FR2850667A1 - Procede pour la preparation d'une composition de sequences d'adn permettant l'identification des souches d'helicobacter pylori et leur utilisation dans un procede de diagnostic - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne un procédé pour la préparation d'un ensemble de fragments d'ADN ou leurs produits d'expression permettant le typage des souches d'H. pylori, ledit procédé comprenant les étapes suivantes de :a. préparation de compositions d'ADN génomique d'isolats cliniques, ou de souches d'H. pylori, que l'on peut distinguer notamment soit par leur origine géographique soit pas la pathologie particulière qui leur est associée,b. identification d'un ensemble d'ORFs non ubiquistes parmi les ORFs du génome d'une souche d'H. pylori de référence, par comparaison avec l'ADN génomique desdits isolats cliniques ou souches précédemment préparé en a),c. préparation d'une composition comprenant un ensemble d'ORFs identifiées en b), ou leurs fragments, , leurs produits d'expression ou des anticorps dirigés contre ces produits d'expression.L'invention concerne également les compositions définies précédemment et leur utilisation dans un procédé de typage et/ou de diagnostique.

Description

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Procédé pour la préparation d'une composition de séquences d'ADN permettant l'identification des souches d'Helicobacter pylori et leur utilisation dans un procédé de diagnostic.

La présente invention concerne une composition de séquences d'ADN, ou leur produit d'expression permettant l'identification des souches d'Helicobacter pylori, un procédé pour la préparation de cette composition et son utilisation dans un procédé de diagnostic.

Il est aujourd'hui admis que la bactérie Helicobacter pylori est l'agent étiologique des pathologies gastro-duodénales: elle est responsable des gastrites chroniques, des ulcères gastro-duodénaux et joue un rôle important dans la genèse des cancers gastriques. Ceci a conduit non seulement à réviser le traitement des ulcères, mais aussi à chercher à éradiquer cette bactérie qui infecte plus de 50% de la population mondiale.

On pensait jusqu'en 1982 qu'aucune bactérie ne pouvait persister dans l'estomac, incapable de résister au sucs gastriques acides qu'il sécrète. Mais à cette date, deux médecins australiens, Barry Marshall et Robin Warren, cultivent pour la première fois Helicobacter pylori, une bactérie présente à la surface de la muqueuse gastrique, où elle est capable de survivre et de persister en dépit de l'acidité gastrique et d'une forte réponse immunitaire. Ils émettent alors l'hypothèse qu'elle pourrait être à l'origine de certaines pathologies inflammatoires chroniques gastro-duodénales. Il fallut plusieurs années et de nombreuses études pour que le bien fondé de cette hypothèse soit largement accepté. En France, c'est en 1995 qu'au cours d'une conférence de consensus le corps médical reconnaissait officiellement le rôle majeur joué par Helicobacter pylori dans le développement de la maladie ulcéreuse qu'il fallait dorénavant traiter comme une maladie infectieuse.

L'infection à H. pylori est acquise pendant l'enfance et perdure pendant des décennies.

Toute personne infectée développe une forte réponse inflammatoire qui s'installe dans la chronicité au cours du temps. Chez la plupart des individus, la gastrite chronique évolue sans autre conséquence et reste asymptomatique. Une proportion faible de patients (environ 10% des personnes infectées) développeront une maladie ulcéreuse, et 1 % des personnes infectées développeront un cancer gastrique. Les données accumulées ces dernières années montrent toutefois que ces deux issues cliniques sont mutuellement exclusives, et que l'évolution vers l'une ou l'autre des pathologies est fonction de prédispositions génétiques. L'évolution vers la maladie ulcéreuse est associée à une gastrite antrale de l'estomac et à une hyper-sécrétion acide, alors que l'évolution vers

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l'atrophie gastrique puis le cancer gastrique est associée à une pangastrite (gastrite de l'antre et du fundus) et à une hypo-sécrétion acide. Ainsi, H. pylori est-elle la première bactérie impliquée dans la génèse d'un cancer, le cancer de l'estomac, deuxième cause de cancers dans le monde et première dans les pays en développement. L'infection à H. pylori est l'une des infections chroniques les plus répandues dans le monde : de 20 à 90 % des individus adultes sont infectés selon les pays, l'infection étant plus fréquente dans les pays en développement que dans les pays industrialisés. La bactérie se transmet probablement directement d'homme à homme par voie orale.

Helicobacter pylori est trouvée chez plus de 90% des personnes souffrant d'un ulcère duodénal et chez environ 80% de celles qui ont un ulcère gastrique. Chez ces patients, le risque de réapparition d'un ulcère duodénal ou gastrique dans les douze mois suivant l'éradication de la bactérie par un traitement antibiotique adapté est inférieur à 5% (contre 60 à 80% chez les patients suivant un traitement "classique" anti-sécrétoire). Combattre l'infection à Helicobacter pylori, et non plus simplement réduire l'acidité gastrique, apparaît désormais être un objectif majeur pour traiter les ulcères gastro-duodénaux.

L'évolution de l'infection par H. pylori dépendra de nombreux facteurs associés à l'individu infecté, mais également à l'appartenance de la bactérie à un groupe déterminé, lequel groupe comprend des souches provenant d'une même origine géographique et/ou associées à une même pathologie, telle que lymphome, ulcère peptique, adénocarcinome ou lésion précancéreuse telle que métaplasie intestinale ou atrophie gastrique Il est donc important de pouvoir disposer d'un test efficace permettant le typage moléculaire des différentes souches d'H. pylori, en particulier des isolats cliniques, afin d'en déterminer l'origine géographique et/ou, en fonction de son appartenance à un groupe défini, de diagnostiquer les risques de développements de pathologies particulières associés audit groupe.

Le génome complet de la souche 26695 d'H. pylori a été décrit dans la littérature. Il s'agit d'un génome circulaire de 1 667 867 paires de bases comprenant 1590 séquences codantes putatives ou ORFs (Nature 1997 Aug 7 ;388(6642):539-47). membranes haute densité (DNA micro-array) sur lesquelles ces 1590 ORFs sont fixées sont disponibles dans le commerce, notamment commercialisées par la société

EUROGENTEC (http:/Iwww.eurogentec.be/code/en/geno dnaa prod pylo.htm ) ou par la société NIPPON GENE CO.

(http.//www.nippongene.ip/pages/products/dnaarray/pylori e.html

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En étudiant la distribution des ORFs identifiés par TIGR dans le génome de la souche 26695 d'H. pylori avec l'ADN chromosomique de 20 isolats provenant de patients originaires d'Europe, d'Asie et d'Afrique, les inventeurs ont pu mettre en évidence une série d'ORFs non ubiquistes ou souches spécifiques.

La présente invention concerne donc un procédé pour la préparation d'un ensemble de fragments d'ADN, ou leur produit d'expression permettant le typage des souches d'H. pylori, ledit procédé comprenant les étapes successives de : a. préparation de compositions d'ADN génomique d'isolats cliniques, ou de souches d'H. pylori, que l'on peut distinguer notamment soit par leur origine géographique soit pas la pathologie particulière qui leur est associée, b. identification d'un ensemble d'ORFs non ubiquistes parmi les ORFs du génome d'une souche d'H. pylori de référence, par comparaison avec l'ADN génomique desdits isolats cliniques ou souches précédemment préparé en a), c. préparation d'une composition comprenant un ensemble d'ORFs identifiées en b), ou leurs fragments, leurs produits d'expression ou des anticorps dirigés contre ces produits d'expression.

Le procédé selon l'invention peut comprendre, en outre, une étape de vérification du profil d'hybridation de l'ADN génomique desdits isolats cliniques ou souches avec l'ensemble des ORFs sélectionnées en b), permettant de distinguer les différents isolats et/ou souches.

De manière préférentielle, le nombre d'isolats ou de souches distincts employés pour l'identification des ORFs non ubiquistes est supérieur ou égal à 10, plus préférentiellement supérieur ou égal à 15, encore plus préférentiellement supérieur ou égal à 20.

Par non ubiquiste , on entend selon l'invention les ORFs de la souche de référence que l'on ne retrouve pas dans au moins l'un des isolats étudiés. Par ubiquiste , on entend selon l'invention les ORFs de la souche de référence que l'on retrouve également dans tous les isolats étudiés.

Par fragment , on entend selon l'invention une séquence d'ADN comprenant un nombre de nucléotides inférieur ou égal à celui de la séquence complète de l'ORF correspondante, toutefois suffisamment important pour permettre son utilisation dans une

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étude de profil d'hybridation. Cette taille minimum dépendra bien entendu de la technique d'hybridation employée. Il sera de préférence supérieur à 350 nucléotides. Ces fragments peuvent être préparés par tout moyen approprié à la disposition de l'homme du métier, par synthèse et clonage d'oligomères synthétiques, ou encore par PCR. Selon un mode de réalisation préférentiel de l'invention, le fragment d'ADN correspondant à l'ORF non ubiquiste sélectionnée est un produit de PCR. Le fragment d'ADN est de préférence un ADN simple brin.

Par produit d'expression , on entend selon l'invention une séquence d'ARN correspondante à l'ORF, ou son fragment considéré, ou encore un polypeptide résultant de la traduction de ladite ORF, ou dudit fragment considéré.

Selon un mode préférentiel de réalisation de l'invention, la souche de référence est la souche H. pylori 26695.

Les moyens et méthodes employés pour la mise en #uvre du procédé selon l'invention sont des moyens bien connus de l'homme du métier, employés de manière usuelle en biologie moléculaire et en génomique.

Selon un mode préférentiel de réalisation de l'invention, la composition comprenant un ensemble d'ORFs préparée par le procédé selon l'invention comprend au moins un fragment d'ADN pour chaque ORF non ubiquiste sélectionnée. Chaque fragment peut être reproduit par les techniques usuelles à la disposition de l'homme du métier, comme les techniques PCR.

Le nombre d'ORFs non ubiquistes sélectionnée pour la préparation de la composition selon l'invention dépendra de différents facteurs comme : - le nombre total d'ORFs non ubiquistes identifiées, - la méthode de réalisation de profils d'hybridation sélectionnée, la difficulté de sa mise en oeuvre et sa capacité à traiter rapidement un grand nombre de réactions d'hybridation, - le tout étant pondéré par le degré de précision recherché par l'homme du métier dans la comparaison des profils d'hybridation des différents isolats ou souches.

De manière avantageuse, la composition préparée par le procédé selon l'invention comprend au moins 2 fragments d'ADN, ou leurs produits d'expressionou les anticorps dirigés contre ces produits d'expression, correspondant à 2 ORFs non ubiquistes

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différentes, plus préférentiellement au moins 16. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, la composition comprend 246 fragments d'ADN, ou les produits d'expression ou les anticorps dirigés contre ces produits d'expression, correspondant à 246 ORFs différentes, en particulier les 246 ORFs non ubiquistes identifiées sur la figure 1 en annexe (les ORFs distinguées par un signe + sont des ORFs ubiquistes, les ORFs non ubiquistes ne comprenant pas ce signe).

Selon un mode préférentiel de réalisation de l'invention, les fragments d'ADN ou leurs produits d'expression ou les anticorps dirigés contre ces produits d'expression, dans la composition obtenue par le procédé selon l'invention sont immobilisés sur un support approprié, de manière covalente ou non covalente, en particulier immobilisées sous forme de réseaux à des positions prédéterminées. Les séquences d'ADN ou produits d'expression ainsi fixées peuvent ainsi être repérées par leur localisation géographique.

Selon un mode préférentiel, les positions prédéterminées sont distribuées selon un réseau normé, le réseau étant plus préférentiellement orthonormé. En particulier, le support peut être une puce à ADN ou un filtre à haute ou moyenne densité (WO 97/29212, WO 97/10365, WO 92/10588). Le support peut également être une puce à protéine (protein chip). Les protéines fixées sur les puces à protéines selon l'invention sont soit les produits d'expression des ORFs non ubiquistes ou de leur fragments, soir les anticorps dirigés contre ces produits d'expression.

Il existe de nombreuses technologies pour fabriquer de telles matrices, comme la synthèse directe d'oligonucléotides courts sur une surface préalablement fonctionnalisée et activée pour permettre le greffage, ou comme l'immobilisation de ligands préalablement synthétisés et caractérisés avant leur immobilisation, sur une surface fonctionnalisée, le dépôt de ces sondes pouvant être réalisé par des méthodes mécaniques ou électrochimiques.

La préparation de tels réseaux, micro ou macro-réseaux, puce à ADN ou filtre à moyenne ou haute densité, comprenant un support approprié sur lequel sont fixées les fragments d'ADN selon l'invention à des positions prédéterminées est aujourd'hui largement automatisée, par l'emploi de robots appropriés, comme par exemple les robots commercialisés sous la marque Q-Pix par la société Genetix Ltd. Le fonctionnement de ces robots est contrôlé par des moyens informatiques appropriés, comme par exemple le logiciel Gridding QSoft 2000, de la société Genetix Ltd.

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Les supports en réseau peuvent également être préparés à façon par des sociétés spécialisées disposant des moyens nécessaires à leur réalisation, auxquels l'homme du métier fournira simplement les informations relatives aux séquences nucléotidiques des sondes selon l'invention devant être fixées sur ledit support, ou le matériel nécessaire à leur préparation.

La présente invention concerne également une composition permettant le typage des souches d'H. pylori, comprenant au moins deux fragments d'ADN, ou leurs produits d'expression, choisis parmi un ensemble d'ORFs non ubiquistes parmi les ORFs du génome d'une souche d'H. pylori telle que définie précédemment.

La présente invention concerne également un procédé permettant le typage moléculaire d'isolats ou de souches d'H. pylori, en particulier d'isolats cliniques desdites souches, ledit procédé comprenant les étapes de a. mise en contact d'une composition selon l'invention avec une composition d'acide nucléique comprenant des fragments d'ADN isolés de l'isolat ou de la souche d'H. pylori à typer, et de b. réalisation d'un profil d'hybridation associé audit isolat ou à ladite souche à typer par identification des sondes venant s'hybrider avec les fragments d'ADN isolés.

Selon un mode préférentiel de réalisation de l'invention, le procédé de typage moléculaire comprend en outre une étape de normalisation des valeurs (ANOVA) et le cas échéant, une étape d'analyse des composantes principales (ALP).

La préparation, le calibrage et le marquage des fragments d'ADN sont effectués par des techniques usuelles pour l'homme du métier.

Lorsque les sondes selon l'invention sont fixées sur un en réseau à des positions déterminées, il est possible d'identifier rapidement les sondes se fixant aux fragments d'ADN marqués, émettant un signal positif, en particulier en employant des moyens automatisés appropriés, comme par exemple un Phosphorlmager, commercialisé par la société Amersham Biosciences, où les différentes intensités de spots formés sur le support en réseau sont ensuite converties en données chiffrées (cf. Johnston & al., (1990) Electrophoresis, 11, 355-360). Les données chiffrées, associée à une position

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prédéterminée, sont ensuite analysées au moyen de logiciels appropriés, comme par exemple le logiciel XdotsReader, commercialisé par la société Cose.

Les exemples de réalisation ci-après permettent d'illustrer l'invention, sans toutefois chercher à en limiter la portée.

Préparation d'une membrane comprenant 246 ORFs non ubiquistes et 45 ORFs ubiquistes La membrane préparée est une membrane nylon sur laquelle 246 ORFs non ubiquistes et 45 ORFs ubiquistes sont fixées. Les 45 ORFs ubiquistes permettent de normaliser les valeurs d'hybridation.

Les ORFs fixées sur la membrane sont des produits PCR obtenus par amplification dans des plaques 96 puits, selon les conditions préconisées par le fabriquant, des séquences des ORFs correspondantes contenues dans une banque d'ADN constituée par un mélange de bactéries E. coli recombinantes, chacune hébergeant un plasmide porteur d'une des 1590 ORFs d'H. pylori 26695. Il s'agit du mélange d'E. coli DH5a (pTCA, pILL570#-HP0001 à HP1590) déposée le 13 avril 2000 auprès de la Collection Nationale de Culture de Microorganismes, 24 rue de Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, selon les dispositions du traité de Budapest, sous le numéro d'ordre I-2442.

Les fragments d'ADN sont amplifiés en employant d'une part le couple d'oligonucléotides 570-3 et 570-4 dont les séquences sont décrites ci-dessous, et d'autre part les oligonucléotides de 30 paires de bases correspondants à l'ORF à amplifier, décrits sur la figure 2 en annexe. Les produits PCR est purifié et séquence selon les techniques usuelles.

Les membranes sont des membranes nylon de type Q Filter Genetix (membrane N+ de 222 mmm), traitées selon les recommandations du fabriquant. Les dépôts des fragments d'ADN sont réalisés automatiquement par un robot Q-Pix, en suivant les recommandations du fabriquant. Chaque ORF est déposée en triplicat (griding 5x5).

La membrane ainsi obtenue est représentée de manière schématique sur la figure 3 annexée. La localisation relative de chaque ORF sélectionnée sur chaque plaque est indiquée dans les tableaux représentés sur les figures 3A à 3D en annexe.

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Préparation et marquage des sondes chromosomiques L'ADN chromosomique est ici utilisé comme sonde pour identifier la présence des ORFs déposées sur les membranes. Pour obtenir un marquage homogène de l'ensemble du chromosome, l'ADN est d'abord soniqués pour générer des fragments linéaires d'une taille moyenne de 500 paires de bases, puis dénaturé à la chaleur. Des brins d'ADN complémentaires sont alors synthétisés après hybridation d'un mélange d'oligonucléotides courts (hexamers) dont la séquence correspond à toutes les combinaisons envisageables des 4 nucléotides. Ces oligonucléotides hybridées tout au long des fragments linéaires de façon aléatoire servent alors d'amorces pour leur extension en 3' en prenant pour matrice la séquence de l'ADN chromosomique auquel elles sont hybridées. Dans les réactions de synthèse d'ADNc, un seul des quatre déoxyribonucléotides est radioactivement marqué. Ici, il s'agit du dCTP[[alpha]33P].

Réactifs : - Sérum albumine de boeuf (BSA) à 10 mg/ml (Biologie moléculaire grade).

- DNA polymérase I, fraction Klenow (Amersham RPN1607) - dATP 10mM, dGTP 10mM, dTTP 10mM, (Roche) - dCTP[[alpha]-33P] (1000 Ci/ l ; NEGG134 NEN) - OL : oligonucléotides : pd (N6), Ref. 27-2166 ; solution à 50 U OD/ml, Pharmacia Solutions :
TM :
250 mM Tris-HCI pH8 250 l du stock 1 M
25 mM MgCI2 25 l du stock 1 M + 722 l H20
50 mM ss-Mercaptoethanol 3,5 l de la solution
DTM:
100 M dATP in TM 10 l du stock 10mM
100 M dGTP in TM 10 l du stock 10 mM + 970 l TM
100 M dTTP in TM 10 l du stock 10 mM
LS :
25 volumes de 1 M HEPES pH6. 6 437 l de 1 M HEPES
25 volumes de DTM 437 l de DTM
7 volumes d'OL 17,5 l d'OL
Aliquoter sous volume de 200 l et conserver à -20 C

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1. Contrôle de qualité de l'ADN préparé par QIAamp L'ADN chromosomique purifié doit présenter une concentration comprise entre 15 et 50 g. Déposer sur un gel d'agarose à 1 % 5 et 10 l de la préparation QIAamp ainsi que 10 l de la référence Smart permettant d'estimer la concentration (cf. fiche technique 2).

2. Sonication de l'ADN Mélanger 250 l de la solution d'ADN chromosomique à 250 l d'eau stérile dans un tube eppendorf Introduire la sonde du sonicateur en la plongeant de 5 mm au-dessous de la surface de la solution, et soniquer 20 secondes (puissance 3 sous forme de pulses à 50 %) en maintenant le tube eppendorf plongé dans un bain d'eau glacée.

Contrôler la fragmentation de l'ADN en déposant 10 l du mélange soniqué sur un gel d'agarose à 1 %. Vérifier que les fragments ont majoritairement une taille comprise entre 0,5 et 1,5 kilobases.

3. Marquage de la sonde par extension d'amorces aléatoires Dénaturation de l'ADN chromosomique : - Introduire 50 à 100 ng de l'ADN soniqué/calibré dans un tube Eppendorf- - Compléter le volume à 10 l avec de l'eau stérile - Incuber le tube 5 minutes au bain-marie à 100 C, puis le plonger 5 minutes dans la glace. Centrifuger 2 secondes pour collecter les gouttes de vapeur d'eau au fond du tube Synthèse de l'ADN marqué - Ajouter dans le tube : - 11,5 l du tampon LS - 1 pl de BSA à 10 mg/ml - 2 l de dCTP[a-33P] de production récente - 0,5 l de Klenow Mélanger en pipetant avec un pipetman équipé d'un cône à filtre. Centrifuger 2 secondes pour collecter l'ensemble du mélange au fond du tube. Le volume final est de 25 l.

Incuber le tube pendant 3 heures à température ambiante en veillant à le garder de façon à minimiser le rayonnement radioactif. Inactiver l'enzyme et arrêter la réaction de polymérisation en incubant le tube 3 minutes à 100 C dans le bloc chauffant.

Purification des sondes marquées radioactivement

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Les ADN néosynthétisés soit à partir de l'ADN chromosomique soit à partir de l'ARN doivent être purifiés et séparés des nucléotides marqués non incorporés. Ils le sont par chromatographie sur colonne Sephadex où les molécules se séparent suivant leur taille en traversant la couche de billes poreuses pendant la centrifugation. Les molécules de petite taille (amorces et nucléotides non incorporés) diffusent dans les pores des billes et sont retenues dans la colonne tandis que les macromolécules (ADN néosynthétisé) sont éluées. L'efficacité de la synthèse est estimée en comparant au moyen d'un compteur Geiger la radioactivité présente dans l'éluat (ADNc synthétisés) à celle dans la colonne (nucléotides non incorporés).

TAMPONS ET REACTIFS - Quick Spin TM Columns, Séphaddex G-25, Fine (Boehringer Mannheim-Roche #1273
922) - Tube Falcon #2059 PROTOCOLE 1. Inverser à plusieurs reprises la colonne Sephadex G-25 spin pour resuspendre la résine 2. Enlever les deux bouchons de la colonne en commençant par le bouchon supérieur, et mettre la colonne sur un microtube fourni dans le kit. Laisser le tampon s'écouler pendant 5 minutes dans le tube. Vider le tube et remettre la colonne sur ce même tube. Mettre l'ensemble (colonne + tube) dans un tube falcon 2059.

3. Centrifuger 4 minutes à 5000 rpm dans une centrifugeuse équipée d'un rotor swinging.

Enlever l'ensemble (colonne + tube) avec une pince et jeter le microtube.

4. Mettre la colonne sur un microtube neuf et réinstaller l'ensemble dans le tube Falcon. A l'aide d'un pipetman 200, déposer la solution contenant les ADNc synthétisés en haut de la matrice, sans la toucher.

5. Centrifuger 4 minutes à 5000rpm. Enlever uniquement la colonne avec une pince et la déposer sur un microtube. Puis prélever l'éluat et le mettre dans un tube Eppendorf stérile.

Mesurer le taux d'incorporation (T) : Placer un compteur Geiger contre la paroi du tube Eppendorf contenant l'éluat radioactif. Faire de même avec la colonne.

T = nombre de coups éluat/nombre de coups éluat+nombre de coups colonne.

T doit être supérieur ou égal à 30.

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Les sondes sont utilisées immédiatement de préférence, ou peuvent être conservées quelques jours à -20 C.

Hybridation des sondes aux cibles d'ADN immobilisées sur une membrane Les réactions d'hybridation mettent en jeu deux chaînes d'ADN, ou d'ARN et d'ADN sous forme simple brin . On appelle "cible" (target) la molécule sur laquelle se trouve la séquence à détecter et "sonde" (probe) la molécule qui permettra la détection. La stabilité de l'hybride formé est définie par sa température de fusion (Tm) et dépend de différents paramètres dont la taille, la teneur en GC et la présence ou non de mésappariements au sein de l'hybride, ainsi que la concentration en ions monovalents et en agents déstabilisants (formamide ou urée).

Dans la plupart des expériences, la sonde utilisée est spécifique, c'est à dire qu'elle doit s'hybrider à l'ADN ou à l'ARN d'intérêt et seulement à celui-ci. Pour une sonde de plus de 100 nucléotides, la température optimale d'hybridation est inférieure d'environ 5 à 10 C à la température de dénaturation (Tm) de la sonde. Les lavages seront ensuite faits dans des conditions qui s'approchent plus ou moins du Tm de la sonde. Plus la température est proche du Tm, plus les conditions sont stringentes, c'est-à-dire ne permettant qu'aux séquences parfaitement appariées de rester associées. Les conditions optimales doivent être recherchées.

Le Tm dépend de la composition en nucléotides (nt) de la sonde, de la molarité en Na+, et de la présence d'agents déstabilisants. Pour une hybridation ADN/ADN, il se calcule ainsi Tm = 81,5 C + 16,6 [Iog10 [Na+] + 0,41 (%G+C) - 0,63 (%formamide) - 600/1 # étant la longueur de la sonde en nucléotides Dans les cas d'analyse de transcriptome, la population d'ADNc marquées est composée de molécules ayant chacune leur valeur de Tm propre. Pour réaliser les hybridations, on sera donc obligé d'utiliser des conditions standards qui correspondent à une valeur moyenne de Tm. On peut toutefois influencer la stringence de la réaction en diluant plus ou moins le tampon et le SDS de la solution de lavage.

# Church, G. M., and Gilbert, W. (1984) Genomic sequencing. Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 81, 1991-1995.

# Bertucci F., Bernard K., Loriod B., Chang Y. C., Granjeaud S., Birnbaum D., Nguyen
C., Peck K., Jordan B.R. Sensitivity issues in DNA array-based expression

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measurements and performance of nylon microarrays for small samples. Hum. Mol.

Genet. 8 (1999) 1715-1722.

REACTIFS ET TAMPONS
SDS : Sigma # L-5750
Sperme de saumon : GENAXIS #GX12970
Polyvinyl-pyrrolidone (PVP) : Sigma # P-6755
Serum albumine fraction V : Sigma # A-9647
Ficoll type 400 : Sigma # F-4375 - Tampon 20XSSC :NaCI 3M, Citrate de sodium 0,3M
NaCI 175,3 g
Citrate trisodique, 2H20 88,3 g
Eau distillée qsp 1000 ml
Dissoudre à l'aide d'un barreau aimanté sur un agitateur magnétique. Ajuster à pH7,0 avec HCI. Autoclaver 20 minutes à 110 C.

Ou, solution commercialisée par QUANTUM Biotechnologies (# SSC 001) - 100xPM (Denhardt's X100)
Ficoll type 400 (Sigma F-4375) 2 g
Polyvinyl-pyrrolidone PVP (Sigma P-6755) 2 g
Serum albumine fraction V (Sigma A-9647) 2 g
Eau distillée q. s.p 100 ml
Dissoudre à l'aide d'un barreau aimanté sur un agitateur magnétique. Aliquoter sous des volumes de 20 ml conservés congelés à -20 C.

- Tampon d'hybridation : (25ml/membrane, volume pour 6 membranes)
20X SSC 37,5 ml
SDS 3 gr
ADN de Sperme de saumon 1,5 ml
Denhardt's reagent 100x 1,5 ml
Eau distillée q. s.p. 150 ml - Solution de lavage : (volume pour 6 membranes)
20 X SSC 50 ml
SDS 2 g
Eau distillée q. s.p. 2000 ml - Solution de deshybridation : (500 ml/membrane)
Tris 1 M pH 7,6 20 ml
EDTA 0,5M pH8,0 4 ml

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SDS 20 gr
Eau distillée q.s.p. 2000 ml PROTOCOLE - Réhydrater la membrane dans 50 ml de 2X SSC dans une boîte plastique pendant 5 minutes. La membrane ne doit jamais séchée une fois qu'elle a été réhydratée.

- Régler le four à hybridation et un bain marie sur 65 C ainsi qu'un bloc chauffant sur 100 C.

Préchauffer la solution d'hybridation à 65 C.

Pré-hybridation de la membrane
Coller un adhésif sur un rouleau
Placer la membrane dans un rouleau à hybridation avec du tampon 2X SSC.

Tourner le rouleau jusqu'à ce que la membrane soit collée à la paroi. Eliminer les bulles.

Eliminer ensuite l'excédant de 2X SSC et ajouter 15 ml de solution d'hybridation préalablement chauffée à 65 C.

Mettre au four avec rotation et incuber pendant une heure à 65 C.

Dénaturation de la sonde et hybridation
Incuber la sonde d'ADN, marquée et purifiée, 10 minutes à 95 C dans un bloc chauffant.

Ajouter la sonde à 5 ml de solution d'hybridation préalablement chauffée dans un tube Falcon à usage unique. Noter le nom de la souche bactérienne étudiée sur l'adhésif du rouleau.

Jeter les 15ml versés à l'étape préhybridation et les remplacer par les 5 ml contenant la sonde radioactive.

Remettre le rouleau au four avec rotation toute la nuit à 65 C.

Lavage des membranes et mise en cassette 1. Par membrane, mettre 300ml de solution de lavage à préchauffer dans une étuve à 65 C pendant le temps des lavages à température ambiante.

2. Jeter la solution d'hybridation dans une poubelle pour déchets radioactifs.

3. Ajouter 50 ml de solution de lavage à température ambiante dans chaque rouleau.

Inverser le rouleau pendant trois minutes à température ambiante. Jeter ensuite la solution de lavage dans une poubelle pour déchets radioactifs.

4. Répéter deux fois l'étape 3.

5. Mettre 100ml de solution de lavage, préchauffée à 65 C, dans chaque rouleau. Le placer dans le four à hybridation à 65 C avec rotation pendant 20 minutes. Jeter la solution de lavage dans une poubelle pour déchets radioactifs.

6. Répéter deux fois l'étape 5.

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7. Sortir chaque membrane en la tirant doucement avec le doigt ganté.

8. Dérouler la membrane sur un papier whatman. Découper une feuille de cellophane (Sarande 20 m d'épaisseur) correspondant à trois fois la taille de la membrane. Mettre la membrane sur la cellophane et verser sur la membrane 5ml de SSC 2X. Replier la cellophane sur la membrane et lisser-la avec un papier Gemo. Veiller à ce qu'il n'y ait ni plis ni bulles. Sceller les quatre cotés avec un scelleur. Puis essuyer, afin d'enlever toute trace d'humidité.

9. Placer chaque membrane dans une cassette de Phospholmager en respectant l'alignement par rapport à la grille de la cassette.

10. Exposer entre 18 et 60 heures selon la nature de l'hybridation.

Acquisition des images d'hybridation au Phosprolmager La révélation quantitative des hybridations se fait au moyen d'un scanner Phosphorlmager où les différentes intensités des spots sont converties en données chiffrées (Johntson & al., (1990) Electrophoresis, 11,355-360). Les données issues du Phosphorlmager sont ensuite analysées par le logiciel XdotsReader qui positionne la grille, localise les spots et quantifie les signaux d'hybridation.

Les résultats obtenus pour 3 isolats cliniques, comparés à ceux obtenus avec la souche de référence 2665 sont représentés sur la figure 4 en annexe. Il montrent qu'il est possible de distinguer sans ambiguïté possible les profils d'hybridation des différents isolats.

Les ronds gris recouvrant les triplets d'ORFs indiquent une absence d'hybridation. Les triplets de points noirs en triangle indiquent une hybridation. Les résultats encadrés pour la souche de référence correspondent à des témoins négatifs ou positifs.

Claims (13)

Revendications

1. Procédé pour la préparation d'un ensemble de fragments d'ADN ou leurs produits d'expression permettant le typage des souches d'H. pylori, ledit procédé comprenant les étapes suivantes de : a) préparation de compositions d'ADN génomique d'isolats cliniques, ou de souches d'H. pylori, que l'on peut distinguer notamment soit par leur origine géographique soit par la pathologie particulière qui leur est associée, b) identification d'un ensemble d'ORFs non ubiquistes parmi les ORFs du génome d'une souche d'H. pylori de référence, par comparaison avec l'ADN génomique desdits isolats cliniques ou souches précédemment préparé en a), c) préparation d'une composition comprenant un ensemble d'ORFs identifiées en b), ou leurs fragments, leurs produits d'expression ou des anticorps dirigés contre ces produits d'expression.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la souche de référence est la souche H. pylori 26695.

3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que la composition préparée comprend au moins 2 fragments d'ADN correspondant à 2 ORFs non ubiquistes différentes, leurs produits d'expression ou les anticorps dirigés contre ces produits d'expression, plus préférentiellement au moins 16.

4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la composition comprend 246 fragments d'ADN correspondant à 246 ORFs différentes, leurs produits d'expression ou les anticorps dirigés contre ces produits d'expression.

5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que les 246 ORFs différentes sont les 246 ORFs non ubiquistes identifiées sur la figure 1 en annexe.

6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que les fragments d'ADN, leurs produits d'expression ou les anticorps dirigés contre les produits d'expression de la composition obtenue par le procédé sont immobilisés sur un support approprié, de manière covalente ou non covalente.

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7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que les fragments d'ADN sont immobilisés sous forme de réseaux à des positions prédéterminées.

8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que les positions prédéterminées sont distribuées selon un réseau normé, le réseau étant plus préférentiellement orthonormé.

9. Procédé selon l'une des revendications 6 à 8, caractérisé en ce que le support peut être une puce à ADN, un filtre à haute ou moyenne densité ou une puce à protéine.

10. Procédé selon l'une des revendications 7 à 9, caractérisé en ce que la préparation du réseau est effectuée de manière automatisée au moyen d'un robot approprié.

11. Composition permettant le typage des souches d'H. pylori, comprenant au moins deux fragments d'ADN choisis parmi un ensemble d'ORFs non ubiquistes parmi les ORFs du génome d'une souche d'H. pylori telle que définie selon l'une des revendications 1 à 10.

12. Composition permettant le typage des souches d'H. pylori selon la revendication 11, comprenant au moins deux fragments d'ADN choisis parmi les 246 ORFs non ubiquistes du génome d'une souche d'H. pylori telle qu'identifiée sur la figure 1 en annexe.

13. Procédé permettant le typage moléculaire d'isolats ou de souches d'H. pylori, en particulier d'isolats cliniques desdites souches, ledit procédé comprenant les étapes de a) mise en contact d'une composition selon la revendication 11 ou 12 avec une composition d'acide nucléique comprenant des fragments d'ADN isolés de l'isolat ou de la souche d'H. pylori à typer, et de b) réalisation d'un profil d'hybridation associé audit isolat ou à ladite souche à typer par identification des sondes venant s'hybrider avec les fragments d'ADN isolés.