FR2859482A1 - Vecteurs d'expression d'arn interferents, leurs procedes de preparation et leurs utilisations - Google Patents

Abstract

La présente invention se rapporte à un vecteur d'expression d'ARN interférent caractérisé en ce qu'il comprend un ou plusieurs éléments isolants protégeant les molécules d'ADN codant pour l'ARN interférent contre les séquences régulatrices des cellules.

Description

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VECTEURS D'EXPRESSION D'ARN INTERFÉRENTS, LEURS PROCÉDÉS DE PRÉPARATION ET LEURS UTILISATIONS.

La présente invention concerne des produits et procédés de modulation de l'expression d 'ARN interférents tant dans des cellules en culture que dans un organisme comme l'animal, l'homme ou les plantes.

L'invention s'intéresse tout particulièrement à l'interférence à l'ARN (ARN interférents ou RNAi ou encore siRNA) et ses applications thérapeutiques ou pour le criblage de substances actives comme des candidats médicaments.

L'interférence à l'ARN est une technique d'inactivation génique post-transcriptionnelle dans laquelle un petit ARN double brin, désigné ci-après ARN interférent ou RNAi ou siRNA ou shRNA, complémentaire de l'ARN messager ciblé, va induire la dégradation de ce dernier après s'y être hybridé. La puissance de cette technique et sa spécificité sont telles que l'on peut inactiver chez un individu l'allèle d'un gène dont la mutation est associée au développement d'une pathologie. Toutefois, les développements de la technologie de l'interférence à l'ARN nécessitent de disposer de moyens efficaces d'une part pour contrôler l'expression des molécules d'ARN interférents, et d'autre part pour le transport et la délivrance de ces ARN interférents dans les tissus ou cellules ciblés.

La présente invention vise précisément à résoudre les problèmes ci-dessus en offrant de nouveaux vecteurs d'expression des ARN interférents.

On entend au sens de l'invention par ARN interférents des molécules d'ARN double brin (siRNA) d'environ 21 nucléotides, obtenues par hybridation de

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deux molécules d'ARN simple brin généralement générées par synthèse chimique. Ainsi ces molécules d'ARN double brin comprennent un premier brin complémentaire d'une séquence nucléotidique du gène cible et un second brin complémentaire du premier et sont capables d'inhiber l'expression dudit gène cible. Il s'agit aussi d'ARN qui sont produits directement dans la cellule via la transcription d'une séquence d'ADN spécifique du gène ciblé et clonée en aval d'un promoteur. Ces ARN interférents portent dans ce cas le nom de shRNA (small hairpin RNA) car ils adoptent une structure en épingle à cheveux compte tenu du repliement spécifique de l'ARN transcrit.

Il a également été proposé (Shinagawa et Ishii ; Genes and Development, 2003, Vol : 17, Pages 1340-1345) d'exprimer un long ARN double brin présentant des propriétés interférentes suite à la restriction de sa localisation initiale dans le noyau de la cellule, et ce, grâce au plasmide utilisé. Ce grand ARN double brin peut être clivé en siRNA dans le noyau. Ces siRNA migrent alors dans le cytoplasme où ils induisent la dégradation de l'ARN ciblé.

Ces ARN interférents peuvent être dirigés contre n'importe quel gène, comme par exemple de façon non limitative des gènes contrôlant la prolifération cellulaire (tel que p53), ou codant pour des facteurs de transcription, des protéines kinases (telle que LKB1), des récepteurs, etc.

Selon un premier aspect, les vecteurs de l'invention comprennent un ou plusieurs éléments isolants, aussi désignés ci-après insulateur ,

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permettant de protéger les molécules d'ADN codant pour les ARN interférents contre les séquences régulatrices des cellules et de l'environnement chromatinien, une fois intégrées dans le génome cellulaire.

En effet, la structure chromatinienne est un élément majeur de contrôle de la transcription des gènes. Les chromosomes seraient formés d'une succession de domaines autonomes et indépendants, présentant tous les éléments nécessaires à l'expression correcte des gènes qu'ils contiennent. Ce modèle est conforté par l'identification de séquences capables d'assurer l'expression correcte d'un transgène qui leur est associé et ce, indépendamment de leur site d'intégration dans le génome.

La LCR (Locus Control Région) du locus de 6-globine est une telle séquence régulatrice. Chez l' homme, la souris et le poulet, la LCR, située en 5' du locus de 6-globine, active de façon bidirectionnelle la transcription sur une distance d'environ 50 Kb. Chez le poulet, immédiatement en aval de ce locus, se trouve le gène du récepteur au folate (Prioleau et al., 1999). Ce gène est transcrit dans les mêmes cellules que celles qui expriment les gènes de globines à savoir la lignée érythrocytaire. Toutefois, la transcription du gène du récepteur au folate précède celle des gènes de globines et cesse lorsque ces derniers sont activés, à un stade de différenciation précis. Il y a donc autonomie de régulation de deux domaines juxtaposés transcrits dans les cellules d'un même processus de différenciation mais à des stades distincts malgré les propriétés et la position de la LCR du locus de 6-globine.

Chez le poulet, la limite 5' du locus de ssglobine, locus qui s'étend sur 33 kb, est marquée par

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la présence d'un site hypersensible à la DNase I constitutif appelé HS4. Un site hypersensible à la DNase I marque des régions de chromatine dites ouvertes , caractéristiques de séquences régulatrices.

Il a été montré (Chung et al., 1993) par des expériences dans les cellules érythroïdes humaines K562 que le site hypersensible à la DNase I HS4 possède les propriétés d'un insulateur, c'est-à-dire qu'il bloque l'action d'un amplificateur (enhancer) quand il se trouve placé entre cet enhancer et un promoteur. Il a également été observé par l'analyse de drosophiles transgéniques que l'insulateur HS4 prévient l'effet de position lié au site d'intégration dans la chromatine du transgène. Ainsi, l'expression du minigène white dans l'#il de drosophile est uniforme lorsqu'il est encadré par l'insulateur alors que son expression est hétérogène en l'absence de cette séquence.

Il a ainsi été proposé dans la demande de brevet US No. 5,610,053 d'utiliser le fragment de 1,2 kb contenant le site hypersensible à la Dnase I HS4 pour isoler un gène des séquences de régulation à fonctionnement cis de la chromatine dans laquelle ce gène a été inséré. Ce fragment est généré par double digestion avec les enzymes de restriction SacI et SspI d'ADN génomique de poulet. Ce fragment est représenté dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEQ ID NO.1 (# U78775 dans la base PubMed/NCBI).

Plus récemment, il a été montré (Pikaart et al., 1998) que dans des cellules en culture exprimant de façon stable un transgène, la présence de l'insulateur HS4 de part et d'autre de ce transgène entraîne une homogénéité de son niveau d'expression dans les différents clones cellulaires testés. Au

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contraire, en son absence, l'expression est variable d'un clone cellulaire à un autre. La présence de l'insulateur permet donc d'échapper à l'effet de position consécutive à l'insertion dans la chromatine comme cela a précédemment été décrit dans la drosophile. En outre, il a été rapporté de l'étude sur des cellules en culture, qu'en présence de l'insulateur, l'extinction de l'expression du transgène au cours du temps ne se produit pas, alors que c'est un phénomène fréquemment observé dans les expériences de transfert de gènes, tant dans les cellules que chez l'animal (Pikaart et al., 1998).

L'invention a donc plus particulièrement pour objet un vecteur comprenant au moins une cassette d' expression d'ARN interférent et au moins un élément capable d'isoler ladite cassette des séquences de régulations à fonctionnement cis de la chromatine d'une cellule transfectée par ledit vecteur.

La mise en #uvre d'éléments insulateurs et tout particulièrement de l'insulateur HS4 permet de contrôler l'expression homogène et persistante dans le temps de molécules d'ARN interférents.

L'élément capable d'isoler ladite cassette est avantageusement le fragment de 1,2 kb contenant l'insulateur HS4 ou une partie de celui-ci et notamment la séquence core de 242 ou de 250 pb et leurs variants comprenant le site de fixation du facteur protéique CTCF (Bell et al. 1999) . Cette séquence de 250 pb, issue de la séquence #U78775, est représentée dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEQ ID NO.2. Deux variants sont représentés dans la liste de séquence en annexe sous les numéros SEQ ID NO. 3 et SEQ ID NO.4.

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On entend par variants des séquences cidessus, des séquences présentant une forte homologie avec les séquences ci-dessus ou des fragments de celles-ci comme par exemple décrits dans la demande de brevet internationale publiée sous le No. WO 200102553.

On peut citer plus particulièrement comme variants de la séquence core les séquences SEQ ID NO.3 (US No.

5,610,053) et SEQ ID NO.4 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997,Vol 94, p575-580).

L'insulateur HS4 permet : (i) une autonomie de régulation (enhancer blocking), et (ii) d'empêcher l'effet de position et les phénomènes d'extinction génique observés au cours du temps, de la molécule codant l'ARN à laquelle il est associé une fois celle-ci intégrée dans la chromatine native. Ces deux propriétés sont indépendantes et ne sont pas partagées par tous les insulateurs. Par exemple, les insulateurs aujourd'hui connus chez la souris (DMD, BEAD-1) et l'homme (5'HS5, DM1) ne possèdent que la propriété d'enhancer blocking, et présentent donc moins d'intérêt que l'insulateur HS4.

Les insulateurs décrits chez les invertébrés (drosophile, levure), n'ont souvent également qu'une seule de ces deux propriétés (enhancer blocking le plus généralement) et présentent donc également moins d'intérêt que l'insulateur HS4.

Selon un mode de réalisation préféré, le vecteur comprend de part et d'autre de la cassette d'expression au moins un élément capable d'isoler ladite cassette des séquences de régulations à

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fonctionnement cis de la chromatine d'une cellule transfectée par ledit vecteur. Tout particulièrement, le vecteur comprend de part et d'autre de la cassette d'expression deux copies en tandem dudit élément.

La cassette d'expression peut contenir une ou plusieurs unités de transcription. Une telle unité de transcription comprend au moins une molécule d'ADN codant l'ARN interférent placé sous le contrôle d'un promoteur. Le promoteur est de préférence choisi dans le groupe comprenant les promoteurs constitutifs ou inductibles, dépendants de l'ARN polymérase III ou de l'ARN polymérase II. On peut citer par exemple les promoteurs Hl et U6 dépendants de l'ARN polymérase III ainsi que les promoteurs dépendant de l'ARN polymérase II, comme par exemple le promoteur du cytomégalovirus (promoteur CMV) (Xia H., et al., 2002).

Ces différents promoteurs peuvent être régulés ou non par la tétracycline ou d'autres régulateurs. Les séquences du promoteur CMV et du promoteur TRE-CMV (régulé par la tétracycline) sont représentées dans la liste de séquence en annexe respectivement sous les numéro SEQ ID NO.5 et SEQ ID NO.6.

Le vecteur selon l'invention comprend également une cassette de sélection avantageusement placée, comme la cassette d'expression, entre les éléments capables d'isoler la cassette d'expression des séquences de régulations à fonctionnement cis de la chromatine d'une cellule transfectée par ledit vecteur.

Ces cassettes de sélection confèrent aux cellules en culture une résistance à un antibiotique.

Avantageusement, une cassette de sélection est introduite par plasmide. A titre d'exemple de gène de sélection on peut citer :

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- le gène de résistance à la néomycine sous le contrôle du promoteur du virus SV40 et du site de polyadénylation (pA) du gène Thymidine kinase ; - le gène de résistance à l'hygromycine sous le contrôle du promoteur du virus SV40 et du pA du virus SV40 ; - le gène de résistance à la blasticidine sous le contrôle du promoteur du virus CMV et du pA du virus SV40.

La casette de sélection peut comprendre outre le gène de résistance à un antibiotique, un ou plusieurs autres gènes comme par exemple celui de la GFP (Green Fluorescent Protein).

Ainsi l'invention concerne également une construction d'ADN purifiée comprenant une cassette d'expression d'ARN interférent et une cassette de sélection du type décrit précédemment et au moins un élément pour isoler l'expression d'ARN interférent des séquences de régulations à fonctionnement cis de la chromatine. Avantageusement dans cette construction d'ADN, les cassettes d'expression et de sélection sont placées entre deux copies en tandem dudit élément, de préférence l'insulateur HS4.

L'organisation d'une telle cassette est schématisée sur la figure 1 en annexe.

Les vecteurs et les constructions de l'invention définis précédemment sont utiles pour la préparation de modèles cellulaires, destinées par exemple à analyser la modulation de l'expression d'un ou plusieurs gènes cibles, selon des méthodes d'inactivation génique.

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Un procédé de préparation de tels modèles cellulaires comprend les étapes suivantes : - les cellules sont transfectées avec les vecteurs de l'invention, - les cellules transfectées sont placées en présence de l'antibiotique dont la résistance est apportée par la cassette de sélection, - les cellules sont sélectionnées pour obtenir des clones cellulaires individuels qui seront amplifiés.

A titre d'exemples de cellules, on peut citer les cellules de mammifères, homme essentiellement mais aussi la souris. Il peut s'agir de cellules primaires, immortalisées ou transformées et de différentes origines (sein, foie, cellules nerveuses etc...) .

Les vecteurs de l'invention peuvent être aussi utilisés chez un sujet humain ou animal, notamment dans le cadre d'applications thérapeutiques des ARN interférents. Ainsi, l'invention concerne aussi des animaux transgéniques comprenant les cellules génétiquement modifiées ci-dessus.

Une méthode d' analyse de la modulation de l'expression d'un ou plusieurs gènes cibles mettant en #uvre un modèle cellulaire ci-dessus comprend les étapes suivantes : - L'établissement du modèle cellulaire codant ou non pour un ARN interférent comme décrit cidessus.

- L'analyse par exemple par la technique de Western Blot (WB) de la quantité de protéine codée par le gène ciblé par ARN interférence dans les modèles cellulaires.

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La technique de WB est envisageable s'il existe un anticorps spécifiquement dirigé contre cette protéine. En parallèle, le taux d'expression d'une protéine endogène dont l'expression ne doit pas être affectée par l'effet interférent, doit être analysé afin de normaliser les variations de la protéine ciblée d'un point expérimental à un autre. Des protéines telles que l'actine cytoplasmique ou la beta-tubuline peuvent par exemple être utilisées, sachant que des anticorps spécifiques de ces protéines sont disponibles. L'analyse par WB nécessite au préalable une lyse des cellules dans des conditions classiques qui sont compatibles avec le maintien de l'intégrité des protéines.

Dans le cas où le gène ciblé par ARN interférence code pour une protéine apportant une nouvelle propriété à la cellule, l'analyse de l'effet interférent peut être réalisée en étudiant la perte de cette propriété. Par exemple, si le gène ciblé est le gène codant pour la protéine GFP, il est possible d'étudier et de quantifier le taux d'expression de cette protéine par une analyse de la fluorescence, par exemple au FACS, et donc d'analyser l'effet interférent.

L'analyse de l'effet interférent peut également être réalisée par l'étude de la variation du taux d'ARN transcrit à partir du gène ciblé et ce, grâce aux techniques de RT-PCR semi quantitative ou en temps réel. Comme dans le cas de l'analyse par WB, il est nécessaire d'étudier simultanément la variation d'un gène endogène non ciblé par l'ARN interférent. Des gènes tels que l'actine cytoplasmique ou GAPD peuvent par exemple être étudiés. Ces techniques nécessitent de

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générer des oligonucléotides utilisés comme amorce dans les étapes de reverse transcription et de PCR. Les conditions d'extractions d'ARN et les réactions de reverse transcription et de PCR correspondent aux conditions classiquement décrites dans la littérature.

Il est néanmoins nécessaire de déterminer les conditions optimales de reverse transcription et de PCR pour chaque ARN étudié.

L'étude des résultats obtenus après normalisation par analyse du taux de protéine et/ou d'ARN issus du gène ciblé et ce, en comparant la situation en présence de la molécule interférente de celle en l'absence, permet de déduire l'effet de l'ARN interférent dirigé contre le ou les gènes ciblés dans les modèles cellulaires générés.

Les vecteurs selon l'invention pour véhiculer les molécules codant les ARN interférents et permettre leur expression peuvent être des plasmides ou des vecteurs viraux.

En effet, les séquences codant ces shRNA sont très généralement véhiculées par un plasmide mais le développement de vecteurs viraux est de plus en plus fréquent.

Le transport des siRNA dans les cellules est possible grâce à l'utilisation d'agents de transfection commerciaux comme l'Oligofectamine (Invitrogen). L'inconvénient de ces agents, outre leur coût très élevé et l'effet transitoire de l'action interférente des molécules transfectées, est leur toxicité cellulaire fréquente ainsi, et surtout, que leur faible efficacité sur un grand nombre de lignées cellulaires et de cellules primaires.

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Une étude réalisée chez la souris a montré qu'il est possible d'injecter des siRNA directement dans la circulation sanguine de l'animal via une méthode appelée méthode hydrodynamique , et ce, pour cibler directement le foie (Mc Caffrey et al., 2002, Nature, Vol 418, page 38). Le ciblage des autres tissus par l'injection directe de siRNA n'a pas été décrit mais les inconvénients d'une telle approche, notamment l'effet transitoire pour une approche lourde et invasive, sont tels qu'il ne devrait pas être envisagé.

Les molécules de type shRNA sont elles produites directement dans la cellule par transcription d'une séquence d'ADN spécifique du gène ciblé clonée en aval d'un promoteur. Ce promoteur est le plus souvent dépendant de l' ARN polymérase III afin de générer des molécules de structure compatible avec un effet interférent et la séquence d'ADN est telle que l'ARN, une fois transcrit, est capable de se replier sur luimême.

Ces séquences d'ADN codant des shRNA peuvent être véhiculées soit par un plasmide soit par un vecteur viral. Le grand intérêt de cette stratégie est que l'on peut obtenir un effet interférent à long terme car les séquences pourront éventuellement s'intégrer dans le génome cellulaire. Il sera possible de sélectionner ces cellules sur la base, par exemple, de l'intégration simultanée d'un gène de résistance à un antibiotique.

Les plasmides codant les shRNA peuvent être transfectés dans les cellules grâce à l'utilisation d'agent de transfection. Mais tout comme dans le cas de la transfection des siRNA, certaines cellules s'avèrent réfractaires à la transfection, ou bien le sont avec une efficacité réduite, voir nulle. De plus, dans des

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perspectives d'application thérapeutique du RNAi, le ciblage efficace d'un tissu précis est une priorité majeure.

Dans ces conditions, l'utilisation de vecteurs viraux pour véhiculer les séquences codant les shRNA présente un intérêt. En effet, certains d'entre eux peuvent transduire des cellules difficilement transfectables, telles que des cellules primaires. Ils peuvent également être utilisés chez l'animal pour cibler spécifiquement un tissu. Mais les vecteurs viraux ont également des inconvénients qui sont propres à chaque type de virus. Certains ont un effet transitoire (cas des adénovirus), d'autres ne vont transduire que des cellules qui se divisent (les rétrovirus) etc...

Plusieurs types de virus recombinants présentant chacun des avantages et des inconvénients sont aujourd'hui disponibles. Il a été proposé d'utiliser des adénovirus, des rétrovirus et des lentivirus recombinants pour véhiculer les séquences codant pour les ARN interférents. Les travaux de recherche réalisés par la Demanderesse lui ont permis de mettre en évidence les propriétés remarquables de vecteurs recombinants dérivés de l'Adeno-Associated virus (AAV) pour véhiculer des séquences codant pour les ARN interférents, notamment dans les cellules du système nerveux.

Ainsi, selon un autre aspect, l'invention se rapporte à des vecteurs recombinants dérivés de l'Adeno-Associated virus (AAV) pour véhiculer les molécules codant pour les ARN interférents et permettre leur expression dans les cellules de mammifères en

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culture, chez l'animal ou l'homme. Bien entendu l'invention concerne l'utilisation combinée de ces vecteurs avec les insulateurs définis précédemment.

Les AAV peuvent transduire des cellules post mitotiques, ce qui est le cas de beaucoup de cellules d'un organisme telles que les cellules nerveuses. Cette propriété n'est pas partagée par les autres virus (adénovirus, rétrovirus), à l'exception des lentivirus. Les AAV sont capables de transduire avec une grande efficacité les cellules du système nerveux, de la rétine et du muscle, et semble-t-il, également le foie. Il existe six variants du virus AAV, appelées sérotypes 1 à 6 : ils présentent des tropismes différents pour les différentes cellules du système nerveux, permettant ainsi d'envisager cibler très spécifiquement les différentes cellules du cerveau. Les vecteurs lentiviraux peuvent également transduire les cellules du système nerveux.

Un autre intérêt majeur de l'AAV, intérêt partagé avec les vecteurs lentiviraux, est qu'il s'intègre dans le génome cellulaire conduisant à une expression à long terme du transgène véhiculé, ce qui n'est pas le cas des adénovirus par exemple. Plusieurs études de transfert de gènes dans les cellules du système nerveux central confirment cette observation.

Cette expression à long terme est également liée à l'absence (ou presque) de réponses inflammatoires induites par ce virus (pas le cas de l'adénovirus).

Contrairement aux lentivirus, l'AAV n'est l'agent étiologique d'aucune maladie et présente un génome simple donc facilement manipulable.

Enfin, une des caractéristiques importantes du virus AAV sauvage est qu'il est capable de s'intégrer spécifiquement dans une région du chromosome

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19 humain, appelée AAVS1, région qui n'est pas essentielle à la vie de la cellule. Or, les vecteurs lentiviraux vont s'intégrer de façon aléatoire dans le génome pouvant conduire à des perturbations majeures des fonctions cellulaires. Toutefois, les premiers vecteurs viraux dérivés de l'AAV ont perdu cette propriété de s'intégrer spécifiquement dans le site AAVS1, mais cette caractéristique peut être retrouvée en présence d'une protéine virale.

L'invention concerne aussi les compositions plus particulièrement pharmaceutiques comprenant des vecteurs identiques ou différents décrits précédemment.

Ces compositions sont utiles pour inhiber un gène cible impliqué dans l'apparition ou le développement d'une pathologie.

D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront des exemples qui suivent concernant la préparation de vecteur d'expression d'ARN interférent et leur utilisation pour la préparation de modèle cellulaire, et dans lesquels il sera fait référence aux dessins en annexe dans lesquels :
La figure 1 est une représentation schématique d'une construction d'ADN selon l'invention.

Exemple 1 : Préparation du vecteur.

Deux copies en tandem de l' insulateur HS4 (fragment de 1200 pb) ou deux copies en tandem du fragment core de l'insulateur HS4 (fragment de 242-250 pb), ont été clonées dans le vecteur pSuper (Reuven Agami), dans lequel a été introduite une séquence codant un shRNA dirigé contre le gène humain p53. Il a également été introduit dans ce plasmide trois cassettes de sélection à un antibiotique, une cassette par plasmide comme montré sur la figure 1.

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1.1 : Clonage de deux copies en tandem de l'insulateur HS4 :
Deux copies en tandem de l' insulateur HS4 ont été isolées par digestion enzymatique EcoRI plus BamHI du plasmide pJC13-1 (Chung et al., 1993, Cell, Vol 74, pages 505-514). Les deux copies en tandem issues du plasmide pJC13.1 ont été clonées dans le plasmide pSG5 (Stratagène), entre les sites EcoRI et BamHI pour des raisons de commodités, l'utilisation ultérieure de l'insulateur se faisant maintenant systématiquement à partir de ce plasmide (plasmide pSG5-HS4).

Les deux copies en tandem d'HS4 ont été clonées en 5' des cassettes de résistance aux antibiotiques. Les cassettes hygromycine et néomycine sont privilégiées car des études expérimentales préalables ont montré la difficulté d'obtenir des clones cellulaires individuels dans les cellules en culture retenues pour l'étude avec la cassette de sélection blasticidine. Pour réaliser le clonage, le plasmide pSG5-HS4 est digéré par EcoRI+BamHI et purifié sur gel pour isoler les deux copies de l' insulateur.

Des oligonucléotides permettant de reconstituer des sites de restriction aux extrémités de l'insulateur compatibles avec son clonage dans les différents plasmides pSuper sont alors ligués au fragment correspondant. Après purification sur gel, le fragment correspondant à l'insulateur, auquel des oligoculéotides spécifiques ont été ligués à chaque extrémité, peut être cloné dans le plasmide pSuper-Neo ou pSuper-Hygro digéré par les enzymes de restriction adéquates et purifié sur gel. Les plasmides ainsi générés peuvent être analysés par les techniques

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classiques de biologie moléculaire (transformation bactérienne, miniprep d'ADN plasmidique etc...).

Une fois réalisée l'introduction de deux copies en tandem de l'insulateur en 5' des cassettes de sélection aux antibiotiques, deux copies sont alors introduites en 3' de la cassette codant le shRNA (figure 1 ) .

1.2 : Clonage de deux copies en tandem du fragment core de l'insulateur HS4 :
Une copie du fragment core est amplifiée par PCR à partir du plasmide pSG5-HS4 (décrit dans l'exemple 1. 1), en utilisant comme primer de PCR un oligonucléotide 5' créant un site de restriction Bst XI, et un oligonucléotide 3' créant un site de restriction Not I. Le fragment amplifié, après purification, est cloné dans ces mêmes sites, en amont des cassettes de résistances aux antibiotiques dans le plasmide pSuper-Néo ou le plasmide pSuper-Hygro décrit ci-dessus, puis séquence.

Une seconde copie du fragment core est amplifiée par PCR à partir du plasmide pSG5-HS4, en utilisant le même oligonucléotide 5' créant un site de restriction Bst XI que celui utilisé dans l'étape précédente et un oligonucléotide 3' créant un site de restriction Sac I. Le fragment est cloné, après purification, dans ces mêmes sites en amont de la première copie du fragment core, dans les plasmides générés précédemment, puis séquence.

Les deux copies du core ainsi obtenues sont purifiées sous la forme d'un seul fragment par digestion enzymatique par les enzymes de restriction Sac I et Not I à partir des plasmides précédemment générés.

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Après purification, les extrémités du fragment d'environ 500 paires de base ainsi obtenu sont rendues franches par action de l'enzyme T4 DNA polymérase.

Le fragment est alors cloné en aval de la cassette d'expression des gènes de résistance aux antibiotiques et du shRNA, dans le site Kpn I des plasmides obtenus précédemment, après que le site de restriction ait été rendu franc par l'action de l'enzyme T4 DNA polymérase.

La description ci-dessous se rapporte plus particulièrement à la préparation d'un vecteur AAV selon l'invention.

Les différentes séquences que l'on souhaite véhiculer dans l'AAV recombinant doivent être clonées entre les deux séquences répétées terminales du virus (ITR) qui sont les seuls éléments viraux requis pour la réplication et l'encapsidation du génome viral. Les séquences d'intérêt sont introduites entre les ITR, elles-mêmes contenues dans un plasmide, par l'utilisation d'enzyme de restriction et des techniques classiques de biologie moléculaire (ligation, transformation bactérienne, etc.).

La taille limite des séquences qui peuvent être clonées entre les deux ITR est d'environ 4700 paires de base. Au delà, le génome ne pourra plus être encapsidé.

Outre la cassette codant pour le shRNA, on inclut dans le vecteur AAV recombinant, une cassette de sélection codant pour un gène de résistance à un antibiotique ou un gène tel que GFP. On inclut également l'insulateur HS4. Il faut toutefois prendre garde à la taille limite du génome qui peut être

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encapsidé. En effet, deux copies en tandem du fragment de 1200 pb de l'insulateur HS4 représentent une taille de 4800 pb. Aussi, soit le fragment de 1200 pb sera introduit sous la forme d'une seule copie de part et d'autre des séquences clonées, soit deux copies en tandem du fragment de 250 pb sont utilisées.

Les séquences codant pour les protéines virales nécessaires à l'intégration ciblée dans le site AAVS1 sont éventuellement également introduites.

Dans le cas où la séquence codant le shRNA se trouve sous le contrôle d'un promoteur inductible, les éléments régulant ce promoteur pourront également être introduits dans le vecteur.

Les séquences clonées correspondent dans un premier temps au moins à une séquence codant pour un shRNA dirigé contre un gène d'intérêt, placé sous le contrôle d'un promoteur dépendant de l'ARN polymérase III ou de l'ARN polymérase II, inductible ou non. Dans les études préliminaires, le shRNA est dirigé contre le gène GFP pour étudier l'effet interférent dans des lignées cellulaires humaines HeLa ayant intégrées de façon stable le gène GFP, ou bien, il est dirigé contre un gène cellulaire.

Une fois les séquences d'intérêt clonées, les virus AAV recombinant vont être produits. Pour cela, le plasmide véhiculant les séquences étudiées clonées entre les deux ITR est transfecté dans des cellules humaines en culture (très généralement la lignée 293 issue de rein), en présence des protéines Rep et Cap de l'AAV et de fonctions dite helper (l'AAV est un virus défectif), très souvent apportées par un adénovirus. Les protéines Rep et Cap et les fonctions adénovirales peuvent être apportées par différentes stratégies. Lorsque la production d'AAV

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recombinant est achevée (environ 72 à 80 heures après le début de la transfection), les virus sont récupérés et purifiés. Les méthodes de purification sont variables, mais se font très généralement sur un gradient. Les virus seront ensuite testés pour leur qualité et titrés.

Exemple 2: Transfection de cellules avec le plasmide de l'exemple 1.

Les plasmides ainsi obtenus sont transfectés individuellement dans des cellules humaines MCF7 (cellules de glandes mammaires issues d'un site métastatique) (transfection par utilisation de la Lipofectamine d'Invitrogen) parallèlement à la transfection des plasmides pSuper correspondant dépourvus des deux copies en tandem d'HS4. 48 heures après transfection, les cellules sont placées en présence de l'antibiotique (aux concentrations préalablement déterminées expérimentalement) dont la résistance est apportée par la cassette de sélection.

Les cellules sont sélectionnées pour obtenir des clones cellulaires individuels qui seront amplifiés. Le nombre de clones cellulaires obtenus en présence ou en l'absence de l'insulateur est analysé.

De même, l'expression de l'effet interférent dirigé contre le gène endogène p53 est analysé dans les clones cellulaires individuels, en comparant la situation en présence de l'insulateur de celle en son absence. L' analyse est faite par Western Blot et RT-PCR semi quantitative. Les clones cellulaires sont maintenus en culture pendant une longue période (au moins deux mois), avec ou sans

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antibiotiques, après quoi l'effet interférent est réévalué.

Dans le cas des AAV recombinants, une fois ceux-ci produits, ils sont utilisés dans un premier temps dans des cellules humaines en culture pour tester l'effet interférent qu'ils véhiculent. Les cellules sont infectées à différentes MOI (Multiplicity of Infection = nombre de virus par cellules). Les gammes de MOI optimales ont été préalablement déterminées grâce à la transduction de ces mêmes cellules en culture par un AAV recombinant véhiculant le gène codant pour la GFP. L'analyse de l'effet interférent sur le gène ciblé est analysé à différent temps posttransduction, par différentes approches (Western Blot, RT-PCR semi quantitative, immunofluorescence etc...).

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Références Bibliographiques
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(1999) . The protein CTCF is required for the enhancer blocking activity of vertebrate insulators. Cell. 98 : 387-396.

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Claims (14)

REVENDICATIONS

1) Vecteur d'expression d'ARN interférent caractérisé en ce qu'il comprend un ou plusieurs éléments isolants protégeant les molécules d'ADN codant pour l'ARN interférent contre les séquences régulatrices des cellules.

2) Vecteur selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une cassette d'expression d'ARN interférent et au moins un élément capable d'isoler ladite cassette des séquences de régulations à fonctionnement cis de la chromatine d'une cellule transfectée par ledit vecteur.

3) Vecteur selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'élément capable d'isoler ladite cassette est le fragment de 1,2 kb contenant l'insulateur HS4 ou une partie de celui-ci.

4) Vecteur selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'élément capable d'isoler ladite cassette est la séquence de 242 ou 250 pb ou leurs variants comprenant le site de fixation du facteur protéique CTCF capable de fixer le facteur protéique CTCF dudit fragment de 1,2 kb.

5) Vecteur selon l'une des revendications 2 à 4, caractérisé en ce qu'il comprend de part et d'autre de la cassette d'expression au moins un élément capable d'isoler ladite cassette des séquences de régulations à fonctionnement cis de la chromatine d'une cellule transfectée par ledit vecteur.

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6) Vecteur selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il comprend de part et d'autre de la cassette d'expression deux copies en tandem dudit élément.

7) Vecteur selon l'une quelconque des revendications 2 à 6, caractérisé en ce que la casette d'expression contient une ou plusieurs unités de transcription comprenant au moins une molécule d'ADN codant l'ARN interférent placé sous le contrôle d'un promoteur.

8) Vecteur selon la revendication 7, caractérisé en ce que le promoteur est choisi dans le groupe comprenant les promoteurs constitutifs ou inductibles, dépendants de l'ARN polymérase III ou de l'ARN polymérase II.

9) Vecteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend une cassette de sélection.

10) Vecteur selon la revendication 9, caractérisé en ce que la cassette de sélection est placée, comme la cassette d'expression, entre les éléments capables d'isoler la cassette d'expression des séquences de régulations à fonctionnement cis de la chromatine d'une cellule transfectée par ledit vecteur.

11) Vecteur selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est dérivé d'un plasmide ou d'un vecteur viral.

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12) Vecteur selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il dérive d'un AAV.

13) Une construction d'ADN purifiée comprenant une cassette d'expression d'ARN interférent, une cassette de sélection et au moins un élément pour isoler l'expression d'ARN interférent des séquences de régulations à fonctionnement cis de la chromatine, comme décrit dans l'une quelconque des revendications 2 à 10.

14) Procédé de préparation d'un modèle cellulaire, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - la transfection de cellules avec les vecteurs selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, - les cellules transfectées sont placées en présence de l'antibiotique dont la résistance est apportée par la cassette de sélection, - les cellules sont sélectionnées pour obtenir des clones cellulaires individuels qui seront amplifiés.