FR2847583A1 - Procede d'oligomerisation de molecules, dispositif de mise en oeuvre dudit procede et utilisation - Google Patents

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Douaa Beggar
Benedicte Dodet
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Michel Meunier
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Abstract

Procédé d'oligomérisation de molécules caractérisé en ce que l'on soumet à un plasma froid ou à un effluent de plasma froid des monomères ou des oligomères de molécules ayant des groupements amine ou carboxyles libres ou susceptibles d'être créés et/ou libérées sous l'action du plasma, et utilisation dudit procédé.

Description

PROCEDE D'OLIGOMERISATION DE MOLECULES,
DISPOSITIF DE MISE EN îEJVRE DUDIT PROCEDE ET UTILISATION
L'invention concerne un procédé d'obtention d'oligomères, notamment d'oligomères protéiques, et la formation de liaisons covalentes entre des monomères ou des oligomères sous l'effet d'un plasma froid ou d'un effluent
de plasma froid.
Un procédé d'oligomérisation de protéines par formation de liaisons covalentes amides obtenues par condensation d'une fonction amine et d'une fonction carboxylique est décrit par Simmons et ai., Protein Science (2002) 11:1558-1564. Suivant ce procédé, les protéines monomères sont lyophylisées, puis placées dans une enceinte de verre sous vide, à une température de 850C et pendant 24h puis réhydratées dans un tampon ou dans de l'eau distillée. Ce procédé en trois étapes est renouvelé plusieurs fois pour obtenir un rendement d'oligomérisation accru pouvant aller jusqu'à 35%, essentiellement sous forme
de dimères.
Toutefois, ce procédé est long à mettre en oeuvre et coteux, et ne permet pas de traiter des protéines thermosensibles. Par ailleurs, de nombreuses études ont été menées visant à mettre en oeuvre les propriétés physicochimiques spécifiques des plasmas hors équilibre thermodynamique dits plasmas "froids". Notamment, des surfaces d'objets divers métalliques ou plastiques tels des films de polymères variés ont été traités par des décharges électriques génératrices de plasmas froids, soit en interaction directe plasma/surface, soit par contact post décharge de l'effluent du plasma avec la surface; suivant les expériences, des ruptures de liaisons et/ou des
agrégations ont été constatées.
Les inventeurs ont eu l'idée de soumettre à un plasma froid ou à un effluent de plasma froid des monomères ou des oligomères de protéines, et ont constaté qu'au lieu d'obtenir les cassures et les réorganisations anarchiques des chaînes principales et latérales de ces oligomères, ils obtenaient un résultat organisé sous forme d'une grande quantité de dimères et d'une proportion minoritaire de trimères. Ils ont également constaté que cette association sous forme dimérique s'effectue par création d'une liaison covalente, de type amide. Ils ont également constaté que ce procédé était applicable non seulement aux chaînes
protéiques, mais aussi à d'autres types de molécules.
A partir de cette constatation, les inventeurs ont mis au point un procédé permettant d'oligomériser rapidement et à moindre cot des monomères ou des
oligomères, sans avoir besoin d'élever la température.
Le but de la présente invention est donc de proposer un procédé d'oligomérisation de molécules caractérisé en ce que l'on soumet à un plasma froid ou à un effluent de plasma froid des monomères ou des oligomères de molécules ayant des groupements amine ou acide carboxylique libres ou susceptibles d'être créés et/ou libérés sous
l'action du plasma.
Suivant différents modes de réalisation de l'invention, ces monomères ou oligomères sont des protéines, des acides nucléiques, des oligosaccharides, des
glycolipides ou un mélange de ceux-ci.
Avantageusement, le procédé selon l'invention est appliqué à des molécules thermosensibles, et notamment des
protéines et des enzymes.
Suivant un mode de réalisation préféré de l'invention, ces protéines sont le lysozyme d'oeuf, la phosphatase alcaline, la béta-galactosidase, la glutamate
deshydrogénase ou un mélange de celles-ci.
Suivant un second mode de réalisation particulier de l'invention, les oligosaccharides sont du
chitosane.
Le plasma froid ou l'effluent de plasma froid utilisé dans le procédé de l'invention est obtenu par déclenchement d'une décharge électrique dans un gaz ou un mélange gazeux. De préférence, cette décharge électrique est obtenue par polarisation d'un jeu d'électrodes métalliques, isolées ou non, baignant dans ledit mélange gazeux. Suivant un mode de réalisation particulier de l'invention, les monomères ou oligomères de molécules peuvent se présenter, préalablement à leur soumission au plasma froid ou à l'effluent de plasma froid, en solution aqueuse, ou en solution organique, ou sous forme de gel ou
sous forme sèche.
Suivant un mode de réalisation préféré de l'invention lorsque les monomères ou oligomères se présentent en solution aqueuse ou sous forme de gel, le milieu dans lequel ils se trouvent est acidifié jusqu'à un pH inférieur à 4 mais supérieur à 1 avant leur soumission au plasma froid ou à l'effluent de plasma froid. Dans ce mode de réalisation, le plasma froid ou l'effluent de plasma froid est obtenu par une décharge électrique appliquée à un gaz ou à un mélange gazeux composé d'oxygène seul ou en combinaison avec de l'azote ou un gaz rare tel que l'argon. De préférence, le mélange gazeux est formé par 98-80 % d'argon ou d'azote et 2-20 % d'oxygène. Dans le cas d'une solution aqueuse, l'acidification peut être obtenue lors de leur soumission au plasma froid ou à l'effluent de plasma froid si le mélange gazeux comprend de l'oxygène et de l'azote. Enfin, lorsque les monomères ou oligomères se présentent en solution organique, l'acidification préalable ou simultanée à l'application du plasma et/ou de ses effluents, n'aura de sens que si cette solution a une base aqueuse; il est à noter qu'en cas de phase organique hydrophobe, le traitement plasma sera possible mais sans
l'apport de l'acidification.
Suivant un autre mode de réalisation de l'invention, lorsque les monomères ou oligomères se présentent sous forme sèche, ils sont soumis à un plasma froid ou un effluent de plasma froid obtenu par une décharge électrique appliquée à un gaz ou à un mélange gazeux composé d'eau et d'oxygène et éventuellement d'azote
ou d'un gaz rare tel que l'argon.
L'invention a également pour objet un dispositif de mise en oeuvre du procédé ci-dessus caractérisé en ce que les électrodes baignées dans le mélange gazeux et générant la décharge électrique génératrice de plasma peuvent présenter en regard des configurations géométriques différentes pointe/plan, multipointes/plan, fil/fil, fil/plan, lame/plan, plan/plan
ou des cylindres coaxiaux.
Le nombre d'électrodes en présence est au minimum de deux; des combinaisons comprenant plus de deux électrodes sont également envisagées. Dans certaines conditions, une ou plusieurs électrodes peuvent être
recouvertes d'un matériau diélectrique.
La tension susceptible d'être appliquée aux électrodes peut être une tension continue positive ou négative, sinusodale, alternative, impulsionnelle, unidirectionnelle ou bidirectionnelle, de préférence avec des fréquences comprises entre le domaine des micro-ondes (classiquement 2,45 GHz) et les fréquences réseau (50 ou 60 Hz), incluant ainsi le domaine des radiofréquences (classiquement 13,56 MHz) et les moyennes fréquences (5 kHz
à 100 kHz).
Suivant un mode de réalisation particulier du dispositif selon l'invention, les électrodes présentent une configuration multipointes/plan et sont espacées de 10 mm, et la tension qui leur est appliquée est une tension continue positive, comprise, à pression atmosphérique,
entre 1 et 20 kV, de préférence entre 5 et 15 kV.
Avantageusement, le plasma hors équilibre thermodynamique, dit plasma froid est obtenu par la combinaison des conditions de pression du gaz et de fréquence du signal d'alimentation électrique, lorsque
celui-ci n'est pas continu.
Suivant un autre mode de réalisation particulier de l'invention, l'une des électrodes est recouverte d'un diélectrique, et la tension appliquée aux électrodes est alors à caractère alternatif. Dans ce cas,
la distance séparant les électrodes peut être nulle.
De préférence, les électrodes métalliques sont en matériau peu sensible à l'oxydation, par exemple l'acier
inoxydable et/ou le rhodium.
Un autre objet de l'invention est l'utilisation du procédé ci-dessus pour la stabilisation de protéines
et/ou la fabrication de protéines actives à effet retard.
De préférence, ces protéines sont des enzymes, des peptides
ou des protéines antigéniques.
Encore un objet de l'invention est l'utilisation du procédé ci-dessus pour la fabrication de
protéines chimères.
L'invention a également pour objet l'utilisation du procédé ci-dessus pour la fixation d'un
film moléculaire uniforme ou de protéines sur un support.
L'invention a également pour objet l'utilisation d'un produit obtenu par le procédé de l'invention pour la fabrication d'une composition pharmaceutique, vaccinale, diététique, agroalimentaire ou cosmétique. Notamment, l'invention a pour objet l'utilisation d'un tel produit pour la fabrication d'un vaccin destiné à empêcher le développement des maladies infectieuses à microorganismes bactériens, viraux ou protistes. D'autres avantages et caractéristiques de
l'invention apparaîtront à la lecture de la description qui
suit, qui illustre non limitativement l'invention.
L'invention a donc pour objet une application particulière des plasmas froids, pour l'oligomérisation de monomères ou de petits oligomères. Plus particulièrement, l'invention a pour objet un procédé tel que, sous l'influence d'un effluent particulier de plasma froid ou d'un plasma froid, des monomères ou oligomères qui y sont
soumis se lient entre eux par des liaisons covalentes.
Dans le cas des protéines, les liaisons covalentes qui se forment sont des liaisons amides. Toutes les molécules qui présentent des fonctions amine ou acide carboxylique libres ou susceptibles d'être créées et/ou libérées sous l'action oxydante du plasma ou de l'effluent de plasma, peuvent former des liaisons covalentes de type amide avec des molécules qui présentent respectivement des fonctions acide carboxylique ou amine libres, ou susceptibles d'être créées et/ou libérées sous l'action oxydante du plasma. Par exemple, on peut lier, conformément au procédé de l'invention, des acides nucléiques présentant des fonctions amine ou acide carboxylique avec des protéines présentant respectivement des fonctions acide carboxylique ou amine. Certains oligosaccharides sont également susceptibles d'être traités par le procédé selon l'invention. Le chitosane, dérivé de la chitine par désacétylation des glucosamines, présente des fonctions amine libres susceptibles de former des liaisons amides avec des molécules complémentaires présentant un groupe carboxyle. Les autres polysaccharides peuvent devenir réactifs lors de l'ouverture de leur cycle et libération de groupements carboxyle sous l'effet du plasma froid ou de
l'effluent de plasma froid.
L'oligomérisation des protéines thermosensibles est particulièrement visée par le procédé selon l'invention, car elle doit s'effectuer dans des conditions de température douces qui sont parfaitement mises en oeuvre par le procédé selon l'invention. En effet, le procédé s'effectue à température ambiante. Il permet d'obtenir des
rendements en dimères/trimères de l'ordre de 25 %.
L'application du plasma froid ou de l'effluent de plasma froid selon le procédé de l'invention sur des monomères uniquement, conduit à des dimères ou des trimères. Son application sur des petits oligomères ou sur un mélange de petits oligomères et de monomères, conduit à
des multimères.
Avantageusement, les molécules soumises au plasma froid ou à l'effluent de plasma froid sont acidifiées, soit avant d'être soumises à l'effluent par l'ajout d'un acide par exemple l'acide nitrique, ou d'autres acides appropriés, soit par l'action même du plasma: on choisit alors un plasma obtenu à partir d'un mélange gazeux contenant un gaz oxydant, notamment l'oxygène et éventuellement un gaz rare; un mélange d'oxygène et d'azote, et de préférence de 2-20 % d'oxygène et de 98-80 % d'azote, conduit à la production d'un effluent de décharge à propriétés potentiellement acidifiantes. L'acidification permet de favoriser l'oxydation et la rupture de liaisons et de ce fait
d'augmenter la réactivité des molécules entre elles.
L'acidification a donc un rôle important sur la cinétique de réaction. De préférence, l'acidification est conduite jusqu'à un pH inférieur à 4. Toutefois, les inventeurs ont montré que l'acidification préalable (par ajout d'un acide choisi) ou simultanée au traitement (par l'effet du plasma d'oxygène et d'azote) de la solution contenant les monomères ou oligomères n'était pas absolument nécessaire; mais il est à noter que l'acidification préalable de la
solution permet d'augmenter le taux de dimères et trimères.
Enfin, les inventeurs ont observé qu'une valeur de pH inférieure à 1 conduisait non pas à une oligomérisation des
protéines, mais au contraire à leur fractionnement.
L'effluent de plasma froid est obtenu par une décharge électrique appliquée à un mélange gazeux à pression atmosphérique, à température ambiante. Le mélange est de préférence composé de 80-98% d'argon et de 220% d'oxygène, mais d'autres mélanges gazeux, notamment d'azote et d'oxygène, peuvent également être appropriés. La décharge électrique est obtenue par polarisation d'un jeu d'électrodes métalliques, isolées ou non, baignant dans ledit mélange gazeux. Elle est appliquée pendant 1 à 30 minutes. A pression atmosphérique, lorsque la tension appliquée au jeu d'électrodes permet l'obtention d'un champ électrique suffisant, à savoir compris entre 1 et 3 MV/m, il se développe dans le volume gazeux des décharges filamentaires impulsionnelles, de type " streamer " qui produisent transitoirement un plasma hors équilibre
thermodynamique dit plasma froid.
Il est nécessaire d'ajuster les conditions de pression (et nature) du gaz et de fréquence du signal d'alimentation électrique lorsque la tension appliquée n'est pas continue, afin de conserver au plasma ses propriétés de plasma froid. Ainsi, une fréquence d'alimentation située dans la gamme des micro-ondes sera généralement associée à une pression de fonctionnement inférieure à 103 Pa. Le domaine des moyennes fréquences (5 kHz - 100 kHz) peut être compatible avec la pression atmosphérique. L'obtention d'un plasma froid est ici garante de la conversion de l'énergie électrique vers la création d'espèces gazeuses réactives, au détriment du chauffage du gaz. Ainsi, le plasma thermique, dont l'arc
électrique est un exemple, est à proscrire.
Suivant un mode de réalisation particulier de l'invention, on utilise un système à barrière diélectrique, dans lequel au moins une des électrodes est recouverte d'un diélectrique pour éviter le passage éventuel à l'arc électrique. Cette particularité impose l'utilisation d'une tension alternative, pour éviter la coupure de la décharge par accumulation de charges sur le diélectrique. Dans le même but, l'utilisation d'impulsions de tension de forte amplitude (jusqu'à 100 kV à pression atmosphérique) et de faible durée (environ 100 ns) permet d'obtenir des courants de décharge élevés sans toutefois dégénérer vers l'arc électrique. Suivant un mode de réalisation préféré de l'invention, on opère à un régime de décharge donné, avec des courants de décharge maximum, car la réactivité conférée au gaz dépend de la charge électrique écoulée dans le volume de décharge et le nombre de liaisons formées
croît proportionnellement à cette charge.
Les matériaux d'électrodes doivent être choisis de façon à éviter les problèmes d'érosion, notamment par impact ionique ou effet thermique et de corrosion chimique par les réactifs créés par la décharge. L'acier inoxydable et le rhodium sont donc des exemples de matériaux préférés
pour la réalisation des électrodes métalliques.
Les molécules à soumettre au traitement peuvent être placées in situ dans l'espace de décharge et ainsi être exposées à tous les produits, chargés et non chargés, du plasma, ou elles peuvent être traitées ex situ, et exposées alors aux seuls effluents non chargés,
électriquement neutres, du plasma.
La composition du milieu gazeux dans le volume de décharge peut être identique ou différente de celle du
milieu gazeux hors décharge.
De préférence, la récupération des molécules
s'effectue très simplement par un lavage à l'eau.
L'invention a également pour objet un dispositif permettant la mise en oeuvre du procédé ci-dessus décrit et notamment la mise en oeuvre ex situ de l'effluent
de plasma froid.
L'invention a encore pour objet l'utilisation du procédé selon l'invention pour créer des molécules chimères. Suivant un mode de réalisation particulier de l'invention, les molécules à traiter sont composées d'un mélange de molécules différentes, et l'application du procédé selon l'invention permet la formation de liaisons il covalentes entre les différentes molécules permettant
l'obtention d'hétérooligomères dites molécules chimères.
L'invention a également pour objet l'utilisation du procédé pour la stabilisation d'enzymes; dans ce but, les monomères à traiter sont des enzymes labiles ou peu stables sous forme de monomères; l'exposition de ces enzymes à un plasma froid ou à un effluent de plasma froid selon le procédé de l'invention, permet la formation de liaisons covalentes entre lesdites enzymes et la formation d'oligomères qui stabilisent la structure protéique, soit vis-à-vis des conditions de température, de pH ou de force ionique, soit vis-à-vis
d'enzymes de dégradation par exemple les protéases.
L'invention a enfin pour objet l'utilisation du procédé pour fixer des protéines sur un support: dans ce but, les éléments de départ sont d'une part un mélange de protéines et d'autre part des chaînes peptidiques greffées à un support et portant des fonctions amines et/ou des fonctions carboxyliques. L'exposition de la solution aqueuse au plasma froid ou à l'effluent de plasma froid selon le procédé de l'invention permet la formation de liaisons covalentes de type amide entre les protéines en
solution et le support.
Exemple unique Une solution aqueuse de lysozyme de blanc d'oeuf est, en vue d'augmenter les surfaces d'échange gaz/liquide, fractionnée en microgouttelettes (d'un volume unitaire de microlitres) et déposée sur une surface lisse et propre constituée par une lame de verre. L'ensemble est soumis pendant 10 minutes aux effluents d'un plasma froid d'argon et d'oxygène (respectivement 80 % et 20 %) produit par décharge électrique entre deux électrodes métalliques, à
pression atmosphérique et à température ambiante.
Ces deux électrodes sont composées d'une électrode de type multipointes polarisée positivement et d'une électrode plane de masse, les deux électrodes étant disposées parallèlement en regard l'une de l'autre. Les deux électrodes sont séparées de 10 mm et il est appliqué une tension continue positive de 10 kV pendant une durée de minutes. Les protéines traitées sont récupérées par un lavage d'eau. La solution aqueuse résultante est analysée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS (Sodium Dodécyl Sulfate) en présence de réducteur. 20 % environ des protéines traitées est alors sous forme dimérique et trimérique.

Claims (23)

REVENDICATIONS
1. Procédé d'oligomérisation de molécules caractérisé en ce que l'on soumet à un plasma froid ou à un effluent de plasma froid des monomères ou des oligomères de molécules ayant des groupements amine ou carboxyles libres ou susceptibles d'être créés et/ou libérées sous l'action
du plasma.
2. Procédé d'oligomérisation de molécules selon la revendication 1, caractérisé en ce que lesdits monomères ou oligomères sont des protéines, des acides nucléiques, des oligosaccharides, des glycolipides ou un mélange de
ceux-ci.
3. Procédé d'oligomérisation de molécules selon la revendication 2, caractérisé en que lesdits monomères ou
oligomères sont des molécules thermosensibles.
4. Procédé d'oligomérisation de molécules selon
l'une quelconque des revendications 2 ou 3, caractérisé en
ce que lesdites molécules sont des protéines choisies dans le groupe comprenant le lyzozyme d'oeuf, la phosphatase alcaline, la bétagalactosidase, la glutamate
deshydrogénase ou un mélange de celles-ci.
5. Procédé d'oligomérisation de molécules selon la revendication 2, caractérisé en ce que lesdits
oligosaccharides sont du chitosane.
6. Procédé d'oligomérisation de molécules selon
l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en
ce que ledit plasma froid ou ledit effluent de plasma froid est obtenu par une décharge électrique déclenchée dans un
gaz ou à un mélange gazeux.
7. Procédé d'oligomérisation de molécules selon la revendication 6, caractérisé en ce que ladite décharge électrique est obtenue par polarisation d'un jeu d'électrodes métalliques, isolées ou non, baignant dans
ledit mélange gazeux.
8. Procédé d'oligomérisation de molécules selon
l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en
ce que lesdits monomères ou oligomères sont, préalablement à leur soumission au plasma froid ou à l'effluent de plasma froid, en solution aqueuse, ou en solution organique, ou
sous forme de gel ou sous forme sèche.
9. Procédé d'oligomérisation de molécules selon la revendication 8, caractérisé en ce que, lesdits monomères ou oligomères en solution aqueuse ou organique ou sous forme de gel sont acidifiés jusqu'à un pH inférieur à 4 mais supérieur à 1 avant leur soumission au plasma froid ou à l'effluent de plasma froid ou lors de leur soumission
au plasma froid ou à l'effluent de plasma froid.
10. Procédé d'oligomérisation de molécules selon la revendication 9, caractérisé en ce que ledit plasma froid ou ledit effluent de plasma froid est obtenu par une décharge électrique appliquée à un gaz ou à un mélange gazeux composé d'oxygène seul ou en combinaison
avec de l'azote ou un gaz rare tel que l'argon.
11. Procédé d'oligomérisation de molécules selon la revendication 10, caractérisé en ce que ledit mélange gazeux est formé par 98-80 % d'argon ou d'azote et
2-20 % d'oxygène.
12. Procédé d'oligomérisation de molécules selon la revendication 8, caractérisé en ce que, lesdits monomères ou oligomères se présentant sous forme sèche sont soumis à un plasma froid ou un effluent de plasma froid obtenu par une décharge électrique appliquée à un gaz ou à un mélange gazeux composé d'eau et d'oxygène et
éventuellement d'azote ou d'un gaz rare tel que l'argon.
13. Dispositif de mise en oeuvre du procédé
selon l'une quelconque des revendications 1 à 12,
caractérisé en ce que les électrodes baignées dans le mélange gazeux et générant la décharge électrique génératrice de plasma présentent en regard des configurations différentes pointe/plan, multipointes/plan, fil/plan, fil/fil, lame/plan, plan/plan,
ou des cylindres coaxiaux.
14. Dispositif selon la revendication 13, caractérisé en ce que la tension appliquée aux électrodes est une tension continue positive ou négative, sinusodale, alternative, impulsionnelle unidirectionnelle ou bidirectionnelle, de préférence à une fréquence comprise entre le domaine des micro-ondes (quelques GHZ) et la
fréquence réseau (50-60 Hz).
15. Dispositif selon l'une quelconque des
revendications 13 ou 14, caractérisé en ce que ledit plasma
hors équilibre thermodynamique, dit plasma froid est obtenu par la combinaison des conditions de pression du gaz et de fréquence du signal d'alimentation électrique, lorsque
celui-ci n'est pas continu.
16. Dispositif selon l'une quelconque des
revendications 13 à 15, caractérisé en ce que l'une
desdites électrodes est recouverte d'un diélectrique.
17. Dipositif selon l'une quelconque des
revendications 13 à 16, caractérisé en ce que lesdites
électrodes sont réalisées en un matériau métallique peu sensible à l'oxydation, par exemple l'acier inoxydable
et/ou le rhodium.
18. Utilisation du procédé selon l'une
quelconque des revendications 1 à 12 pour la stabilisation
de protéines et/ou la fabrication de protéines actives à
effet retard.
19. Utilisation selon la revendication 18, caractérisée en ce que lesdites protéines sont des enzymes,
des peptides ou des protéines antigéniques.
20. Utilisation du procédé selon l'une
quelconque des revendications 1 à 12 pour la fabrication de
protéines chimères.
21. Utilisation du procédé selon l'une
quelconque des revendications 1 à 12 pour la fixation d'un
film moléculaire uniforme ou de protéines sur un support.
22. Utilisation d'un produit obtenu par le
procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12
pour la fabrication d'une composition pharmaceutique,
vaccinale, diététique, agroalimentaire ou cosmétique.
23. Utilisation d'un produit pour la fabrication d'un vaccin destiné à empêcher le développement des maladies infectieuses à microorganismes bactériens,
viraux ou protistes.
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