FR2833273A1 - Procede de detection et d'analyse quantitative de molecules d'acides nucleiques comprenant une etape d'extraction par une base forte et applications - Google Patents
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Abstract
La présente invention est relative un procédé de détection et d'analyse quantitative de molécules d'acides nucléiques comprenant une étape d'extraction et de fractionnement aléatoire desdites molécules d'acides nucléiques par une base forte, et ses applications.
Description
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La présente invention est relative à un procédé de détection et d'analyse quantitative de molécules d'acides nucléiques comprenant une étape d'extraction et de fractionnement aléatoire desdites molécules d'acides nucléiques par une base forte, et ses applications.
On connaît différents procédés d'extraction de molécules d'acides nucléiques à partir de suspensions cellulaires. Ces procédés comprennent généralement une étape de lyse cellulaire par traitement enzymatique, osmotique ou encore chimique, suivie d'une étape d'extraction des molécules d'acides nucléiques généralement en condition alcaline. En fonction des analyses que l'on souhaite réaliser, il existe principalement deux grandes classes de procédés d'extraction, à savoir les procédés d'extraction permettant de préserver l'intégrité des molécules d'acides nucléiques (ADN) des cellules que l'on veut analyser et des procédés d'extraction conduisant au fractionnement de l'ADN.
En effet, lorsqu'il s'agit d'analyser l'effet d'un facteur extérieur, tel que par exemple l'effet de radiations ou d'un agent chimique ou biologique, il est essentiel que la procédure d'extraction et d'analyse ne provoque pas de cassure supplémentaire simple ou double brin de l'ADN, et ce afin de ne pas diminuer la sensibilité de la méthode d'analyse. Plus particulièrement, il est essentiel de bien maîtriser les conditions alcalines utilisées car elles sont souvent à l'origine d'un bruit de fond de coupures. Ces techniques d'extraction et d'analyse permettant de préserver l'intégrité des molécules d'ADN sont notamment décrites dans les articles de DEAN et al., Nature, 1966,209, 49-52 ; KOHN et al., Biochemistry, 1976,15 (21), 4629-4637 ; OSTLING et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 1984,123 (1), 291-298 ; SINGH et al., Experimental Cell Research, 1988,175, 184-191 et BIHARI et al., Comp. Biochem. Physiol., 1992,102B (2), 419-424.
Toutefois, ces méthodes d'extraction d'ADN sont souvent longues, t > et comprennent de multiples étapes limitantes, notamment des étapes d'isolement de l'ADN vis-à-vis d'autres biomolécules telles que des ARNs ou des protéines, qui sont susceptibles d'être libérées au cours des différentes étapes de traitement. Ces étapes d'isolement sont nécessaires afin de ne pas perturber, voire empêcher les mesures ultérieures.
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Certains auteurs ont néanmoins récemment mis au point une mesure sensible de l'intégrité de L'ADEN double brin, ladite mesure étant réalisée directement dans un lysat cellulaire, à l'aide d'un nouveau fluorochrome spécifique, insensible à la présence d'ARNs, d'ADN simple brin ou d'urée dans le lysat (BATEL et al., Analytical Biochemistry, 1999,270, 195-200). Ces mêmes auteurs indiquent
également que ce système de quantification ne fonctionne plus lorsque le pH du milieu Z > réactionnel dépasse 12,7.
également que ce système de quantification ne fonctionne plus lorsque le pH du milieu Z > réactionnel dépasse 12,7.
Cependant, pour la mise en oeuvre de certaines techniques d'analyses quantitatives de l'ADN, la présence de molécules d'ADN non fractionnées n'est pas adaptée. En effet, la viscosité et la taille de longues molécules d'acides nucléiques ne sont pas appropriées ou bien nécessitent d'utiliser des conditions de dénaturation ou d'hybridation ne convenant pas pour un type de détection donné.
Aussi, dans ces cas particuliers, les procédés d'extraction d'ADN doivent permettre de fractionner les molécules d'ADN.
Dans, ce but, il a déjà été proposé d'utiliser, par exemple, des traitements enzymatiques, radioactifs ou mécaniques. On peut en particulier citer comme exemple de procédé de fractionnement simple à mettre en oeuvre et ne nécessitant pas de manipulations dangereuses, comme par exemple l'utilisation de rayons X, le pipetage répété plusieurs fois de molécules d'acides nucléiques extraites à
partir de lysats cellulaires afin d'obtenir des fragments de l'ordre de 15 kilo bases (kb) C > qui sont ensuite utilisés afin de détecter les longueurs télomériques, (NAKAMURA et al., Clinical Chemistry, 1999,45 (10), 1718-1724).
partir de lysats cellulaires afin d'obtenir des fragments de l'ordre de 15 kilo bases (kb) C > qui sont ensuite utilisés afin de détecter les longueurs télomériques, (NAKAMURA et al., Clinical Chemistry, 1999,45 (10), 1718-1724).
Toutefois, ce procédé de fractionnement par pipetages successifs est Z > fastidieux, long, peu reproductible et conduit à l'obtention de fragments d'ADN qui sont parfois encore trop longs pour être utilisés dans certains types d'analyses. En outre, le procédé d'analyse de l'ADN mis en oeuvre à la suite de cette étape de fractionnement conduit seulement à l'obtention de valeurs relatives.
Les procédés de fractionnement enzymatique de l'ADN mettent en oeuvre des enzymes de restriction telles que des endonucléases qui coupent les molécules d'ADN au niveau de sites spécifiques et conduisent ainsi à l'obtention de
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fragments de restriction présentant une séquence spécifique. Par cette technique, il est donc impossible d'obtenir des fragments aléatoires d'ADN.
C'est donc afin de remédier à l'ensemble de ces inconvénients et de pourvoir à un procédé d'analyse quantitative de l'ADN simple, rapide, reproductible et sans étape limitante, que les Inventeurs ont mis au point ce qui fait l'objet de la présente invention.
Les Inventeurs ont notamment mis en évidence, de façon surprenante et inattendue, qu'il était possible de détecter et de doser directement dans un lysat cellulaire, des fragments aléatoires d'ADN obtenus par traitement de suspensions cellulaires par une base forte, et ce dans des conditions particulières de pH.
L'invention a donc pour premier objet un procédé de détection et d'analyse quantitative de molécules d'acides nucléiques à partir d'un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une phase d'extraction desdites molécules d'acides nucléiques comprenant les étapes suivantes : a) la mise en contact d'un échantillon biologique comprenant lesdites molécules d'acides nucléiques avec une base forte présentant une molarité suffisante pour conférer à l'échantillon biologique un pH supérieur à 13, b) la lyse du mélange obtenu jusqu'à dissolution complète de l'échantillon biologique, et c) la neutralisation du milieu réactionnel, pour obtenir des fragments de molécules d'acides nucléiques aléatoires neutralisés.
Ce procédé présente de nombreux avantages. Il est simple, non coûteux, facile à mettre en oeuvre et parfaitement reproductible. Il ne met pas en oeuvre de manipulations dangereuses telles que l'utilisation des rayons X. Il peut de plus être utilisé à grande échelle. Par ailleurs, les fragments aléatoires obtenus en mettant en oeuvre ce procédé présentent l'avantage de pouvoir être directement utilisés dans les procédés d'analyse quantitative de l'ADN, c'est-à-dire sans étape supplémentaire obligatoire de purification.
Selon l'Invention, l'échantillon biologique est par exemple constitué de suspensions de culots cellulaires, d'ADN purifié à partir de cultures cellulaires ou d'homogénats tissulaires.
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Selon une première forme de réalisation du procédé conforme à l'invention et lorsque l'échantillon biologique mis en oeuvre à l'étape a) est une suspension de culots cellulaires, alors la concentration cellulaire au sein de ladite suspension est de préférence comprise entre 5. 104 et 1. 108 cellules/ml de base forte et
, . 107 encore plus particulièrement entre 5. 10 et 3. 10 cellules/ml de base forte.
, . 107 encore plus particulièrement entre 5. 10 et 3. 10 cellules/ml de base forte.
Selon une deuxième forme de réalisation du procédé conforme à l'Invention et lorsque l'échantillon biologique mis en oeuvre au cours de l'étape a) est
de l'ADN purifié à partir de cultures cellulaires, alors la concentration de l'ADN est de préférence comprise entre 3. 10-4 et 0, 6 mg d'ADN/ml de base forte et encore plus particulièrement entre 3. 10-3 et 0, 3 mg d'ADN/ml de base forte.
de l'ADN purifié à partir de cultures cellulaires, alors la concentration de l'ADN est de préférence comprise entre 3. 10-4 et 0, 6 mg d'ADN/ml de base forte et encore plus particulièrement entre 3. 10-3 et 0, 3 mg d'ADN/ml de base forte.
La nature de la base forte utilisée conformément à l'Invention n'est pas critique. Elle peut notamment être choisie parmi la soude et la potasse, la soude étant particulièrement préférée.
La molarité de la base forte permettant d'amener le pH de
l'échantillon biologique à une valeur de pH supérieure à 13 est généralement comprise 'ID entre 0,7 et 1,5 M, une molarité de 1 M étant tout particulièrement préférée.
l'échantillon biologique à une valeur de pH supérieure à 13 est généralement comprise 'ID entre 0,7 et 1,5 M, une molarité de 1 M étant tout particulièrement préférée.
L'étape b) de lyse est de préférence conduite pendant une durée comprise entre 15 minutes et 24 heures. Ce temps de contact doit bien entendu être adapté à la nature de l'échantillon biologique à analyser.
En particulier, lorsque l'échantillon biologique est constitué de suspensions de culots cellulaires ou d'homogénats tissulaires, la durée de l'étape de lyse est de préférence comprise entre 3 et 12 heures, de façon à permettre la dissolution complète de l'échantillon.
Par contre, lorsque l'échantillon biologique est constitué d'ADN purifié, la durée de lyse peut être plus courte et est généralement comprise entre 15 minutes et 2 heures.
Quelle que soit sa durée, l'étape de lyse est de préférence réalisée à
une température comprise entre la température ambiante et 100oC, et de préférence entre la température ambiante et 40 C.
une température comprise entre la température ambiante et 100oC, et de préférence entre la température ambiante et 40 C.
Lorsque l'échantillon biologique est constitué de suspensions de culots cellulaires ou d'homogénats tissulaires, la phase d'extraction du procédé
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conforme à l'Invention peut en outre comprendre une étape supplémentaire de sonication de l'échantillon, de façon à accélérer l'étape de lyse. Cette étape supplémentaire de sonication est de préférence réalisée après l'étape a), dans les 15 à 30 minutes environ qui suivent la mise en contact de l'échantillon avec la base forte.
L'étape de sonication peut être conduite une ou plusieurs fois, en général une ou deux fois, pendant des durées variant entre 15 et 30 minutes.
L'étape de lyse cellulaire proprement dite est ensuite poursuivie normalement jusqu'à dissolution complète de l'échantillon.
Cette étape de sonication n'est pas nécessaire lorsque l'échantillon est constitué d'ADN purifié.
La lyse cellulaire est arrêtée par neutralisation du milieu de réaction.
Lors de cette neutralisation, le pH du milieu réactionnel est alors de préférence amené à une valeur comprise entre 6 et 8 environ et de manière tout à fait préférée à une valeur de 7. 5 environ.
Cette étape de neutralisation est de préférence effectuée par ajout d'un agent acidifiant ou d'un tampon permettant de faire baisser le pH du milieu réactionnel à la valeur désirée.
Selon une forme de réalisation particulière de l'Invention, cette étape de neutralisation est réalisée de préférence par ajout de 5 à 7 volumes d'un tampon, et encore plus particulièrement par ajout de 6 volumes d'un tampon, pour un volume de base forte. On utilise de préférence 6 volumes de tampon phosphate de sodium 1 M (pH 7) pour un volume de base forte.
La neutralisation est bien entendu effectuée après l'étape b) de lyse et avant l'étape d'analyse quantitative de l'ADN des échantillons biologiques.
Le procédé de détection et d'analyse conforme à l'invention peut être utilisé pour déterminer, en valeur absolue, les quantités d'ADN ou les longueurs télomériques de l'ADN par des techniques connues de l'homme de l'art comme par exemple l'hybridométrie (Chevrier et al., Mol. Cell Probes, 1993, 7, 187-197).
D'autre part, le procédé conforme à la présente invention peut également être utilisé pour toutes applications nécessitant une numération cellulaire, par exemple, le criblage de molécules destinées à contrôler la longueur télomérique, ce
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qui permet l'aide au diagnostic en cancérologie, d'assurer le suivi du vieillissement prématuré, le monitoring de l'immunosénescence, le choix des traitements et le suivi Zn thérapeutique en chimiothérapie, le développement de recherches en biologie du vieillissement ; le comptage de cellules sanguines ou autres lors d'examens cliniques ; le monitoring de l'extension des cellules souches en thérapie cellulaire et la mesure de la concentration d'un médicament comme les antirétroviraux dans le cadre du HIV, etc...
L'invention a également pour objet les fragments aléatoires et neutralisés de molécules d'acides nucléiques obtenus en mettant en oeuvre la phase d'extraction du procédé conforme à la présente invention.
La taille des fragments des molécules d'acides nucléiques est généralement comprise entre 50 et 50 000 paires de bases (pb).
Ces fragments aléatoires peuvent être directement utilisés pour l'analyse quantitative de l'ADN et la numération cellulaire.
L'invention a donc également pour objet l'utilisation des fragments aléatoires neutralisés conformes à l'Invention, dans un procédé de détection et d'analyse quantitative de l'ADN, ainsi que pour la numération cellulaire.
Outre les dispositions qui précèdent, l'Invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à un exemple d'extraction et de quantification de l'ADN d'extraits cellulaires et de détermination de la taille des télomères de chromosomes de cellules eucaryotes, à un
exemple de corrélation entre la quantité d'ADN et le comptage des cellules ZD mononucléées du sang périphérique lors du dosage de métabolites intracellulaires, ainsi qu'aux figures annexées dans lesquelles : - la figure 1 représente la relation entre la fluorescence et la quantité de cellules extraites dans 100 ul de NaOH 1 M, dans le cas de lysats dilués 10 fois ;
- la figure 2 représente la relation entre la fluorescence et la quantité de cellules extraites dans 100 ul de NaOH 1 M, dans le cas de lysats dilués 100 fois ; - la figure 3 représente la relation entre la fluorescence et la quantité de SYBR Green (dilué au 1/7 000), pour un échantillon contenant 10 ng d'ADN dans un volume total de 20 u. I ;
exemple de corrélation entre la quantité d'ADN et le comptage des cellules ZD mononucléées du sang périphérique lors du dosage de métabolites intracellulaires, ainsi qu'aux figures annexées dans lesquelles : - la figure 1 représente la relation entre la fluorescence et la quantité de cellules extraites dans 100 ul de NaOH 1 M, dans le cas de lysats dilués 10 fois ;
- la figure 2 représente la relation entre la fluorescence et la quantité de cellules extraites dans 100 ul de NaOH 1 M, dans le cas de lysats dilués 100 fois ; - la figure 3 représente la relation entre la fluorescence et la quantité de SYBR Green (dilué au 1/7 000), pour un échantillon contenant 10 ng d'ADN dans un volume total de 20 u. I ;
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- la figure 4 représente la relation entre la fluorescence et la quantité d'ADN en présence de différentes concentrations de SYBR Green (dilué au 1/7000) dans un volume total de 20 11 ; - la figure 5 représente la relation entre la fluorescence et la quantité d'ADN pour un plasmide étalon purifié, et pour l'ADN provenant de lysats cellulaires ; - la figure 6 représente le dosage de la longueur des séquences télomériques de plasmide dont la taille varie de 0 à 1600 pb ; - la figure 7 représente le dosage de la longueur des séquences télomériques de l'ADN de cellules MRC5 ; - la figure 8 représente la relation existant entre le nombre de cellules et le signal en fluorescence.
EXEMPLE 1 : EXTRACTION ET QUANTIFICATION DE L'ADN D'EXTRAITS CELLULAIRES ET DETERMINATION DE LA TAILLE DES TELOMERES DE CHROMOSOMES DE CELLULES EUCARYOTES 1 - Matériel et méthode 1) Préparation des lysats cellulaires
Des cellules eucaryotes provenant de vertébrés sont lavées dans du tampon phosphate salin (PBS), puis les culots sont asséchés, congelés dans l'azote liquide et stockés à-80 C ou-20 C pour une utilisation ultérieure.
Des cellules eucaryotes provenant de vertébrés sont lavées dans du tampon phosphate salin (PBS), puis les culots sont asséchés, congelés dans l'azote liquide et stockés à-80 C ou-20 C pour une utilisation ultérieure.
Après décongélation à 4 C, les cellules sont reprises à raison de 1. 106/100). 11 de NaOH 1 M et vortexés. Après 2 x 30 minutes de sonication à température ambiante, les lysats cellulaires sont incubés à température ambiante pendant une nuit, jusqu'à dissolution complète du culot. Les lysats cellulaires sont neutralisés à pH 7,5 par l'addition de 6 volumes de tampon phosphate de sodium 1 M (pH 7) pour 1 volume de NaOH 1M.
2) Détermination de la taille des fragments d'ADN issus des lysats cellulaires
Les lysats sont préalablement partiellement dessalés par diafiltration.
Les lysats sont préalablement partiellement dessalés par diafiltration.
Après centrifugation des échantillons (200 pLI), à 13 000 g, pendant 15 minute et à 20 C, dans des Microcon (R)-30 (Amicon), les rétentats sont dilués dans 200 11 d'eau, puis centrifugés à nouveau à 10 000 g, pendant 5 minutes à 20 C. Les rétentats sont
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récupérés et déposés sur un nouveau Microcon@-30, puis centrifugés à 10 000 g, pendant 5 minutes à 20 C.
Ainsi, les échantillons CI 05 l de volume final) sont diafiltrés, partiellement dessalés et concentrés 6,7 fois.
La taille des fragments d'ADN peut ensuite être déterminée par électrophorèse sur gel d'agarose à 2 %.
3) Quantification de l'ADN par fluorescence
L'ADN cellulaire fragmenté lors de l'extraction par la soude est quantifié par fluorescence à l'aide d'un fluorimètre Light Cycler (R) (Roche).
L'ADN cellulaire fragmenté lors de l'extraction par la soude est quantifié par fluorescence à l'aide d'un fluorimètre Light Cycler (R) (Roche).
L'échantillon est constitué d'un capillaire en verre contenant 5 ul de
lysat cellulaire neutralisé et dilué lysat cellulaire neutralisé et dilué 30 fois dans l'eau, ou 5 u. I de solution étalon (ADN ladder XIV, Roche, à 250 ng/tl) et 5 ul de réactif SYBR Green (Interchim, Molecular Probes, SYBR Gold nucleic acid, Réf. S11494) dilué extemporanément au 1/7000 dans l'eau. La gamme de linéarité de la méthode est comprise entre 0,5 et 10 ng d'ADN.
lysat cellulaire neutralisé et dilué lysat cellulaire neutralisé et dilué 30 fois dans l'eau, ou 5 u. I de solution étalon (ADN ladder XIV, Roche, à 250 ng/tl) et 5 ul de réactif SYBR Green (Interchim, Molecular Probes, SYBR Gold nucleic acid, Réf. S11494) dilué extemporanément au 1/7000 dans l'eau. La gamme de linéarité de la méthode est comprise entre 0,5 et 10 ng d'ADN.
La lecture est réalisée à 30oC. après 3 minutes de dénaturation de l'ADN à 95 C et 3 minutes de renaturation à 30oC. La mesure est réalisée par excitation de l'agent intercalant à 470 nm et la lecture d'émission s'effectue à 530 nm.
4) Détermination de la longueur des télomères par hybridométrie
La méthode consiste, dans un premier temps, à fixer de façon covalente sur une plaque, par exemple une plaque de 96 puits, un oligonucléotide capteur complémentaire des séquences télomériques.
La méthode consiste, dans un premier temps, à fixer de façon covalente sur une plaque, par exemple une plaque de 96 puits, un oligonucléotide capteur complémentaire des séquences télomériques.
Chez les vertébrés, la séquence télomérique est constituée d'une répétition du motif TTAGGG. L'oligonucléotide capteur présente donc la séquence (TTAGGG) 6, sur laquelle les séquences télomériques contenues dans les lysats cellulaires neutralisés se fixent par complémentarité.
Un oligonucléotide traceur présentant la séquence (TTAGGG) 3 couplée à la biotine en 3'est ensuite hybridé à l'ensemble. La détection est réalisée par colorimétrie, via un couplage entre la streptavidine (qui présente une affinité pour la biotine) et l'acétylcholinestérase, qui permet la transformation d'un substrat incolore, le réactif d'Ellman, en produit coloré.
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Fixation covalente de l'olizonucléotide cadteur .....................................................
L'oligonucléotide SflA8 à 100 nmol/ml (1 270 pLg/ml) est incubé pendant 10 minutes à une température de 95 C, puis pendant 10 minutes dans la glace.
L'oligonucléotide capteur (160 u. l) est ensuite dilué dans une solution constituée par : - 6 ml d'une solution de 1-méthyl-imidazole (1-MeIM) 100 mM et de pH 7, (préparée en diluant 398, 6 ul de 1-MeIM dans 220 ul d'HCI fumant et une quantité suffisante d'eau pour avoir un volume final de 50 ml, ladite solution ayant été filtrée sur filtre de 0,45 m), - 575, 6 mg de 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)-carbodiimide (EDAC), et - une quantité suffisante d'eau pour ajuster le volume final à 59,84 ml.
L'oligonucléotide capteur est alors incubé pendant une nuit à 50 C dans une plaque 96 puits (Covalent Binding NUNC#, Covalink), à raison de 100 l par puits.
La plaque est ensuite lavée 3 fois au tampon de lavage (NaOH 0,4
M ; sodium dodécylsulfate (SDS) 10 mM), préchauffé à 50 C, à raison de 200 ul par puits, incubée pendant 5 minutes à 50 C, puis lavée encore 2 fois.
M ; sodium dodécylsulfate (SDS) 10 mM), préchauffé à 50 C, à raison de 200 ul par puits, incubée pendant 5 minutes à 50 C, puis lavée encore 2 fois.
La plaque est ensuite lavée à l'eau désionisée puis stockée à 4 C. des télomères b.). Dosage de la. longueur des. telomeres
Les solutions d'oligonucléotides, les plasmides étalons et les lysats cellulaires sont incubés pendant 15 minutes à 60 C puis pendant 10 minutes à 4 C.
Les solutions d'oligonucléotides, les plasmides étalons et les lysats cellulaires sont incubés pendant 15 minutes à 60 C puis pendant 10 minutes à 4 C.
50 ul d'oligonucléotides traceurs SflC8h à 10 nmol/ml sont dilués dans 4 950 ul de tampon d'hybridation (TH : tampon phosphate de sodium 5 mM, pH 7,0, NaCl 0,75 M, EDTA 5mM, solution filtrée sur filtre de 0,45 um).
Les lysats cellulaires non neutralisés dans du NaOH 1 M.
La plaque est lavée à l'eau distillée. Les puits sont remplis à raison de :
- soit 50 ul de traceur, 10 ul de plasmide et 10 ul de NaOH 1M, - soit 50 ul de traceur, 10 u. l de lysat cellulaire non neutralisé et
10 l de tampon TH,
- soit 50 ul de traceur, 10 ul de plasmide et 10 ul de NaOH 1M, - soit 50 ul de traceur, 10 u. l de lysat cellulaire non neutralisé et
10 l de tampon TH,
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La plaque est ensuite incubée pendant 15 minutes à 40 C.
La plaque est lavée 2 fois avec 150 ul/puits de tampon TH.
100 l/puits de G4-Str à 1 UE/ml sont alors ajoutés avant l'incubation de la plaque pendant 4 heures à 20 C dans l'obscurité. La plaque est lavée 2 fois avec 150 ul/puits de tampon TH.
200 ul/puits de réactif d'Ellman sont alors ajoutés puis la plaque est incubée entre 3 et 24 heures à 20 C dans l'obscurité.
Le dosage est ensuite réalisé par lecture de la plaque à 414 nm.
Pour quantifier la longueur télomérique, on établit une relation entre l'absorbance à 414 nm (A nm) et le nombre d'unités télomériques/ml pour un échantillon étalon déposé sur la même plaque que les échantillons à doser. Cette relation répond à l'équation suivante :
A414nm= a x (unités télo/ml) + b dans laquelle a représente la pente de la droite A414nm = f (unités télomériques/ml), et b
l'ordonnée à l'origine de cette droite, soit l'absorbance mesurée lorsque le nombre t : l d'unités télomériques/ml = 0.
A414nm= a x (unités télo/ml) + b dans laquelle a représente la pente de la droite A414nm = f (unités télomériques/ml), et b
l'ordonnée à l'origine de cette droite, soit l'absorbance mesurée lorsque le nombre t : l d'unités télomériques/ml = 0.
On considère que les 46 chromosomes d'une cellule diploïde représentent une masse de 6x10-12 g. Le calcul du nombre d'unités télomériques de l'échantillon étalon se fait alors de la façon suivante : Unités télo/ml = 46 x C x L x 2/ (6 X 6xlO-12), avec C = concentration en ADN de l'échantillon (g/ml) et L = longueur d'un télomère en paire de base (pb).
En ce qui concerne l'échantillon à doser, on établit le calculs suivant :
Unités télo/ml = (14nm - b)/a
Chromosomes/ml = C x 46/6. 10-12
L (pb) = (unités télo/ml) x 6/ [ (chromosomes/ml) x2] Il-Résultats 1) Détermination de la taille des fragments d'ADN obtenus après lyse et sonication
Unités télo/ml = (14nm - b)/a
Chromosomes/ml = C x 46/6. 10-12
L (pb) = (unités télo/ml) x 6/ [ (chromosomes/ml) x2] Il-Résultats 1) Détermination de la taille des fragments d'ADN obtenus après lyse et sonication
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Après migration sur gel d'agarose, l'ADN est observé sous la forme d'une"smear"sont les tailles sont comprises entre moins de 100 pb et plus de 25 000 pb.
2) Quantification de l'ADN
Les résultats obtenus apparaissent sur les figures 1 et 2 en annexe qui représentent la quantité d'ADN extraite dosée par fluorescence (en ordonnée) en fonction du nombre de cellules dans 100 u. l de NaOH 1 M (en abscisse), dans le cas de lysats neutralisés dilués 10 fois (figure 1) et 100 fois (figure 2).
Les résultats obtenus apparaissent sur les figures 1 et 2 en annexe qui représentent la quantité d'ADN extraite dosée par fluorescence (en ordonnée) en fonction du nombre de cellules dans 100 u. l de NaOH 1 M (en abscisse), dans le cas de lysats neutralisés dilués 10 fois (figure 1) et 100 fois (figure 2).
Ces résultats montrent que dans le cas où les lysats sont dilués 10 fois, la relation entre la fluorescence et le nombre de cellules est linéaire jusqu'à 2. 106 cellules/100 l de NaOH 1 M ; et dans le cas où les lysats sont dilués 100 fois, la
m. 106 relation est linéaire jusqu'à 3. 10 cellules/100 1 de NaOH 1 M.
m. 106 relation est linéaire jusqu'à 3. 10 cellules/100 1 de NaOH 1 M.
Cela indique que la perte de linéarité n'est pas due à la méthode de dosage par fluorescence utilisée et décrite ci-dessus mais au rendement de lyse qui
,. 106 diminue au-delà de 3. 106 cellules/lOO tl de NaOH 1M. Par conséquent, afin d'obtenir un rendement de lyse constant, on utilisera de préférence des culots cellulaires ne dépassant pas 3.106 cellules/100 l de NaOH 1 M.
,. 106 diminue au-delà de 3. 106 cellules/lOO tl de NaOH 1M. Par conséquent, afin d'obtenir un rendement de lyse constant, on utilisera de préférence des culots cellulaires ne dépassant pas 3.106 cellules/100 l de NaOH 1 M.
Influence de la quantité de SYBR Green
La figure 3 en annexe présente la relation entre la quantité de SYBR Green en u. I (en abscisse) et la fluorescence (en ordonnée), d'un échantillon contenant 10 ng d'ADN dans un volume final de 20 ul.
La figure 3 en annexe présente la relation entre la quantité de SYBR Green en u. I (en abscisse) et la fluorescence (en ordonnée), d'un échantillon contenant 10 ng d'ADN dans un volume final de 20 ul.
Ces résultats montrent que la fluorescence de l'échantillon augmente avec la concentration de l'agent intercalant, jusqu'à saturation obtenue à partir de 2,8 ni de SYBR Green dilué au 1/7 000, pour 10 ng d'ADN dans un volume final de 20 ul.
La figure 4 en annexe montre la relation entre la quantité d'ADN en
ng (en abscisse) et la fluorescence (en ordonnée), en présence de différentes z : l concentrations de SYBR Green dilué au 1/7 000 dans un volume final de pilz Ces résultats montrent qu'entre 4 et 10 ul de SYBR Green, aucune différence de fluorescence n'est observée pour des échantillons contenant de 0,17 à 10 ng d'ADN.
ng (en abscisse) et la fluorescence (en ordonnée), en présence de différentes z : l concentrations de SYBR Green dilué au 1/7 000 dans un volume final de pilz Ces résultats montrent qu'entre 4 et 10 ul de SYBR Green, aucune différence de fluorescence n'est observée pour des échantillons contenant de 0,17 à 10 ng d'ADN.
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Influence du milieu d'extraction cellulaire
La figure 5 en annexe représente la variation de l'intensité (en ordonnée) en fonction de la quantité d'ADN en ng (en abscisse), dans le cas d'un plasmide pur dilué (p) ou de lysats cellulaires neutralisés dilués (lysat A : CI et lysat B : 0)
Ces résultats montrent que la variation de la fluorescence est la même qu'il s'agisse de l'ADN d'un lysat cellulaire ou d'un ADN étalon.
La figure 5 en annexe représente la variation de l'intensité (en ordonnée) en fonction de la quantité d'ADN en ng (en abscisse), dans le cas d'un plasmide pur dilué (p) ou de lysats cellulaires neutralisés dilués (lysat A : CI et lysat B : 0)
Ces résultats montrent que la variation de la fluorescence est la même qu'il s'agisse de l'ADN d'un lysat cellulaire ou d'un ADN étalon.
Le contenu des lysats cellulaires neutralisés n'a donc pas d'influence sur le dosage de la quantité d'ADN par fluorescence.
Effet de la température sur la mesure de fluorescence
On note que la fluorescence diminue à mesure que la température de dénaturation de l'ADN augmente de 30 à 95 C (données non représentées), la valeur de fluorescence la plus élevée étant obtenue pour le température testée la plus basse (30 C).
On note que la fluorescence diminue à mesure que la température de dénaturation de l'ADN augmente de 30 à 95 C (données non représentées), la valeur de fluorescence la plus élevée étant obtenue pour le température testée la plus basse (30 C).
3) Détermination de la longueur des télomères par hvbridométrie
Les résultats obtenus sont reportés sur les figures 6 et 7 en annexe Zn qui représentent les valeurs d'absorbance à 414 nm (en ordonnée) en fonction du nombre d'unités télomériques/ml (en abscisse), dans le cas d'un plasmide étalon contenant 1,6 kb de séquences télomériques (PSX1, 6) (figure 6) et dans le cas d'un lysat de cellules diploïdes MRC5 (figure 7).
Les résultats obtenus sont reportés sur les figures 6 et 7 en annexe Zn qui représentent les valeurs d'absorbance à 414 nm (en ordonnée) en fonction du nombre d'unités télomériques/ml (en abscisse), dans le cas d'un plasmide étalon contenant 1,6 kb de séquences télomériques (PSX1, 6) (figure 6) et dans le cas d'un lysat de cellules diploïdes MRC5 (figure 7).
Ces résultats mettent en évidence que le procédé d'extraction et de fractionnement de l'ADN conforme à l'Invention permet d'aboutir à un lysat cellulaire pouvant être utilisé afin de déterminer la longueur des télomères par hybridométrie.
EXEMPLE 2 : CORRELATION ENTRE LA QUANTITE D'ADN ET LE COMPTAGE DES PBMCs LORS DU DOSAGE DES METABOLITES INTRACELLULAIRES DES INTIs.
Dans le cadre des dosages intracellulaires des métabolites phosphorylés des inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase inverse (INTI) du VIH dans les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMCs), le nombre de PBMCs obtenu pour un échantillon après séparation du tube CPT est corrélé à la quantité d'ADN marqué par un intercalent fluorescent.
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1 - Matériels et méthodes
1) Préparation de la gamme étalon et des contrôles qualité
On isole, à partir de trois poches de sang différents fournies par l'Établissement Français du sang (échantillons 1 à 3), les PBMCs grâce à des tubes CPT (Becton-Dickinson, réf. 332761) et selon la technique indiquée par le fabricant.
1) Préparation de la gamme étalon et des contrôles qualité
On isole, à partir de trois poches de sang différents fournies par l'Établissement Français du sang (échantillons 1 à 3), les PBMCs grâce à des tubes CPT (Becton-Dickinson, réf. 332761) et selon la technique indiquée par le fabricant.
On mesure le nombre de PBMCs isolées par comptage avec une cellule de Malassez. Ce comptage est réalisé à partir de deux dilutions de la suspension de PBMCs (1/20ème et 1/40ème), en déposant 20 Ill de chaque dilution précédente et comptage en duplicate sur 10 carreaux.
On prépare une dilution A (standard 1) contenant 25. 106 PBMCs.
Cette dilution constitue le standard le plus concentré. Elle sert ensuite à préparer les 6 dilutions standard de calibration extemporanément à chaque dosage (cf. Mode Opératoire point 3) ci-après).
A partir de la dilution A décrite ci-dessus, on prépare également plusieurs séries de contrôle de qualité : (CQ), de concentrations suivantes : - CQ n l = 2. 106 PBMCs par échantillon, - CQ n02 = 5. 106 PBMCs par échantillon, - CQ n03 = 10. 106 PBMCs par échantillon - CQ n04 = 15. 106 PBMCs par échantillon, et - CQ n05 = 20. 106 PBMCs par échantillon.
Trois CQ seront inclus dans chaque série d'analyse, par exemple un CQ n l, un CQ n 3 et un CQ n 5.
Le standard 1 et les CQ sont ensuite centrifugés à environ 1 200 g pendant 3 minutes à 4 C. Après élimination du surnageant, les culots de standard et de CQ sont congelés à sec à-80 C.
2) Préparation des échantillons
La préparation des échantillons issus de patients HIV positif est réalisée à partir d'un prélèvement de sang (environ 8 ml) PBMCs, grâce à des tubes CPT comme décrit précédemment. Les isolats de PBMCs sont ensuite centrifugés à environ 1 200 g pendant 3 minutes à 4 C. Après élimination du surnageant, les culots de PBMCs sont congelés à sec à-80 C.
La préparation des échantillons issus de patients HIV positif est réalisée à partir d'un prélèvement de sang (environ 8 ml) PBMCs, grâce à des tubes CPT comme décrit précédemment. Les isolats de PBMCs sont ensuite centrifugés à environ 1 200 g pendant 3 minutes à 4 C. Après élimination du surnageant, les culots de PBMCs sont congelés à sec à-80 C.
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3) Dosage de l'ADN
Ce dosage intervient sur les culots de standard 1, de CQ et d'échantillons préparés ci-dessus.
Mode opératoire :
On ajoute à chaque culot, 500 ut d'un mélange Tris HC1 0,05 M pH 7,4/méthanol (30/70). Le contenu du tube est alors transféré dans un nouveau tube Eppendorf et centrifugé à 18 000 g pendant 30 minutes à 4 C. Le surnageant est prélevé et conservé pour le dosage ultérieur des INTI du VIH.
On ajoute à chaque culot, 500 ut d'un mélange Tris HC1 0,05 M pH 7,4/méthanol (30/70). Le contenu du tube est alors transféré dans un nouveau tube Eppendorf et centrifugé à 18 000 g pendant 30 minutes à 4 C. Le surnageant est prélevé et conservé pour le dosage ultérieur des INTI du VIH.
On ajoute au culot de centrifugation 200 nul de NaOH 1 M, puis on soumet le culot à une sonication pendant 30 minutes. Les culots soniqués sont alors
incubés pendant une nuit à température ambiante (entre 20 et 24 C).
incubés pendant une nuit à température ambiante (entre 20 et 24 C).
La lyse cellulaire est ensuite arrêtée par ajout de 500 ul de tampon phosphate de potassium 1 M de pH 7,4.
Le lysat cellulaire ainsi neutralisé de standard 1, contenant 25. 106 cellules, est dilué de 2 en 2 en tampon phosphate de potassium 1 M, pH = 7,4 afin d'obtenir les 6 standards de calibration. Les concentrations des standards obtenues sont
106 106 106 alors les suivantes : 25. 106 ; 12, 5. 106 ; 6, 25. 106 ; 3, 13. 106 ; 1, 56. 106 et 0, 78. 106 cellules par standard.
106 106 106 alors les suivantes : 25. 106 ; 12, 5. 106 ; 6, 25. 106 ; 3, 13. 106 ; 1, 56. 106 et 0, 78. 106 cellules par standard.
Le lysat cellulaire échantillon (extrait d'ADN) est dilué au 1/10è en tampon phosphate de potassium. On dépose ensuite au fond d'un puits d'une plaque de microtitration opaque (MUNCH@, Brand Product), 10 ul d'extrait d'ADN dilué au 1/10'à 100 ul de SYBr Green (réf. : S-7585, Molecular Probes) au 1/10 000è en eau millipore.
La lecture se fait au bout de 5 minutes à l'aide d'un fluorimètre Fluoroseane II, Labsystems (excitation 465 nm, émission 530 nm).
Pour les standards, on trace la relation linéaire entre les résultats des comptages obtenus sur cellule de Malassez et la méthode proposée de quantification de l'ADN. on obtient la droite de régression de type y = ax + b où y est la valeur du signal fluorescent et x le nombre de cellules (voir figure 8 annexée).
Pour les échantillons et les CQ, connaissant la valeur de y (signal en fluorescence), on calcule, à l'aide de cette équation, le nombre de cellules.
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Les valeurs calculées pour les échantillons doivent être comprises dans l'étendue de la gamme.
Pour chaque échantillon, la mesure est effectuée 4 fois, chaque mesure intervenant à des jours différents.
Il-Résultats
Les résultats obtenus sont reportés dans le Tableau 1 ci-après :
TABLEAU 1
Les résultats obtenus sont reportés dans le Tableau 1 ci-après :
TABLEAU 1
<tb>
<tb> Echantillon <SEP> Signal <SEP> de <SEP> fluorescence <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> Ecart <SEP> à <SEP> la <SEP> valeur
<tb> représentatif <SEP> de <SEP> la <SEP> quantité <SEP> cellules <SEP> calculé <SEP> calculée <SEP> sur <SEP> cellule
<tb> d'ADN <SEP> dans <SEP> l'échantillon <SEP> (106 <SEP> cellules) <SEP> de <SEP> Malassez
<tb> Echantillon <SEP> 1
<tb> Mesure <SEP> 1 <SEP> 0,86 <SEP> 2,12 <SEP> 24,3
<tb> Mesure <SEP> 2 <SEP> 0,85 <SEP> 2, <SEP> 94-5, <SEP> 0
<tb> Mesure <SEP> 3 <SEP> 0, <SEP> 83 <SEP> 2.74 <SEP> 2,1
<tb> Mesure <SEP> 4 <SEP> 0,77 <SEP> 2,56 <SEP> 8,6
<tb> Moyenne <SEP> 2, <SEP> 59 <SEP> 7,50
<tb> Ecart-type <SEP> 0,30
<tb> CV <SEP> (%) <SEP> 11,7
<tb> Echantillon <SEP> 2
<tb> Mesure <SEP> 1 <SEP> 2,5 <SEP> 7,96 <SEP> 20,4
<tb> Mesure <SEP> 2 <SEP> 3, <SEP> 11 <SEP> 10, <SEP> 77-7, <SEP> 7
<tb> Mesure <SEP> 3 <SEP> 3,3 <SEP> 10, <SEP> 93-9, <SEP> 3
<tb> Mesure <SEP> 4 <SEP> 2,18 <SEP> 7, <SEP> 23 <SEP> 27,7
<tb> Moyenne <SEP> 9,22 <SEP> 7,78
<tb> Ecart-type <SEP> 1,65
<tb> CV <SEP> (%) <SEP> 17,9
<tb> Echantillon <SEP> 3
<tb> Mesure <SEP> 1 <SEP> 5,06 <SEP> 17,07 <SEP> 18,7
<tb> Mesure <SEP> 2 <SEP> 6,18 <SEP> 21, <SEP> 40-1, <SEP> 9
<tb> Mesure <SEP> 3 <SEP> 6,51 <SEP> 21, <SEP> 56-2, <SEP> 7
<tb> Mesure <SEP> 4 <SEP> 4,75 <SEP> 15,75 <SEP> 25,0
<tb> Moyenne <SEP> 18,95 <SEP> 9,79
<tb> Ecart-type <SEP> 2, <SEP> 58
<tb> CV(%) <SEP> 13,6
<tb>
<tb> Echantillon <SEP> Signal <SEP> de <SEP> fluorescence <SEP> Nombre <SEP> de <SEP> Ecart <SEP> à <SEP> la <SEP> valeur
<tb> représentatif <SEP> de <SEP> la <SEP> quantité <SEP> cellules <SEP> calculé <SEP> calculée <SEP> sur <SEP> cellule
<tb> d'ADN <SEP> dans <SEP> l'échantillon <SEP> (106 <SEP> cellules) <SEP> de <SEP> Malassez
<tb> Echantillon <SEP> 1
<tb> Mesure <SEP> 1 <SEP> 0,86 <SEP> 2,12 <SEP> 24,3
<tb> Mesure <SEP> 2 <SEP> 0,85 <SEP> 2, <SEP> 94-5, <SEP> 0
<tb> Mesure <SEP> 3 <SEP> 0, <SEP> 83 <SEP> 2.74 <SEP> 2,1
<tb> Mesure <SEP> 4 <SEP> 0,77 <SEP> 2,56 <SEP> 8,6
<tb> Moyenne <SEP> 2, <SEP> 59 <SEP> 7,50
<tb> Ecart-type <SEP> 0,30
<tb> CV <SEP> (%) <SEP> 11,7
<tb> Echantillon <SEP> 2
<tb> Mesure <SEP> 1 <SEP> 2,5 <SEP> 7,96 <SEP> 20,4
<tb> Mesure <SEP> 2 <SEP> 3, <SEP> 11 <SEP> 10, <SEP> 77-7, <SEP> 7
<tb> Mesure <SEP> 3 <SEP> 3,3 <SEP> 10, <SEP> 93-9, <SEP> 3
<tb> Mesure <SEP> 4 <SEP> 2,18 <SEP> 7, <SEP> 23 <SEP> 27,7
<tb> Moyenne <SEP> 9,22 <SEP> 7,78
<tb> Ecart-type <SEP> 1,65
<tb> CV <SEP> (%) <SEP> 17,9
<tb> Echantillon <SEP> 3
<tb> Mesure <SEP> 1 <SEP> 5,06 <SEP> 17,07 <SEP> 18,7
<tb> Mesure <SEP> 2 <SEP> 6,18 <SEP> 21, <SEP> 40-1, <SEP> 9
<tb> Mesure <SEP> 3 <SEP> 6,51 <SEP> 21, <SEP> 56-2, <SEP> 7
<tb> Mesure <SEP> 4 <SEP> 4,75 <SEP> 15,75 <SEP> 25,0
<tb> Moyenne <SEP> 18,95 <SEP> 9,79
<tb> Ecart-type <SEP> 2, <SEP> 58
<tb> CV(%) <SEP> 13,6
<tb>
Ces résultats montrent que le procède a'analyse quantitative ae molécules d'acides nucléiques conforme à l'invention peut être appliqué, de façon reproductible, à la numération cellulaire. En effet, le CV obtenu est inférieur à 20% quelle que soit la quantité initiale de cellules (entre 2,5. 106 et 19. 106 cellules).
<Desc/Clms Page number 16>
Ces résultats mettent également en évidence l'exactitude de la méthode. En effet, lorsque l'on compare les résultats obtenus en mettant en oeuvre le procédé conforme à l'invention et les résultats obtenus par comptage classique à l'aide d'une cellule de Malassez, on constate que les écarts entre les valeurs obtenues par ces deux méthodes ne différent pas de plus de 10 %, quelle que soit la quantité initiale de cellules (entre 2,5. 1 06 et 19. 1 06 cellules).
Claims (13)
1. Procédé de détection et d'analyse quantitative de molécules d'acides nucléiques à partir d'un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une phase d'extraction desdites molécules d'acides nucléiques comprenant les étapes suivantes : a) la mise en contact d'un échantillon biologique comprenant lesdites molécules d'acides nucléiques avec une base forte présentant une molarité suffisante pour conférer à l'échantillon biologique un pH supérieur à 13,
b) la lyse du mélange obtenu jusqu'à dissolution complète de 1 : 1 1 l'échantillon biologique, et c) la neutralisation du milieu réactionnel, pour obtenir des fragments de molécules d'acides nucléiques aléatoires neutralisés.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'échantillon biologique est constitué de suspensions de culots cellulaires, d'ADN
purifié à partir de cultures cellulaires ou d'homogénats tissulaires. puri ÎD
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé par le fait que l'échantillon est une suspension de culots cellulaires et que la concentration cellulaire au sein de ladite suspension comprise entre 5. 104 et 1. 108 cellules/ml de base forte.
4. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé par le fait que l'échantillon biologique est de l'ADN purifié à partir de cultures cellulaires, et que la
10-4 concentration de l'ADN est comprise entre 3. 10-4 et 0, 6 mg d'ADN/ml de base forte.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que la base forte est choisie parmi la soude et la potasse.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que la molarité de la base forte est comprise entre 0,7 et 1, 5 M.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que l'étape b) de lyse est conduite pendant une durée comprise entre 15 minutes et 24 heures.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que l'étape b) de lyse est réalisée à une température comprise entre la température ambiante et 100 C.
<Desc/Clms Page number 18>
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 et 5 à 8, caractérisé par le fait que la phase d'extraction comprend une étape supplémentaire de sonication de l'échantillon biologique.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que lors de l'étape c) de neutralisation, le pH du milieu réactionnel est amené à une valeur comprise entre 6 et 8.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que l'étape c) de neutralisation est réalisée par ajout de 5 à 7 volumes d'un tampon pour un volume de base forte.
12. Utilisation du procédé tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 11, pour déterminer, en valeur absolue, les quantités d'ADN ou les longueurs télomériques de l'ADN dans un échantillon biologique.
13. Utilisation du procédé tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 11, pour la numération cellulaire dans un échantillon biologique.
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- 2002-11-14 EP EP02793232A patent/EP1451361A2/fr not_active Withdrawn
- 2002-11-14 AU AU2002358892A patent/AU2002358892A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19724781A1 (de) * | 1997-06-12 | 1998-12-24 | Werner E G Prof Dr Mueller | Mikro-Methode zur Schnellbestimmung von DNA-Schäden und deren Reparatur unter Verwendung des Fluoreszenzfarbstoffs Picogreen und ihre Anwendung |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| BATEL RENATO ET AL: "A microplate assay for DNA damage determination (fast micromethod) in cell suspensions and solid tissues.", ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, vol. 270, no. 2, 1 June 1999 (1999-06-01), pages 195 - 200, XP002208227, ISSN: 0003-2697 * |
| ELMENDORFF-DREIKORN K ET AL: "ASSESSMENT OF DNA DAMAGE AND REPAIR IN HUMAN PERIPHERAL BLOOD MONONUCLEAR CELLS USING A NOVEL DNA UNWINDING TECHNIQUE", CELLULAR AND MOLECULAR BIOLOGY, CMB ASSOCIATIONS, NOISY-LE-GRAND, FR, vol. 45, no. 2, March 1999 (1999-03-01), pages 211 - 218, XP000996116, ISSN: 0145-5680 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2003048386A2 (fr) | 2003-06-12 |
| US20050118593A1 (en) | 2005-06-02 |
| FR2833273B1 (fr) | 2004-08-13 |
| AU2002358892A1 (en) | 2003-06-17 |
| WO2003048386A3 (fr) | 2004-02-26 |
| EP1451361A2 (fr) | 2004-09-01 |
| AU2002358892A8 (en) | 2003-06-17 |
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