinetobacter ADP1 ne possède aucun des enzymes des voies de récupération des nucléosides décrits chez E. coli et n'exprime pas d'activité thymidine kinase. L'utilisation du gène tdk comme gène marqueur dans les manipulations génétiques du chromosome d'Acinetobacter est donc aisée, sans la nécessité de construction préalable.

Nous avons utilisé le gène tdk comme marqueur de sélection d'événements de recombinaison homologue dans Acinetobacter ADP1pour obtenir la délétion du gène cysN, qui code pour l'activité sulfurylase essentielle pour l'assimilation du soufre à partir du sulfate. Dans une première étape, le gène cysN a été remplacé sur le chromosome par une cassette, contenant les deux gènes en tandem tdk (thymidine kinase) et kan (gène de résistance à la kanamycine), introduite par recombinaison homologue. Les bactéries recombinantes, sélectionnées par leur résistance à la kanamycine, expriment le gène tdk et sont donc sensibles à l'AZT. Dans une deuxième étape, la cassette tdk-kan a été éliminée du chromosome par un événement de recombinaison homologue sélectionné par la restauration de la résistance à l'AZT.

La cassette tdk-kan a été clonée dans un dérivé du vecteur pUCl8 de la façon suivante : la séquence du gène tdk d' E. coli précédé du promoteur du bactériophage T5 a été clonée dans les site EcoRI et SacI et le gène de résistance à la kanamycine a été cloné dans les sites PstI et Xbal (plasmide pEVL385).

La construction permettant la délétion de la séquence codante du gène cysN sur le chromosome a été obtenue de la façon suivante : la cassette tdk-kan a été amplifiée par

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PCR à partir du plasmide pEVL385 à l'aide des oligonucléotides 1130/1131. La séquence correspondant aux 300 premiers nucléotides et celle correspondant aux 300 derniers nucléotides du gène cysN ont été amplifiées par PCR respectivement à l'aide des deux paires d'oligonucléotides (1150/1151) et (1152/1153) sur l'ADN chromosomique d'Acinetobacter ADP 1. Les primers 1151 et 1152 possèdent à l'une de leurs extrémités 20 bases homologues aux extrémités de la cassette tdk-kan, ce qui a permis de rassembler les trois fragments par PCR recombinante.

15 l du produit PCR purifié (Qiaquick, Qiagen) ont été introduits par transformation dans des bactéries Acinetobacter ADP1cultivées à 30 C en milieu minéral sans sulfate + succinate et supplémenté avec du thiosulfate 1mM jusqu'à une OD600 de 0,5 - 0,6.

Après 3 h de croissance à 30 C avec agitation, les bactéries transformantes sont sélectionnées sur milieu minéral + succinate + thiosulfate 1 mM en présence de kanamycine (25ug/ml). Les clones ont été testés pour leur sensibilité à l'AZT (800 M).

L'utilisation du sulfate et du sulfite par ces clones résistants à la kanamycine et sensibles à l'AZT a été ensuite testée. La localisation de la cassette au locus cysN a été confirmée par PCR sur l'ADN chromosomique d'un clone (souche +2912) exprimant le phénotype sulfate-/sulfite+.

Dans un second temps, la cassette tdk-kan a été éliminée de la souche +2912 par un événement de recombinaison entre le chromosome et un fragment d'ADN obtenu par amplification PCR recombinante (amorces 1150/1403, 1402/1153 puis 1150/1153) ayant en tandem les 300 premiers et 300 derniers nucléotides de cysN. 15 l du produit PCR purifié (Qiaquick, Qiagen) ont été introduits pas transformation dans des bactéries de la souche +2912. Les bactéries recombinantes ont été sélectionnées sur milieu minéral + succinate + thiosulfate en présence d'AZT (800 M). La délétion cysN et l'élimination de la cassette tdk-kan ont été confirmées par PCR sur les clones résistants à l'AZT.

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TABLEAU DES AMORCES

<tb>
<tb> #SEQ <SEP> ID <SEP> Séquence
<tb> NO
<tb> 1130 <SEP> 8 <SEP> 5'CCCAGCCTCCAATTCAAATCATAAAAAAT
<tb> 1131 <SEP> 9 <SEP> 5'CCAGCTCCGCATGCTTAGAAAAACTCATCG <SEP>
<tb> 1150 <SEP> 10 <SEP> 5'ATGTCTCACCAGTCAGATCTTATTAG
<tb> 1151 <SEP> 11 <SEP> 5'TTTTTATGATTTGAATTGGAGGCTGGGGTAACGATACGCCACATCAATGG
<tb> 1152 <SEP> 12 <SEP> 5'CGATGAGTTTTTCTAAGCATGCGGAGCTGGGACTGCTCACAGCAATCCTGG <SEP>
<tb> 1153 <SEP> 13 <SEP> 5'TTATAGGCGAACCAATTCAACCACTTG
<tb> 1403 <SEP> 14 <SEP> 5'CCCATCCACTACACAAATCCCCGCCACATCAATGGTAATACCC
<tb> 1402 <SEP> 15 <SEP> 5'GGGATTTGTGTAGTGGATGGGGACTGCTCACAGCAATCCTG
<tb>

Claims (25)

1. REVENDICATIONS 1. Méthode pour altérer de manière ciblée le génome d'une bactérie par double recombinaison homologue, comprenant : a) l'introduction, dans une bactérie déficiente pour l'activité thymidine kinase, d'une construction génétique comprenant (i) au moins une région ayant une séquence homologue à un segment sélectionné du génome de la bactérie, dont l'altération est souhaitée, ladite région possédant une longueur suffisante pour permettre la recombinaison homologue, (ii) un marqueur positif de sélection et (iii) un marqueur négatif de contre-sélection comprenant un gène codant un polypeptide ayant une activité thymidine kinase, b) la culture des bactéries dans des conditions de sélection vis-à-vis du marqueur positif et la sélection des bactéries exprimant le marqueur positif inséré dans leur chromosome, et c) la culture de bactéries obtenues à l'étape b) en présence d'un analogue de nucléoside métabolisé par la thymidine kinase, et la sélection des bactéries capables de survie ou de croissance en présence de cet analogue, lesdites bactéries possédant un génome altéré.
2. 2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que le marqueur positif de sélection confère la résistance à un composé antibiotique et en ce que l'étape b) comprend la culture des bactéries en présence du composé antibiotique et la sélection de bactéries capables de survie et/ou de croissance.
3. 3. Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que le marqueur négatif de contre-sélection comprend un gène tdk .
4. 4. Méthode selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que le marqueur positif de sélection et/ou le marqueur négatif de contre-sélection est placé, dans la construction génétique, sous contrôle d'un promoteur transcriptionnel constitutif ou régulé.

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5. 5. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que le marqueur positif de sélection et le marqueur négatif de contre-sélection sont un gène unique codant un polypeptide ayant une activité thymidine kinase, de préférence un gène tdk.
6. 6. Méthode selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisée en ce que l'analogue de nucléoside est l'AZT.
7. 7. Méthode selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que la bactérie est une souche de E. coli.
8. 8. Méthode selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que la bactérie est une souche Acinetobacter, de préférence Acinetobacter calcoaceticus (ADP 1).
9. 9. Méthode selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que la construction génétique est un ADN circulaire, de préférence un plasmide.
10. 10. Méthode selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que la construction génétique est un ADN linéaire.
11. 11. Méthode selon l'une quelconque des revendications 2 à 10, caractérisée en ce que, dans l'étape c), le composé antibiotique est présent dans le milieu de culture.
12. 12. Méthode selon l'une des revendications 2 à 10, caractérisée en ce que, dans l'étape c), le composé antibiotique est absent du milieu de culture.
13. 13. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, pour altérer spécifiquement le génome d'une bactérie par échange allélique.
14. 14. Méthode selon la revendication 13, caractérisée en ce que l'élément (i) de la construction génétique comprend la séquence d'une copie altérée d'une partie au moins d'un gène dont l'altération est souhaitée.

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15. 15. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, pour altérer spécifiquement le génome d'une bactérie par remplacement de gène.
16. 16. Méthode selon la revendication 15, caractérisée en ce que, dans la construction génétique, le marqueur positif de sélection (ii) est encadré par deux régions d'homologies (i) ayant chacune une séquence homologue à un segment distinct du gène de la bactérie dont l'altération est souhaitée, lesdites régions possédant chacune une longueur suffisante pour permettre la recombinaison homologue.
17. 17. Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, pour altérer spécifiquement le génome d'une bactérie par délétion de tout ou une partie fonctionnelle de gène.
18. 18. Méthode selon la revendication 17, caractérisée en ce que, dans la construction génétique, l'ensemble comprenant le marqueur positif de sélection (ii) et le marqueur négatif de contre-sélection (iii) est encadré par deux régions d'homologies (i) ayant chacune une séquence homologue à un segment distinct du gène de la bactérie dont l'altération est souhaitée, lesdites régions possédant chacune une longueur suffisante pour permettre la recombinaison homologue.
19. 19. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, pour inactiver spécifiquement un gène dans le génome de la bactérie, par exemple un gène impliqué dans une voie de biosynthèse.
20. 20. Méthode pour inactiver spécifiquement un gène dans le génome d'une bactérie du genre Acinetobacter par double recombinaison homologue, comprenant : a) l'introduction in vitro dans une bactérie du genre Acinetobacter d'une construction génétique comprenant (i) la séquence d'une copie mutée ou altérée du gène dont l'inactivation est souhaitée, (ii) un marqueur positif de sélection conférant la résistance à un composé antibiotique et (iii) un gène tdk,

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    b) la culture des bactéries en présence de l'antibiotique et la sélection des bactéries capables de croissance ou de survie, et c) la culture de bactéries obtenues à l'étape b) en l'absence de l'antibiotique et en présence d'un analogue de nucléoside métabolisé par la tdk, et la sélection des bactéries capables de croissance ou de survie, lesdites bactéries possédant un génome modifié par inactivation dudit gène.
21. 21. Méthode selon l'une des revendications 1 à 20, pour créer de nouvelles voies métaboliques dans les bactéries.
22. 22. Méthode selon l'une des revendications 1 à 20, pour analyser la fonction de gènes ou protéines.
23. 23. Méthode selon l'une des revendications 1 à 20, pour cribler des banques d'acides nucléiques.
24. 24. Composition comprenant : - une construction génétique comprenant (i) une région ayant une séquence homologue à un segment sélectionné du génome d'une bactérie dont l'altération est souhaitée, ladite région possédant une longueur suffisante pour permettre la recombinaison homologue, (ii) un marqueur positif de sélection conférant la résistance à un composé antibiotique et (iii) un marqueur négatif de contre-sélection comprenant un gène tdk ; -un analogue de nucléoside.
25. 25. Construction génétique recombinante, constitué par (i) une région ayant une séquence homologue à un segment sélectionné du génome d'une bactérie dont l'altération est souhaitée, ladite région possédant une longueur suffisante pour permettre la recombinaison homologue, (ii) un marqueur positif de sélection conférant la résistance à un composé antibiotique et (iii) un marqueur négatif de contre-sélection comprenant un gène tdk.