FR2835531A1

FR2835531A1 - PROCESS FOR THE PRODUCTION OF AMIDES IN THE PRESENCE OF MICROBIOLOGICAL NITRILE HYDRATASE AND NEW MICROORGANISM

Info

Publication number: FR2835531A1
Application number: FR0201385A
Authority: FR
Inventors: Marco Wieser; Patrick Pommares
Original assignee: SNF SA
Current assignee: SNF SA
Priority date: 2002-02-06
Filing date: 2002-02-06
Publication date: 2003-08-08
Anticipated expiration: 2022-02-06
Also published as: FR2835531B1; WO2003066800A3; AU2002364875A1; AU2002364875A8; WO2003066800A2

Abstract

Procédé de fabrication d'amides consistant à hydrater un nitrile en une amide correspondante, en présence d'une nitrile-hydratase d'origine microbiologique, caractérisé en ce que ladite nitrile hydratase est produite par une bactérie appartenant à l'espèce Rhodococcus pyridinovorans.Process for the manufacture of amides consisting in hydrating a nitrile to a corresponding amide, in the presence of a nitrile hydratase of microbiological origin, characterized in that said nitrile hydratase is produced by a bacterium belonging to the species Rhodococcus pyridinovorans.

Description

PROCEDE POUR LA FABRICATION D'AMIDES EN PRESENCE D'UNE NITRILE HYDRATASE D'ORIGINE MICROBIOLOGIQUE ET NOUVEAU MICROORGANISM. PROCESS FOR THE PRODUCTION OF AMIDES IN THE PRESENCE OF A MICROBIOLOGICAL NITRILE HYDRATASE AND A NOVEL MICROORGANISM

L'invention a tout d'abord pour objet un procédé de production d'amides obtenues par hydratation d'un nitrile en présence d'une nitrile hydratase d'origine microbiologique. Plus précisément, l'invention concerne un procédé de fabrication d'amides en présence d'une nitrile hydratase produite par une bactérie appartenant à l'espèce Rhodococcus pyridinovorans. Elle se rapporte ensuite à un procédé de

culture de bactéries appartenant à l'espèce / ! oococcM 'i'ncon. ?. L'invention concerne enfin une souche bactérienne spécifique appartenant à l'espèce Rhodococcus pyridinovorans. The invention firstly relates to a process for producing amides obtained by hydration of a nitrile in the presence of a nitrile hydratase of microbiological origin. More specifically, the invention relates to a process for producing amides in the presence of a nitrile hydratase produced by a bacterium belonging to the species Rhodococcus pyridinovorans. It then relates to a method of

culture of bacteria belonging to the species /! oococci 'i'ncon. ?. The invention finally relates to a specific bacterial strain belonging to the Rhodococcus pyridinovorans species.

Le document FR-A-2 294 999 décrit un procédé de préparation d'un amide par hydrolyse du nitrile correspondant consistant à soumettre le nitrile en solution aqueuse à l'action de bactéries présentant une activité nitrile hydratasique. En tant que bactérie à activité nitrile hydratasique, est notamment décrit le genre Brevibactérium, tel que défini au sens de Bergey et plus particulièrement la souche R312. FR-A-2,294,999 describes a process for the preparation of an amide by hydrolysis of the corresponding nitrile comprising subjecting the nitrile in aqueous solution to the action of bacteria exhibiting a hydrated nitrile activity. As a bacterium with nitrile hydratase activity, is described in particular the genus Brevibacterium, as defined in the meaning of Bergey and more particularly the strain R312.

Le document EP-188 316 décrit un procédé de fabrication d'amides en présence d'une nitrile hydratase d'origine microbiologique, en particulier d'acrylamide, à partir d'un mononitrile contenant de deux à six atomes de carbone. En tant que microorganismes, sont spécifiquement décrits les bactéries appartenant au genre Rhodococcus ou au genre Microbactérium. Cependant, le procédé tel que décrit dans ce document ne reste efficace que pour l'hydratation de nitriles aliphatiques inférieurs, l'activité sur les nitriles aromatiques restant très faible (voir exemple 2). EP-188 316 discloses a process for producing amides in the presence of a nitrile hydratase of microbiological origin, in particular acrylamide, from a mononitrile containing from two to six carbon atoms. As microorganisms, bacteria belonging to the genus Rhodococcus or genus Microbacterium are specifically described. However, the process as described in this document only remains effective for the hydration of lower aliphatic nitriles, the activity on the aromatic nitriles remaining very low (see Example 2).

Pour résoudre ce problème, le document EP-A-307 926 décrit une souche spécifique appartenant au genre Rhodococcus, plus précisément la souche Rhodococcus rhodochrous J-l (FERM BP-1478) qui, en présence d'ions cobalt, hydrate les nitriles. La concentration en CoCl-ôHO des milieux de culture est de 10 mg/1. To solve this problem, the document EP-A-307 926 describes a specific strain belonging to the genus Rhodococcus, specifically the strain Rhodococcus rhodochrous J-1 (FERM BP-1478) which, in the presence of cobalt ions, hydrates the nitriles. The concentration of CoCl-6HO of the culture media is 10 mg / l.

Le brevet EP-A-362829 présente une méthode de production de cellules de la bactérie Rhodoccocus rhodochrous permettant d'obtenir une activité nitrile hydratasique élevée en additionnant de l'urée, ou un dérivé, au milieu de culture

de la bac, %. de la bactérie. La culture des bactéries est de façon systématique commencée en présence d'ion cobalt et d'urée, ou de ses dérivés. Patent EP-A-362829 discloses a method for producing Rhodococcus rhodochrous bacteria cells which makes it possible to obtain a high nitrile hydratase activity by adding urea, or a derivative, to the culture medium.

of the tray,%. of the bacteria. Culture of bacteria is systematically started in the presence of cobalt ion and urea, or its derivatives.

En conséquence, la bactérie AoococcM oJc'c/OM J-7 décrite dans les deux documents précités, de par son activité élevée, est devenue, pour l'homme du métier, la bactérie de référence en matière d'activité nitrile hydratasique. Consequently, the bacterium Aoococcus® / OM J-7 described in the two aforementioned documents, by virtue of its high activity, has become, for the person skilled in the art, the reference bacterium with regard to hydrated nitrile activity.

Le document GB-A-2 290 295 décrit également l'utilisation d'une souche de Rhodococcus rhodochrous déposée auprès de la collection nationale russe de microorganismes sous le numéro VKM Ac-1515D. Cette souche est utilisée comme source de nitrile hydratase, pour la fabrication biologique d'amides et ce, en l'absence d'inducteur ce qui amène à penser que l'activité nitrile hydratasique de cette bactérie est constitutive. GB-A-2 290 295 also discloses the use of a strain of Rhodococcus rhodochrous deposited with the Russian national collection of microorganisms under the number VKM Ac-1515D. This strain is used as a source of nitrile hydratase, for the biological manufacture of amides and this, in the absence of inducer which suggests that the nitrile hydratase activity of this bacterium is constitutive.

YOON & al. décrit dans le document Int J Syst. Evol. Microbiol. 2000 Nov., 50 Pt, 6 : 2173-80, une nouvelle souche bactérienne désignée"PDB9T"ayant donné lieu à l'identification d'une nouvelle espèce, à savoir l'espèce pyridinovorans appartenant au genre Rhodococcus. La souche PDB9 a été déposée auprès de la collection coréenne des cultures sous le numéro KCTC 0647 BP de même qu'auprès du centre coréen de culture de microorganisme sous le numéro KCCM 80005. La séquence partielle de l'ARN 16S ribosomal est en outre YOON & al. described in the document Int J Syst. Evol. Microbiol. 2000 Nov., 50 Pt, 6: 2173-80, a new bacterial strain designated "PDB9T" that gave rise to the identification of a new species, namely the species pyridinovorans belonging to the genus Rhodococcus. The strain PDB9 has been deposited with the Korean collection of cultures under the number KCTC 0647 BP as well as with the Korean center of culture of microorganism under the number KCCM 80005. The partial sequence of the ribosomal 16S RNA is furthermore

disponible dans la banque de gènes GENBANK sous le numéro d'accession AF 173005. Le document YOON indique que Rhodococcus pyridinovorans est apte à dégrader la pyridine. available in the GENBANK genebank under accession number AF 173005. The YOON document indicates that Rhodococcus pyridinovorans is capable of degrading pyridine.

Or, le Demandeur a découvert que, de manière tout à fait surprenante, Rhodococcus pyridinovorans présentait une activité nitrile hydratase élevée, en faisant un microorganisme avantageusement utilisable dans un procédé de fabrication biologique d'amides. However, the Applicant has discovered that, quite surprisingly, Rhodococcus pyridinovorans has a high nitrile hydratase activity, making a microorganism advantageously usable in a process for the biological manufacture of amides.

En conséquence, l'invention concerne un procédé de fabrication d'amides consistant à hydrater un nitrile en une amide correspondante, en présence d'une nitrile hydratase d'origine microbiologique caractérisé en ce que ladite nitrile hydratase est produite par une bactérie appartenant à l'espèce Rhodococcus pyridinovorans. Accordingly, the invention relates to a process for the manufacture of amides comprising hydrating a nitrile to a corresponding amide in the presence of a nitrile hydratase of microbiological origin characterized in that said nitrile hydratase is produced by a bacterium belonging to the Rhodococcus species pyridinovorans.

Même si les bactéries d'espèce pyridinovorans appartiennent au même genre Rhodococcus que les bactéries d'espèce rhodochrous, lesquelles présentent une activité nitrile hydratase élevée, il n'était pas pour autant évident que pyridinovorans soit également douée d'une activité nitrile hydratase élevée. En effet, à ce jour, seule l'espèce rhodochrous a permis un développement industriel pour la production d'amides tels que l'acrylamide. Les autres espèces majeures du genre Rhodoccocus comme erythropolis ou equi ne présentent que des activités marginales notamment pour la production d'acrylamide. Although the bacteria of the pyridinovoran species belong to the same genus Rhodococcus as the rhodochrous bacteria, which have a high nitrile hydratase activity, it was not obvious that pyridinovorans is also endowed with a high nitrile hydratase activity. Indeed, to date, only the rhodochrous species has allowed industrial development for the production of amides such as acrylamide. The other major species of the Rhodoccocus genus such as erythropolis or equi have only marginal activities, in particular for the production of acrylamide.

En outre, le Demandeur a démontré que l'activité nitrile hydratasique pouvait être améliorée en appliquant des conditions de culture spécifiques, en particulier en employant des concentrations et/ou des temps d'ajouts d'une source de carbone, d'un ion métallique et d'un inducteur sélectif. In addition, the Applicant has demonstrated that the nitrile hydratase activity can be improved by applying specific culture conditions, in particular by employing concentrations and / or addition times of a carbon source, a metal ion and a selective inductor.

Ainsi et selon une première caractéristique, les bactéries de l'invention sont cultivées dans un milieu contenant des ions cobalt (Co et/ou Co). Le cobalt peut être ajouté sous forme de sels de cobalt ou de composés organiques. Il peut être ajouté en 1 fois ou en continu, en début ou en cours de culture, de préférence

séquentiellement. En pratique, les concentrations finales en cobalt (base Col2- 6H2O) sont comprises entre 10 et 40 mg/L et préférentiellement entre 15 et 30 mg/L. Thus and according to a first characteristic, the bacteria of the invention are cultured in a medium containing cobalt ions (Co and / or Co). Cobalt can be added in the form of cobalt salts or organic compounds. It can be added in 1 time or continuously, at the beginning or in the course of culture, preferably

sequentially. In practice, the final concentrations of cobalt (Col2-6H2O base) are between 10 and 40 mg / l and preferably between 15 and 30 mg / l.

Pour améliorer davantage l'activité, les bactéries sont cultivées en présence également d'un inducteur choisi dans le groupe des amides ou des nitriles. La plupart des amides (y compris l'urée et ses dérivés) peuvent être utilisés comme inducteur de l'activité nitrile-hydratasique. Ces inducteurs peuvent être ajoutés seuls ou en mélange, en 1 fois, séquentiellement ou en continu, en début ou en cours de culture. To further enhance activity, the bacteria are cultured in the presence of an inducer selected from the group of amides or nitriles. Most amides (including urea and its derivatives) can be used as inducers of nitrile-hydrate activity. These inducers can be added alone or as a mixture, in one, sequentially or continuously, at the beginning or during culture.

En pratique, l'inducteur est choisi dans le groupe comprenant crotonamide, urée, propionamide, acétamide, n-butyramide, isobutyramide, n-valéramide, ncapronamide, méthacrylamide et cyclohexanecarboxamide. In practice, the inducer is chosen from the group comprising crotonamide, urea, propionamide, acetamide, n-butyramide, isobutyramide, n-valeramide, necpronamide, methacrylamide and cyclohexanecarboxamide.

Certains inducteurs de type nitrile peuvent également être utilisés, comme par exemple : acétonitrile, propionitril, isobutyronitrile. Some nitrile inducers may also be used, for example: acetonitrile, propionitril, isobutyronitrile.

On utilisera de préférence un inducteur peu onéreux qui n'est pas ou peu métabolisé (urée ou ses dérivés). En pratique, les concentrations finales en urée ou ses dérivés sont comprises entre 5 et 50 g/L, préférentiellement supérieures à 10 g/L. An inexpensive inductor which is not or little metabolized (urea or its derivatives) is preferably used. In practice, the final concentrations of urea or its derivatives are between 5 and 50 g / l, preferably greater than 10 g / l.

En d'autres termes, le Demandeur a démontré que l'activité nitrile hydratase

des bactéries de l'invention était améliorée dans des conditions standards de cultures (CoCI2-6H2O > 10 mg/1 ; urée préférentiellement > 10 g/l) distinctes de In other words, the Applicant has demonstrated that the nitrile hydratase activity

bacteria of the invention was improved under standard culture conditions (CoCl2-6H2O> 10 mg / l, urea preferentially> 10 g / l) distinct from

celles utilisées pour Rhodococcus rhodochrous J-l (CoC12-6H2O : 10mg/l ; urée : 7,5 g/l) [Optimum culture conditions for the production of cobalt-containing nitrile hydratase by Rhodococcus rhodochrous JI, Appl. Microbiol. Biotechnol. those used for Rhodococcus rhodochrous J-1 (CoC12-6H2O: 10mg / l, urea: 7.5g / l) [Optimum culture conditions for the production of cobalt-containing nitrile hydratase by Rhodococcus rhodochrous JI, Appl. Microbiol. Biotechnol.

(1991) 34 : 783-788]. (1991) 34: 783-788].

La concentration en source de carbone influence également l'obtention d'une activité nitrile-hydratasique satisfaisante. En pratique, on utilise des sources de C à des concentrations nominales variant de 5 à 50 g/L, de préférence de 12 à 30 g/L, ajoutées seules ou en mélange, en 1 fois, séquentiellement ou en continu, en début ou en cours de culture. De façon non limitative, on citera en tant que source de carbone le D-Glucose, le Pyruvate, le D-Sorbitol... The concentration of carbon source also influences the obtaining of a satisfactory nitrile-hydratase activity. In practice, sources of C are used at nominal concentrations ranging from 5 to 50 g / l, preferably from 12 to 30 g / l, added alone or as a mixture, in one go, sequentially or continuously, at the beginning or in in the course of culture. In a nonlimiting manner, mention will be made as a carbon source D-Glucose, Pyruvate, D-Sorbitol ...

En pratique, des quantités pré-déterminées d'urée, de cobalt et d'une source de carbone sont ajoutées au milieu basal. La culture est menée à une température comprise entre 15 et 50 oC, préférentiellement autour de 28 C, à un pH compris entre 6 et 9 durant au minimum 96 heures (jusqu'à 200 heures). In practice, pre-determined amounts of urea, cobalt and a carbon source are added to the basal medium. The culture is carried out at a temperature of between 15 and 50.degree. C., preferably around 28.degree. C., at a pH of between 6 and 9 for at least 96 hours (up to 200 hours).

Dans un mode de réalisation particulier, la bactérie utilisée est la souche MW3 appartenant à l'espèce Rhodococcus pyridinovorans et déposée le 24 janvier 2002 à la CNCM (Collection Nationale de Culture de Microorganismes), Institut Pasteur, 25 rue du Dr. ROUX, PARIS, France, sous le numéro CNCM 1-2772, et les mutants de cette souche. Les mutants de la souche ci-dessus entrent en effet dans le cadre de l'invention dès lors qu'ils présentent une activité nitrile hydratase. In a particular embodiment, the bacterium used is the strain MW3 belonging to the species Rhodococcus pyridinovorans and deposited on January 24, 2002 at the CNCM (National Collection of Culture of Microorganisms), Institut Pasteur, 25 rue du Dr. ROUX, PARIS , France, under the number CNCM 1-2772, and the mutants of this strain. The mutants of the above strain are within the scope of the invention since they have a nitrile hydratase activity.

Dans un mode de réalisation avantageux, le microorganisme peut être immobilisé en utilisant des méthodes et des procédures connues de l'homme du métier. Ces méthodes comprennent, par exemple, les immobilisations par inclusion sur gel (polyacrylamide, extraits d'algues, alginates...) ainsi que les immobilisations sur support par adsorption ou par liaisons covalente (supports In an advantageous embodiment, the microorganism can be immobilized using methods and procedures known to those skilled in the art. These methods include, for example, fixed assets by inclusion on a gel (polyacrylamide, algae extracts, alginates ...) as well as fixed assets on adsorption or covalent bonds (supports

d'origine minérale (alumine, brique, verre, argile...) ou organique (résines échangeuses, collagène, cellulose...). of mineral origin (alumina, brick, glass, clay ...) or organic (exchange resins, collagen, cellulose ...).

Selon une autre caractéristique, les substrats sur lesquels agissent Rhodococcus pyridcnovorans peuvent aussi bien être des nitriles aliphatiques que les nitriles aromatiques. On citera à titre d'exemple sans toutefois limiter l'invention, des composés tels que l'acétonitrile, le propionitrile, le méthacrylonitrile, l'acrylonitrile, le benzonitrile, la 3-cyanopyridine, le 3-hydroxy isovaleronitrile, le 3-hydroxypropionitrile, le 2-hydroxy 4methylthiobutyronitrile... According to another characteristic, the substrates on which Rhodococcus pyridcnovorans act may as well be aliphatic nitriles as aromatic nitriles. By way of example, without limiting the invention, mention may be made of compounds such as acetonitrile, propionitrile, methacrylonitrile, acrylonitrile, benzonitrile, 3-cyanopyridine, 3-hydroxyisovaleronitrile and 3-hydroxypropionitrile. 2-hydroxy 4-methylthiobutyronitrile ...

On notera que la production d'amide obtenues par hydratation d'un nitrile en présence de la nitrile hydratase produite par le microorganisme de la présente demande peut se faire aussi bien par le biais de procédés continus que discontinus (appelés" batch "). It will be noted that the production of amide obtained by hydration of a nitrile in the presence of the nitrile hydratase produced by the microorganism of the present application can be carried out either by means of continuous or discontinuous processes (called "batch").

L'invention se rapporte aussi à un procédé de culture de bactéries appartenant à l'espèce Rhodococcus pyridinovorans. Selon une première caractéristique, le milieu de culture contient des ions cobalt Co2+ et/ou Co3+ dans des concentrations comprises entre 10 et 40 mg/L (base CoCI2-6H2O), préférentiellement entre 15 et 30 mg/L. Selon un mode de réalisation avantageux, le milieu contient en outre de l'urée ou ses dérivés dans des concentrations finales comprises entre 5 et 50 g/L, préférentiellement supérieures à 10 g/L. Selon une forme de réalisation préférée, le milieu contient en outre une source de carbone dont les concentrations nominales varient entre 5 et 50 g/L, de préférence entre 12 et 30 g/L. The invention also relates to a method for culturing bacteria belonging to the Rhodococcus pyridinovorans species. According to a first characteristic, the culture medium contains cobalt ions Co2 + and / or Co3 + in concentrations of between 10 and 40 mg / l (CoCl2-6H2O base), preferably between 15 and 30 mg / l. According to an advantageous embodiment, the medium also contains urea or its derivatives in final concentrations of between 5 and 50 g / l, preferably greater than 10 g / l. According to a preferred embodiment, the medium also contains a carbon source whose nominal concentrations vary between 5 and 50 g / l, preferably between 12 and 30 g / l.

L'invention concerne également la souche MW3 appartenant à Rhodococcus pyridinovorans déposée le 24 janvier 2002 à la CNCM sous le numéro CNCM 1-2772 et les mutants de cette souche. The invention also relates to the MW3 strain belonging to Rhodococcus pyridinovorans deposited on January 24, 2002 at the CNCM under the number CNCM 1-2772 and the mutants of this strain.

L'invention et les avantages qui en découlent ressortiront mieux des exemples de réalisation suivants. The invention and the advantages thereof will become more apparent from the following exemplary embodiments.

1/Caractérisation de la souche MW3 a/Milieudeculture

Milieu basal : K2HPO4 0.5 g KH. PO, 0.5 g MgS04, 7ho 0. 5 g Extrait de levure 1.0 g Tryptone de caseine 7.5 g Eau déionisée q. s. p. 1 litre (pH 7.2) Ion métallique Co : 10 mg/L (CoCl2-6H2O) Inducteur Urée : 7,5 g/L Source de carbone D-Glucose monohydrate 10 g/L b/PropriétésdeMW3 Type de colonie : gram + colonies pigmentées en rose Caractère biochimique : oxydase- catalase + nitrate réductase + nitrite réductaseMétabolisme respiratoire : aérobie stricte 1 / Characterization of the MW3 strain a / Midculture

Basal medium: K2HPO4 0.5 g KH. PO, 0.5 g MgSO4, 7ho 0.5 g Yeast extract 1.0 g Tryptone casein 7.5 g Deionized water qs 1 liter (pH 7.2) Metallic ion Co: 10 mg / L (CoCl2-6H2O) Inducer Urea: 7.5 g / L Carbon source D-Glucose monohydrate 10 g / L b / Properties of MW3 Colony type: gram + pink pigmented colonies Biochemical character: oxidase-catalase + nitrate reductase + nitrite reductase Respiratory metabolism: strict aerobic

ci Identification
Méthode utilisée : - Amplification du gène rrs codant l'ARNr 16S - Séquençage du gène rrs
L'analyse de la séquence d'ARNr 16S de MW3 montre un pourcentage d'homologie égal à 100% avec la séquence de l'ARNr 16S de la souche PDB9 accessible dans la banque GENBANK sous le numéro AF173005. L'homologie étant de 100%, on en conclut que MW3 appartient à Rhodococcus py'dinovorans.

ci Identification
Method used: - Amplification of rrs gene coding for 16S rRNA - Sequencing of the rrs gene
Analysis of the 16S rRNA sequence of MW3 shows a percentage of homology equal to 100% with the 16S rRNA sequence of the PDB9 strain accessible in the GENBANK library under number AF173005. The homology being 100%, it is concluded that MW3 belongs to Rhodococcus py'dinovorans.

2/Activité nitrile hydratase de MW3
Descriptif des mesures de l'activite nitrile-hydratasique effectuées : Définitions

- Activité spécifique : gmol d'amide produit. min-t. mg-t de poids sec bactérien. 2 / MN3 nitrile hydratase activity
Description of the measurements of the nitrile-hydrated activity carried out: Definitions

- Specific activity: amide gmol produced. min-t. mg-t bacterial dry weight.

Activité relative : activité exprimée en pourcent correspondant à l'activité spécifique ou totale obtenue rapportée à l'activité spécifique ou totale de référence (100%).

Relative activity: activity expressed as a percentage corresponding to the specific or total activity obtained relative to the specific or total reference activity (100%).

- Activité totale : umol d'amide produit. min-'. g-'de milieu de culture. - Total activity: amide umol produced. min- '. g-'de culture medium.

Test d'activité à 200C . Solution réactionnelle de 100g contenant : - 50g de tampon phosphate lOOmM - 49g de solution aqueuse de nitrile respectivement : . x grammes de nitrile correspondant à la quantité nécessaire à l'obtention de la concentration finale recherchée . 49-x g d'eau déionisée Activity test at 200C. 100 g reaction solution containing: - 50 g of 100 mM phosphate buffer - 49 g of aqueous nitrile solution respectively: x grams of nitrile corresponding to the amount necessary to obtain the desired final concentration. 49-x g deionized water

La réaction est déclenchée en rajoutant 1 g de suspension cellulaire (contenant une quantité prédéterminée de cellules centrifugées 10 min à
10000 g). The reaction is triggered by adding 1 g of cell suspension (containing a predetermined quantity of cells centrifuged for 10 min.
10000 g).

Prélèvement de 4 mL après différents temps d'incubation et arrêt de la réaction avec 30 nul d'acide sulfurique concentré. Take 4 mL after different incubation times and stop the reaction with 30% concentrated sulfuric acid.

Dosage par chromatographie phase liquide de l'amide formé. Assay by liquid phase chromatography of the amide formed.

3/EXEMPLES
A/EXEMPLE1
Test activité effectué dans des conditions standards optimales utilisées pour Rhodococcus rhodochrous Y/ [Optimum culture conditions for the production of cobalt-containing nitrile hydratase by Rhodococcus rhodochrous J1, Appl. 3 / EXAMPLES
A / EXAMPLE1
Test activity carried out under optimum standard conditions used for Rhodococcus rhodochrous Y / Optimum culture conditions for the production of cobalt-containing nitrile hydratase by Rhodococcus rhodochrous J1, Appl.

Microbiol. Biotechnol. (1991) 34 : 783-788]. Microbiol. Biotechnol. (1991) 34: 783-788].

Conditions de culture : CoClHO : 10mg/1 ; urée : 7,5 g/1 ; glucose : 10 g/L ; substrat : acrylonitrile 50 mM

Culture conditions: CoClHO: 10 mg / l; urea: 7.5 g / l; glucose: 10 g / L; substrate: acrylonitrile 50 mM

<tb>
<tb> Bactérie <SEP> Formation <SEP> d'amide1
<tb> MW3 <SEP> 10
<tb> Rhodococcus <SEP> rhodochrous <SEP> J1 <SEP> 100*
<tb> @ <SEP> : <SEP> Activité <SEP> spécifique <SEP> relative <SEP> (%)
<tb> <Tb>
<tb> Bacteria <SEP> Training <SEP> of amide1
<tb> MW3 <SEP> 10
<tb> Rhodococcus <SEP> rhodochrous <SEP> J1 <SEP> 100 *
<tb> @ <SEP>: <SEP> Activity <SEP> specific <SEP> relative <SEP> (%)
<Tb>

* : sur la base des résultats du brevet EP 362829 (AS = 497 ; ex 2, tab 1) On constate que, dans des conditions standards décrites comme optimales pour Jl, MW3 présente une activité nitrile hydratasique modérée.

*: on the basis of the results of the patent EP 362829 (AS = 497, ex 2, tab 1) It is found that, under standard conditions described as optimal for Jl, MW3 has moderate hydrated nitrile activity.

B/EXEMPLE 2 : Variation des conditions de culture de MW3 en fonction des concentrations et/ou des temps d'ajout du cobalt. B / EXAMPLE 2 Variation of the culture conditions of MW3 as a function of the concentrations and / or times of addition of cobalt.

Conditions de culture : CoCI2-6H2O : variable ; urée : 7,5 g/l ; glucose : 10 g/L ; substrat : acrylonitrile 50 mM

Culture conditions: CoCI2-6H2O: variable; urea: 7.5 g / l; glucose: 10 g / L; substrate: acrylonitrile 50 mM

<tb>
<tb> Concentration <SEP> en <SEP> Temps <SEP> d'ajout <SEP> Formation
<tb> CoCL2-6H20 <SEP> d'amide1
<tb> 10 <SEP> mg/L <SEP> (standard) <SEP> T=O <SEP> 100
<tb> 20 <SEP> mg/L <SEP> T=O <SEP> 345
<tb> 30mg/L <SEP> T=0 <SEP> 128
<tb> 2x10 <SEP> mg/L <SEP> T=0et24h <SEP> 396
<tb> @ <SEP> : <SEP> Activité <SEP> spécifique <SEP> relative <SEP> (%)
<tb> <Tb>
<tb> Concentration <SEP> in <SEP><SEP> Addition Time <SEP> Training
<tb> CoCL2-6H20 <SEP> of amide1
<tb> 10 <SEP> mg / L <SEP> (standard) <SEP> T = O <SEP> 100
<tb> 20 <SEP> mg / L <SEP> T = O <SEP> 345
<tb> 30mg / L <SEP> T = 0 <SEP> 128
<tb> 2x10 <SEP> mg / L <SEP> T = 0and24h <SEP> 396
<tb> @ <SEP>: <SEP> Activity <SEP> specific <SEP> relative <SEP> (%)
<Tb>

En multipliant par 2 la concentration en cobalt et en fractionnant son ajout, l'activité de MW3 peut de façon surprenante être multipliée par 4. By multiplying the cobalt concentration by 2 and fractionating its addition, the MW3 activity can surprisingly be multiplied by 4.

C/EXEMPLE 3 : Variation des conditions de culture de MW3 en fonction des concentrations et/ou des temps d'ajout de l'inducteur (l'urée). C / EXAMPLE 3 Variation of the culture conditions of MW3 as a function of the concentrations and / or the addition times of the inducer (urea).

Conditions de culture : CoC12-6H2O : 10 mg/1 ; urée : variable ; glucose : 10 g/L ; substrat : acrylonitrile 50 mM

Culture conditions: CoC12-6H2O: 10 mg / l; urea: variable; glucose: 10 g / L; substrate: acrylonitrile 50 mM

<tb>
<tb> Concentration <SEP> en <SEP> Temps <SEP> d'ajout <SEP> Formation
<tb> urée <SEP> d'amide'
<tb> 7, <SEP> 5 <SEP> g/L <SEP> (standard) <SEP> T=0 <SEP> 100
<tb> 7,5 <SEP> g/L <SEP> T <SEP> = <SEP> 12h <SEP> 110
<tb> 15g/L <SEP> T=24h <SEP> 260
<tb> 15 <SEP> g/L <SEP> T <SEP> = <SEP> 36h <SEP> 240
<tb> 2 <SEP> x <SEP> 7, <SEP> 5 <SEP> g/L <SEP> T <SEP> = <SEP> 24h <SEP> et <SEP> 48h <SEP> 250
<tb> 2 <SEP> x <SEP> 7, <SEP> 5 <SEP> g/L <SEP> T <SEP> = <SEP> 12h <SEP> et <SEP> 36h <SEP> 250
<tb> 2 <SEP> x <SEP> 15 <SEP> g/L <SEP> T <SEP> = <SEP> 24h <SEP> et <SEP> 48h <SEP> 290
<tb> 1 <SEP> : <SEP> Activité <SEP> spécifique <SEP> relative <SEP> (%)
<tb> <Tb>
<tb> Concentration <SEP> in <SEP><SEP> Addition Time <SEP> Training
<tb> urea <SEP> amide '
<tb> 7, <SEP> 5 <SEP> g / L <SEP> (standard) <SEP> T = 0 <SEP> 100
<tb> 7.5 <SEP> g / L <SEP> T <SEP> = <SEP> 12h <SEP> 110
<tb> 15g / L <SEP> T = 24h <SEP> 260
<tb> 15 <SEP> g / L <SEP> T <SEP> = <SEP> 36h <SEP> 240
<tb> 2 <SEP> x <SEP> 7, <SEP> 5 <SEP> g / L <SEP> T <SEP> = <SEP> 24h <SEP> and <SEP> 48h <SEP> 250
<tb> 2 <SEP> x <SEP> 7, <SEP> 5 <SEP> g / L <SEP> T <SEP> = <SEP> 12h <SEP> and <SEP> 36h <SEP> 250
<tb> 2 <SEP> x <SEP> 15 <SEP> g / L <SEP> T <SEP> = <SEP> 24h <SEP> and <SEP> 48h <SEP> 290
<tb> 1 <SEP>: <SEP> Activity <SEP> specific <SEP> relative <SEP> (%)
<Tb>

De façon surprenante, lorsque l'ajout d'urée n'intervient qu'après le début de culture de MW3 (au moins 12 heures) et que la quantité utilisée est augmentée, l'activité nitrile hydratasique de la bactérie est surmultipliée. Surprisingly, when the addition of urea occurs only after the start of MW3 culture (at least 12 hours) and the amount used is increased, the nitrile hydratase activity of the bacteria is overdriven.

DI EXEMPLE 4 : Variation des conditions de culture de MW3 en fonction des concentrations et/ou des temps d'ajout de la source de carbone (le glucose). DI EXAMPLE 4: Variation of the culture conditions of MW3 as a function of the concentrations and / or times of addition of the carbon source (glucose).

Conditions de culture : CoCI2-6H2O : 10mg/l ; urée : 7,5 g/l ; glucose : variable ; substrat : acrylonitrile 50 mM

Culture conditions: CoCl2-6H2O: 10mg / l; urea: 7.5 g / l; glucose: variable; substrate: acrylonitrile 50 mM

<tb>
<tb> Concentration <SEP> en <SEP> Temps <SEP> d'ajout <SEP> Formation
<tb> glucose <SEP> d'amide <SEP> 1
<tb> 10 <SEP> g/L <SEP> T=O <SEP> 100
<tb> 15g/L <SEP> T=0 <SEP> 140
<tb> 20g/L <SEP> T=0 <SEP> 190
<tb> 2 <SEP> x <SEP> 10 <SEP> g/L <SEP> T <SEP> = <SEP> 0 <SEP> et <SEP> 24h <SEP> 200
<tb> 3#10 <SEP> g/L <SEP> T=0,24 <SEP> et <SEP> 48h <SEP> 220
<tb> @ <SEP> : <SEP> Activité <SEP> totale <SEP> relative <SEP> (%)
<tb> <Tb>
<tb> Concentration <SEP> in <SEP><SEP> Addition Time <SEP> Training
<tb> glucose <SEP> amide <SEP> 1
<tb> 10 <SEP> g / L <SEP> T = O <SEP> 100
<tb> 15g / L <SEP> T = 0 <SEP> 140
<tb> 20g / L <SEP> T = 0 <SEP> 190
<tb> 2 <SEP> x <SEP> 10 <SEP> g / L <SEP> T <SEP> = <SEP> 0 <SEP> and <SEP> 24h <SEP> 200
<tb> 3 # 10 <SEP> g / L <SEP> T = 0.24 <SEP> and <SEP> 48h <SEP> 220
<tb> @ <SEP>: <SEP> Activity <SEP> total <SEP> relative <SEP> (%)
<Tb>

De façon surprenante, lorsque la quantité en source de carbone est augmentée et que son ajout est fractionné après le début de culture de MW3, l'activité nitrile hydratasique de la bactérie est amplifiée. Surprisingly, when the amount of carbon source is increased and its addition is fractionated after the start of MW3 culture, the nitrile hydratase activity of the bacterium is amplified.

E/EXEMPLE 5 : Variation du substrat (nitrile) utilisé lors du test d'activité.
Conditions de culture : CoClHO : 10mg/1 ; urée : 7,5 g/1 ; glucose : 10 g/L ; substrat : variable

EXAMPLE 5 Variation of the substrate (nitrile) used during the activity test.
Culture conditions: CoClHO: 10 mg / l; urea: 7.5 g / l; glucose: 10 g / L; substrate: variable

<tb>
<tb> Substrat <SEP> (50mM) <SEP> Formation <SEP> d'amide1
<tb> Acrylonitrile <SEP> 100
<tb> Méthacrylonitrile <SEP> 79
<tb> Cyanopyridine <SEP> 33
<tb> Benzonitrile <SEP> 53
<tb> Propionitrile <SEP> 69
<tb> Acétonitrile <SEP> 109
<tb> @ <SEP> : <SEP> Activité <SEP> spécifique <SEP> relative <SEP> (%)
<tb> <Tb>
<tb> Substrate <SEP> (50mM) <SEP> Amide1 <SEP> Formation
<tb> Acrylonitrile <SEP> 100
<tb> Methacrylonitrile <SEP> 79
<tb> Cyanopyridine <SEP> 33
<tb> Benzonitrile <SEP> 53
<tb> Propionitrile <SEP> 69
<tb> Acetonitrile <SEP> 109
<tb> @ <SEP>: <SEP> Activity <SEP> specific <SEP> relative <SEP> (%)
<Tb>

MW3 présente une activité nitrile hydratasique sur une grande variété de substrats aussi bien aliphatiques, aromatiques ou insaturés. MW3 has hydrated nitrile activity on a wide variety of aliphatic, aromatic or unsaturated substrates.

FI EXEMPLE 6 : Mesures d'activité spécifique (substrat : acrylonitrile 377 mM).

EXAMPLE 6 Specific Activity Measurements (Substrate: 377 mM Acrylonitrile)

Test <SEP> 1 <SEP> Test <SEP> 2 <SEP> Test <SEP> 3
<tb> CoC12-6H20 <SEP> 20 <SEP> mg/L <SEP> 20 <SEP> mg/L <SEP> 20 <SEP> mglL
<tb> Temps <SEP> d'ajout <SEP> T=O <SEP> T <SEP> = <SEP> 0 <SEP> et <SEP> 24h <SEP> T=O
<tb> Urree2 <SEP> x <SEP> 7, <SEP> 5 <SEP> g/L2 <SEP> x <SEP> 7, <SEP> 5 <SEP> g/L2 <SEP> x <SEP> 7, <SEP> 5 <SEP> g/L
<tb> Temps <SEP> d'ajout <SEP> T <SEP> = <SEP> 0 <SEP> et <SEP> 24h <SEP> T <SEP> = <SEP> 24 <SEP> et <SEP> 48h <SEP> T <SEP> = <SEP> 0 <SEP> et <SEP> 24h
<tb> Glucose2xlOg/L16 <SEP> g/L2x10 <SEP> g/L
<tb> Temps <SEP> d'ajout <SEP> T <SEP> = <SEP> 0 <SEP> et <SEP> 24h <SEP> T=O <SEP> T <SEP> = <SEP> 0 <SEP> et <SEP> 24h
<tb> Durée <SEP> de <SEP> culture <SEP> 168h <SEP> 168h <SEP> 120h
<tb> Concentration <SEP> de <SEP> 9 <SEP> g/L <SEP> 8, <SEP> 1 <SEP> g/L <SEP> 6,2 <SEP> g/L
<tb> cellules
<tb> Formation <SEP> d'amide
<tb> Activité <SEP> Spécifique <SEP> 340 <SEP> 220 <SEP> 250
<tb> Activité <SEP> Totale <SEP> 3060 <SEP> 1760 <SEP> 1550
<tb> Test <SEP> 1 <SEP> Test <SEP> 2 <SEP> Test <SEP> 3
<tb> CoC12-6H20 <SEP> 20 <SEP> mg / L <SEP> 20 <SEP> mg / L <SEP> 20 <SEP> mglL
<tb> Add <SEP> Time <SEP> T = O <SEP> T <SEP> = <SEP> 0 <SEP> and <SEP> 24h <SEP> T = O
<tb> Urree2 <SEP> x <SEP> 7, <SEP> 5 <SEP> g / L2 <SEP> x <SEP> 7, <SEP> 5 <SEP> g / L2 <SEP> x <SEP> 7 , <SEP> 5 <SEP> g / L
<tb> Time <SEP> of addition <SEP> T <SEP> = <SEP> 0 <SEP> and <SEP> 24h <SEP> T <SEP> = <SEP> 24 <SEP> and <SEP> 48h <SEP> T <SEP> = <SEP> 0 <SEP> and <SEP> 24h
<tb> Glucose2xlOg / L16 <SEP> g / L2x10 <SEP> g / L
<tb> Added <SEP> Time <SEP> T <SEP> = <SEP> 0 <SEP> and <SEP> 24h <SEP> T = O <SEP> T <SEP> = <SEP> 0 <SEP > and <SEP> 24h
<tb> Duration <SEP> of <SEP> culture <SEP> 168h <SEP> 168h <SEP> 120h
<tb> Concentration <SEP> of <SEP> 9 <SEP> g / L <SEP> 8, <SEP> 1 <SEP> g / L <SEP> 6.2 <SEQ> g / L
<tb> cells
<tb> Training <SEP> Amide
<tb> Activity <SEP> Specific <SEP> 340 <SEP> 220 <SEP> 250
<tb> Activity <SEP> Total <SEP> 3060 <SEP> 1760 <SEP> 1550
<Tb>

Remarque :
Lorsque l'ajout d'urée est effectué en totalité à T = 0, l'activité totale obtenue était nettement plus faible que celles constatées pour les tests présentés dans le tableau ci-dessus (inférieure à 1000). Note :
When the addition of urea is carried out in full at T = 0, the total activity obtained was significantly lower than those found for the tests presented in the table above (less than 1000).

G/EXEMPLE 7 : immobilisation
140 g d'une suspension cellulaire de MW-3 (contenant 15% p/p de cellules sèches dans du tampon phosphate 50 mM pH 7,0) obtenue par fermentation sur G / EXAMPLE 7: Immobilization
140 g of a cell suspension of MW-3 (containing 15% w / w of dry cells in 50 mM phosphate buffer pH 7.0) obtained by fermentation on

milieu nutritif tel que décrit par l'exemple 6 (test 1), est immobilisée dans un gel de polyacrylamide selon un procédé bien connu de l'homme de l'art. Le gel ainsi obtenu est broyé dans un moulin afin d'obtenir après tamisage des particules de taille homogène comprise entre 500 et 1500 um. Ces particules sont lavées dans le tampon phosphate pH 7,0 puis stockés dans ce même tampon. Nutrient medium as described by Example 6 (test 1), is immobilized in a polyacrylamide gel according to a method well known to those skilled in the art. The gel thus obtained is milled in a mill in order to obtain, after sieving, particles of homogeneous size of between 500 and 1500 μm. These particles are washed in phosphate buffer pH 7.0 and then stored in this same buffer.

H/EXEMPLE 8 : essai de bioconversion n01
On prend 120 g de gel égoutté obtenu selon l'exemple 7 et ayant une activité totale de 15000 U sont ajoutés à 2,895 kg d'eau déionisée contenant 148 ppm d'acrylate de sodium, pH 8,0. Le mélange est maintenu, sous une agitation de 200 rpm, à 12 C les 12 premières heures puis à 20 C les 12 heures suivantes. 2624 ml d'acrylonitrile sont ajoutés à un débit constant de 164 ml/h pendant 16 h, le pH étant régulé par addition de soude 50 mM. Après une durée totale de 24 h de bioconversion, on obtient une solution finale présentant une concentration de 56,4% en acrylamide et avec un résidu d'acrylonitrile < 50 ppm (vérification effectuée par Chromatographie Liquide Haute Pression). Le produit est séparé du catalyseur par filtration sur 0.2 um. H / EXAMPLE 8: bioconversion test n01
120 g of drained gel obtained according to Example 7 and having a total activity of 15000 U are added to 2.895 kg of deionized water containing 148 ppm of sodium acrylate, pH 8.0. The mixture is maintained, with stirring of 200 rpm, at 12 ° C. for the first 12 hours and then at 20 ° C. for the following 12 hours. 2624 ml of acrylonitrile are added at a constant rate of 164 ml / h for 16 h, the pH being regulated by the addition of 50 mM sodium hydroxide. After a total duration of 24 hours of bioconversion, a final solution is obtained with a concentration of 56.4% acrylamide and with an acrylonitrile residue <50 ppm (verification carried out by high pressure liquid chromatography). The product is separated from the catalyst by filtration over 0.2 μm.

Il EXEJ\1PLE 9 : essai de bioconversion n 2
20 g de MW-3 immobilisé et égoutté comme décrit dans l'exemple 7 sont ajoutés à 811 g d'eau déionisée contenant 148 ppm d'acrylate de sodium, pH 8.0. La température du mélange étant maintenue à 20 C sous une agitation de 200 rpm. 189 ml de méthacrylonitrile sont ajoutés à un débit constant pendant 24 h. Après une durée totale de 30 h de bioconversion, 19, 1% de methacrylamide contenant moins de 100 ppm de methacrylonitrile sont obtenus. Le produit est séparé du catalyseur par filtration sur 0.2 u. m, puis cristallisé avec un rendement de 46%. It EXEJ \ 1PLE 9: bioconversion test n 2
20 g of immobilized MW-3 and drained as described in Example 7 are added to 811 g of deionized water containing 148 ppm of sodium acrylate, pH 8.0. The temperature of the mixture is maintained at 20 C with stirring of 200 rpm. 189 ml of methacrylonitrile are added at a constant rate for 24 hours. After a total of 30 hours of bioconversion, 19.1% methacrylamide containing less than 100 ppm methacrylonitrile are obtained. The product is separated from the catalyst by filtration on 0.2 μ. m, then crystallized with a yield of 46%.

J/EXEMPLE 10 : essai de bioconversion n 3
3 g d'une suspension de cellules libres de MW-3 (310 mg de cellules sèches dans 0.85% NaCl) sont ajoutés à 687 g d'eau déionisée contenant 148 ppm EXAMPLE 10 Bioconversion Test No. 3
3 g of a suspension of free MW-3 cells (310 mg of dry cells in 0.85% NaCl) are added to 687 g of deionized water containing 148 ppm

d'acrylate de sodium, pH 8,0. Ce mélange étant maintenu à 20 C sous une agitation de 200 rpm, 389 ml d'acrylonitrile sont ajoutés à un débit constant durant 16 h. Après une durée totale de bioconversion de 24 h, une solution de 42% d'acrylamide contenant moins de 50 ppm d'acrylonitrile résiduel est obtenue. Les cellules sont séparées du produit final par filtration sur 0. 2 am. sodium acrylate, pH 8.0. This mixture being maintained at 20 ° C. with stirring of 200 rpm, 389 ml of acrylonitrile are added at a constant flow rate for 16 hours. After a total bioconversion time of 24 hours, a solution of 42% of acrylamide containing less than 50 ppm of residual acrylonitrile is obtained. The cells are separated from the final product by filtration over 0.2 am.

Claims

1 / Process for the manufacture of amides consisting in hydrating a nitrile to a corresponding amide, in the presence of a nitrile hydratase of microbiological origin, characterized in that the said nitrile hydratase is produced by a bacterium belonging to the species Rhodococcus pyridinovorans .

2 / A method according to claim 1, characterized in that the bacteria are cultured in the presence of cobalt ions.

3 / A method according to claim 2, characterized in that the final concentrations of cobalt (CoCLrôHO base) are between 10 and 40 mg / l, preferably between 15 and 30 mg / l.

4 / A method according to the preceding claim, characterized in that the bacteria are cultured in the presence of urea or its derivatives.

5 / A method according to claim 4, characterized in that the final concentrations of urea or its derivatives are between 5 and 50 g / l, preferably greater than 10 g / L.

6 / A method according to one of the preceding claims, characterized in that bacteria are cultured in the presence of a carbon source whose nominal concentrations vary between 5 and 50 g / l, preferably between 12 and 30 g / L.

7 / A method according to one of the preceding claims, characterized in that the bacterium used is the strain MW3 filed on January 24, 2002 at the CNCM under number CNCM 1-2772 and the mutants of this strain.

8 / A method for culturing bacteria belonging to the Rhodococcus pyridinovorans species, characterized in that the medium contains cobalt ions in concentrations of between 10 and 40 mg / L (CoClHO base), preferably between 15 and 30 mg / L.

9 / A method according to claim 8, characterized in that the medium contains urea or its derivatives in final concentrations of between 5 and 50 g / l, preferably greater than 10 g / l.

10 / A method according to one of claims 8 or 9, characterized in that the medium contains a carbon source whose nominal concentrations vary between 5 and 50 g / l, preferably between 12 and 30 g / L.

11 / MW3 strain belonging to Rhodococcus pyridinovorans deposited on January 24, 2002 at the CNCM under the number CNCM 1-2772 and the mutants of this strain.

DEPOSITOR: S. N. F.

REPRESENTATIVE: CABINRZLAURENT & CHARRAS