FR2839081A1

FR2839081A1 - Procede de determination de la presence d'un atnc responsable d'une encephalopathie spongiforme subaigue transmissible

Info

Publication number: FR2839081A1
Application number: FR0205392A
Authority: FR
Inventors: Franck Mouthon; Virginie Nouvel; Jean Philippe Deslys
Original assignee: Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Current assignee: Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date: 2002-04-29
Filing date: 2002-04-29
Publication date: 2003-10-31
Also published as: AU2003249386A8; WO2003093505A2; AU2003249386A1; WO2003093505A3

Abstract

La présente invention porte sur une méthode d'identification de gènes dont le niveau d'expression cellulaire est corrélé à la présence d'un agent transmissible non conventionnel (ATNC), ou d'une forme pathologique d'une protéine prion (PrP). Elle porte en outre sur un procédé de détermination de la présence d'un ATNC responsable d'une Encéphalopathie Spongiforme Subaiguë Transmissible dans un échantillon biologique ainsi que sur un procédé de sélection d'un composé apte à ralentir, stopper ou empêcher le développement d'une ESST. Enfin, sont également visés dans la présente invention, les amorces, les sondes nucléotidiques et les kits pour la mise en oeuvre du procédé de détermination de la présence d'un ATNC.

Description

PROCEDE DE DETERMINATION DE LA PRESENCE D'UN ATNC
RESPONSABLE D'UNE ENCEPHALOPATHIE SPONGIFORME
SUBAIGUË TRANSMISSIBLE La présente invention porte sur une méthode d'identification de gènes dont le niveau d'expression cellulaire est corrélé à la présence d'un agent transmissible non conventionnel (ATNC), ou d'une forme pathologique d'une protéine prion (PrP). Elle porte en outre sur un procédé de détermination de la présence d'un ATNC responsable d'une Encéphalopathie Spongiforme Subaiguë Transmissible dans un échantillon biologique ainsi que sur un procédé de sélection d'un composé apte à ralentir, stopper ou empêcher le développement d'une ESST. Enfin, sont également visés dans la présente invention, les amorces, les sondes nucléotidiques et les kits pour la mise en #uvre du procédé de détermination de la présence d'un ATNC.

Le groupe des Encéphalopathies Spongiformes Subaiguës Transmissibles (ESST) humaines et animales, ou maladies à prions, dont le mode d'apparition peut être infectieux, génétique ou sporadique, sont des affections dégénératives du cerveau caractérisées par l'accumulation d'une protéine de l'hôte, la protéine du prion ou PrP. Ceci se traduit par des lésions de spongiose et de gliose. Les ESST incluent notamment chez l'homme la maladie de Creutzfeldt-Jakob, le syndrome GerstmannStraussler-Scheinker, l'insomnie fatale familiale et sporadique, le kuru et, plus récemment, la nouvelle variante de la maladie de Creutzfeldt-Jakob. Chez l'animal, les ESST comprennent notamment la tremblante du mouton et l'encéphalopathie spongiforme bovine (maladie de la vache folle). Les ESST humaines et animales, naturelles ou expérimentales présentent les caractéristiques communes suivantes :

la période d'incubation asymptomatique est particulièrement longue au regard de la durée de vie des individus de l'espèce considérée, alors même que la phase clinique, qui évolue selon un mode subaigu et qui est le reflet exclusif de l'atteinte nerveuse central, est relativement courte ; les ESST ne présentent aucun des signes cliniques et neuropathologiques rencontrés habituellement dans les viroses lentes du système nerveux central ; la réplication de l'agent transmissible semble échapper au contrôle du système immunitaire.

Ainsi, les ESST peuvent être définies comme des maladies neurodégénératives toujours mortelles, évoluant très lentement, et caractérisées par une très longue période d'incubation asymptomatique. La nature exacte des agents de ces maladies étant toujours inconnue, mais présentant des propriétés différentes des agents microbiens ou viraux connus à ce jour, ils sont nommés dans le présent texte Agent Transmissible Non Conventionnels (ATNC).

Les ATNC sont en outre caractérisés par les propriétés suivantes : - ils ont une taille estimée entre 14 et 40 nm (Alper et al., 1996, BBRC,
22 (3) : 278-284) ; - ils sédimentent dans un gradient de sucrose en premier lieu avec la fraction microsomale (Tamai, Y., 1991, Neurochemistry, In Creutzfeldt-
Jakob disease and other transmissible spongiform encephalopathies.

Mosby/yearBook, Baltimore, Md, pp 97-114) ; - ils présentent une grande résistance aux radiations aux températures élevées et aux protéases (Bockman, J. M. 1991, Physicochemical and biological properties of the transmissible agent, 11-35. In Bastian, F.O.

(Md. ), Creutzfeldt-Jakob disease and other transmissible spongiform encephalopathies. Mosby/yearBook, Baltimore, Md. ).

Les ATNC se propagent de manière interspécifique et intraspécifique. Si la transmission au sein d'une même espèce animale est relativement aisée, la transmission d'une espèce à une autre dépend majoritairement de l'homologie de séquence des gènes codant la PrP du donneur et du receveur.

L'ensemble de ces observations a permis d'étayer l'hypothèse d'une nature protéique de l'ATNC constitué par la protéine PrP. Dans cette hypothèse, la pathogénicité serait acquise par un changement de la structure tridimensionnelle de la PrP sans modification de la séquence primaire. La forme anormale infectieuse ou pathologique de la PrP est encore appelée PrPSc ou PrPRes selon la nomenclature. Les symptômes cliniques de la maladie seraient la conséquence d'une accumulation posttranscriptionnelle d'une protéine neurotoxique répondant à un mécanisme de transconformation, la propagation de la conformation anormale se faisant par contact direct protéine-protéine .

Cependant, les mécanismes de neurodégénérescence pourraient se révéler plus complexes puisque deux études au moins (Büeler et al., 1994, Mol Med. 1(1):19-30; Lasmézas et al., 1997, Science 275: 402-5) ont rapporté clairement une dissociation entre l'accumulation de PrP anormale, les signes anatomo-pathologiques et l'apparition de signes cliniques : les lésions de spongiose et de gliose seraient la conséquence de l'accumulation de la PrP pathologique tandis que la mort neuronale, responsable des signes clinique, aurait une autre cause, potentiellement liée à la réplication des agents responsables des ESST.

Si aucune séquence spécifique n'a été identifiée dans les acides nucléiques qui copurifient avec l'infectiosité, il existe pourtant plusieurs souches d'ATNC.

La nature exacte du support de l'information spécifique de souche reste hypothétique et controversée. S'il s'agit de la PrP anormale elle-même, l'information serait portée exclusivement par les repliements anormaux de la protéine. Dans une autre hypothèse, les ATNC pourraient correspondre à un acide nucléique, protégé par la PrP anormale de l'hôte particulièrement résistante (c'est l'hypothèse du virino). A ce jour, les informations disponibles ne permettent pas de trancher entre l'une ou l'autre des hypothèses.

Le groupe des ESST humaines et animales, ou maladies à prions, constitue un problème de santé publique émergeant majeur compte tenu d'une part du risque iatrogénique en pathologie humaine, et d'autre part de l'impact économique dans le domaine des maladies animales.

Plusieurs approches diagnostiques existent aujourd'hui. La première consiste en la recherche de formes pathologiques de la PrP par des tests immunologiques.

Elles portent en particulier sur la détection immuno-enzymatique de l'accumulation de la protéine PrP sous sa forme partiellement résistante aux protéases, post mortem à partir de prélèvements cérébraux chez l'homme, ou ante mortem à partir de biopsie d'amygdale pour le diagnostic du nouveau variant de la maladie de Creutzfeldt-Jakob (Kascsak et al., 1987 , J Viral 61 : 3688-93 ; Collinge étal., 1997, Lancet 349).

Par ailleurs, différents tests sont aussi actuellement commercialisés en Europe pour le dépistage systématique des bovins de plus de 30 mois. Le test suisse Prionics (WO 9915651) est basé sur une technique de western blot. Le test irlandais (Enfer) (PCT/IE 98/00007) est basé sur une technique Elisa qui est plus adaptée au dépistage à grande échelle. Enfin, le test Français (CEA-BioRad) est basé sur une technique de purification de la forme pathologique de la protéine PrP couplée à une détection Elisa (WO 99/41280, CEA). On remarquera que l'ensemble de ces tests repose

sur la détection directe d'une forme anormale de la protéine prion dans un tissu infecté ou susceptible de l'être.

Ces méthodes sont donc particulièrement invasives, et ne peuvent être pratiquées qu'en dernier recours et aux dépens d'une détection précoce.

Une technique d'électrophorèse capillaire a récemment été décrite permettant de détecter la protéine PrP pathologique dans le sang des moutons (Schmerr étal., 1999, J ChromatogrA 853,207-14).

Cependant, seul un diagnostic sensible des ESST avant l'apparition des premiers symptômes cliniques permettrait de limiter efficacement la propagation des ESST chez les animaux ou de traiter des hommes à un stade précoce de la maladie.

D'autres méthodes proposent la détection inmmuno-enzymatique de protéines présentes dans le liquide céphalo-rachidien telles que la protéine 14-3-3 (WO 9835236, 1998 ; Lee and Harrington, 1996, Lancet. 1996, 348, 887) ou l'Enolase spécifique de Neurones (Zerr et al., 1996, Lancet 348, 846-849 ; Kropp et al., 1999, Neurosci Lett. 261:124-6.). La détection plasmatique et urinaire d'un métabolite du cortisol au cours de la tremblante naturelle du mouton a aussi été décrite (Schlelcher et al., 1999, Endocrinology 140 : 2422-5). Cependant, la détection de ces molécules ne constitue actuellement qu'un élément d'orientation diagnostic et non des marqueurs pathognomoniques de ces maladies.

Par ailleurs, des marqueurs de prédisposition ou de susceptibilité aux ESST ont été identifiés. Leur utilisation reste cependant limitée à l'identification de certains génotypes de la PrP chez l'homme et le mouton.

Enfin, aucun traitement n'est encore disponible pour les ESST. Néanmoins, quelques molécules telles que les Polyanions, le rouge Congo, l'Amphotéricine B et les Anthracyclines sont capables de retarder

l'apparition des signes cliniques et éventuellement de prolonger la durée de vie des animaux infectés expérimentalement (Muller et al., 2000, Mech Ageing Dev 116 :193-218 ; Seman and Adjou, 1999 ; La revue du praticien 49,971-975). De fait, les approches thérapeutiques demeurent limitées, d'une part, par l'absence de diagnostic précoce de la maladie et d'autre part, par le manque de connaissances concernant l'apparition de la maladie et sa propagation.

Il existe donc un réel besoin d'identifier de nouveaux marqueurs moléculaires des ESST, et notamment les gènes dont l'expression est corrélée au développement et à la propagation des ESST. Ces marqueurs seraient utiles non seulement pour l'établissement de nouveaux outils de diagnostic mais aussi pour le criblage de médicaments pour le traitement des ESST.

Une approche pour l'identification de tels marqueurs moléculaires consiste à rechercher les polypeptides présentant des altérations quantitatives ou qualitatives consécutives à l'infection, et identifier leurs gènes.

L'une des approches consiste à rechercher les gènes différentiellement exprimés dans des cellules infectées par un ATNC responsable d'une ESST et dans des cellules non infectées. Pour simplifier la lecture de ce texte, par gènes différentiellement exprimés , on entend un gène dont le niveau d'expression est différent dans une cellule infectée par un ATNC de celui observé dans une cellule non infectée par ledit ATNC.

Des ARNs messagers différentiellement exprimés au cours de l'infection ont été isolés en particulier par hybridation soustractive de banques d'ADNc (Borras T. étal. ; 1986, Arch. Viral. 88 :79-90).

Huit gènes dont l'expression est augmentée dans le cerveau de souris infectées par les ATNC ont aussi été identifiés par la méthode du Differential Display (Dandoy-Dron et al., 2000, Brain Res Mol Brain Res, 76,173-9). Cependant, rien dans ces premières approches ne permet

d'identifier l'un quelconque de ces gènes à un marqueur pathognomonique de la maladie.

Il s'avère donc nécessaire de rechercher l'existence de ces marqueurs identifiables à un stade précoce de l'infection, à partir d'échantillons de cellules ou tissus provenant de prélèvements moins invasifs. La notion même de marqueurs de maladie implique l'existence d'une corrélation entre la présence de ce marqueur et l'état pathologique. En particulier, la guérison ou la réversion d'un état pathologique à un état normal doit s'accompagner de la disparition du ou des marqueurs identifiés.

La présente invention porte sur de tels marqueurs, dont certains correspondent à des gènes codant des protéines référencées dans les bases de données mais jamais évoqués dans les ESST et d'autres ne correspondent à aucune expression connue. L'identification de ces marqueurs résulte d'une adaptation de la méthode RDA à l'identification de gènes dont l'expression cellulaire est corrélée à la présence d'un agent transmissible non conventionnel (ATNC) ou à la présence d'une forme pathologique d'une protéine prion (PrP).

La méthode RDA (Representational Difference Analysis) décrite initialement par Lisitsyn et collaborateurs pour l'analyse de différences entre deux génomes (Lisitsyn et al., 1993, Science 259, 946-51) permet d'identifier des gènes différentiellement exprimés entre deux populations d'ADNc issus de la transcription inverse d'extraits d'ARN messagers de deux échantillons cellulaires à comparer (Hubank et Shatz, 1994, Methods Enzymol 303, 3259).

Il a été constaté que, de manière inattendue, la présente méthode permettait non seulement l'identification de gènes dont la structure était connue mais dont l'expression modifiée au cours de l'infection aux prions n'avait jamais été décrite, mais également, de séquences d'acides

nucléiques dont l'expression est modifiée au cours de l'infection aux prions et dont la structure et la fonction n'avaient jamais été décrites à ce jour.

La présente invention résulte également de l'observation selon laquelle certaines substances sont capables d'inverser le phénotype pathologique des ESST sur un modèle ex vivo (cellules GT1, Schâtzl et al. J Viral 1997 71 : 8821-8821) et que cette réversion est corrélée à une réversion de l'expression desdits gènes à son état normal. Parmi ces substances décrites comme ayant un effet thérapeutique sur les ESST, on peut citer le rouge congo, l'amphothéricine B et plus particulièrement le sulfate de dextran (Caughey et al., 1993, J Viral 67 : 643-650). Par modification de l'expression d'un gène, on entend sa transcription et/ou sa traduction, et/ou les fonctions de son ou ses produits d'expression. Une expression anormale de ces séquences étant corrélée à la présence d'un ATNC ou de la PrP sous sa forme pathologique, l'analyse du niveau d'expression de ces séquences permet ainsi la détermination de la présence d'un ATNC ou d'une forme pathologique d'une PrP, dans un échantillon biologique.

Ainsi, dans un premier aspect, l'invention a trait à une méthode d'identification de gènes dont le niveau d'expression dans des cellules ou tissus est corrélé à la présence ou non dans lesdites cellules ou tissus d'un agent transmissible non conventionnel (ATNC) ou à la présence d'une forme anormale ou pathologique d'une protéine du prion (PrP), ladite méthode comprenant : a) la mise en #uvre de la méthode dite RDA (Representational
Difference Analyse) à partir d'échantillons d'ARN totaux et/ou messagers issus de cellules ou tissus infectés par ledit ATNC et/ou
PrP ; b) l'identification de séquences partielles d'ARN messagers dont le niveau d'expression est augmenté ou diminué dans les cellules ou

tissus infectés par rapport à celui observé dans les cellules ou tissus non-infectés ; c) le criblage de bases de données de gènes et/ou de banque d'ADNc obtenus à partir des mêmes cellules ou tissus, afin d'identifier le gène correspondant aux séquences partielles d'ARN messagers identifiées en b) ; d) le cas échéant, la confirmation de la sous-expression ou de la sur- expression du gène identifié, par exemple, par RT-PCR, réalisée à l'aide d'amorces dont la séquence découle de l'étape c) ; e) le cas échéant, la recherche parmi les séquences identifiées, de celles dont le niveau d'expression redevient normal après traitement des cellules infectées par une substance apte à inverser le phénotype des cellules infectées à celui de cellules saines.

L'identification des ARNm en b) résulte de l'identification de fragments d'ARNm par la méthode RDA appliquée tant aux ARN totaux que messagers.

Dans la présente invention, par l'utilisation du mot gène , il faut comprendre toute séquence d'ADN susceptible d'être transcrite en ARN messager ou comme un précurseur de celui-ci, et, le cas échéant, d'être exprimée sous forme de polypeptide. En particulier, par gène , on entend indifféremment, les séquences codantes d'un gène, contenant les séquences d'exons (ADNc), la phase ouverte de lecture (ORF) comprenant les séquences des introns, ou la combinaison de la phase ouverte de lecture et les séquences promotrices et terminatrices adjacentes, nécessaires à l'initiation et la terminaison de la transcription et de la traduction.

Par expression cellulaire d'un gène , il faut comprendre la synthèse des produits de transcription du gène et la traduction de l'ARN messager correspondant.

Le terme ATNC fait référence à tout Agent Transmissible Non Conventionnel, responsable d'une Encéphalopathie Spongiforme Subaiguë Transmissible. Les propriétés des ATNC ont été décrites plus haut.

Par forme anormale ou pathologique d'une protéine prion , il faut comprendre la conformation d'une protéine prion associée au développement clinique d'une ESST, en particulier, la forme infectieuse de la protéine, aussi appelée PrPSc.

La forme anormale ou pathologique d'une protéine prion encore appelée PrPRes correspond à une protéine d'un faible poids moléculaire résistante aux protéases telles que la protéinase K, même en présence de détergent ionique. Cette propriété semble liée à une forme agrégée présentant une structure amyloïde (empilements de protéines au niveau de feuillets P). La forme anormale s'accumule dans les tissus cérébraux des patients au cours du développement clinique de la maladie.

La forme normale ou PrPc est codée par un gène dont la séquence est très bien conservée chez les mammifères. Un polymorphisme sur le codon 129 (méthionine ou valine) semble associé à une sensibilité à l'infection chez l'homme.

La forme dite anormale ou pathologique est un conformère de la protéine prion PrPc, notamment exprimé à partir du gène cellulaire de la PrPc.

Il est bien entendu que, dans le cadre de la présente invention, un ATNC n'est pas nécessairement uniquement constitué de la forme anormale ou pathologique de la protéine prion, mais pourrait comprendre d'autres facteurs, protéiques, peptidiques, nucléotidiques ou autres, nécessaires en particulier à la réplication et à l'infectiosité de l'agent.

Dans la présente invention, la dite méthode RDA est définie par les étapes suivantes :

1) l'obtention de deux sous-populations d'acides nucléiques représentatives de deux transcriptomes, 2) l'enrichissement des séquences différentiellement exprimées par le couplage d'hybridations soustractives et d'amplifications sélectives des séquences différentiellement exprimées entre les deux populations.

3) Le clonage et l'isolement des séquences enrichies après l'étape 2.

Un protocole spécifique de mise en oeuvre de la méthode RDA est en particulier décrit par Hubank et Schatz (Hubank et Schatz, 1999, Methods Enzymol 303,325-49). Un protocole est aussi décrit dans la partie expérimentale qui suit. Cependant, l'homme du métier saura adapter ce protocole, selon sa pratique et l'évolution des méthodologies de biologie moléculaire, en particulier, celles concernant les procédés d'amplification de séquence d'acides nucléique, de digestion de l'ADN par restriction et ligatures de l'ADN à l'aide de ligase ou de clonage et d'isolement d'acides nucléiques.

Dans un mode préféré de réalisation de la méthode de l'invention, l'étape 1 de la méthode RDA définie ci-dessus est en particulier réalisée par les opérations suivantes : - extraction des ARN des deux populations, - le cas échéant, traitement à la Dnase, et purification des ARN messagers, - rétrotranscription des ARN pour l'obtention d'ADNc double brins, - digestion des ADNc à l'aide d'une enzyme de restriction, telle que Dpnll, - ligation avec des adaptateurs (notés ci-après R), - amplification par PCR à l'aide d'amorces spécifiques des adaptateurs R, - digestion des adaptateurs.

L'étape 2 peut être en outre réalisée par les opérations suivantes : - ligation d'une population d'ADNc amplifiés, dite testeur à l'aide d'amorces notées ci-après J ; - hybridation soustractive par mélange de la population testeur avec l'autre population d'ADNc amplifiés, dite driver en anglais, la quantité d'ADN de population amplifiée driver étant en excès, de préférence d'un facteur 10, par rapport à la quantité d'ADN de population testeur , puis par amplification PCR sélective à l'aide des amorces J.

Dans un mode préféré de mise en #uvre, la méthode d'identification de gènes selon l'invention est caractérisée en ce que les ARN extraits des deux populations de cellules infectées et non-infectées sont des ARN totaux. Il a en effet été constaté que la méthode RDA mise en #uvre à partir d'extraits d'ARN totaux de cellules infectées ou non-infectées permettait l'identification de séquences différentes de celles obtenues par la mise en #uvre de la méthode RDA sur les ARNm.

Les cellules ou tissus choisis pour l'extraction des ARN sont préférentiellement des cellules de mammifères, préférentiellement prélevées de tissus cérébraux.

Les acides nucléiques amplifiés et enrichis par la méthode RDA correspondent théoriquement à des séquences partielles d'ARN messagers dont le niveau d'expression est augmenté ou diminué dans les cellules ou tissus infectés par rapport à celui observé dans les cellules ou tissus noninfectés.

Afin d'identifier le cas échéant les gènes correspondants à ces acides nucléiques, les acides nucléiques peuvent être clonés dans un vecteur, amplifiés et à nouveau purifiés et caractérisés par séquençage.

Les séquences obtenues sont comparées aux séquences disponibles dans les bases de données, telles que GenBank, afin d'identifier les séquences complètes des gènes correspondants et, le cas échéant, la fonction potentielle du produit de ces gènes.

Si aucun gène connu ne correspond à la séquence identifiée par le procédé, il est possible alors, selon les techniques classiques de biologie moléculaire, d'isoler l'acide nucléique contenant le gène ou l'acide nucléique correspondant à la séquence identifiée par criblage d'une banque d'ADN génomique ou banque d'ADNc. Les méthodes de clonage d'un gène ou d'un ADNc par criblage d'une banque d'ADN génomique ou d'ADNc sont en particulier décrites par Sambrook et al., 2001 (Molecular Cloning : A laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor, laboratory press, Cold Spring Harbor, New York).

Ainsi, à chaque séquence partielle d'ARN messager isolé par la méthode RDA, l'homme du métier en déduira aisément la séquence complète du gène correspondant.

Afin de confirmer que le gène identifié est bien différentiellement exprimé entre les deux populations de cellules étudiées, infectées ou non-infectées, on comparera le cas échéant le niveau d'expression du gène dans les deux populations de cellules. Les méthodes de comparaison du niveau d'expression d'un gène sont bien connues de l'homme du métier et incluent notamment le Northern blot, la RT-PCR quantitative ou semi-quantitative ou encore la PCR en temps réel combinée avec la transcription inverse.

La RT-PCR quantitative permet d'évaluer la quantité initiale d'un ARN messager. La RT-PCR semi-quantitative consiste à comparer la quantité de produits d'amplification d'un ARN messager rétro-transcrit spécifique issus de deux populations distinctes par rapport à la quantité de produit d'amplification d'un ARN messager d'un gène standard dont l'expression est connue pour être constitutive. Parmi les gènes

standard utilisés pour la RT-PCR semi-quantitative, le gène codant la GAPDH est classiquement utilisé.

Des méthodes dites de PCR en temps réel pour la quantification des produits d'ADNc amplifiés sont celles utilisant des couples de groupements fluorophores/quenchers telles que le système TaqMan TM commercialisé par ABl#, le système AmpliSensorTM commercialisé par InGen ou encore le système Sunrise TM commercialisé par Oncor# et Appligène#.

Afin de confirmer la corrélation directe entre le niveau d'expression anormal d'un gène et la présence d'un ATNC ou d'une forme pathologique de la protéine prion dans les cellules, la méthode d'identification de gènes de l'invention peut comprendre une étape de recherche parmi les séquences identifiées, de celles dont le niveau d'expression redevient normal après traitement des cellules infectées par une substance apte à inverser le phénotype des cellules infectées à celui de cellules saines (étape (e) cidessus).

Dans un mode de réalisation préféré, une substance apte à inverser le phénotype de cellules infectées à celui de cellules saines est le sulfate de dextran 500 (Caughey et al., 1993, J. Virol. 67 : 643-650). Les inventeurs ont constaté en effet que, dans les modèles cellulaires in vitro, l'administration du sulfate de dextran 500 aux cellules en culture conduit à une disparition de la forme pathologique de la protéine prion dans les cellules. Cet effet est corrélé également dans des modèles in vivo à une augmentation de la durée de vie des animaux et un ralentissement de l'apparition de la forme pathologique de la PrP.

Ainsi, la mise en #uvre du procédé de l'invention décrit ci-dessus a permis d'identifier 116 fragments de gènes dont l'expression anormale (surexpression ou sous-expression) est clairement corrélée à la présence d'un Agent Transmissible Non Conventionnel (ATNC) responsable d'une Encéphalopathie Spongiforme Subaiguë Transmissible dans un échantillon

biologique constitué d'une culture de cellules susceptibles d'être infectées par la protéine prion PrPSc.

Plus précisément, ont été identifiés :
36 fragments de séquences d'acides nucléiques dont l'expression est diminuée à l'occasion d'une infection par un ATNC, dont 12 correspondent à des gènes référencés dans les bases de données (12 gènes différents identifiés) ;
80 fragments de séquences d'acides nucléiques dont l'expression est augmentée au cours de l'infection par un ATNC, dont 51 correspondent à des gènes référencés dans les bases de données (23 gènes différents identifiés).

La réversion phénotypique obtenue par le sulfate de dextran 500 dans un modèle cellulaire ou animal est accompagnée de la réversion de la surexpression ou sous-expression des gènes, dans tous les cas où celle-ci a pu être testée.

L'invention porte également sur tout ou partie d'un groupe d'acides nucléiques utilisables comme marqueurs des ESST, le dit groupe étant constitué par : a) les acides nucléiques choisis parmi SEQ ID NO: 1-116 ; ou, b) les acides nucléiques hybridant dans des conditions stringentes avec les acides nucléiques identifiés en a) L'invention vise également un procédé de détermination de la présence d'un Agent Transmissible Non Conventionnel (ATNC) responsable d'une Encéphalopathie Spongiforme Subaiguë Transmissible dans un échantillon biologique isolé du corps humain ou animal et susceptible d'être infecté par un tel ATNC, ledit procédé comprenant la mise en évidence,

a) d'une sur-expression d'un ou plusieurs gènes, appartenant à un groupe constitué des gènes sur-exprimés dans les cellules ou tissus infectés tels qu'identifiés dans le procédé d'identification de gènes décrit précédemment ; et/ou, b) d'une sous-expression d'un ou plusieurs gènes, appartenant à un groupe constitué des gènes sous-exprimés dans les cellules ou tissus infectés tels qu'identifiés dans le procédé d'identification de gènes décrit précédemment.

Par échantillon biologique , il faut comprendre tout matériel biologique susceptible de contenir des cellules infectées par un ATNC, et en particulier, un échantillon de cellules, de tissus, d'organes, de fluides biologiques tels que le sang, l'urine ou encore le liquide céphalo-rachidien.

Par procédé de détermination de la présence d'un ATNC , il faut comprendre que le procédé permet d'indiquer la présence d'un ATNC dans un échantillon biologique. Cependant, il sera bien sûr tenu compte par l'homme du métier que, comme dans le cas de tout procédé de détection, le procédé de l'invention présente une sensibilité et une spécificité en général inférieures à 100% et variables en fonction des gènes différentiellement exprimés choisis pour sa mise en #uvre. Le procédé permet cependant de trier les échantillons sains des échantillons infectés avec une probabilité d'erreur statistiquement inférieure à celle d'un tri aléatoire.

Pour mettre en évidence une sur-expression ou sous-expression d'un ou plusieurs gènes, on déterminera le niveau d'expression anormale d'un gène par rapport à celui observé dans un échantillon contrôle, dont on sait qu'il n'est pas infecté par un ATNC. En particulier, on déterminera la quantité d'ARN messagers transcrits ou de polypeptides ou protéines traduites à partir du gène à l'aide des méthodes de quantification de produits d'expressions connues de l'homme du métier.

En particulier, un mode de mise en #uvre préféré du procédé de détection décrit ci-dessus comprend la mise en évidence, a) d'une sur-expression d'un ou plusieurs produits d'expression, appartenant à un groupe constitué des produits d'expression des gènes comprenant l'une des séquences d'acides nucléiques suivantes : SEQ ID NO: 1-51, et/ou d'une sur-expression d'un ou plusieurs ARN comprenant une séquence correspondant à l'une des séquences d'acides nucléiques suivantes : SEQ ID NO: 64-92. b) d'une sous-expression d'un ou plusieurs produits d'expression, appartenant à un groupe constitué des produits d'expression des gènes comprenant les séquences d'ADNc suivantes : SEQ ID NO: 52-
63, et/ou d'une sur-expression d'un ou plusieurs ARN contenant une séquence correspondant à l'une des séquences d'acides nucléiques suivantes : SEQ ID NO: 93-116.

Dans un mode de réalisation préféré, les produits d'expression recherchés sont des ARN messagers. Le niveau d'expression des ARN messagers peut en particulier être évalué par RT-PCR.

Afin de pouvoir estimer la quantité relative de chaque transcrit amplifié et de tenir compte de la variabilité de la quantité d'ARN total extrait d'un échantillon à un autre, un contrôle interne est utilisé. Un tel contrôle interne peut être le transcrit du gène GAPDH ou de la ss-actine. L'expression relative (normalisée par rapport au contrôle interne) d'un gène donné, dans un échantillon à tester, est alors comparée par rapport à l'expression relative de ce gène dans des cellules non-infectées.

Plus généralement, toute calibration permettant une évaluation quantitative des transcrits, notamment celles qui éliminent les biais introduits lors des amplifications de transcrits de tailles différentes, peut être valablement utilisée dans cette étape du procédé de l'invention.

Une surexpression (respectivement sous-expression) est mise en évidence lorsque le niveau d'expression relatif dans l'échantillon testé est significativement supérieur (respectivement inférieur) à celui mesuré dans les cellules non-infectées. De préférence, une surexpression (respectivement sous-expression) est mise en évidence lorsque le niveau d'expression relatif dans l'échantillon testé est supérieur d'au moins 10%, et mieux encore, au moins deux fois supérieur (respectivement inférieur) à celui mesuré dans les cellules non-infectées.

Pour la mise en #uvre des RT-PCR, l'homme du métier choisira des amorces hybridant spécifiquement avec les séquences des gènes différentiellement exprimés choisis dans le procédé de l'invention.

En particulier, pour l'amplification quantitative des séquences d'acides nucléiques spécifiques décrites ci-dessus, la RT-PCR peut être réalisée à l'aide d'un couple d'amorces telles que définies ci-après : a) une amorce oligonucléotidique comprenant entre 10 et 50 nucléotides, de préférence entre 15 et 35 nucléotides, caractérisée en ce qu'elle hybride spécifiquement dans des conditions de forte stringence avec l'une des séquences SEQ ID NO: 1-116, et en particulier, l'un des fragments spécifiques de ces séquences ; b) une amorce choisie parmi les amorces suivantes : SEQ ID NO: 117-
190.

Par conditions stringentes ou conditions de forte stringence , on entend les conditions qui permettent l'hybridation spécifique de deux séquences d'ADN simple brin à environ 65 C par exemple dans une solution de 6 x SSC, 0,5% SDS, 5X Denhardt's solution et 100 g d'ADN non spécifique ou toute autre solution de force ionique équivalente et après un lavage à 65 C, par exemple dans une solution d'au plus 0,2 x SSC et 0,1% SDS ou toute autre solution de force ionique équivalente. Les

paramètres définissant les conditions de stringence dépendent de la température à laquelle 50% des brins appariés se séparent (Tm). Pour les séquences comprenant plus de 30 bases, Tm est définie par la relation : Tm = 81,5 + 0,41 (%G + C) + 16,6Log (concentration en cations) - 0,63(% formamide) - (600/nombre de bases). Pour les séquences de longueur inférieure à 30 bases, Tm est définie par la relation : Tm = 4 (G+C) + 2(A+T). Les conditions de stringence peuvent donc être adaptées par l'homme du métier selon la taille de la séquence, la teneur en GC et tout autre paramètre, selon notamment les protocoles décrits dans Sambrook et al., 2001 (Molecular Cloning : A laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor, laboratory press, Cold Spring Harbor, New York).

Naturellement, l'invention porte également sur les amorces telles que définies ci-dessus, utiles dans la mise en #uvre du procédé de détermination de la présence d'un ATNC dans un échantillon biologique.

Dans un autre mode de réalisation du procédé de l'invention, les produits d'expression recherchés sont des polypeptides. Le niveau d'expression des polypeptides peut en particulier être évalué à l'aide d'un test immunologique permettant la reconnaissance spécifique d'un antigène porté par les polypeptides avec un anticorps ou fragment d'anticorps et la quantification du complexe antigène-anticorps formé.

Dans un mode de réalisation préféré, et notamment dans l'objectif de procéder à un diagnostic d'une ESST à partir d'un échantillon biologique isolé du corps humain ou animal, l'échantillon biologique provient de tissus humains, bovins ou ovins. Le procédé de l'invention peut ainsi être appliqué à une méthode de diagnostic in vitro d'une ESST chez l'homme ou l'animal, et notamment de diagnostic de la maladie de Creutzfeldt-Jakob chez l'homme, de l'Encéphalopathie Spongiforme Bovine chez le bovin et de la tremblante chez le mouton.

Dans l'objectif d'une mise en #uvre précoce ou systématique d'un tel procédé, il est préférable que le mode d'extraction d'un échantillon biologique soit peu invasif.

Ainsi, dans un mode de mise en #uvre préféré du procédé, l'échantillon biologique prélevé provient du sang ou des tissus lymphoïdes.

L'invention vise en outre les différents moyens permettant la mise en #uvre du procédé de détermination de la présence d'un ATNC décrit cidessus. Outre les amorces déjà décrites, lesdits moyens comprennent notamment des sondes nucléotidiques pour la mesure des niveaux d'expression des gènes différentiellement exprimés par hybridation avec des extraits d'acides nucléiques.

Les sondes nucléotidiques selon l'invention sont donc d'au moins 50 nucléotides, de préférence d'une taille comprise entre 50 nucléotides et 1000 nucléotides, et mieux d'environ 100 à 300 nucléotides, et hybrident spécifiquement avec l'une des séquences SEQ ID NO: 1-116, de préférence les sondes sont choisies parmi des fragments spécifiques de l'une ou plusieurs des séquences SEQ ID NO: 1-116.

Fait également partie de l'invention, un kit pour la mise en #uvre d'une méthode de détection d'un ATNC responsable d'une Encéphalopathie Spongiforme Subaiguë Transmissible dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend a) soit, au moins un couple d'amorces telles que définies plus haut, approprié pour l'amplification génique d'un fragment nucléotidique spécifique d'un gène ; une sonde nucléotidique appropriée pour hybrider spécifiquement avec l'un des gènes différentiellement exprimés,

b) le cas échéant des réactifs et/ou moyens pour effectuer la polymérisation dudit fragment nucléotidique à partir des amorces nucléotidiques ou des moyens pour effectuer une hybridation de la sonde avec un extrait d'acides nucléiques.

Dans un mode de réalisation préféré, le(s) couple(s) d'amorces ou le(s) sonde (s) choisis permettent l'amplification ou la détection de séquences de gènes humains, bovins ou ovins. Ils sont choisis en particulier parmi les amorces de séquences SEQ ID NOs 117-190, permettant d'amplifier les gènes telles que présentés dans la partie expérimentale.

Avantageusement, l'expression des transcrits correspondant aux gènes différentiellement exprimés est étudiée par hybridation des extraits d'ADNc ou d'ARNm dans des kits constitués de puces à ADN , ou micro-réseaux ou macro-réseaux sur lesquels sont fixées une ou plusieurs sonde(s) spécifique (s) d'un ou plusieurs gène (s) différentiellement exprimé (s) dont l'expression est recherchée.

Par puce à ADN , il faut ainsi comprendre tout type de support permettant la fixation stable d'une quantité d'acides nucléiques, l'hybridation des acides nucléiques fixés sur le support avec une séquence contenue dans un extrait d'ADN ou d'ARN préalablement marqué, puis la quantification de l'hybridation. Les technologies des puces à ADN sont en particulier décrites par Sambrook et al. (voir plus haut).

La puce à ADN permet notamment, en une seule étape, de comparer le niveau d'expression de plusieurs gènes différentiellement exprimés entre deux échantillons (échantillon testé et échantillon contrôle).

L'invention porte donc sur une puce à ADN pour la détermination de la présence d'un ATNC d'une Encéphalopathie Spongiforme Subaiguë Transmissible dans un échantillon biologique, contenant un ou plusieurs acide (s) nucléique(s) choisi (s) parmi les séquences suivantes :

a) SEQ ID NO: 1-116 ; b) un acide nucléique d'au moins 15 nucléotides s'hybridant spécifiquement dans des conditions de forte stringence avec l'une des séquences définies en a) ;ou c) une séquence présentant un pourcentage d'homologie d'au moins 80%, de préférence au moins 90%, avec l'une des séquences définies en a) après alignement optimal.

Le pourcentage d'homologie est évalué à l'aide d'un programme d'alignement optimal de séquence, tel que le programme BESTFIT (Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, GCG) ou encore le programme Clustal w. Ces programmes prennent en compte la dégénération du code génétique sur la 3ème base des triplets, qui n'est pas comptée dans le pourcentage d'homologie. L'homologie de séquence est d'au moins 80%, et de préférence au moins 90%, sur les deux premières bases des triplets et donc sur les acides aminés correspondants.

Il est entendu également ici que ces pourcentages d'homologie ne prennent pas en compte les séquences non traduites, telles certaines des séquences régulatrices de l'expression des gènes.

En particulier, pour la réalisation des puces à ADN selon l'invention, un acide nucléique choisi est un fragment d'une séquence de gène humain, bovin ou ovin.

L'invention porte également sur un kit pour l'identification d'un ATNC responsable d'une Encéphalopathie Subaiguë Spongiforme Transmissible (ESST), caractérisé en ce qu'il comprend : a) un anticorps ou fragment d'anticorps capable de détecter un produit d'expression spécifique d'un gène comprenant l'une des séquences choisies parmi :

i) SEQ ID NO: 1-116 ; ii) une séquence hybridant dans des conditions de forte stringence avec l'une des séquences SEQ ID NO: 1- 116 ; ou, iii) une séquence nucléotidique présentant un pourcentage d'homologie d'au moins 80%, de préférence au moins 90% avec l'une des séquences de SEQ ID NO: 1-116 après alignement optimal ; b) le cas échéant des réactifs pour la détection d'un complexe antigène- anticorps spécifique.

Un mode de réalisation préféré d'un kit selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend un anticorps ou fragment d'anticorps capable de détecter un produit d'expression spécifique d'un gène humain, bovin ou ovin.

Ces kits peuvent notamment comprendre une puce à protéines constituée d'un support sur lequel est fixé un anticorps ou fragment d'anticorps dirigé contre un produit d'expression d'un gène différentiellement exprimé. Les techniques de puces à protéines sont en particulier décrites dans les références suivantes : Emili & Cagney, 2000, Nat. Biotechnol. 18, 393-397 ; MacBeath & Schreiber, 2000, Science 289, 1760-1763 ; Zhu et al., 2000, Nat. Genet. 26, 283-289 ; Holt et al., 2000, Nucleic Acids Res. 28, e72 ; Mahlknecht et al., 2001, J. Biotechnol. 88, 89- 94.

L'invention porte donc sur une puce à protéine pour la détermination de la présence d'un ATNC responsable d'une Encéphalopathie Subaiguë Spongiforme Transmissible (ESST) dans un échantillon biologique, ladite puce à protéine contenant un anticorps ou fragment d'anticorps capable de détecter spécifiquement un produit d'expression de l'une des séquences choisies parmi

a) SEQ ID NO: 1-116 ; b) une séquence hybridant dans des conditions de forte stringence avec l'une des séquences SEQ ID NO: 1- 116 ; ou, c) une séquence nucléotidique présentant un pourcentage d'homologie d'au moins 80%, de préférence au moins 90% avec l'une des séquences de SEQ ID NO: 1-116 après alignement optimal.

Dans un mode de réalisation préféré, une puce à protéine selon l'invention est caractérisée en ce que ledit anticorps ou fragment d'anticorps est capable de détecter spécifiquement un produit d'expression d'un gène humain, bovin ou ovin.

Les séquences identifiées par le procédé de l'invention dont l'expression anormale est corrélée à la présence d'un ATNC ou d'un état pathologique d'une protéine prion dans une cellule constituent évidemment des cibles particulièrement intéressantes dans le cadre de criblage de molécules actives dans le traitement ou la prévention des symptômes liés au développement d'une ESST.

Aussi, l'invention porte sur une méthode de sélection de composés aptes à ralentir, stopper ou empêcher le développement d'une ESST, comprenant a) La culture de cellules infectées par un ATNC responsable de l'ESST, b) la mise en contact de la culture avec un composé candidat ; c) la détermination de l'expression d'un ou plusieurs gènes choisis parmi le groupe des séquences SEQ ID NO: 1-116; et d) la sélection d'un composé capable de diminuer le niveau d'expression d'un ou de plusieurs ARN choisi (s) dansle groupe constitué des ARN contenant une séquence correspondant à l'une des séquences
SEQ ID NO: 1-51 et 64-92 et/ou capable d'augmenter le niveau d'expression d'un ou plusieurs ARN choisi (s) dansle groupe constitué

des ARN contenant une séquence correspondant à l'une des séquences SEQ ID NO: 52-63 et 93-116.

L'invention porte également sur une méthode de sélection d'un composé apte à ralentir, stopper ou empêcher le développement d'une ESST, comprenant a) l'administration d'un composé candidat à un modèle animal infecté par un ATNC ; b) le prélèvement de cellules potentiellement infectées ; c) la détermination de l'expression d'un ou plusieurs gènes choisis parmi le groupe des séquences SEQ ID NO: 1-116 ; et d) la sélection d'un composé capable de diminuer le niveau d'expression d'un ou de plusieurs ARN choisi (s) dansle groupe constitué des ARN contenant une séquence correspondant à l'une des séquences
SEQ ID NO: 1-51 et 64-92 et/ou capable d'augmenter le niveau d'expression d'un ou plusieurs ARN choisi (s) dansle groupe constitué des ARN contenant une séquence correspondant à l'une des séquences SEQ ID NO: 52-63 et 93-116.

Dans le cadre du procédé de sélection de composés selon l'invention, les cellules choisies peuvent être obtenues à partir de tissus d'animaux infectés. Dans un mode de réalisation spécifique du procédé décrit cidessus, les cellules infectées sont des cellules GT-1 (Schâtzl et al., voir supra).

Les exemples et figures ci-après illustrent, sans limiter la portée de l'invention, certains modes de réalisation spécifiques.

LEGENDES DES FIGURES La figure 1 illustre l'effet du sulfate de dextran 500 sur la réversion de l'état pathologique de la protéine PrP résistant exprimées par les cellules GT1, à un état normal, sensible aux protéases.

La figure 2 est un diagramme illustrant les étapes de la méthode RDA de la préparation des ADN tester et driver à la première hybridation soustractive.

La figure 3 est un diagramme illustrant les étapes de la méthode RDA de l'hybridation soustractive à la première amplification sélective.

La figure 4 est un diagramme illustrant les étapes de la méthode RDA de la première amplification sélective au clonage et à l'analyse des produits d'amplification.

La figure 5 est un gel d'agarose représentant la séparation de produits d'amplification issus de la 4ème soustraction de la RDA.

La figure 6 montre les résultats des RT-PCR révélant les niveaux d'expression de certains gènes identifiés par le procédé de l'invention dans les cellules GT-1 infectées ou non infectées par la PrP.

EXEMPLES Mise en évidence de la réversion du phénotype pathologique de la PrP en présence du sulfate de dextran 500 Les cellules non infectées GT1.7 ou infectées avec la souche Chandler, GT K* ont été cultivées en présence de 10 g/ml de sulfate de dextran 500 pendant 4 jours consécutifs, espacées d'un passage cellulaire. Après 11 jours de culture, les protéines et les ARN totaux sont extraits après lyse cellulaire. Le lysat protéique total subit un traitement à la protéinase K (2 g de PK pour 500 g de protéine) 1 heure à 37 C. La présence de la PrPres est ensuite analysée en Western Blot à l'aide d'un anticorps spécifique. Les résultats présentés à la figure 1 montrent que les extraits protéiques correspondant aux cellules non traitées au sulfate de dextran 500 contiennent une forme protéique résistante aux protéases, caractéristique de la protéine prion pathologique. En revanche, les extraits protéiques correspondant aux cellules traitées avec 10 g/ml de sulfate de dextran 500 ne contiennent plus de traces visibles de la présence de protéine prion pathologique. Ces résultats sont conformes à d'autres résultats obtenus avec des substances aptes à inverser le phénotype pathologique des protéines prions.

Identification de séquences d'acides nucléiques dont le niveau d'expression anormal est corrélé à la présence d'une forme pathologique de la protéine prion 1. Matériels 1.1 Les cellules utilisées : 6 flasques de 175 cm2 ont été préparées contenant les cellules non infectées GT1.7.

9 flasques de 175 cm2 ont été préparées contenant les cellules infectées avec la souche Chandler, GT K* (tremblante expérimentale de la souris).

1.2 Les amorces utilisées : R Dpn 24 : 5'-AGC ACT CTC CAG CCT CTC ACC GCA-3' (62 M, 0,5 g/mL) (SEQ ID NO: 191) R Dpn 12 : 5'-GAT CTG CGG TGA-3' (62 M, 0,25ug/uL) (SEQ ID NO: 192) J Dpn 24 : 5'-AGC GAC GTC GAC TAT CCA TGA ACA-3' (62 uM, 0,5 g/ L) (SEQ ID NO: 193) J Dpn 12 : 5'-GAT CTG TTC ATG-3' (62 M, 0,25 g/ L) (SEQ ID N0:194) N Dpn 24 : 5'-AGC CAA CTG TGC TAT CCG AGG GAA-3' (62 M, 0,5ug/uL) (SEQ ID NO: 195) N Dpn 12 : 5'-GAT CTT CCC TCG-3' (62 M, 0,25 g/ L) (SEQ ID N0:196) 1.3 Les enzymes utilisées : Taq DNA polymerase : Taq Qbiogene 15 U/ L (ref #EPTQC200) Dpnll : New England Biolabs 10U/ L (ref # R0543L) T4 ligase: New England Biolabs 400 U/ L (ref #M0202L) 1.4 Kits Universal Riboclone cDNA Synthesis System : Promega (ref#C4360) RNeasy midi kit : (ref#75144) Oligotex direct mRNA mni kit : Qiagen(ref#72022) Quiaquick PCR purification kit : Qiagen(ref#28106) Qiaprep spin miniprep kit : Qiagen(ref#27106) Qiaexll gel extraction kit : Qiagen(ref#20021) MessageClean Kit : Genhunter Corporation (ref#M601 ) TOPO-TA pCR-4 cloning kit : Invitrogen (ref#K458040)

2. Mise en #uvre de la méthode RDA pour l'identification de séquences différentiellement exprimées 2.1 Obtention de deux sous-populations d'acides nucléiques représentatives de deux transcriptomes Les ARN totaux issus de 6 flasques de 175 cm2 de culture de cellules de souris GT1.7 (cellules non infectées) (Schatzl et al., voir supra) et de 9 flasques de 175 cm2 de culture de cellules de souris GT K* (cellules infectées avec la souche Chandler, tremblante expérimentale de la souris) ont été extraits à l'aide du kit Rneasy columns commercialisé par QIAGEN.

Chaque extrait d'ARN a été traité à la DNase (Geneclean, GENE HUNTER), puis les ARN ont été purifiés sur colonne.

Afin d'obtenir un échantillon d'ARN messager séparé des ARN de transferts et des ARN ribosomaux, une partie des échantillons d'ARN totaux a été purifiée à l'aide du Kit Oligotex (QIAGEN).

Quatre microgrammes d'ARN totaux ou messagers purifiés ont ensuite été rétrotranscrits à l'aide du kit Universal Riboclone cDNA synthesis PROMEGA puis purifiés sur colonne PCR (QIAGEN).

Les quatre populations d'ADNc ainsi obtenues (une population issue d'extrait d'ARN totaux de cellules non infectées, une population issue d'extrait d'ARN totaux de cellules infectées, une population issue d'ARN messagers de cellules infectées et une population issue d'ARN messagers de cellules non infectées) ont ensuite été incubées en présence de l'enzyme de restriction Dpnll, puis à nouveau purifiées sur colonne PCR (QIAGEN).

Les adaptateurs R12 et R24 sont ligaturés sur les produits de digestion Dpnll issus des ADNc dérivés des cellules infectées et non-infectées. On procède ensuite pour chacune des populations à une première amplification de 20 cycles dans des conditions standard avec l'amorce R24

comme représentée à la figure 2 (RDA, étape 1). Après purification sur colonne PCR, les adaptateurs sont libérés par digestion Dpnll.

On obtient ainsi deux sous-populations représentatives des transcriptomes de cellules infectées et de cellules non-infectées.

2. 2 Les étapes d'hybridation soustractive et d'amplification sélective La population dite tester est ensuite ligaturée avec les adaptateurs J12 et J24, spécifiques des sites de restriction Dpnll. Environ 0,5 g (1/10 en quantité finale) d'ADNc tester est mélangé avec 5 g (9/10 en quantité finale) d'ADNc driver pour une première hybridation soustractive à l'aide des adaptateurs J.

Les ratios d'ADNc tester/ADNc driver sont de l'ordre de 1:100, 1:5000 et 1:25000 pour les deuxième, troisième et quatrième hybridations soustractives.

Les différents produits de la première hybridation soustractive sont représentés à la figure 3. Une première amplification PCR est réalisée à l'aide des amorces J Dpnll 24 permettant une amplification exponentielle sélective des séquences double-brin uniques, résultat de l'hybridation de séquences de brins complémentaire de l'échantillon testeur. Les opérations d'hybridation soustractive et d'amplification sélective sont répétées pour l'enrichissement des séquences présentes uniquement dans l'échantillon testeur, l'ADN testeur étant lié à l'adaptateur de la série J pour la première amplification et la troisième amplification et à l'adaptateur de la série N pour la deuxième amplification et la quatrième amplification (voir figure 4).

Les produits issus de la quatrième amplification soustractive sont déposés sur gel d'agarose 4%. Les bandes apparentes sur gel, telles que montré à la figure 5, sont ensuite découpées et purifiées à l'aide du kit QIAGEN QIAexll (Qiaexll gel extraction kit, ref#20021). Les fragments d'ADN purifiés sont ensuite clonés et séquences.

Les séquences obtenues ont été comparées aux séquences disponibles dans les banques de données à l'aide du programme BLAST (NCBI).

L'expression différentielle des gènes identifiés a ensuite été confirmée par RT-PCR sur les cellules GT1-7 infectées et non-infectées et pour certains gènes sur les cellules GT1-7 infectées et les cellules GT1-7 infectées traitées au sulfate de dextran 500. La RT-PCR a été réalisée dans les conditions suivantes : Les ARN ont été extraits selon un protocole identique à celui utilisé pour la mise en #uvre de la méthode RDA (décrit plus haut). Les conditions d'amplification sont les conditions standards : 30 à 35 cycles, 45 s de dénaturation à 94 C, 1 minute d'hybridation à 56 C et 45 s d'élongation à 72 C.

Le tableau 1 suivant indique les couples d'amorces utilisés pour l'amplification spécifique de chacun des gènes identifiés.

Tableau 1

<tb>
<tb> Nom <SEP> du <SEP> gène <SEP> Couples <SEP> d'amorces
<tb> utilisées
<tb> GAPDH <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NOS: <SEP> 117 <SEP> et <SEP> 118
<tb> ULIP <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NOS <SEP> : <SEP> 119 <SEP> et <SEP> 120
<tb> Voltage <SEP> gated <SEP> Na <SEP> channel <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NOS <SEP> : <SEP> 121 <SEP> et <SEP> 122
<tb> Transgeline <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NOS <SEP> : <SEP> 123 <SEP> et <SEP> 124
<tb> NaCI <SEP> dépendent <SEP> hight <SEP> affinity <SEP> choline <SEP> transporter <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NOS <SEP> : <SEP> 125 <SEP> et <SEP> 126
<tb> SH2 <SEP> containing <SEP> inositol <SEP> 5 <SEP> phosphatase <SEP> 2 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NOS <SEP> : <SEP> 127 <SEP> et <SEP> 128
<tb> Protein <SEP> disulfide <SEP> isomerase <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NOS <SEP> : <SEP> 129 <SEP> et <SEP> 130
<tb> Prostaglandine <SEP> endoperoxydase <SEP> - <SEP> Synthase <SEP> 1 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NOS <SEP> : <SEP> 131 <SEP> et <SEP> 132
<tb> Plasma <SEP> glutamate <SEP> carboxypeptidase <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NOS <SEP> : <SEP> 133 <SEP> et <SEP> 134
<tb> Phosphodiesterase <SEP> 1a <SEP> calmoduline <SEP> dépendent <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NOS <SEP> : <SEP> 135 <SEP> et <SEP> 136
<tb> Myosine <SEP> light <SEP> chain <SEP> kinase <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NOS: <SEP> 137 <SEP> et <SEP> 138
<tb> Methyl <SEP> CpG <SEP> binding <SEP> protein <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NOS <SEP> : <SEP> 139 <SEP> et <SEP> 140
<tb>

<tb>
<tb> Nom <SEP> du <SEP> gène <SEP> Couples <SEP> d'amorces
<tb> utilisées
<tb> Methionine <SEP> aminopeptidase <SEP> 2 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NOS <SEP> : <SEP> et <SEP> 142
<tb> H <SEP> Protein <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NOS <SEP> : <SEP> 143 <SEP> et <SEP> 144
<tb> Guanine <SEP> Nucleotide <SEP> Binding <SEP> Proteine <SEP> (Gna <SEP> 14) <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NOS <SEP> : <SEP> 145 <SEP> et <SEP> 146
<tb> Fibronectine <SEP> 1 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NOS <SEP> : <SEP> 147 <SEP> et <SEP> 148
<tb> Ferritin <SEP> Heavy <SEP> Chain <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NOS <SEP> : <SEP> 149 <SEP> et <SEP> 150
<tb> Endomucine <SEP> ~~~~~~~~~~ <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NOS <SEP> : <SEP> et <SEP> 152
<tb> Gamma <SEP> Actine <SEP> ~~~~~~~~~~ <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NOS <SEP> : <SEP> 153 <SEP> et <SEP> 154
<tb> Caldesmon <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NOS <SEP> : <SEP> 155 <SEP> et <SEP> 156
<tb> ATP <SEP> Synthase <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NOS <SEP> : <SEP> 157 <SEP> et <SEP> 158
<tb> 26S <SEP> protease <SEP> - <SEP> ATPase <SEP> ~~~~~~~~~~ <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NOS <SEP> : <SEP> 159 <SEP> et <SEP> 160
<tb> RBM3 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NOS <SEP> : <SEP> 161 <SEP> et <SEP> 162
<tb> ERGIC <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NOS <SEP> : <SEP> 163 <SEP> et <SEP> 164
<tb> TCP1 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NOS <SEP> : <SEP> 165 <SEP> et <SEP> 166
<tb> Serin/threonin <SEP> protein <SEP> phosphatase <SEP> type <SEP> 1 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NOS <SEP> : <SEP> 167 <SEP> et <SEP> 168
<tb> POPEYE <SEP> protein <SEP> 1 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NOS <SEP> : <SEP> 169 <SEP> et <SEP> 170
<tb> Neurexine <SEP> 1 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NOS <SEP> : <SEP> 171 <SEP> et <SEP> 172
<tb> Myelin <SEP> Factor3 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NOS <SEP> : <SEP> 173 <SEP> et <SEP> 174
<tb> Hcn <SEP> 1 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NOS <SEP> : <SEP> 175 <SEP> et <SEP> 176
<tb> CAGF9 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NOS <SEP> : <SEP> 177 <SEP> et <SEP> 178
<tb> Astrotactine <SEP> ~~~ <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NOS <SEP> : <SEP> 179 <SEP> et <SEP> 180
<tb> T <SEP> complex <SEP> polypeptide <SEP> 1 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NOS <SEP> : <SEP> 181 <SEP> et <SEP> 182
<tb> TRAP <SEP> 240 <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NOS <SEP> : <SEP> 183 <SEP> et <SEP> 184
<tb> Secretogranin <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NOS <SEP> : <SEP> 185 <SEP> et <SEP> 186
<tb> Stathmin <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NOS <SEP> : <SEP> 187 <SEP> et <SEP> 188
<tb> Aczonine <SEP> ~~~ <SEP> ~~~~~~~~ <SEP> SEQ <SEP> ID <SEP> NOS <SEP> : <SEP> 189 <SEP> et <SEP> 190
<tb>
Les produits PCR obtenus ont été semi-quantifiés sur gel d'agarose en se rapportant au gène GAPDH dont l'expression est constitutive. La figure 6 illustre les résultats obtenus avec les gènes codant la Gna14, la transgéline, l'astrotactine et la secretogranine II.

3. Résultats 116 clones ont été identifiés à l'issue de l'application de la méthode RDA aux cellules GT1-7 infectées ou non-infectées correspondant aux séquences SEQ ID NO: 1-116.

Parmi ces 116 clones, ont été identifiés 23 gènes connus et 29 fragments d'acides nucléiques inconnus, surexprimés dans les cellules infectées, 12 gènes connus et 24 fragments de séquences de gènes inconnus, sousexprimés dans les cellules infectées.

Le tableau 2 résume les principaux résultats obtenus, en particulier les noms des gènes identifiés, et la confirmation par RT-PCR de leur expression anormale dans les cellules infectées et/ou de la réversion de leur phénotype d'expression après traitement au sulfate de dextran 500.

La mise en #uvre de la méthode selon l'invention a permis en particulier d'identifier 12 gènes de séquences connues dont le niveau d'expression est diminué dans des cellules exprimant la forme pathologique de la PrP et 23 gènes de séquences connues dont le niveau d'expression est augmenté dans des cellules exprimant la forme pathologique de la PrP.

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<tb> NB <SEP> gènes <SEP> Espèce <SEP> Rôle <SEP> Physiologique <SEP> RDA <SEP> Confirmation <SEP> RT-PCR <SEP> sur <SEP> Confirmation <SEP> RT-PCR <SEP> sur
<tb> gènes <SEP> Espèce <SEP> Rôle <SEP> Physiologique <SEP> m/t <SEP> Taille <SEP> cellules <SEP> Infectées <SEP> versus <SEP> cellules <SEP> Infectées <SEP> versus
<tb> 1 <SEP> (1) <SEP> ~~~~~~~~~~~~ <SEP> non <SEP> Infectées <SEP> (2) <SEP> traitées <SEP> DEXTRAN <SEP> 500
<tb> 1 <SEP> ERGIC <SEP> Rat <SEP> Transport <SEP> du <SEP> RE <SEP> vers <SEP> le <SEP> Golgi <SEP> T <SEP> 188pb <SEP> OUI <SEP> OUI
<tb> 2 <SEP> Fibronectin <SEP> Rat <SEP> Matrice <SEP> extra-cellulaire/Croissance <SEP> axonale <SEP> T <SEP> 170pb <SEP> /309/317 <SEP> pb <SEP> OUI <SEP> OUI
<tb> 3 <SEP> Gamma <SEP> Actine <SEP> Souris <SEP> Cytosquelette <SEP> T <SEP> 221 <SEP> pb <SEP> NC <SEP> NC
<tb> 4 <SEP> RBM3 <SEP> Souris <SEP> Cold <SEP> shock <SEP> protein/ <SEP> Chaperonne <SEP> T <SEP> 108 <SEP> pb <SEP> OUI <SEP> NC <SEP>
<tb> 5 <SEP> Voltage <SEP> gated <SEP> Na <SEP> Channel <SEP> Souris <SEP> Synapse <SEP> / <SEP> Ataxie <SEP> lors <SEP> de <SEP> mutation <SEP> T <SEP> 183/201/240/282/235 <SEP> pb <SEP> OUI <SEP> OUI
<tb> 6 <SEP> 26 <SEP> S <SEP> Protéase <SEP> ATPase <SEP> Souris <SEP> Protéasome/apoptose <SEP> et <SEP> amyloïde <SEP> T <SEP> 225pb <SEP> NC <SEP> NC
<tb> 7 <SEP> Ulip <SEP> Souris <SEP> Croissance <SEP> axonale <SEP> T <SEP> 244 <SEP> pb/253 <SEP> pb <SEP> OUI <SEP> NC
<tb> 8 <SEP> Caldesmon-1 <SEP> Rat <SEP> Protéine <SEP> associée <SEP> aux <SEP> membranes <SEP> des <SEP> vésicules <SEP> synaptiques <SEP> / <SEP> 255/265 <SEP> pb <SEP> OUI <SEP> NC
<tb>

... ; # ~~~~~~ Fixation F-actine/tubuline 255/265 pb OU! NC methionine amtnopeptfdase ##############'##"-##-######## ### #-~~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~~~

<tb> methionine <SEP> aminopeptidase <SEP> Souris <SEP> Chaperonne <SEP> /initiation <SEP> de <SEP> la <SEP> transcription <SEP> T <SEP> 255 <SEP> pb <SEP> OUI <SEP> OUI
<tb> 10 <SEP> Protéine <SEP> disuifide <SEP> Isomerase <SEP> Souris <SEP> Chaperonne/ <SEP> Reponse <SEP> à <SEP> l'hypoxie <SEP> et <SEP> antipopotique <SEP> T <SEP> 246 <SEP> pb <SEP> OUI <SEP> OUI
<tb>

Phosphodiesterase Souris , , Calmodullne dépendante Souris Transduction du signal 271 OUI Calmoduline dépendante Souns ~~~~~~~ Transduction du signa! T 271 pb OU! NC 12 SH2-Containing inositol-5 Transduction du signal #### #.~~~~~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~~~~~~~ -phosphatase 2 Souris Transduction du signât T 283 pb OUi OUI 13 NaCi Dépendent High Affinity, , , #### ~~~~~~.~~~~~~~~~ ~~~~~~~"'~~~~~~~

<tb> Choline-transporter <SEP> Souris <SEP> Transport <SEP> de <SEP> la <SEP> choline/ <SEP> augmenté <SEP> dans <SEP> Alzheimer <SEP> T <SEP> 289/329 <SEP> pb <SEP> OUI <SEP> OUI
<tb> Choline <SEP> transporter
<tb> 14 <SEP> Transgellne <SEP> Souris <SEP> architecture <SEP> de <SEP> la <SEP> synapse <SEP> m <SEP> 227 <SEP> pb <SEP> OUI <SEP> NC
<tb>

Phosphodiesterase 1a Transduction du signal ### #####'P ~~~~~ ~~~~~~OUi~~~~~~ Calmoduline dépendante ~~~~~~~~~~~Transduction du signal m 271 pb OU!

<tb> Kinase <SEP> Cytosquelette <SEP> m <SEP> 231 <SEP> pb <SEP> OU! <SEP> NC
<tb>

nase 16 Methyl-CpG btnding#####""#:######################-##-#############################~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ do:::I;:;:ti:I:d1) Souris Régulation transcrit ion 252 OUI domaine protein 1 (Mbdl) " "" Régulation transcritpion m 252 pb OU! ni 17 ATP synthase H+ , " ATP synthase FO Homme Chaine respiratoire m 140/250 pb NC NC

<tb> 5 <SEP> Voltage <SEP> gated <SEP> Na <SEP> Channel <SEP> Souris <SEP> Synapse <SEP> / <SEP> Ataxie <SEP> lors <SEP> de <SEP> mutation <SEP> m <SEP> 240pb <SEP> OUI <SEP> OUI
<tb> 8 <SEP> Caldesmon-1 <SEP> Rat <SEP> Protéine <SEP> associée <SEP> aux <SEP> membranes <SEP> m <SEP> 265 <SEP> pb <SEP> OUI <SEP> NC
<tb> Plasma <SEP> des <SEP> vesicules <SEP> synaptiques <SEP> / <SEP> Fixation <SEP> F-actine/tubuline <SEP> OUI
<tb>

18 Plasma Glutamate Souris Métabolisme du Glutamate m 272/285pb OUI OUI Carbox e tidase "" ~~~~~~~~~Métabolisme Glutamate 272/285pb OU)t')! Guanine nucleotide binding , " ### ############## .~~~~~~~~~~~~~~~ 19 oroteln aloha 14/Gna141 Souris Protéine G transduction du signal par Ca2+ 2871296/308 OUI NC ~~protein.a)pha14(Gna14) q / transduction du signai par Ca2+ m 287/296/308 pb OU)

<tb> 20 <SEP> Ferritin <SEP> Heavy <SEP> Chain <SEP> (Fth) <SEP> Souris <SEP> Stockage <SEP> du <SEP> fer <SEP> m <SEP> 312 <SEP> pb <SEP> OUI <SEP> NC
<tb> 21 <SEP> Prostaglandine- <SEP> Souris <SEP> Voies <SEP> de <SEP> Leukotriène/inflammation <SEP> m <SEP> 312 <SEP> pb <SEP> OUI <SEP> NC
<tb> Endoperoxide <SEP> Synthase <SEP> Souris <SEP> Augmentation <SEP> dans <SEP> Alzheimer <SEP> m <SEP> 254 <SEP> pb <SEP> OUI
<tb> 22 <SEP> H-Protein <SEP> Rat <SEP> Élément <SEP> du <SEP> complexe <SEP> mitochondriale <SEP> Glycine <SEP> Décarboxylase <SEP> m <SEP> 539 <SEP> pb <SEP> OUI <SEP> OUI
<tb> 23 <SEP> Endomucin <SEP> Souris <SEP> Matrice <SEP> extra-cellulaire <SEP> m <SEP> 250 <SEP> pb <SEP> OUI <SEP> NC
<tb>

es

0 14-0 ns les cellules infe

<0 -0 Gènes sous-exprimés

<tb> RDA <SEP> Confirmation <SEP> RT-PCR <SEP> sur <SEP> Confirmation <SEP> RT-PCR <SEP> sur
<tb> NB <SEP> gènes <SEP> Espèce <SEP> Rôle <SEP> Physiologique <SEP> RDA <SEP> Taille <SEP> cellules <SEP> Infectées <SEP> versus <SEP> cellules <SEP> infectées <SEP> versus
<tb> ~~~~~~~~~~~~~~~~ <SEP> ~~~~ <SEP> > ~~~~~~~~~~~ <SEP> non <SEP> Infectées <SEP> traitées <SEP> DEXTRAN <SEP> 500
<tb> 1 <SEP> Neurexin <SEP> Rat <SEP> Architecture <SEP> de <SEP> la <SEP> synapse/interaction <SEP> T <SEP> 290 <SEP> pb <SEP> OUI <SEP> NC
<tb> Matrice <SEP> extracellulaire <SEP> oul
<tb> 2 <SEP> T-complex <SEP> polypeptide <SEP> 1(Tcp-1) <SEP> Souris <SEP> Chaperone <SEP> du <SEP> cytosquelette <SEP> T <SEP> 252 <SEP> pb <SEP> NC <SEP> OUI
<tb> Myelin <SEP> expression <SEP> Souris <SEP> Protéine <SEP> neuronale <SEP> fonction? <SEP> T <SEP> 254 <SEP> pb <SEP> OUI <SEP> OUI
<tb> Factor-3-like <SEP> protein <SEP> oui
<tb> 4 <SEP> Aczonin <SEP> Souris <SEP> Architecture <SEP> de <SEP> la <SEP> synapse/ <SEP> Trafic <SEP> des <SEP> vésicules <SEP> T <SEP> 284 <SEP> pb <SEP> NC <SEP> NC
<tb> Hyperpolarisation <SEP> Cyclic <SEP> Souris <SEP> Transduction <SEP> du <SEP> signal <SEP> T <SEP> 350 <SEP> pb <SEP> OUI <SEP> NC
<tb>

nueleotide çiated 1 Hcn-1 Thyrold hormone

<tb> 6 <SEP> Thyroid <SEP> hormone <SEP> Homme <SEP> Régulation <SEP> de <SEP> la <SEP> transcription <SEP> m <SEP> 206 <SEP> pb <SEP> OUI <SEP> NC
<tb>

receptor-associeted 1 uro e serlne/threonlne protein,

<tb> 7 <SEP> serine/threonine <SEP> protein <SEP> Souris <SEP> Transduction <SEP> du <SEP> signal <SEP> m <SEP> 175 <SEP> pb <SEP> OUI <SEP> NC
<tb> 8 <SEP> Stathmin <SEP> Souris <SEP> Differenciation <SEP> cellulaire/voies <SEP> de <SEP> Phosphorylation <SEP> m <SEP> 235 <SEP> pb <SEP> OUI <SEP> NC
<tb> 9 <SEP> Secretogranin <SEP> Il <SEP> Souris <SEP> Organisation <SEP> de <SEP> la <SEP> synapse/trafic <SEP> des <SEP> vesicules <SEP> m <SEP> 303 <SEP> pb <SEP> OUI <SEP> NC
<tb> 10 <SEP> CAGF9 <SEP> homme <SEP> extention <SEP> polyglutamine <SEP> /huntington <SEP> m <SEP> 331 <SEP> OUI <SEP> NC
<tb> 11 <SEP> Popeye <SEP> protein <SEP> Souris <SEP> Protéine <SEP> transmembranaire <SEP> / <SEP> m <SEP> 248 <SEP> pb <SEP> OUI <SEP> OUI
<tb> Popeye <SEP> protein <SEP> oouns <SEP> interaction <SEP> avec <SEP> cytosquelette <SEP> pD <SEP> nh <SEP> uul <SEP> ni <SEP> oul <SEP> r\i <SEP>
<tb> 12 <SEP> Astrotactin <SEP> Souris <SEP> Croissance <SEP> axonale <SEP> et <SEP> interaction <SEP> avec <SEP> la <SEP> glie <SEP> m <SEP> 361 <SEP> pb <SEP> OUI <SEP> OUI
<tb>
ar PT-PCR

-S con

-<t) ? - A sur ARN m A sur ARN tot kpression diff@@ pas encore

Ô su ï "II S 3 - N@

Claims

REVENDICATIONS 1. Méthode d'identification de gènes dont le niveau d'expression dans des cellules ou tissus est corrélé à la présence ou non dans lesdites cellules ou tissus d'un agent transmissible non conventionnel (ATNC), notamment à la présence d'une forme normale ou pathologique d'une protéine du prion (PrP), ladite méthode comprenant : a) la mise en oeuvre de la méthode dite RDA (Representational Différence Analysis) à partir d'échantillons d'ARN totaux et/ou messagers issus de cellules ou tissus infectés par ledit ATNC et/ou PrP ; b) l'identification de séquences partielles d'ARN messagers dont le niveau d'expression est augmenté ou diminué par rapport à celui observé dans les cellules ou tissus non-infectés ;

c) le criblage de bases de données de gènes et/ou de banque d'ADNc obtenus à partir des mêmes cellules ou tissus, afin d'identifier le gène correspondant aux séquences partielles d'ARN messagers identifiées en b) ; d) le cas échéant, la confirmation de la sous-expression ou de la sur-expression du gène identifié, par exemple, par RT-PCR réalisée à l'aide d'amorces dont la séquence découle de l'étape c) ; e) le cas échéant, la recherche parmi les séquences identifiées, de celles dont le niveau d'expression redevient normal après traitement des cellules infectées par une substance apte à inverser le phénotype des cellules infectées à celui de cellules saines.

<Desc/Clms Page number 37>

2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que la méthode

RDA est mise en #uvre à partir d'échantillons d'ARN totaux.

3. Méthode selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce qu'une substance apte à inverser le phénotype de cellules infectées à celui de cellules saines est le sulfate de dextran 500.

4. Procédé de détermination de la présence d'un Agent Transmissible

Non Conventionnel (ATNC) responsable d'une Encéphalopathie

Spongiforme Subaiguë Transmissible dans un échantillon biologique isolé du corps humain ou animal et susceptible d'être infecté par un tel ATNC, ledit procédé comprenant la mise en évidence, a) d'une sur-expression d'un ou plusieurs gènes, appartenant à un groupe constitué des gènes sur-exprimés dans les cellules ou tissus infectés tels qu'identifiés dans le procédé selon l'une quelconque des revendication 1 à 3 ; b) d'une sous-expression d'un ou plusieurs gènes, appartenant à un groupe constitué des gènes sous-exprimés dans les cellules ou tissus infectés tels qu'identifiés dans le procédé selon l'une quelconque des revendication 1 à 3.

5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en évidence, a) d'une sur-expression d'un ou plusieurs produits d'expression, appartenant à un groupe constitué des produits d'expression des gènes comprenant l'une des séquences d'acides nucléiques suivantes : SEQ ID NO: 1-51 et/ou d'une sur- expression d'un ou plusieurs ARN comprenant une séquence correspondant à l'une des séquences suivantes : SEQ ID NO:

64-92 ;

<Desc/Clms Page number 38>

b) d'une sous-expression d'un ou plusieurs produits d'expression, appartenant à un groupe constitué des produits d'expression des gènes comprenant les séquences d'ADNc suivantes : SEQ

ID NO: 52-63 et/ou d'une sur-expression d'un ou plusieurs ARN contenant une séquence correspondant à l'une des séquences d'acides nucléiques suivantes : SEQ ID NO: 93-116.

6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que les produits d'expression sont des ARN messagers.

7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le niveau d'expression des ARN messagers est évalué par RT-PCR.

8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la RT-PCR est réalisée à l'aide des amorces selon l'une quelconque des revendications 13 à 15.

9. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que les produits d'expression sont des polypeptides.

10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que le niveau d'expression des polypeptides est évalué à l'aide d'un test immunologique permettant la reconnaissance spécifique d'un antigène porté par les polypeptides avec un anticorps ou fragment d'anticorps et la quantification du complexe antigène-anticorps formé.

11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 10, caractérisé en ce que l'échantillon biologique provient de tissus humains, bovins ou ovins.

<Desc/Clms Page number 39>

12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 11, caractérisé en ce que l'échantillon biologique provient du sang ou des tissus lymphoïdes.

13. Amorce oligonucléotidique comprenant entre 10 et 50 nucléotides, de préférence entre 15 et 35 nucléotides, caractérisée en ce qu'elle hybride spécifiquement dans des conditions de forte stringence avec l'une des séquences SEQ ID NO : 1-116.

14. Amorce oligonucléotidique selon la revendication 13, caractérisée en ce qu'elle consiste en un fragment de l'une des séquences SEQ ID

NO: 1-116.

15. Amorce oligonucléotidique, selon l'une des revendications 13 ou 14, choisie parmi l'une des séquences SEQ ID NO: 117-190.

16. Sonde nucléotidique d'au moins 50 nucléotides, de préférence d'une taille comprise entre 50 nucléotides et 1000 nucléotides, et mieux d'environ 100 à 300 nucléotides, hybridant spécifiquement avec l'une des séquences SEQ ID NO: 1-116.

17. Sonde nucléotidique selon la revendication 16, caractérisée en ce qu'elle consiste en un fragment spécifique de l'une des séquences

SEQ ID NO: 1-116.

18. Kit pour la mise en #uvre d'une méthode de détermination de la présence d'un ATNC responsable d'une Encéphalopathie

Spongiforme Subaiguë Transmissible dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend a) soit, au moins un couple d'amorces selon l'une des revendications 13 à 15, approprié pour l'amplification génique

<Desc/Clms Page number 40>

d'un fragment nucléotidique spécifique d'un gène ; une sonde nucléotidique selon l'une des revendications 16 ou 17 ; et, b) le cas échéant des réactifs et/ou moyens pour effectuer la polymérisation dudit fragment nucléotidique, à partir des amorces nucléotidiques ou des moyens pour effectuer une hybridation de la sonde avec un extrait d'acides nucléiques.

19. Kit selon la revendication 18, caractérisé en ce que le(s) couple(s) d'amorces ou le(s) sonde (s) permettent l'amplification ou la détection de séquences de gènes humains ou animaux, notamment bovins ou ovins.

20. Puce à ADN pour la détermination de la présence d'un ATNC d'une

Encéphalopathie Spongiforme Subaiguë Transmissible, contenant un ou plusieurs acide (s) nucléique(s) choisi (s) parmi les séquences suivantes : a) SEQ ID NO: 1-116 ; b) un acide nucléique d'au moins 15 nucléotides s'hybridant spécifiquement dans des conditions de forte stringence avec l'une des séquences définies en a) ;ou c) une séquence présentant un pourcentage d'homologie d'au moins 80%, de préférence au moins 90%, avec l'une des séquences définies en a) après alignement optimal.

21. Puce à ADN selon la revendication 20, caractérisée en ce qu'un acide nucléique choisi est un fragment d'une séquence de gène humain, bovin ou ovin.

<Desc/Clms Page number 41>

22. Kit pour l'identification d'un ATNC responsable d'une

Encéphalopathie Subaiguë Spongiforme Transmissible (ESST), caractérisé en ce qu'il comprend : a) un anticorps ou fragment d'anticorps capable de détecter un produit d'expression spécifique d'un gène comprenant l'une des séquences choisies parmi i. SEQ I D NO: 1-116 ; ii. une séquence hybridant dans des conditions de forte stringence avec l'une des séquences SEQ ID NO: 1- 116 ; ou, iii. une séquence nucléotidique présentant un pourcentage d'homologie d'au moins 80%, de préférence au moins 90% avec l'une des séquences de SEQ ID NO: 1-116 après alignement optimal. b) le cas échéant des réactifs pour la détection d'un complexe antigène-anticorps spécifique.

23. Kit selon la revendication 22, caractérisé en ce que ledit anticorps ou fragment d'anticorps est capable de détecter un produit d'expression spécifique d'un gène humain, bovin ou ovin.

24. Puce à protéine pour la détermination de la présence d'un ATNC responsable d'une Encéphalopathie Subaiguë Spongiforme

Transmissible (ESST) contenant un anticorps ou fragment d'anticorps capable de détecter spécifiquement un produit d'expression de l'une des séquences choisie parmi a) SEQ ID NO: 1-116 ; b) une séquence hybridant dans des conditions de forte stringence avec l'une des séquences SEQ ID NO: 1- 116 ; ou,

<Desc/Clms Page number 42>
c) une séquence nucléotidique présentant un pourcentage d'homologie d'au moins 80%, de préférence au moins 90% avec l'une des séquences de SEQ ID NO: 1-116 après alignement optimal.

25. Puce à protéine selon la revendication 24, caractérisée en ce que ledit anticorps ou fragment d'anticorps est capable de détecter spécifiquement un produit d'expression d'un gène humain, bovin ou ovin.

26. Méthode de sélection d'un composé apte à ralentir, stopper ou empêcher le développement d'une ESST, comprenant a) la culture de cellules infectées par un ATNC responsable de l'ESST ; b) la mise en contact de la culture avec un composé candidat ; c) la détermination de l'expression d'un ou plusieurs gènes choisis parmi le groupe des séquences SEQ ID NO: 1-116 ; d) la sélection d'un composé capable de diminuer le niveau d'expression d'un ou de plusieurs ARN choisi (s) dansle groupe constitué des ARN contenant une séquence correspondant à l'une des séquences SEQ ID NO: 1-51 et 64-92 et/ou capable d'augmenter le niveau d'expression d'un ou plusieurs ARN choisi (s) dans le groupe constitué des ARN contenant une séquence correspondant à l'une des séquences SEQ ID NO:

52-63 et 93-116.

27. Méthode de sélection d'un composé apte à ralentir, stopper ou empêcher le développement d'une ESST, comprenant a) l'administration d'un composé candidat à un modèle animal infecté par un ATNC ;

<Desc/Clms Page number 43>

b) le prélèvement de cellules potentiellement infectées ; c) la détermination de l'expression d'un ou plusieurs gènes choisis parmi le groupe des séquences SEQ ID NO: 1-116 ; d) la sélection d'un composé capable de diminuer le niveau d'expression d'un ou de plusieurs ARN choisi (s) dansle groupe constitué des ARN contenant une séquence correspondant à l'une des séquences SEQ ID NO: 1-51 et 64-92 et/ou capable d'augmenter le niveau d'expression d'un ou plusieurs ARN choisi (s) dans le groupe constitué des ARN contenant une séquence correspondant à l'une des séquences SEQ ID NO:

52-63 et 93-116.

28. Méthode selon la revendication 26, caractérisée en ce que les cellules infectées sont des cellules GT-1.

29. Utilisation d'acides nucléiques selon la revendication 30, de sondes selon l'une des revendications 13 à 15, ou d'amorces selon l'une des revendications 16 à 17, dans la mise en #uvre d'une méthode de diagnostic d'une ESST à partir d'un échantillon biologique.

30. Acide nucléique utilisable comme marqueur des ESST, constitué de: a) l'un des acides nucléiques choisis parmi SEQ ID NO: 1-116 ; ou, b) un acide nucléique hybridant dans des conditions stringentes avec un acide nucléique identifié en a).