FR2848669A1 - Procede de mesure d'une quantite de photons proportionnelle a la quantite de photons recus par l'objet et dispositif associe. - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un dispositif de mesure de fluorescence comportant une source émettrice de photons (1) destinée à émettre un faisceau de photons vers un échantillon à analyser, le dispositif comprenant également des moyens de détection (11) d'une lumière de fluorescence émise par l'échantillon en réponse aux photons du faisceau reçus par l'échantillon. Le dispositif comporte en outre des moyens de prélèvement (3) aptes à prélever, au cours de la mesure de fluorescence, une fraction déterminée du faisceau de photons émis par la source de photons, et des moyens de mesure (4) de ladite fraction du faisceau de photons prélevée.L'invention concerne également un procédé capable de fournir une estimation précise et répétable de la quantité de photons envoyés sur l'échantillon pour une mesure donnée et qui utilise le dispositif selon l'invention. Ce procédé comprend au moins une étape de comparaison entre la valeur obtenue par les moyens de mesure (4) et une valeur de référence, cette comparaison donnant une valeur appelée valeur de fluorescence normalisée.

Description

PROCEDE DE MESURE D'UNE QUANTITE DE PHOTONS

PROPORTIONNELLE A LA QUANTITE DE PHOTONS RE US PAR L'OBJET ET DISPOSITIF ASSOCIE

DESCRIPTION

DOMAINE TECHNIQUE

Le procédé et le dispositif selon l'invention ont pour but d'augmenter la précision des 10 systèmes de mesure de la fluorescence, en particulier dans le domaine de la lecture de la fluorescence par microscopie. Le procédé et le dispositif décrits cidessous se rapportent aussi bien à des mesures obtenues 15 par épi-illumination qu'à des mesures provenant d'une excitation par ondes évanescentes, ou à des mesures de fluorescence obtenues par l'intermédiaire d'un guide d'onde. La détection de la fluorescence provenant d'une solution ou d'une surface, que l'on appellera de manière générale " échantillon ", permet d'obtenir des informations sur ladite solution ou ladite surface qui vont être utiles pour l'analyse, la caractérisation ou 25 l'imagerie dudit échantillon. La quantité de lumière de fluorescence réémise par l'échantillon fluorescent dépendra, d'une part, du voisinage de l'échantillon, et d'autre part, du flux de photons d'excitation, ainsi que du spectre dudit flux de photons et de la quantité 30 de photons reçue par l'échantillon. Il convient donc, pour assurer une bonne reproductibilité des mesures, de s'assurer qu'on peut contrôler ces différents paramètres. Dans la plupart des systèmes de mesures de fluorescence, le spectre d'excitation obtenu après 5 filtrage ne fluctue pas ou bien de manière négligeable.

Si on considère un échantillon dans un environnement donné et dans une petite plage de variation du flux d'éclairement (de l'ordre de quelques 10%), la quantité de lumière de fluorescence réémise par l'échantillon 10 sera directement proportionnelle à la quantité de photons d'excitation qui aura atteint ledit échantillon. Pour avoir une bonne estimation du niveau de fluorescence de l'échantillon observé, il faut donc 15 pouvoir relier la quantité de photons arrivant sur le détecteur de fluorescence et la quantité de photons envoyés sur l'échantillon. Or la quantité de photons reçue par l'échantillon varie et les mesures obtenues vont donc être entachées d'erreur. Il faut donc pouvoir 20 contrôler à chaque instant l'exposition de l'échantillon.

ETAT DE LA TECHNIQUE ANTERIEURE

En mesure de fluorescence et en particulier 25 en microscopie de fluorescence, que l'on travaille en excitation par épi-illumination ou par transparence à travers l'échantillon, le contrôle de l'exposition de l'échantillon quand il est pris en compte est fait par une mesure de temps.

En général, on définit un temps d'intégration et on considère que le niveau d'éclairement pendant cette durée est constant.

Dans les systèmes un peu régulés, on mesure 5 le niveau d'éclairement par une acquisition sur un échantillon de référence à un temps donné, ce qui permet de normaliser les mesures.

Mais ce type de correction est très limité si la source, c'est-à-dire la quantité de photons émis, 10 varie pendant le temps d'intégration car alors cette variation ne peut être prise en compte.

Dans d'autres systèmes, on prélève une partie des photons émis par la source à un temps donné 15 et on mesure ce flux lumineux: cette mesure sert de mesure de référence. On considère que ce flux lumineux ne varie pas pendant la mesure de la fluorescence par rapport au moment o on a pris la mesure de référence.

Or cette hypothèse n'est valide que pour des mesures o 20 la répétabilité n'est pas critique, mais est largement insuffisante quand on recherche une répétabilité de l'ordre de 1%, notamment dans le domaine de l'imagerie quand on cherche à corriger des images.

Il ne semble pas qu'on n'ait jamais mesuré, 25 directement par prélèvement et en continu, une valeur proportionnelle au nombre de photons qui atteignent l'échantillon. Aucun des constructeurs actuels de microscopes travaillant en fluorescence ne fournit une mesure proportionnelle au nombre de photons ayant 30 atteint l'échantillon afin de pouvoir corriger les mesures. De même, aucun des scanners de lecture de biopuce actuel (qu'il soit confocal ou non) n'assure ce type de contrôle.

En résumé, dans l'art antérieur, le contrôle du flux lumineux se fait soit par mesure du 5 temps, soit par acquisition sur un échantillon de référence.

Tous les procédés actuellement utilisés ne permettent pas de suivre les fluctuations en temps réel. On peut toujours faire l'hypothèse que 10 l'intensité de la source ne varie pas pendant la mesure effective, mais cette hypothèse n'est pas acceptable quand on veut obtenir des mesures avec une grande précision. Le dispositif et le procédé proposés 15 permettent de s'affranchir des erreurs de mesures liées aux variations d'intensité du dispositif d'éclairage.

EXPOS DE L'INVENTION La solution consiste à prélever une partie 20 du faisceau incident en continu au cours de la mesure, de mesurer cette quantité et de l'utiliser comme compteur de photons afin de savoir exactement quelle quantité de photons est reçue par l'échantillon.

Le but de l'invention est de fournir une 25 estimation précise et répétable de la quantité de photons envoyés sur l'échantillon pour une mesure donnée. Ce but et d'autres encore sont atteints, conformément à l'invention par un dispositif de mesure 30 de fluorescence comportant une source émettrice de photons destinée à émettre un faisceau de photons vers un échantillon à analyser, le dispositif comprenant également des moyens de détection d'une lumière de fluorescence émise par l'échantillon en réponse aux photons du faisceau reçus par celui-ci, caractérisé en 5 ce qu'il comporte en outre des moyens de prélèvement aptes à prélever, au cours de la mesure de fluorescence, une fraction déterminée du faisceau de photons émis par la source de photons, et des moyens de mesure de ladite fraction du faisceau de photons 10 prélevée.

Avantageusement, ledit dispositif de mesure de fluorescence comportera également un objectif de microscope situé entre l'échantillon à analyser et les moyens de détection de la lumière de fluorescence émise 15 par l'échantillon et sur le trajet de la lumière de fluorescence. Avantageusement, les moyens de prélèvement sont une lame semitransparente.

En effet, le faisceau émis par la source 20 n'est, en général, pas parfaitement stable géométriquement dans le temps. Ces petites fluctuations doivent être moyennées et pour tenir compte de ce problème, il est avantageux de prélever un nombre de photons directement proportionnel au nombre total de 25 photons compris dans le faisceau. Une manière de réaliser cette opération consiste à utiliser une lame semitransparente qui réfléchit un pourcentage fixe de l'ensemble du faisceau sur une optique qui focalise l'ensemble de ces photons prélevés sur les moyens de 30 mesure de cette fraction de photons prélevée.

Avantageusement, les moyens de détection de la lumière de fluorescence émise par l'échantillon et les moyens de mesure de la fraction du faisceau de photons prélevée sont choisis parmi le groupe constitué 5 d'un capteur CCD, d'un photomultiplicateur et d'une photodiode. Selon une variante de réalisation, le dispositif de mesure de fluorescence comporte en outre des moyens d'intégration permettant d'intégrer la 10 fraction déterminée du faisceau de photons.

Selon un premier mode de réalisation, lesdits moyens d'intégration comporteront un capteur unitaire qui intègrera l'ensemble de la fraction déterminée du faisceau de photons.

Selon un deuxième mode de réalisation, lesdits moyens d'intégration comporteront un ensemble de capteurs unitaires apte à' fournir une image de la répartition spatiale de la fraction déterminée du faisceau de photons selon une section dudit faisceau.

Selon un autre mode de réalisation, le dispositif de mesure de fluorescence peut comporter des moyens de coupure qui commandent la coupure du faisceau de photons émis à un temps d'intégration donné.

Selon un autre mode de réalisation, le 25 dispositif de mesure de fluorescence comporte en outre des moyens de coupure du faisceau de photons émis à un nombre de photons du faisceau prélevé détectés suffisant. Selon un premier cas, lesdits moyens de 30 coupure agiront sur des moyens d'interruption placés sur le trajet optique de la lumière émise par la source entre la source émettrice de photons et les moyens de prélèvement. Selon un deuxième cas, lesdits moyens de coupure agiront sur des moyens d'interruption de l'alimentation de la source émettrice de photons.

Dans les deux cas, ces moyens de coupure permettront d'interrompre l'émission de la source de photons. Selon un autre cas, lesdits moyens de 10 coupure agiront sur des moyens d'interruption placés sur le trajet optique de la lumière provenant de l'échantillon entre ledit échantillon et les moyens de détection. Selon un deuxième autre cas, lesdits moyens 15 de coupure agiront sur des moyens d'interruption du fonctionnement des moyens de détection.

Dans ces deux cas, ces moyens de coupure permettront d'interrompre la mesure de fluorescence par les moyens de détection.

Avantageusement, les moyens d'interruption de l'émission de la source de photons ou de la mesure de fluorescence seront un obturateur.

Comme la plupart des fluorophores sont sensibles au phénomène de photoextinction, si l'on 25 désire s'affranchir des fluctuations de mesures dues à ce phénomène et ceci afin d'améliorer la précision de l'estimation de la fluorescence de l'échantillon, il convient d'effectuer les mesures à un niveau d'éclairement à peu près constant, et surtout de 30 travailler à quantité de photons intégrés constante.

Pour cela, on a le choix entre travailler à un temps d'intégration fixé ou bien à une quantité de photons fixée. Si l'on travaille à un temps d'intégration fixé, les moyens qui commandent la coupure du faisceau 5 ou de la mesure de la fluorescence par le biais des moyens d'interruption agiront lorsque ledit temps sera atteint. Dans ce cas, on utilisera la mesure obtenue par les moyens d'intégration comme correction pour obtenir une valeur normalisée (on utilisera une des 10 formules présentées plus loin).

Si l'on veut travailler à quantité de photons intégrés constante, les moyens de coupure du faisceau de photons émis comprendront en outre un système de comparaison entre la quantité de lumière 15 intégrée par les moyens d'intégration de la lumière prélevée et un niveau d'éclairement pris comme référence. Quand les deux valeurs seront identiques, les moyens de coupure agiront sur au moins un des moyens d'interruption.

Dans ce cas, pour les formules présentées plus loin, les termes " mesure du moniteur ", " mesure de la référence ", " mesure du moniteur à la référence " sont des constantes qui ne varient pas d'une mesure à l'autre. Dès qu'on a obtenu un ratio 25 donné, on coupe le faisceau d'excitation ou la lumière entrant dans les moyens de mesure de la fluorescence.

Avec un tel dispositif, deux mesures faites sur deux échantillons identiques avec des niveaux d'éclairement à peu près identiques donnent deux 30 valeurs de fluorescence mesurées identiques. On a ainsi automatiquement compensé la variation de lumière par une variation de temps nécessaire pour atteindre la quantité de lumière prélevée requise.

On remarquera qu'il est plus facile, pour assurer la précision du dispositif, d'intégrer une 5 quantité de lumière donnée et de couper le faisceau lumineux dès que cette quantité est intégrée.

Avantageusement, ces moyens d'intégration comprendront un condensateur. En effet, il suffira alors d'utiliser le courant fourni par les moyens de 10 mesure de la lumière prélevée pour charger une capacité et de comparer la charge du condensateur à un seuil fixé pour savoir quand l'échantillon aura reçu la bonne quantité de photons.

Avec ce type de dispositif, on peut ainsi 15 obtenir une répétabilité de mesure meilleure que le 1%.

Ce qui permettra de comparer, en relatif mais avec une très bonne précision, des mesures faites sur le même appareil. Un autre objet de l'invention consiste en un procédé capable de fournir une estimation précise et répétable de la quantité de photons envoyés sur l'échantillon pour une mesure donnée qui utilise le dispositif selon l'invention et qui est caractérisé en 25 ce qu'il comprend au moins une étape de comparaison entre la valeur obtenue par les moyens de mesure de la fraction du faisceau de photons prélevée et une valeur de référence, cette comparaison donnant une valeur appelée valeur de fluorescence normalisée.

Selon un premier cas, cette valeur de référence sera une valeur prédéterminée.

Selon un deuxième cas, cette valeur de référence sera le résultat d'une mesure faite au préalable par les moyens de mesure.

Ainsi, si la mesure de la quantité de 5 photons envoyés sur l'échantillon est connue et si la mesure de la quantité correspondante de photons reçue par le capteur de fluorescence est connue, on peut calculer le niveau de fluorescence de l'échantillon. On peut par exemple retenir comme valeur de fluorescence 10 normalisée une valeur du type mesure de fluorescence ou mesure du moniteur mesure de fluorescence xmesure du moniteur de la référence mesure du moniteur xmesure de la référence Avec: - mesure de fluorescence = valeur fournie par le capteur de fluorescence lors de l'examen de 15 l'échantillon, - mesure du moniteur = valeur fournie par le dispositif de mesure de la lumière prélevée lors de l'examen de l'échantillon, - mesure du moniteur de la référence = valeur fournie 20 par le dispositif de mesure de la lumière prélevée lors de l'examen de l'objet de référence, - mesure de la référence = valeur fournie par le capteur de fluorescence lors de l'examen de l'objet de référence. Le dispositif selon l'invention possède de nombreux avantages. 1l

Tout d'abord, il permet d'améliorer la précision de la mesure de fluorescence d'un échantillon. Supposons que le capteur de signal ou 5 capteur de fluorescence (détecteur CCD par exemple) ait une précision de 1%, que le prélèvement du faisceau direct et sa mesure par le moniteur soient effectués avec une précision de 1% et que le comparateur sur le nombre de photons intégrés ait une répétabilité de 1%. 10 La précision photométrique de l'ensemble sera alors de l'ordre de 3x(0,O1)2 = 0,017 soit une répétabilité de l'ordre de 1,7%, répétabilité qui peut être ramenée à 2% si les mesures de 15 fluorescence ont été faites avec des appareils différents mais qui ont été étalonnés par rapport à la même référence.

Si l'on n'utilise pas ce type de contrôle de la source et qu'on se contente d'un prélèvement du 20 flux avant la mesure ou d'une mesure de référence effectuée avant la mesure, on conserve une valeur de 1% pour la précision de la mesure par le capteur de signal, une valeur de 1% sur la mesure de la référence, mais par contre, on a au moins 3% d'incertitude sur la 25 stabilité de la source et 1% sur le temps d'intégration. Cela conduit à une précision au mieux de l'ordre de /3x (0,01)2 +(0,03)2 =0,035 soit une répétabilité de l'ordre de 3,5% qui ne permet pas une comparaison simple avec des mesures de fluorescence effectuées sur un appareil du même type.

On remarquera qu'on peut encore affiner la 5 précision de la mesure de fluorescence en utilisant un capteur d'imagerie (capteur CCD par exemple) comme dispositif de mesure de la lumière prélevée au lieu d'une photodiode ou d'un photomultiplicateur. En effet, on peut dans ce cas effectuer une mesure du flux 10 intégré pour chaque pixel du capteur de signal.

L'utilisation d'un capteur de signal permettant de réaliser une image du faisceau prélevé devrait permettre de prendre en compte à terme dans la correction l'inhomogénéité du faisceau.

Le dispositif permet aussi de prendre en compte les fluctuations d'intensité de la source d'éclairement en microscopie de fluorescence. On n'a pas besoin d'attendre que le flux de la source de photons (laser ou lampe à arc par exemple) soit 20 complètement stabilisé pour faire des mesures (bien qu'il soit quand même préférable d'attendre).

Un autre avantage de l'invention est qu'avec un système de mesure de l'intensité délivrée sur l'échantillon, on peut facilement calibrer le ratio 25 entre le signal prélevé et le signal envoyé sur l'échantillon. Ensuite, en remplaçant l'échantillon par un objet d'albédo calibrée, on peut calibrer le ratio entre la lumière émise par l'échantillon et la lumière mesurée par le capteur de fluorescence. Avec ces deux 30 calibrations, si on utilise l'invention proposée, la même expérience réalisée sur deux systèmes différents donnera le même résultat.

BREVE DESCRIPTION DES DESSINS

L'invention sera mieux comprise et d'autres avantages et particularités apparaîtront à la lecture de la description qui va suivre, donnée à titre d'exemple non limitatif, accompagnée des dessins annexés parmi lesquels: la figure 1 est un schéma illustrant la mise en oeuvre du dispositif selon l'invention dans le cadre d'une mesure en épifluorescence, - la figure 2 est un schéma illustrant la mise en oeuvre du dispositif selon l'invention dans le cas d'un 15 éclairage par ondes évanescentes.

EXPOS D TAILL DE MODES DE R ALISATION PARTICULIERS Dans la figure 1, un faisceau de lumière provenant d'une source de lumière 1, qui peut être un 20 laser ou éventuellement une lampe à arc, passe à travers un obturateur 2 de la source d'éclairement et arrive sur un système de prélèvement de la lumière 3, qui peut être constitué d'une lame semi-réfléchissante.

Ce dispositif de prélèvement de la lumière 3 partage le 25 faisceau lumineux en deux: une partie du faisceau, le faisceau réfléchi, va illuminer un dispositif de mesure 4 de la lumière prélevée; l'autre partie du faisceau, le faisceau transmis, va aller se réfléchir dans un cube dichroque 7.

Le dispositif de mesure de la lumière prélevée 4 qui reçoit le faisceau réfléchi peut être, par exemple, une photodiode, un photomultiplicateur ou un capteur CCD.

Le dispositif de mesure 4 convertit la lumière en un 5 signal qui va être intégré par un système 5. Cette intégration peut aussi être réalisée directement sur le signal lumineux, par exemple à l'aide d'une caméra CCD ou d'une plaque photographique. Puis, éventuellement, le faisceau pourra arriver dans un dispositif 6 dont la 10 fonction est de couper le faisceau à un temps d'intégration donné ou à un nombre de photons détectés suffisant. Pour cela, ce dispositif de coupure est relié et commande le fonctionnement de deux obturateurs 2 et 10 placés respectivement devant la source 15 lumineuse et devant le capteur de fluorescence. Il est à noter que les deux obturateurs ne sont pas nécessaires: un seul est suffisant.

La partie du faisceau qui arrive sur le cube dichroque 7 va être séparée en deux faisceaux. En effet, le cube 20 dichroque a pour effet de séparer la lumière d'excitation de la lumière de fluorescence. La lumière d'excitation est réfléchie par le cube dichroque, traverse un objectif du microscope 8 et arrive sur l'échantillon 9, qui peut être, par exemple, une puce 25 ADN ayant des marqueurs fluorescents. Cet échantillon va émettre à son tour un faisceau qui va traverser l'objectif du microscope 8, et qui, comme il s'agit d'un faisceau de lumière fluorescente, va traverser le cube dichroque 7 et l'obturateur 10 du capteur de 30 mesure de fluorescence. Ce faisceau transmis arrive enfin sur le capteur de signal ou capteur de fluorescence 11, qui peut notamment être un capteur CCD, une photodiode ou un photomultiplicateur.

Dans la figure 2, on a presque le même 5 montage: un faisceau de lumière provenant d'une source de lumière 21 passe à travers un obturateur 22 de la source d'éclairement et arrive sur un système de prélèvement de la lumière 23, qui partage le faisceau lumineux en deux: une partie du faisceau va être reçue 10 par un système de mesure 24 de la lumière prélevée pour aller dans un système 25 intégrant le signal prélevé dans le faisceau de lumière, puis éventuellement dans un système 26 de coupure du faisceau à un temps d'intégration donné ou à un nombre de photons détectés 15 suffisant, l'autre partie du faisceau va aller se propager dans l'échantillon 29. On va observer les ondes évanescentes provenant de cet échantillon qui traversent l'objectif du microscope 28, l'obturateur 30 du capteur de mesure de fluorescence, et arrive sur le 20 capteur de signal 31.

Dans ces deux figures, les obturateurs 2, 22, 10, 30 peuvent être remplacés par des moyens d'interruption placés directement soit sur la source de 25 photons, soit sur les moyens de détection. Une des possibilités la plus simple peut consister à couper l'alimentation électrique de la source ou des moyens de détection. Une des applications industrielles prometteuses de ce dispositif et de son procédé associé selon l'invention est le développement de lecteurs de puces ADN en épiillumination (cas de la figure 1).

Dans ce système, on lit des séries de puces ADN fluorescentes et les niveaux de fluorescence des 5 différentes puces doivent pouvoir être reliés entre eux.

Claims (18)

REVENDICATIONS

1. Dispositif de mesure de fluorescence 5 comportant une source émettrice de photons (1, 21) destinée à émettre un faisceau de photons vers un échantillon (9) à analyser, le dispositif comprenant également des moyens de détection (11, 31) d'une lumière de fluorescence émise par l'échantillon en 10 réponse aux photons du faisceau reçus par celui-ci, caractérisé en ce qu'il comporte en outre des moyens de prélèvement (3, 23) aptes à prélever, au cours de la mesure de fluorescence, une fraction déterminée du faisceau de photons émis par la source de photons, et 15 des moyens de mesure (4, 24) de ladite fraction du faisceau de photons prélevée.

2. Dispositif selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il comporte en outre un objectif 20 de microscope (8, 28) situé entre l'échantillon à analyser et les moyens de détection (11, 31) sur le trajet de la lumière de fluorescence émise par l'échantillon.

3. Dispositif selon la revendication 1 caractérisé en ce que lesdits moyens de prélèvement (3, 23) sont une lame semi-transparente.

4. Dispositif selon la revendication 1 30 caractérisé en ce que lesdits moyens de détection (11, 31) et lesdits moyens de mesure (4, 24) sont choisis parmi le groupe constitué d'un capteur CCD, d'un photomultiplicateur et d'une photodiode.

5. Dispositif selon la revendication 1 5 caractérisé en ce qu'il comporte en outre des moyens d'intégration (5, 25) permettant d'intégrer la fraction déterminée du faisceau de photons.

6. Dispositif selon la revendication 5 10 caractérisé en ce que les moyens d'intégration (5, 25) comportent un capteur unitaire qui intègre l'ensemble de la fraction déterminée du faisceau de photons.

7. Dispositif selon la revendication 5 15 caractérisé en ce que les moyens d'intégration (5, 25) comportent un ensemble de capteurs unitaires apte à fournir une image de la répartition spatiale de la fraction déterminée du faisceau de photons selon une section dudit faisceau.

8. Dispositif selon la revendication 5 caractérisé en ce qu'il comporte en outre des moyens de coupure (6, 26) du faisceau de photons émis à un temps d'intégration donné.

9. Dispositif selon la revendication 5 caractérisé en ce qu'il comporte en outre des moyens de coupure (6, 26) du faisceau de photons émis à un nombre de photons du faisceau prélevé détectés suffisant. 30

10. Dispositif selon la revendication 8 ou 9 caractérisé en ce que lesdits moyens de coupure (6, 26) agissent sur des moyens d'interruption (2, 22) placés sur le trajet optique de la lumière émise par la 5 source entre la source émettrice de photons (1, 21) et les moyens de prélèvement (3, 23) et permettant d'interrompre l'émission de la source de photons.

11. Dispositif selon la revendication 8 ou 10 9 caractérisé en ce que lesdits moyens de coupure (6, 26) agissent sur des moyens d'interruption de l'alimentation de la source émettrice de photons.

12. Dispositif selon la revendication 8 ou 15 9 caractérisé en ce que lesdits moyens de coupure (6, 26) agissent sur des moyens d'interruption (10, 30) placés sur le trajet optique de la lumière provenant de l'échantillon (9, 29) entre ledit échantillon (9, 29) et les moyens de détection (11, 31) et permettant 20 d'interrompre la mesure de fluorescence par les moyens de détection (11, 31).

13. Dispositif selon la revendication 8 ou 9 caractérisé en ce que lesdits moyens de coupure 25 agissent sur des moyens d'interruption du fonctionnement des moyens de détection (11, 31).

14. Dispositif selon la revendication 10 ou 12 caractérisé en ce que lesdits moyens d'interruption 30 (2, 22; 10, 30) sont un obturateur.

15. Dispositif selon la revendication 5 caractérisé en ce que lesdits moyens de coupure (6, 26) du faisceau de photons émis comprennent en outre un système de comparaison entre la quantité de lumière 5 intégrée par les moyens d'intégration (5, 25) et un niveau d'éclairement pris comme référence.

16. Procédé fournissant une estimation précise et répétable de la quantité de photons envoyés 10 sur l'échantillon pour une mesure donnée qui utilise le dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une étape de comparaison entre la valeur obtenue par les moyens de mesure (4, 24) et une valeur de référence, cette 15 comparaison donnant une valeur appelée valeur de fluorescence normalisée.

17. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que la valeur de référence est une 20 valeur prédéterminée.

18. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que la valeur de référence est une valeur obtenue au préalable par les moyens de mesure 25 (4, 24).