FR2834899A1

FR2834899A1 - Nouvelle application therapeutique des facteurs g-csf, gm-csf et scf

Info

Publication number: FR2834899A1
Application number: FR0200611A
Authority: FR
Inventors: Didier Pourquier; Didier Moukoko
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2002-01-18
Filing date: 2002-01-18
Publication date: 2003-07-25
Anticipated expiration: 2022-01-18
Also published as: WO2003061686A1; FR2834899B1

Abstract

L'invention concerne une nouvelle application thérapeutique de l'un au moins des facteurs choisis parmi le G-CSF (Facteur de Stimulation des Colonies de Granulocytes), le GM-CSF (Facteur de Stimulation des Colonies de Granulocytes et de Macrophages) et le SCF (Facteur des Cellules Souches). Ce facteur est utilisé dans la préparation d'un médicament utile comme traitement adjuvant dans un processus de reconstruction de la peau, le médicament étant destiné à l'administration par voie générale. Le G-CSF, le GM-CSF et le SCF sont utiles notamment comme médicament dans le traitement des brûlures de la peau.

Description

Nouvelle application thérapeutique des facteurs G-CSF, GM-CSF et SCF L'invention concerne une nouvelle application thérapeutique du G-CSF, du GM-CSF et du SCF, et plus particulièrement leur utilisation pour la préparation d'un médicament utile en médecine humaine ou vétérinaire.

Le G-CSF (abréviation de "Granulocyte Colony-Stimulating Factor", c'est à dire "Facteur de Stimulation des Colonies de Granulocytes"), le GM-CSF (abréviation de "GranulocyteMacrophage Colony-Stimulating Factor", c'est à dire "Facteur de Stimulation des Colonies de Granulocytes et de Macrophages") et le SCF (abréviation de "Stem Cell Factor", c'est à dire "Facteur des Cellules Souches") sont des facteurs de croissance. Ils correspondent à trois des classes de cytokines appelées facteurs de croissance hématopoïétique ou CSF (Colony-Stimulating Factors). Les CSF forment une famille de glycoprotéines ayant des fonctions capitales dans la formation des cellules sanguines.

Le G-CSF stimule la production des cellules hématopoïétiques et de manière prédominante la production de polynucléaires. Le G-CSF est une glycoprotéine et le produit de l'expression d'un gène situé sur le chromosome 17. Il est produit par différentes cellules, telles que les fibroblastes, macrophages, cellules endothéliales, cellules épithéliales. Le G-CSF est détectable dans le sang, il peut être purifié à partir de surnageants de cultures de cellules tumorales humaines.

Le génie biologique permet aussi de produire un allotype humain de G-CSF, le G-CSF recombinant humain (rHuG-CSF).

En France deux médicaments appartenant à la classe du G-CSF sont disponibles : le Neupogen (r-metHuG-CSF, Filgrastime, commercialisé par Amgen/Produits Roche), et le Granocyte (rHuG-CSF, Lénograstime, commercialisé par les Laboratoires

Aventis/Chugai). Ces deux médicaments sont utilisés par voie d'injection sous-cutanée ou par perfusion intraveineuse, pour une administration systémique, à des doses généralement comprises entre 5 et 10 g par kilogramme de poids corporel et par jour.

Les indications actuelles du G-CSF en thérapeutique humaine sont le traitement des neutropénies chroniques sévères, la réduction des neutropénies induites par les traitements chimiothérapiques anticancéreux myélotoxiques, la réduction des neutropénies induites par les thérapeutiques myélosup- pressives (chimiothérapie ou radiothérapie) suivies de greffe de moelle dans le traitement des cancers ou des leucémies, la mobilisation des cellules souches hématopoïétiques pour constitution d'un greffon en vue d'une greffe de moelle (autogreffe ou allogreffe).

Il est à souligner que, dans cette dernière utilisation, l'objectif du traitement est de faire sortir de la moelle osseuse les cellules souches hématopoïétiques et de les faire passer dans le sang circulant. Ces cellules souches sont alors recueillies par cytaphérèses successives et vont constituer le greffon. Il s'agit donc de mobiliser au maximum vers le sang circulant ce contingent de cellules souches hématopoïétiques qui, à l'état normal, se trouvent en quantité très réduite dans le sang circulant, ce qui ne permet pas de constituer un greffon de qualité suffisante (ceci est résumé dans le terme "mobilisation" de la moelle osseuse).

Cette technique de recueil du greffon par cytaphérèse après mobilisation des cellules souches est venue remplacer avantageusement le recueil direct de la moelle osseuse par cytoponction qui nécessite une anesthésie du patient et de multiples ponctions de moelle. Le greffon ainsi constitué est ensuite transfusé au patient, dont la propre moelle a été détruite par la chimiothérapie ou la radiothérapie ; il

constitue alors la nouvelle source de production des cellules sanguines.

Le G-CSF est utilisé de manière quotidienne pour ces différentes indications. Son innocuité largement reconnue permet de l'utiliser aussi chez des personnes en bonne santé pour constituer des greffons de moelle dans le cadre des allogreffes.

Le GM-CSF stimule à la fois la production de polynucléaires mais aussi celle des macrophages. Le gène contrôlant la production du GM-CSF est situé sur le chromosome 5. Le génie biologique permet de produire une forme recombinante humaine du GM-CSF, le rHuGM-CSF. Les indications cliniques du rHuGMCSF sont identiques à celles de G-CSF. En France le rHuGM-CSF est disponible sous la forme du Leucomax (Molgramostime, distribué par le laboratoire Shering-Plough/Novartis). Il est utilisé par voie intraveineuse ou sous cutanée à la dose de 5g à 10 g par kilogramme de poids corporel et par jour.

Le SCF (abréviation de "Stem Cell Factor", c'est à dire "Facteur de Cellules Souches") est lui aussi un facteur de croissance. Il agit en particulier comme facteur de croissance sur les progéniteurs hématopoïétiques, et peut mobiliser les cellules souches de la moelle vers le sang. Il agit aussi sur la différenciation et le fonctionnement des mastocytes. Il agit par le biais d'un récepteur spécifique de la famille des tyrosines kinases de type III (c-KIT). gène codant la production du SCF est situé sur le chromosome 12.

En France le SCF n'est pas d'usage clinique quotidien, il est disponible pour des essais thérapeutiques sous forme de recombinant humain (Ancestim, Recombinant-methionyl Human Stem Cell Factor (R-metHuSCF)dénomination anglaise} sous la dénomination de Stemgendénomination anglaise}, produit de la société Amgen).

Il est à noter que les recombinants humains du G-CSF sont efficaces sur d'autres espèces animales (Gratwohl et col : Transplantation of G-CSF mobilized allogeneic peripheral

blood stem cells in rabbits. Bone Marrow Transplant 1995 ;16(1):63-68) ; Nohynek GJ et col : of potency of glycosylated and non glycosylated recombinant human granulocyte colony-stimulating factors in neutropenic and non neutropenic CD rats (Cancer Chemother Pharmacol.1997;39:259- 266).

Il est à noter que de nouvelles classes de molécule peuvent augmenter le pouvoir mobilisateur des facteurs de croissance sur la moelle osseuse (Kronenwett R et col: The role of cytokines and adhesion molécules for mobilisation of peripheral blood stem cells. Stem Cells 2000;18:320-330 ; Pless M et col :. of growth factors during mobilization of peripheral blood precursors cells with recombinant Flt3ligand and granulocyte colony-stimulating factor in rabbits. Exp Hematol 1999;27:155-161 ; Kikuta T et col : of hematopoietic primitive and commited progenitor cells into blood in mice by anti-vascular adhesion molecule-1 antibody alone or in combination with granulocyte colony-stimulating factor. Exp Hematol.2000;28:311-317 ; Sweeney EA et col:Increase in circulating SDF-1 after treatment with sulfated glycans. The role of SDF-1 in mobilization. Ann N Y Acad Sci 2001;938:48-52 ; Papayannopoulou R et col:
Synergistic mobilization of hematopoietic progenitor cells using concurent betal and beta2 integrin blockade or beta2- deficient mice. Blood 2001;97:1282-1288 ; Christ 0 et col:
Combining G-CSF with a blockade of adhesion strongly improves the reconstitutive capacity of mobilized hematopoietic progenitor cells. (Exp Hematol 2001;29:380-390). Cependant le
G-CSF lui même possède un pouvoir mobilisateur indirect de la moelle en plus de son effet prolifératif sur la lignée hématopoïétique (Levesque JP et col : cell adhesion molecule-l(CD106) is cleaved by neutrophil proteases in the bone marrow following hematopoietic progenitor cell mobiliza- tion by granulocyte colony-stimulating factor. Blood 2001;98- :1289-1297).

Il convient de rappeler que la moelle osseuse, répartie dans les différents os de l'organisme, est le lieu de production des cellules sanguines matures (érythrocytes, plaquettes, polynucléaires, monocytes, lymphocytes). La production de ces cellules sanguines s'effectue à partir de la multiplication et de la différenciation d'une population de cellules souches (Cellule Souche Hématopoïétique, en abréviation "CSH"). Ces dernières représentent quantitativement une fraction très réduite de la population cellulaire de la moelle osseuse.

Elles sont classiquement caractérisées par l'expression d'un marqueur cellulaire appelé CD34 (Cluster de Différenciation 34).

Cependant il a été décrit un autre type de cellules souches de la moelle osseuse. Cette population de cellules souches constitue, elle aussi, à l'état normal un contingent très réduit des éléments cellulaires de la moelle osseuse mais présente la capacité de se différencier dans de multiples directions de nature conjonctive (os, cartilage, fibrotendon, muscle, graisse)(Pittenger et col : potential of human mesenchymal stem cells. Science 1999 ; 284 : 143-147 ; Dennis et col: A quadripotential mesenchymal progenitor cell isolated from the marrow of an adult mouse. J Bone Miner Res 1999 ; 14 (5): 700-709 ; Seshi et col : bone marrow stromal cell : of markers specific for multiple mesenchymal stem lineage. Blood Cell Mol Dis 2000 (3): 246), mais aussi de nature nerveuse (Woodbury D et col : rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons. J Neurosci Res 2000;61:364-370 ; Sanchez-Ramos J et col : Adult bone marrow stromal cells differentiate into neural cells in vitro. Exp Neurol.2000;164:247-256 ; Mezey E et col : blood into brain : bearing neuronal antigens generated in vivo from bone marrow. Sience 2000;290:1672-1674 ; Azizi SA et col : and migration of human bone marrow stromal cells implanted in brains of albino rats-similarities to astrocytes graft. Proc
Nat Acad Sci.1998;95:3908-3913 ; Kopen GC et col : stromal cells migrate throuhout forebrain and cerebellum, and they differentiate into astrocytes after injection into

neonatal mouse brains. Proc Nat Acad Sci.1999;96;10171-10716; Brazelton TR et col : marrow to brain : of neuronal phenotypes in adult mice. Science 2000;290:1775- 1779), endothéliale (Shi Q et col : for circulating bone marrow-derived endothelial cells. Blood 1998;92:362-367; Asahara T et col : marrow origin of endothelial progenitor cells responsible for post natal vasculogenesis in physiological and pathological neovascularization. Circ Res 1999;85:221-228) ou encore hépatique (Lagasse E et col: Purified hematopoietic stem cells can differentiate into hepatocytes in vivo. Nature Medecine.2000;6:1229-1234). La moelle osseuse en tant que source particulièrement puissante de cellules souches pluripotentes est clairement indiquée par le récent travail de Krause et collaborateurs (Krause D et col : Multi-organ, multi-lineage engraftment by a single bone marrow-derived stem cell. Cell 2001 ; avec dans cette dernière étude un réensemencement de la totalité du tissu hématopoietique à partir d'une unique cellule greffée, et des voies de differentiations in vivo très nombreuses avec des cellules "filles" retrouvées dans de multiples organes (foie, tube digestif, poumon, peau). Ces cellules souches sont appelées cellules souches pluripotentes (en abréviation "CSP") ou aussi cellules souches adultes par opposition aux cellules souches provenant d'embryons.

Il est à noter que la moelle osseuse n'est pas l'unique source de cellules souches. Certaines zones du cerveau peuvent donner des cellules souches pluripotentes (Bjornson CRR et col : brain into blood : a hematopoietic fate adopted by adult neural stem cells in vivo. Science 1998;283:534-537 ; Rietze RL et col : of a pluripotent neural stem cell from the adult mouse brain.

Nature 2001;412:736-739), de même que le muscle (Jackson KJ et col : potential of stem cells isolated from murine skeletal muscle. Proc Natl Acad Sci USA.1999;96:14482- 14486),ou la peau (Fu X et col: Dedifferentiation of epidermal cells to stem cells in vivo ; Lancet2001;358:1067- 1068 ; Toma JG et col:Isolation of multipotent adult stem

cells from the dermis of mammalian skin. Nat Cell Biol 2001;3:778-784).

Cependant la moelle osseuse est à ce jour la source la mieux connue de cellules souches, et aussi la source la plus aisément "manipulable" pharmacologiquement, en particulier à cause de la grande expérience clinique acquise dans le domaine de l'hématologie et de la cancérologie.

Cette population de cellules souches est l'objet actuellement d'une activité de recherche intense, en particulier dans les domaines de la réparation osseuse, de la cardiologie, de la neurologie, de l'hématologie, ceci dans le cadre des domaines émergents de la médecine que sont l'ingénierie tissulaire et la thérapie cellulaire. Cependant, ces cellules souches constituant au départ une quantité de cellules particulière ment faible, les techniques utilisées font le plus souvent appel à un passage in vitro. Pour résumer, on recueille la moelle osseuse, puis in vitro on sépare le contingent des cellules souches du reste des cellules de la moelle, et ces cellules sont ensuite cultivées et multipliées toujours in vitro. Eventuellement elles sont aussi poussées artificiellement dans le sens d'une différenciation spécifique. Par la suite elles sont réinjectées ou réimplantées dans un site anatomique où elles contribuent à la reconstitution d'un tissu délabré, qui peut être un os (Bruder et col : Boneregeneration by implantation of purified culture-expended human mesenchymal stem cells. J Ortho Res 1998 ; 16(2) : 155- 162) ou bien un tendon (Awad HA et col : Autologousmesenchy- mal stem cell-mediated repair of tendon. Tissue Eng 1999;
5:267-277 ; Butler DL et col: Perspectives on cell and collagen composites for tendon repair. Clin Orthop 1999 ; 367Suppl : S 324-332), du muscle cardiaque (Jackson KA et col: Regeneration of ischemic cardiac muscle and vascular endothelium by adult stem cells. J Clin Invest 2001;107:1395- 1402 ; Orlic D et col : marrow cells regenerate infarcted myocardium. Nature 2001;410:702-705). Ces techniques nécessitent cependant une collaboration avec des laboratoires très spécialisés, ce qui limite leur usage clinique quotidien.

Les cellules souches de la moelle sont aussi d'un grand intérêt dans le cadre de la thérapie génique où elles peuvent servir de support au transfert de gènes. De multiples domaines de la pathologie sont concernés (Schwarz EJ et col :Multipotential marrow stroma cells transducted to produce L-DOPA: engraftment in rat model of Parkinson disease. Hum Gene Ther 1999;10:2539-2545 ; Ding L et col :Bone stromal cells as a vehicle for gene transfer. Gene Ther 1999;6:1611-1616).

Bien qu'ayant initialement prêté à discussions (Purton LE et col : Monocytes are the likely candidate "stromal" cell in GCSF-mobilized peripheral blood. Bone Marrow Transplant.1998;21:1075-1076), la présence d'un contingent circulant de cellules souches pluripotentes (Cellules Souches Pluripotentes Circulantes en abréviation "CSPC") est actuellement de mieux en mieux documenté (Huss R et col : of peripheral blood-derived, plastic-adhérent CD34(-/low) hematopoietic stem cell clones with mesenchymal stem cell characteristics. Stem Cell 2000 ; 18(4) : 252-260 ; Zvaifler NJ et col : Mesenchymal precursor cells in blood of normal individuals; Arthritis Res 2000;2:477-488 ; Lange et col : Hematopoietic reconstruction of syngenic mice with a periph eral blood-derived, monoclonal CD34-, Sca-1+, Thyl(low), ckit+ stem cell ligne. J Hematother Stem Cell Res. 1999 ; 8 (4): 335-342 ; Kuznetsov SA et col :Circulating stem cells : J Cell Biol 2001;153:1133-1140). La voie de différeciation endothéliale de ces cellules est aussi explorée (Rafii S : Circulating endothelial precursors :mystery, and promise. J Clin Invest 2000;105:17-19, Boyer M et col: Isolation of endothelial cells and their progenitor cells from human peripheral blood. J Vasc Surg 2000;31:181-189). La mobilisation de cellules souches depuis la moelle osseuse vers le sang par l'ischémie des tissus (Takahashi T et col: Ischemia-and cytokine-induced mobilization of bone marrowderived endothelial progenitor cells for neovascularization Nature Medecine 1999; 5 :434-438), les traumatismes vasculaires ou les brûlures est aussi documenté(Gill M et col: Vascular trauma induces rapid but transient mobilization of

VEGFR2 (+)AC133(+) endothelial precursor cells. Cir Res 2001;88:167-174). Le VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) serait un des médiateurs impliqués dans le processus de mobilisation(Asahara T et col : contributes to postnatal neovascularisation by mobilizing bone marrowderived endothelial progenitor cells. EMBO J 1999;18:1364- 1372 ; Moore MA et col : of endothelial and hematopoietic stem and progenitor cells by adenovectormediated elevation of serum levels of SDF-1, VEGF, and angiopoietin-l.Ann N Y Acad Sci 2001;938:36-45). Ces derniers travaux pourraient indiquer qu'un processus de mobilisation des cellules souches de la moelle osseuse est un mécanisme physiopathologique déjà utilisé par l'organisme dans certaines situations pathologiques.

De même que pour les cellules souches de la moelle, les CSPC sont un support au transfert de gènes (Bodine DM et col: Efficient retrovirus transduction of mouse pluripotent hematopoietic stem cell mobilized into the peripheral blood by treatment by granulocyte colony-stimulating factor and stem cell factor. Blood 1994;84:1482-1491).

Des travaux récents sont aussi venus suggérer un mécanisme de recrutement des CSPC dans les processus de cicatrisation fibroconjonctive sur des modèles animaux in vivo (Abe R et col : Peripheral blood fibrocytes: Differenciation patways and migration to wound sites. The J Immunol 2001;166:7556-7562 ; Bucala R et col : fibrocytes define a new leukocyte subpopulation that mediates tissue repair. Mol
Med.1994;1:71-81). Les CSPC sont aussi soupçonnées de participer à la pathogénèse de processus de fibrose pathologique (sclérodermie)(Chesney J et col : blood fibrocytes:mesenchymal precursor cells and the pathogenesis of fibrosis. Curr Rheumatol Rep.200;2:501-505).

L'implication de ces cellules souches circulantes était cependant soupçonnée depuis longtemps dans certaines patho- logies spécifiques (Labat ML et col : origin of fibroblasts:spontaneous transformation of blood monocytes into neofibroblastic structures in osteomyeloslerosis and

Engelmann's disease. Biomed Pharmacother.1991;45:289-299 ; Labat ML et col : Possible monocytic origin of chondrosarcoma: in vitro transdifferenciation of blood monocytes-like cells from a patient with chondrosarcoma into chondrocyte-like cell. Biomed Pharmacother 1997 ; Des mécanismes immunologiques originaux viendraient aussi contrôler la prolifération et la différenciation de ces CSPC (Labat M L et col : Régulation by phagic T-lymphocytes of a (pluripotent?- ) organ stem cell present in adult human blood. A beneficial exception to self-tolerance. Biomed Pharmacother 2001;55:79- 90) A rappeler aussi qu'au cours des processus de réparation tissulaire, il existe d'une manière générale une contribution de cellules souches locales, les cellules basales de l'épiderme contribuent ainsi à la réparation de la peau, les cellules satellites du muscle contribuent de même à la réparation musculaire, les éléments cellulaires de la couche basale du périoste contribuent classiquement à la reconstruction osseuse. Certains tissus comme l'os en cas de fracture ou la peau en cas de brûlure superficielle sont capables d'une reconstitution "ad integrum".

D'autres tissus, comme le coeur et le cerveau, étaient jusqu'à maintenant réputés incapables de se régénérer après leur destruction (infarctus du myocarde ou accident vasculaire cérébral). Cependant des travaux récents ont montré en fait une certaine capacité du tissu cardiaque à se régénérer à partir des cellules de la bordure des zones lésées (Bel- trami AP et col : that human cardiac myocytes divide after myocardial infarction. New Engl J Med 2001;344:1750- 1757). L'activation de cellules souches déjà présentes au niveau du cerveau est aussi discutée (Kondo T et col: Oligodendrocytes precursor cells reprogrammed to become multipotential CNS stem cells : Science2000;289:1754-1757), remettant en cause des concepts anciens, en particulier le caractère irréversible de la différenciation cellulaire. La place des CSPC dans ces processus de régénération est encore discutée mais les travaux de thérapie cellulaire récents

5 10 15 20 25 30 35 indiquent des possibilités importantes pour le coeur (Jackson KA et col: Regeneration of ischemic cardiac muscle and vascular endothelium by adult stem cells. J Clin Invest 2001;107:1395-1402 ; Orlic D et col : marrow cells regenerate infarcted myocardium. Nature 2001;410:702-705 ; Kocher AA et col : of ischemic myocardium by human bone-marrow-derived angioblast prevents cardiomyocyte apoptosis, reduces remodeling and improves cardiac function. Nature Medecine. 2001;7:430-436). Il est à remarquer que dans le cas des travaux de Kocher AA et col, le "greffon" de cellules souches se fait non pas à partir d'un prélèvement direct de moelle, mais à partir des cellules souches mobilisées depuis la moelle osseuse vers le sang, suggérant le même potentiel biologique pour les CSPC que pour les CSP de la moelle osseuse. Le travail de Jackson KA et col est aussi d'un grand intérêt puisque après irradiation et greffe de moelle de cellules souches marquées, ces travaux indiquent aussi une migration des cellules souches marquées vers le site intracardiaque de l'infarctus du myocarde. On retrouve ici la notion de recrutement spécifique des cellules souches circulantes dans l'espace tissulaire en cours de reconstruction.

Dans le domaine de la pathologie cérébrale, la délivrance locale de cellules souches semble apporter un bénéfice thérapeutique (Eglitis MA et col : of bone marrow- derived astrocytes to the ischemic brain.Neurore- port1999;10:1289-1292 ; Lu D et col : adminis- tration of marrow stromal cells in a rat model of traumatic brain injury. J Neurotrauma 2001;18:813-819 ; Chen J et col: Therapeutic benefit of intracerebral transplantation of bone marrow stromal cells after cerbral ischemia in rats. J Neurol Sci. 2201;189:49-57) ; Mahmood A et col : bone marrow transplantation after traumatic brain injury improving functional outcome in adult rats. J Neurosurg 2001;94:589- 595).

Au total il ressort de l'ensemble de ces observations que la moelle osseuse constitue une réserve majeure de cellules

souches pluripotentes. Ces cellules souches sont retrouvées dans le sang circulant, le nombre de CSPC peut être augmenté par l'utilisation de facteurs de croissance tels que le GCSF, le GM-CSF ou le SCF par mobilisation de ces cellules souches de la moelle osseuse vers le sang. Ce processus de mobilisation des cellules souches de la moelle vers le sang pourrait exister à l'état naturel comme mécanisme de réponse à des situations de souffrance ou d'agression tissulaire. Un mécanisme de recrutement à l'état naturel des CSPC est aussi discuté, en particulier dans les processus de réparation fibrocicatriciel, mais a aussi été suggéré sur des modèles expérimentaux de souffrance tissulaire et des modèles pathologiques spécifiques.

Les Demandeurs ont largement exposé dans le cadre de la pathologie ostéo-articulaire l'intérêt de la mobilisation des cellules souches de la moelle osseuse par le G-CSF et l'existence d'un recrutement de ces cellules dans les espaces tissulaires de reconstruction de l'os.

Différents travaux des Demandeurs ont déjà indiqué que, dans le domaine de la pathologie ostéoarticulaire, un mécanisme de recrutement local des CSPC au cours des fractures osseuses était mis en oeuvre en particulier par le biais de l'activation du périoste. Ces cellules souches, en sortant des vaisseaux, sont mises à la disposition du processus de reconstruction tissulaire local comme des "briques" contribuant à la construction d'un édifice et viennent compléter l'apport direct des cellules souches locales. En terme quantitatif, l'importance du recrutement local de CSPC est cependant dépendante du nombre de cellules souches présentes dans le courant sanguin au niveau des vaisseaux situés dans la zone de reconstruction tissulaire. Comme déjà mentionné, cette population de cellules souches est, chez le sujet en bonne santé, quantitativement très réduite dans la moelle osseuse et le sang circulant. Cependant, le G-CSF, le GM-CSF et le SCF possèdent un puissant pouvoir prolifératif et de mobilisation sur la moelle osseuse. Bien que la lignée hématopoïétique soit surtout concernée par ce pouvoir

prolifératif, le contingent de cellules souches pluripotentes est aussi concerné ; ces différents facteurs de croissance en augmentant le nombre de CSPC dans le sang circulant peuvent mettre à la disposition du processus de reconstruction tissulaire un nombre de cellules souches supérieur à celui que la nature aurait pu fournir à l'état naturel. A partir de la même hypothèse physiopathologique l'utilité du G-CSF comme traitement adjuvant au processus de réparation osseuse et cartilagineuse était démontré dans les travaux des Demandeurs. Les travaux récents menés dans le domaine de la pathologie cardiaque semblent conforter cette hypothèse avec un bénéfice thérapeutique du G-CSF combiné au SCF pour le traitement de l'infarctus du myocarde en réduisant la surface finale de l'infarctus et en préservant la fonction cardiaque. (Orlic D et col: Mobilized bone marrow cells repair the infarcted heart, improving function and survival Proc Natl Acad Sci USA 2001 ;98 :10344-10349).

Dans ce contexte, les Demandeurs ont testé in vivo l'influence d'un traitement par facteurs de croissance sur des lésions de brûlure de la peau. Il est à souligner à nouveau que les brûlures semblent induire une mobilisation des cellules souches de la moelle (dans la variante des précurseurs endothéliaux) (Gill M et col : trauma induces rapid but transient mobilization of VEGFR2(+)AC133(+) endothelial precursor cells. Cir Res 2001;88:167-174). Il est à noter aussi que les brûlures étaient déjà connues pour modifier le processus d'hématopoïèse (Wallner S et col : The haematopoietic response to burning in an animal model. Burns Incl Therm Inj 1984;10 : 236-251 ; Gamelli RL et col : Effect of burn injury on granulocyte and macrophage production. J Trauma 1985 ; 25 : 615-619 ; Santangelo S et col :Myeloid commitment shifts toward monocytopoiesis after thermal injury and sepsis. Annals of Surgery 2001 ; 233 : 97-106), ce qui soulève la question d'une réponse de la moelle osseuse à l'agression de la peau. Le M-CSF (macrophage colony-stimula ting factor) pourrait être impliqué (Fukusawa K et col : Thermal injury increases macrophage colony-stimulating factor levels in plasma and injured skin in mice (abstract).

American Association for the Surgery of Trauma. 1997 ; 75 : 293) dans ce processus. Sur la base des données précédentes, les Demandeurs ont étudié l'influence de la stimulation de la moelle osseuse par le G-CSF, le GM-CSF et le SCF sur le processus de réparation de la peau.

Les Demandeurs ont trouvé, de manière surprenante, une nouvelle application thérapeutique du G-CSF et du GM-CSF et du SCF tel que définis plus haut. Il a été découvert, à la suite de ces travaux, que le G-CSF et le GM-CSF et le SCF pouvaient être utilisés dans la préparation d'un médicament pour le traitement adjuvant au processus de reconstruction de la peau chez un être vivant, le médicatment étant destiné à l'administration par voie générale.

Conformément à l'invention, on peut utiliser l'un au moins de ces trois facteurs, c'est-à-dire soit un seul facteur, soit deux facteurs, soit les trois facteurs.

Il est à rappeler que les brûlures de la peau d'origine thermique ou chimique constituent en fonction de leur étendue et de leur profondeur une pathologie grave impliquant la survie des patients ou des séquelles esthétiques et fonctionnelles majeures. Le traitement standard comporte des mesures de réanimation médicales destinées à compenser les pertes hydriques, des mesures de lutte contre l'infection avec l'utilisation des chambres stériles, et des techniques de "couverture" des téguments brûlés, l'utilisation de greffes de peau est aussi d'usage courant.

On décrira maintenant un exemple expérimental.

Deux groupes d'animaux ont été constitués: Un premier groupe (A) (groupe témoin) comportait 20 rats adultes jeunes, et on réalisait sur le dos de chaque animal une large brûlure calibrée quand à sa surface et son intensité. On réalisait ensuite une "couverture" des téguments brulés à l'aide de pansements adaptés.

Un deuxième groupe (B) comportait un nombre identique d'animaux de même âge et de même poids et on réalisait le même type de brûlure. Cependant, immédiatement après l'intervention et les quatre jours suivant l'intervention, on procédait à une injection de rmetHuG-CSF (Neupogen {filgrastime} Amgen Inc Californie USA/ Produits Roche France) par voie sous cutanée à la dose de 10 g (1MU) par kilogramme de poids corporel.

Afin de travailler véritablement "en aveugle" et dans le but de ne pas influencer la qualité de la brûlure et des procédures de mise en place des pansements le chirurgien ignorait si l'animal opéré appartenait au groupe A ou au groupe B.

Les deux groupes d'animaux étaient ensuite laissés sans autre traitement, hormis l'apport en eau et nourriture nécessaire aux besoins vitaux. Quinze jours suivant la date de l'intervention on évaluait la qualité de la cicatrisation dans chaque groupe d'animaux. On relevait un bénéfice significatif dans le groupe B.

L'invention concerne donc plus particulièrement l'utilisation de l'un au moins des facteurs choisis parmi le G-CSF, le GMCSF et le SCF dans la préparation d'un médicament pour le traitement adjuvant dans des processus de reconstruction du tissu cutané. Il trouve ainsi une application nouvelle et intéressante dans les thérapeutiques chirurgicales et/ou médicales utilisées dans le cadre des brûlures.

Conformément à l'invention, le G-CSF, le GM-CSF, le SCF peuvent être utilisés comme médicament dans le traitement des brûlures de la peau. Dans cette application, le G-CSF, le GMCSF et le SCF sont destinés à l'administration par voie générale.

Il entre également dans le cadre de l'invention d'utiliser le G-CSF, le GM-CSF, ou le SCF comme médicament destiné à l'administration par voie générale et de le combiner à au

moins un autre facteur destiné à l'administration locale ou par voie générale. L'expression "administration locale" signifie que l'administration du principe thérapeutique s'effectue sur le site anatomique où l'on souhaite reconstruire le tissu nerveux.

Cet autre facteur est avantageusement choisi parmi l'un au moins des facteurs suivants : G-CSF (granulocyte colony stimulating factor), le GM-CSF (granulocytemacrophage colony stimulating factor), le SCF (stem cell factor), BMP (Bone Morphogenetic Protein), FGF (fibroblast growth factor), EGF (epidermal growth factor), IGF (insuline-like growth factor), Insuline, KGF (keratinocyte growth factor), TGF (transforming growth factor), Interféron, Interleukine, VEGF (vascular endothélial growth factor), TNF (tumor necrosing factor), GDNF (glial cell ligne-derived neurotrophic factor), NGF (neurotrophin nerve growth factor), , HGF (hepatocyte growth factor), Erythropoïetine, PDGF (platelet-derived growth factor), Héparane Sulfate, Prostaglandines, Ostéoglycine (osteoinductive factor), BCDF (B cell differentiation factor), GDF-5 (growth and differentiation factor-5), Hormone de Croissance ; M-CSF (macrophage colony stimulating factor) ; ou tout facteur de croissance connu d'origine humaine ou animale, d'extraction ou recombinant ; tout facteur biologique renforcant le pouvoir de mobilisation des cellules souches de la moelle osseuse vers le sang circulant.

Pour la mise en oeuvre de l'invention, le G-CSF, le GM-CSF, le SCF sont avantageusement un recombinant humain (pour la médecine humaine), ou la Filgrastime, la Lénograstime, la Molgramostime, l'Ancestim.

Le G-CSF, le GM-CSF et le SCF utilisés seront de préférence d'un allotype humain dans le cadre du traitement d'une personne humaine. Le dosage utilisé sera généralement de 0,1 à 1000 g par kilogramme de poids corporel et par jour. De manière préférentielle on utilisera une dose de 5 à 10 pg par kilogramme de poids corporel et par jour.

5 10 15 20 25 30 35 Le principe de l'invention veut que le G-CSF, le GM-CSF, le SCF soient administrés par voie générale, ce qui signifie que le G-CSF, le GM-CSF,le SCF, entrent dans la circulation sanguine générale. Le mode de délivrance pour obtenir une administration par voie générale peut comprendre un mode par injection intravasculaire directe, un mode par injection sous-cutanée, par injection intramusculaire, par injection intra-articulaire, une délivrance par voie digestive, injection intrapéritonéale, délivrance transpulmonaire, transcutanée, transbuccale, transnasale, transrectale, transconjonctivale, intrarachidienne.

Le principe biologique de l'invention est de mobiliser les CSP de la moelle osseuse vers le sang circulant. Cette augmentation du nombre de cellules souches dans la circulation sanguine permet au processus biologique de reconstruction du tissu nerveux de recruter une quantité de CSPC supérieure à la quantité de CSPC que la nature aurait pu fournir à l'état physiologique.

L'invention sera maintenant décrite en référence à un exemple clinique.

Dans le cadre du traitement des brûlures, on utilisera le traitement standard de réanimation médicale, de prévention des infections, de couverture des téguments brûlés.

Le traitement adjuvant comportera une première dose de 10 g (1 MU) par kilogramme de poids corporel de G-CSF (Neupogen, Filgrastime) qui sera injectée par voie sous-cutanée au patient dès son admission à l'hôpital. La même dose sera injectée de manière quotidienne pendant les quatre jours suivants.

Bien entendu l'exemple ci-dessus est donné seulement à titre illustratif et n'entend pas limiter la portée de l'invention.

Claims

Revendications 1. Utilisation de l'un au moins des facteurs choisis parmi le G-CSF (Facteur de Stimulation des Colonies de Granulocytes), le GM-CSF (Facteur de Stimulation des Colonies de Granulocy tes et de Macrophages) et le SCF (Facteur des Cellules Souches), pour la préparation d'un médicament utile comme traitement adjuvant dans un processus de reconstruction de la peau chez un être vivant, le médicament étant destiné à l'administration par voie générale.
2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que le G-CSF, le GM-CSF, le SCF sont utilisés comme médicament dans le traitement des brûlures de la peau.
3. Utilisation selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisée en ce que le G-CSF, le GM-CSF, le SCF sont utilisés comme médicament destiné à l'administration par voie générale et sont combinés à au moins un autre facteur destiné à l'administration locale ou par voie générale.
4. Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que cet autre facteur est choisi parmi l'un au moins des facteurs suivants : BMP (bone morphogenetic protein), FGF (fibroblast growth factor), EGF (epidermal growth factor), IGF (insuline-like growth factor), Insuline, KGF (keratinocyte growth factor), TGF (transforming growth factor), Interféron, Interleukine, VEGF (vascular endothélial growth factor), TNF (tumor necrosing factor), GDNF (glial cell ligne-derived neurotrophic factor), NGF (neurotrophin nerve growth factor), HGF (hepatocyte growth factor), Erythropoïétine, PDGF (platelet-derived growth factor), Héparane Sulfate, Prostaglandines, Ostéoglycine (osteoinductive factor), BCDF (B cell differentiation factor), GDF-5 (growth and differentiation factor-5), Hormone de Croissance ; M-CSF (macrophage colony stimulating factor) ; tout facteur de croissance connu d'origine humaine ou animale, d'extraction ou recombinant ; tout facteur biologique renforcant le

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pouvoir de mobilisation des cellules souches de la moelle osseuse vers le sang circulant.
5. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le G-CSF, le GM-CSF, le SCF sont des recombinants humains.
6. Utilisation selon l'une des revendication 1 à 4, caracté risée en ce que le G-CSF est la Filgrastime.
7. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le G-CSF est la Lénograstime.
8. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le GM-CSF est la Molgramostime.
9. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le SCF est l'Ancestim.
10. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que le médicament est utilisé avec un dosage en G-CSF, en GM-CSF, en SCF de 0,1 à 1000 g, de préférence de 5 à 10 g, par kilogramme de poids corporel et par jour.
11. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que le médicament est utilisé en médecine humaine.
12. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que le médicament est utilisé en médecine vétérinaire.