FR2830020A1 - Acide nucleique pour l'obtention d'un polynucleotide codant une proteine de detection et d'isolement d'un ligand "proie" et applications de cet acide nucleique - Google Patents

Acide nucleique pour l'obtention d'un polynucleotide codant une proteine de detection et d'isolement d'un ligand "proie" et applications de cet acide nucleique Download PDF

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Abstract

Acide nucléique pour l'obtention d'un polynucléotide codant pour une protéine de détection et d'isolement d'un ligand " proie " ou d'une pluralité de ligands 4 proie " se fixant spécifiquement sur un polypeptide " appât ", ledit acide nucléique codant une protéine comprenant un enchaînement d'au moins deux polypeptides liés entre eux, directement ou indirectement, ladite protéine étant caractérisée en ce que les deux polypeptides sont, respectivement : i) un polypeptide marqueur de détection; et ii) un polypeptide susceptible de se fixer sélectivement sur un support de purification.

Description

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La présente invention se rapporte au domaine de la protéomique, en particulier à l'analyse à grande échelle des interactions se produisant naturellement entre les protéines, au sein de la cellule, ainsi qu'à la caractérisation des différents partenaires protéiques impliqués dans ces interactions.
ETAT DE LA TECHNIQUE
La connaissance de plus en plus complète des génomes de nombreux organismes a facilité le développement de nouveaux outils permettant l'étude de l'expression du génome à grande échelle. On peut citer notamment les puces et les filtres à ADN de haute densité qui permettent une analyse du transcriptome et fournissent des informations sur l'activité transcriptionnelle des gènes.
Toutefois, les connaissances acquises récemment grâce au séquençage complet des génomes de divers organismes procaryotes ou eucaryotes, y compris l'homme, a mis l'accent sur la nécessité de comprendre comment les protéines produites à un instant donné au cours de la vie de la cellule interagissaient entre elles ou avec d'autres composants cellulaires impliqués dans les différentes voies métaboliques et de régulation de la cellule.
Une telle approche s'inscrit dans l'ensemble des études postgénomiques, comme les analyses du transcriptome (PRIMIG et aL, 2000), du disruptome (DELNERI et al., 2001), de l'interactome (LEGRAIN et SELIG, 2000), de l'activitome (MARTZEN et aL, 1999), du métabolome (RAAMSTONK et al., 2001) ou du protéome (BOUCHE, 2001).
Diverses techniques sont utilisées pour l'analyse des interactions protéiques se produisant au sein d'une cellule. On peut citer par exemple la technique de double-hydride comme celle décrite par FROMONT-RACINE et ai. (1997) ou encore la technique décrite par FLAJOLET et al. (2000).
Toutefois, les techniques de double-hybride supposent la préparation préalable de deux familles de vecteurs, respectivement une famille de vecteurs codant pour des polypeptides de fusion contenant un polypeptide proie et une famille de vecteurs pour des polypeptides de fusion contenant potentiellement des polypeptides appât . Les
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techniques de double-hybride constituent en conséquence des méthodes d'étude des interactions protéiques techniquement longues et complexes.
De plus, les techniques de double-hybride, bien qu'elles soient réalisées dans l'environnement intracellulaire, ont recours à l'expression artificielle à la fois d'un polypeptide appât et des polypeptides éventuels proie .
En particulier, les polypeptides proie ne sont pas exprimés dans des conditions respectant la physiologie de la cellule.
D'autres techniques d'études du protéome n'utilisent une expression artificielle que pour le polypeptide appât , dont on recherche les interactions avec les protéines produites naturellement dans une cellule hôte.
Ce second type de technique est illustré notamment par les travaux de RIGAUT et ai. (1999). RIGAUT et al. (1999) décrivent la construction d'un vecteur contenant un insert d'ADN codant pour une protéine de fusion entre un polypeptide appât et deux étiquettes de purification, respectivement une première étiquette constituée d'un peptide se liant à la Calmoduline et une seconde étiquette constituée de la protéine A de Staphylococcus aureus.
RIGAUT et al. (1999) ont testé plusieurs constructions d'ADN codant pour des protéines appât distinctes fusionnées aux deux étiquettes de purification précitées, afin d'identifier la formation intracellulaire de complexes entre chacune des protéines appât choisies et les protéines cellulaires de levure. La technique décrite par ces auteurs implique une phase d'expression des constructions d'ADN codant pour les polypeptides appât de fusion, puis, après lyse des cellules et extraction des protéines intracellulaires, purification des polypeptides appât de fusion successivement sur deux colonnes d'affinité, une première colonne sur laquelle sont immobilisées des immunoglobulines de type IgG et une seconde colonne sur laquelle est immobilisé de la Calmoduline. RIGAUT et al. (1999), montrent que le procédé qu'ils décrivent permet l'isolement et la caractérisation de protéines proie naturellement exprimées dans la levure et qui interagissent avec la protéine appât de fusion.
Toutefois, la technique décrite par RIGAUT et al. (1999) ne permet pas, sans entreprendre les étapes de purification, de mettre en évidence
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l'existence d'un complexe protéine proie/protéine de fusion appât. Ainsi, en utilisant la technique décrite par RIGAUT et ai. (1999), une protéine de fusion appât sera purifiée même si elle ne participe pas à un complexe protéique dans la cellule.
A l'évidence, la technique décrite par RIGAUT et al. (1999) représente un outil de grand intérêt pour une étude de l'interaction entre une protéine appât donnée et les éventuelles protéines cibles de la protéine appât dans la cellule.
Toutefois, compte-tenu des nombreuses étapes de séparation nécessaires à l'isolement du ou des protéines proies qui interagissent avec la protéine appât, la technique de RIGAUT et ai. (1999) n'est pas adaptée à une étude systématique et à grande échelle du protéome.
Le demandeur s'est attaché à mettre au point une famille d'outils de détection et d'isolement de ligands proie utilisables dans des procédés de criblage à grande échelle et à haut débit d'interactions protéine-protéine, notamment pour l'étude du protéome.
SOMMAIRE DE L'INVENTION
L'invention a pour objet un acide nucléique pour l'obtention d'un polynucléotide codant une protéine de détection et d'isolement d'un ligand "proie"ou d'une pluralité de ligands" proie" se fixant spécifiquement sur un polypeptide" appât", ledit acide nucléique codant une protéine comprenant un enchaînement d'au moins deux polypeptides liés entre eux, directement ou indirectement, ladite protéine étant caractérisée en ce que les deux polypeptides sont, respectivement : i) un polypeptide marqueur de détection ; et ii) un polypeptide susceptible de se fixer sélectivement sur un support de purification.
L'acide nucléique selon l'invention est notamment caractérisé en ce que le polypeptide marqueur de détection est un polypeptide détectable par mesure de fluorescence. Le polypeptide marqueur peut être choisi parmi les GFP ("Green Fluorescent Proteins"), les YFP ("Yellow Fluorescent Proteins") et les RFP ("Red Fluorescent Proteins").
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L'invention a également pour objet un ensemble ou une association de deux acides nucléiques, respectivement : a) un acide nucléique pour l'obtention d'un polynucléotide codant pour une protéine de détection et d'isolement d'un ligand proie , tel que défini ci-dessus ; et b) un acide nucléique codant pour un polypeptide appât .
L'invention est également relative à un vecteur recombinant comprenant l'un des acides nucléiques tels que définis ci-dessus.
Elle est également relative à une cellule hôte recombinante caractérisée en ce qu'elle est transformée par un acide nucléique ou par un vecteur recombinant ou une pluralité de vecteurs recombinants tel que définis ci-dessus.
L'invention a également trait à une protéine de détection et d'isolement d'un ligand"proie"comprenant un enchaînement d'au moins trois polypeptides liés entre eux, directement ou indirectement, caractérisé en ce que les trois polypeptides sont respectivement :
1) un polypeptide" appât" se fixant spécifiquement sur le ligand "proie" ;
2) un polypeptide marqueur de détection ; et
3) un polypeptide susceptible de se fixer sélectivement sur un support de purification.
Elle concerne aussi un acide nucléique codant une protéine telle que définie ci-dessus.
L'invention est aussi relative à un procédé d'obtention d'un acide nucléique codant une protéine de détection et d'isolement d'un ligand proie, ledit procédé comprenant les étapes de : a) co-transfecter une cellule hôte respectivement avec (i) un acide nucléique pour l'obtention d'un polynucléotide codant pour une protéine de détection et d'isolement d'un ligand proie tel que défini ci-dessus et (ii) un acide nucléique codant pour un polypeptide appât ; b) cultiver la cellule hôte co-transfectée à l'étape a) et sélectionner les cellules hôtes dans lesquelles, l'acide nucléique (i) et l'acide nucléique (ii) ont été fusionnés ;
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c) isoler l'acide nucléique résultant de la fusion entre l'acide nucléique (i) et l'acide nucléique (ii), qui code pour une protéine de détection et d'isolement d'un ligand proie selon l'invention.
L'invention a encore pour objet un procédé pour détecter et isoler un ligand proie ou une pluralité de ligands"proie"produits par une cellule hôte, comprenant les étapes suivantes : a) transfecter ou transformer une cellule hôte avec un acide nucléique codant une protéine de détection et d'isolement d'un ligand proie comprenant un enchaînement d'au moins trois polypeptides liés entre eux, directement ou indirectement, caractérisé en ce que les trois polypeptides sont respectivement :
1) un polypeptide" appât" se fixant spécifiquement sur le ligand "proie" ;
2) un polypeptide marqueur de détection ; et
3) au moins un polypeptide susceptible de se fixer sélectivement sur un support de purification ; b) cultiver les cellules hôtes obtenues à l'issue de l'étape a) et exprimant la protéine de détection et d'isolement d'un ligand "proie" ; c) Iyser les cellules hôtes cultivées à l'étape b) ; d) détecter, dans le Iysat cellulaire, les complexes éventuellement formés entre la protéine de détection et d'isolement et un ligand "proie"ou une pluralité de ligands" proie" ; e) isoler le ligand" proie "ou la pluralité de ligands" proie"
L'invention est également relative à un procédé pour détecter et isoler un ligand"proie"dans un échantillon, comprenant les étapes suivantes : a) mettre en contact une protéine de détection et d'isolement telle que définie ci-dessus avec l'échantillon ; b) détecter les complexes éventuellement formés entre la protéine de détection et d'isolement et le ligand" proie" ou la pluralité de ligands "proie"contenus dans l'échantillon ;
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c) isoler le ligand"proie".
L'invention concerne aussi des trousses ou nécessaires de détection et d'isolement d'un ligand proie ou d'une pluralité de ligands proie pour la mise en oeuvre des procédés ci-dessus.
Elle a aussi pour objet un procédé pour déterminer les interactions protéiques se produisant, dans une cellule hôte, entre un polypeptide appât et les protéines naturellement synthétisées par cette cellule hôte, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) réaliser l'un des procédés de détection et d'isolement d'un ligand proie tel que défini ci-dessus ; b) réaliser une carte des interactions entre le polypeptide appât et le ou les ligands proie détecté, isolé, et facultativement caractérisé.
Elle a enfin pour objet une carte des interactions protéiques se produisant dans une cellule hôte, entre un polypeptide appât et les protéines naturellement synthétisées par cette cellule hôte, ladite carte étant susceptible d'être obtenue par la mise en oeuvre de l'un des procédés de détection et d'isolement d'un ligand proie selon l'invention.
DESCRIPTION DES FIGURES
La figure 1 illustre la structure générale d'une protéine de détection et d'isolement d'un ligand proie selon l'invention.
La figure 2 illustre la séquence SEQ ID N01 du listage de séquences, qui constitue un mode de réalisation particulier d'un acide nucléique pour l'obtention d'un polynucléotide codant une protéine de détection et d'isolement d'un ligand proie ou d'une pluralité de ligands proie .
La figure 3 illustre un étalonnage de la colonne Superdex 200 avec une série de marqueurs protéiques de poids moléculaire décroissant. L'axe des abscisses représente le volume d'élution de la colonne, exprimé en ml.
L'axe des ordonnées représente le poids moléculaire, exprimé en Daltons.
La figure 4 illustre une courbe d'étalonnage de la colonne Superose 6 avec des marqueurs protéiques de poids moléculaire décroissant. L'axe des abscisses représente le volume d'élution de la
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colonne, exprimé en millilitres. L'axe des ordonnées représente le poids moléculaire, exprimé en Daltons.
La figure 5 illustre la distribution cellulaire dans des cellules de levure d'une protéine de détection et d'isolement selon l'invention, dans laquelle le polypeptide appât est la protéine Ade4p.
La figure 5A illustre un cliché de fluorescence montrant la lumière émise par la GFP constitutive de la protéine de détection et d'isolement de l'invention.
La figure 5B est un cliché des mêmes cellules obtenu en lumière transmise.
La figure 6 illustre un chromatogramme d'élution d'un extrait protéique cellulaire obtenu à partir des cellules de levure recombinantes exprimant une protéine de détection et d'isolement selon l'invention dans laquelle le polypeptide appât est la protéine Adep. La courbe fine correspond aux mesures d'absorbance à 280 nanomètres. La courbe épaisse représente les mesures de fluorescence émises à 510 nanomètres pour une excitation à 480 nm.
En abscisse : le volume d'élution de la colonne d'exclusion Superdex 200, exprimé en millilitres.
Ordonnée à gauche du graphe : absorbance, exprimée en millième d'unité d'absorbance.
Ordonnée, à droite du graphe : fluorescence, exprimée en unités arbitraires.
La figure 7 illustre un chromatogramme obtenu lors de la purification du complexe protéique sur une colonne de nickel.
La courbe en pointillés représente les mesures d'absorbance mesurées à 280 nanomètres.
La courbe en trait continu représente les mesures d'intensité de fluorescence mesurées à 510 nanomètres pour une excitation à 480 nm.
En abscisse : le volume d'élution de la colonne de nickel, exprimé en millilitre.
En ordonnée, à gauche : l'absorbance exprimée en millième d'unité d'absorbance.
En ordonnée, à droite : la fluorescence exprimée en unité arbitraire.
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La figure 8 illustre un chromatogramme de purification du complexe protéique sur une colonne de Calmoduline Binding peptide Sepharose.
La courbe en pointillés représente les mesures d'absorbance mesurées à 280 nanomètres.
La courbe en trait continu représente l'intensité de fluorescence mesurée à 510 nanomètres pour une excitation à 480 nm.
En abscisse : le volume d'élution de la colonne, exprimé en millilitre.
En ordonnée à gauche : la mesure d'absorbance, exprimée en millième d'unité d'absorbance.
En ordonnée à droite : la mesure d'intensité de fluorescence, exprimée en unité arbitraire.
La figure 9 est un cliché d'un gel d'électrophorèse en présence de SDS des protéines purifiées successivement sur une colonne de nickel et une colonne de Calmoduline Binding Peptide Sepharose.
La piste de gauche représente les marqueurs protéiques de poids moléculaire connu.
La piste de droite représente les protéines purifiées à la suite des deux chromatographies d'affinité.
La figure 10 illustre la carte détaillée du vecteur pRS316.
La figure 11 illustre la carte détaillée du vecteur pRS426.
La figure 12 illustre la carte détaillée du vecteur pGB6.
La figure 13 illustre la carte détaillée du vecteur pGB7.
DEFINITIONS GENERALES
De manière préférée, tout acide nucléique et tout polypeptide selon l'invention se présente sous une forme isolée ou purifiée.
Le terme" isolé" au sens de la présente invention désigne un matériel biologique qui a été soustrait à son environnement originel (l'environnement dans lequel il est localisé naturellement). Par exemple, un polynucléotide présent à l'état naturel dans un organisme n'est pas isolé. Le même polynucléotide séparé des acides nucléiques adjacents au sein desquels il est naturellement inséré dans le génome de l'organisme est isolé. Un tel polynucléotide peut être inclus dans un vecteur et/ou un tel
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polynucléotide peut être inclus dans une composition et demeurer néanmoins à l'état isolé du fait que le vecteur ou la composition ne constitue pas son environnement naturel. Le même raisonnement vaut aussi pour un polypeptide extrait de son environnement naturel.
Le terme" purifié" ne nécessite pas que le matériel soit présent sous une forme de pureté absolue, exclusive de la présence d'autres composés. Il s'agit plutôt d'une définition relative.
Un polynucléotide ou un polypeptide est à l'état purifié après purification du matériel de départ ou du matériel naturel d'au moins un ordre de grandeur, de préférence 2 ou 3 et préférentiellement quatre ou cinq ordres de grandeur.
Aux fins de la présente description, l'expression" séquence nucléotidique"peut être employée pour désigner indifféremment un polynucléotide ou un acide nucléique. L'expression"séquence nucléotidique"englobe le matériel génétique lui-même et n'est donc pas restreinte à l'information concernant sa séquence.
Figure img00090001
Les termes"acide nucléique","potynudéotide", "o) igonudéotide"ou encore"séquence nudéotidique"englobent des séquences d'ARN, d'ADN, d'ADNc ou encore des séquences hybrides ARN/ADN de plus d'un nucléotide, indifféremment sous la forme simple brin ou sous la forme de duplex.
Le terme "nucléotide" désigne à la fois les nucléotides naturels (A, T, G, C) ainsi que des nucléotides modifiés qui comprennent au moins une modification telle que (i) un analogue d'une purine, (ii) un analogue d'une pyrimidine, ou (iii) un sucre analogue, de tels nucléotides modifiés étant décrits par exemple dans la demande PCT NOWO 95/04064.
Aux fins de la présente invention, un premier polynucléotide est considéré comme étant"complémentaire"d'un second polynucléotide lorsque chaque base du premier nucléotide est appariée à la base complémentaire du second polynucléotide dont l'orientation est inversée.
Les bases complémentaires sont A et T (ou A et U), et C et G.
Par polypeptide appât , on entend une protéine, ou encore un fragment ou un domaine d'une protéine, qui est susceptible de se lier à une ou plusieurs protéines distinctes exprimées dans une cellule hôte, de préférence des protéines naturellement exprimées dans une cellule hôte.
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Le polypeptide appât peut dans certains cas se lier à lui-même dans la cellule, par exemple lorsque ce polypeptide appât se retrouve naturellement sous la forme d'un multimère, par exemple d'un dimère, dans la cellule dans laquelle il est naturellement exprimé. Le polypeptide appât peut se lier respectivement à plusieurs protéines distinctes, soit que chacune de ces protéines distinctes se lient au même site du polypeptide appât , soit que ces protéines distinctes se lient à des sites différents du polypeptide appât . Dans ce dernier cas, le polypeptide appât pourrait se lier simultanément à une pluralité de protéines distinctes exprimées dans une cellule hôte.
Il peut aussi arriver qu'un polypeptide appât donné ne se lie à aucune des protéines avec lesquelles il est mis en contact, par exemple aucune des protéines exprimées par une cellule hôte.
Un polypeptide appât peut consister en la totalité d'une protéine codée par un cadre de lecture ouvert présent dans le génome d'un organisme hôte. Le polypeptide appât correspond alors à une copie d'une protéine naturellement exprimée dans cette cellule hôte.
Le polypeptide appât peut également consister en un fragment d'une protéine retrouvée naturellement dans une cellule hôte, par exemple lorsque ce fragment constitue un domaine, notamment un domaine conformationnel ou un domaine fonctionnel, de la protéine cellulaire, ce fragment ou domaine étant susceptible de se lier à une ou plusieurs protéines cellulaires distinctes.
A titre illustratif, un fragment ou domaine d'une protéine cellulaire pouvant être utilisée comme polypeptide appât peut être une partie polypeptidique d'une enzyme sur laquelle se fixent des ligands cofacteurs qui en régulent l'activité catalytique.
Le polypeptide appât peut être de toute nature et origine. Le polypeptide appât peut être une protéine qui est naturellement exprimée par la cellule hôte choisie, ou encore un fragment d'une telle protéine hôte.
Selon un autre mode de réalisation, le polypeptide appât peut être une protéine hétérologue vis-à-vis de la cellule hôte dans laquelle son expression est désirée, par exemple une protéine virale ou bactérienne, ou encore un fragment ou un domaine d'une protéine virale ou bactérienne.
Selon ce mode de réalisation particulier, les interactions entre des protéines
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de la cellule hôte et des protéines hétérologues, par exemple bactériennes ou virales peuvent être déterminées selon l'invention.
Selon l'invention, un ligand proie signifie tout composant de la cellule hôte capable de se fixer spécifiquement sur le polypeptide appât . En général, le ligand proie consiste en une protéine cellulaire qui se lie spécifiquement sur le polypeptide appât mais peut aussi être de nature glucidique ou lipidique.
Un ligand proie peut être une enzyme ou un fragment peptidique d'une enzyme sur lequel se fixent des ligands cofacteurs qui en régulent l'activité catalytique.
La détection d'un événement de fixation entre un ligand proie et le polypeptide appât , puis l'isolement, et le cas échéant la caractérisation, du ligand proie permet l'identification des partenaires cellulaires du polypeptide appât et rend possible la détermination des différentes interactions ayant lieu naturellement au sein de la cellule entre une protéine donnée, dont le polypeptide appât représente la copie ou un fragment de la copie, et les ligands proie de la cellule.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Il est fourni selon l'invention des acides nucléiques et des protéines permettant la mise en oeuvre, à grande échelle et à haute vitesse, de procédés d'identification des interactions protéiques se produisant au sein d'une cellule hôte.
Selon l'invention, il a été mis au point une famille d'outils de détection et d'isolement de ligands proie se fixant spécifiquement sur un polypeptide appât , ces outils de détection comprenant la combinaison d'un marqueur de détection et d'un ou plusieurs moyens d'isolement ou de purification.
L'invention a tout d'abord pour objet un acide nucléique pour l'obtention d'un polynucléotide codant pour une protéine de détection et d'isolement d'un ligand"proie"ou d'une pluralité de ligands"proie"se fixant spécifiquement sur un polypeptide" appât ", ledit acide nucléique codant une protéine comprenant un enchaînement d'au moins deux
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polypeptides liés entre eux, directement ou indirectement, ladite protéine étant caractérisée en ce que les deux polypeptides sont, respectivement : i) un polypeptide marqueur de détection ; et ii) un polypeptide susceptible de se fixer sélectivement sur un support de purification.
Comme cela sera exposé en détails dans la suite de la description, l'acide nucléique ci-dessus peut être fusionné avec un second acide nucléique codant un polypeptide appât choisi, l'acide nucléique fusionné résultant codant pour une protéine de détection et d'isolement d'un ligand proie ou d'une pluralité de ligands proie qui se fixent spécifiquement sur le polypeptide appât choisi.
Le marqueur de détection émet un signal dont l'intensité permet de suivre facilement la présence d'une protéine présente en faible abondance au sein d'un échantillon et permet de discriminer, en continu, lors de la procédure de purification, entre les outils de détection et d'isolement selon l'invention non complexés et les outils de détection et d'isolement selon l'invention qui sont complexés à une ou plusieurs protéines exprimées dans la cellule hôte (les ligands proie ), qui interagissent avec un polypeptide appât .
De plus, la possibilité de tracer en continu les outils de détection et d'isolement de l'invention, complexés ou non complexés à des protéines cellulaires, permet la réalisation de procédés de purification en continu, extrêmement rapides, et permettant de séparer directement, en une étape, les outils de détection non complexés, et chacun des outils de détection complexés respectivement avec des protéines cellulaires distinctes.
Il ressort de ce qui précède que la détection et l'isolement du ligand proie sont réalisés selon l'invention par détection et isolement d'un polypeptide de fusion entre le polypeptide appât et le polypeptide comprenant (i) un polypeptide marqueur de détection et (ii) un polypeptide susceptible de fixer sélectivement sur un support de purification.
En effet, ce qui est détecté est la présence du polypeptide marqueur de détection présent au sein du polypeptide de fusion comprenant le polypeptide appât .
Selon l'invention, il est donc possible de discriminer selon que :
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- le polypeptide de fusion comprenant l'appât n'est lié à aucun ligand proie ; ou - le polypeptide de fusion comprenant l'appât est lié à un ligand proie.
La détection du ligand proie est donc réalisée par détection d'un polypeptide de fusion comprenant l'appât possédant un poids moléculaire supérieur au poids moléculaire du polypeptide de fusion libre, sous forme non complexée à un ligand proie .
Les outils de détection et d'isolement selon l'invention permettent en conséquence une détection et un isolement rapide d'une protéine cellulaire ou d'une pluralité de protéines cellulaires de type proie qui interagissent avec un polypeptide appât choisi, la rapidité de la détection et de l'isolement de ces protéines permettant l'identification de protéines peu stables dans le temps.
De plus, les outils de détection et d'isolement de protéines cellulaires proie interagissant avec le polypeptide appât permettent la mise en oeuvre de procédés d'identification des interactions protéiques au sein de la cellule ne nécessitant aucune étape de test d'activité biologique ou encore de test indirect de la présence de complexes, du fait de la présence du marqueur de détection.
L'acide nucléique pour l'obtention d'un polynucléotide codant pour une protéine de détection et d'isolement d'un ligand proie tel que défini ci-dessus est, dans la pratique, transfecté dans la cellule hôte simultanément à un second acide nucléique codant le polypeptide appât , ce second acide nucléique comprenant également, à l'une de ses extrémités 5'ou 3', une séquence nucléotidique hybridant avec l'acide nucléique de l'invention.
L'invention a donc également pour objet une composition comprenant deux acides nucléiques, respectivement :
1) un acide nucléique pour l'obtention d'un polynucléotide codant une protéine de détection et d'isolement d'un ligand"proie"ou d'une pluralité de ligands"proie"se fixant spécifiquement sur un polypeptide "appât ", ledit acide nucléique codant une protéine comprenant un enchaînement d'au moins deux polypeptides liés entre eux, directement ou
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indirectement, ladite protéine étant caractérisée en ce que les deux polypeptides sont, respectivement : i) un polypeptide marqueur de détection ; et ii) un polypeptide susceptible de se fixer sélectivement sur un support de purification.
2) Un acide nucléique codant le polypeptide appât et hybridant avec l'une des extrémités 3'ou 5'de l'acide nucléique défini en 1).
Après la co-transfection de la cellule hôte avec la composition d'acides nucléiques ci-dessus, il se produit au moins un événement de recombinaison homologue in vivo entre l'acide nucléique selon l'invention et le second acide nucléique codant le polypeptide appât . L'évènement de recombinaison homologue permet la production d'un acide nucléique codant une protéine comprenant un enchaînement d'au moins trois polypeptides liés entre eux, directement ou indirectement, ladite protéine étant caractérisée en ce que les trois polypeptides sont respectivement : (i) le polypeptide appât ; (ii) le polypeptide marqueur de détection ; et (iii) au moins un polypeptide susceptible de se fixer sélectivement sur un support de purification.
ACIDE NUCLEIQUE CODANT POUR LE POLYPEPTIDE APPAT
L'acide nucléique codant pour le polypeptide appât comprend un cadre ouvert de lecture codant pour le polypeptide appât désiré, ledit cadre ouvert de lecture comprenant un codon d'initiation de la traduction localisé du côté 5'du cadre ouvert de lecture, l'extrémité 3'du cadre ouvert de lecture étant dépourvue de codon stop d'arrêt de la traduction.
Selon un mode de réalisation préféré, l'acide nucléique codant le polypeptide appât comprend aussi une séquence nucléotidique capable de contrôler la transcription et la traduction du polypeptide appât , cette séquence nucléotidique régulatrice étant fonctionnelle dans la cellule hôte dans laquelle l'expression du polypeptide appât est recherchée.
De manière tout à fait préférée, la séquence nucléotidique régulatrice consiste en la séquence régulatrice naturelle qui contrôle l'expression du polypeptide appât . Il s'agit de la séquence régulatrice
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retrouvée en amont du cadre de lecture ouvert codant pour le polypeptide appât , dans le génome de la cellule hôte dans laquelle le polypeptide appât est naturellement exprimé.
L'acide nucléique codant pour le polypeptide appât comprend aussi, à l'une au moins de ses extrémités 5'ou 3', une séquence nucléotidique s'hybridant, dans les conditions de force ionique caractérisant le milieu intracellulaire, avec l'acide nucléique pour l'obtention d'un polynucléotide codant pour une protéine de détection et d'isolement d'un ligand proie définie dans la présente description.
La séquence nucléotidique d'hybridation définie ci-dessus s'hybride, au sein d'une cellule hôte, avec l'extrémité de l'acide nucléique pour l'obtention d'un polynucléotide codant une protéine de détection et d'isolement d'un ligand proie qui code pour la protéine marqueur de détection, ou encore avec l'acide nucléique qui code pour un peptide espaceur lié directement à la protéine marqueur de détection.
De manière tout à fait préférée, les séquences nucléotidiques d'hybridation localisées respectivement aux extrémités de l'acide nucléique codant le polypeptide appât et de l'acide nucléique pour l'obtention d'un polynucléotide codant pour une protéine de détection et d'isolement d'un ligand proie sont exactement complémentaires l'une de l'autre, afin de favoriser l'hybridation entre les deux acides nucléiques dans la cellule hôte dans laquelle ils ont été transfectés, et favoriser ainsi l'évènement de recombinaison homologue entre ces deux acides nucléiques.
Après l'événement de recombinaison homologue ayant permis la fusion de l'acide nucléique codant pour le polypeptide appât choisi avec l'acide nucléique pour l'obtention d'un polynucléotide codant une protéine de détection et d'isolement d'un ligand proie , la cellule hôte ayant subi l'événement de recombinaison homologue comprend un acide nucléique codant pour une protéine de détection et d'isolement d'un ligand proie ou d'une pluralité de ligands proie , ledit polypeptide comprenant un enchaînement d'au moins trois polypeptides liés entre eux, directement ou indirectement, ladite protéine étant caractérisée en ce que les trois polypeptides sont, respectivement : (i) le polypeptide appât choisi ; (ii) le polypeptide marqueur de détection ; et
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(iii) un polypeptide susceptible de se fixer sélectivement sur un support de purification.
Avantageusement, l'acide nucléique de fusion issu de l'évènement de recombinaison homologue codant pour la protéine de détection et d'isolement d'un ligand proie est inséré dans un vecteur recombinant d'expression.
Dans ce mode de réalisation préféré, l'acide nucléique codant le polypeptide appât comprend aussi, à l'une de ses extrémités 5'ou 3', une séquence nucléotidique hybridant, dans les conditions d'hybridation retrouvées dans l'environnement intracellulaire, avec une séquence nucléotidique du vecteur dans lequel cet acide nucléique doit s'insérer.
De manière tout à fait préférée, la séquence nucléotidique d'hybridation est exactement complémentaire à la séquence du vecteur qui est localisée à l'endroit choisi d'insertion afin de favoriser un second évènement de recombinaison homologue entre l'acide nucléique codant le polypeptide appât et le vecteur.
Ainsi, selon un mode préféré de réalisation de l'invention, l'acide nucléique codant pour le polypeptide appât comprend respectivement, de l'extrémité 5'vers l'extrémité 3' : (i) une séquence nucléotidique d'au moins 20 nucléotides s'hybridant avec une séquence choisie d'un vecteur dans lequel l'acide nucléique est susceptible d'être inséré ; (ii) une séquence nucléotidique codant pour le polypeptide appât et comprenant aussi, le cas échéant, une séquence régulatrice contrôlant l'expression du polypeptide appât dans une cellule hôte ; et (iii) une séquence nucléotidique d'au moins 20 nucléotides s'hybridant avec l'acide nucléique pour l'obtention d'un polynucléotide codant pour une protéine de détection et d'isolement d'un ligand proie selon l'invention.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, les séquences (i) et (iii) ci-dessus ont respectivement les structures suivantes : - séquence (i) : 5'-ACTCACTATAGGGCGAATTG-3' (SEQ ID N 2), cette séquence nucléotidique s'hybridant avec le vecteur d'expression à l'endroit choisi de l'insertion ; et
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- séquence (iii) : 5'-AGCCCGGGGGATCCACTAGT-3' (SEQ D ? 3), cette séquence nucléotidique s'hybridant avec l'acide nucléique pour l'obtention du polynucléotide codant pour la protéine de détection et d'isolement selon l'invention.
Obtention d'un acide nucléique codant pour le polypeptide appât
L'acide nucléique codant le polypeptide appât peut être obtenu par amplification d'un ADN génomique à l'aide d'un couple d'amorces appropriées.
Avantageusement, on utilisera un couple d'amorces nucléotidiques comprenant : - une amorce s'hybridant avec une séquence nucléotidique génomique localisée à au moins 50 bases en amont du cadre ouvert de lecture codant pour le polypeptide appât ; et - une amorce nucléotidique 3's'hybridant avec une séquence nucléotidique génomique localisée à l'extrémité 3'du cadre ouvert de lecture codant pour le polypeptide appât et ne s'hybridant pas avec le codon stop du cadre ouvert de lecture.
De préférence, l'amorce nucléotidique 5's'hybride avec une séquence nucléotidique localisée à au moins 100,150, 200,250, 300,350 ou 400 bases en amont du cadre de lecture ouvert codant le polypeptide appât , afin d'obtenir un produit d'amplification comprenant, en amont du cadre ouvert de lecture, la totalité des séquences promotrices naturelles contrôlant l'expression du polypeptide appât .
Afin de permettre l'évènement de recombinaison homologue entre l'acide nucléique codant pour le polypeptide appât et l'acide nucléique codant pour l'autre partie de la protéine de détection et d'isolement d'un ligand proie , l'amorce 3'comprend aussi une séquence nucléotidique s'hybridant avec l'acide nucléique pour l'obtention d'un polynucléotide codant une protéine de détection et d'isolement d'un ligand proie tel que défini précédemment.
Afin de permettre l'évènement de recombinaison homologue entre l'acide nucléique codant le polypeptide appât et le vecteur dans lequel celui-ci doit être inséré, l'amorce aller comprend aussi une séquence
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nucléotidique hybridant avec une séquence du vecteur localisée au niveau de l'insertion désirée.
De manière tout à fait préférée, l'amorce nucléotidique 5' possède la structure 5'- [N1]- [N2]-3', dans laquelle : (i) [N1] représente la séquence nucléotidique s'hybridant avec le vecteur et (ii) [N2] représente une séquence nucléotidique d'au moins 20 nucléotides s'hybridant avec la séquence nucléotidique génomique (brin +) localisée à au moins 50 bases en amont du cadre de lecture ouvert codant pour le polypeptide appât .
Avantageusement, la séquence [N2] a une longueur d'au moins 25,26, 27,28, 29,30 ou 40 nucléotides.
Préférentiellement, la séquence [N1] est la séquence 5'ACTCACTATAGGGCGAATTG-3' (SEQ ID N02).
De manière tout à fait préférée, l'amorce nucléotidique 3' a la structure 5'- [N3]- [N4]-3', dans laquelle (i) [N3] est la séquence nucléotidique s'hybridant avec l'acide nucléique pour l'obtention du polynucléotide codant pour la protéine de détection et d'isolement selon l'invention et (ii) [N4] est une séquence nucléotidique d'au moins 20 nucléotides s'hybridant avec l'acide nucléique génomique (brin-) localisé à l'extrémité 3'du cadre ouvert de lecture codant pour le polypeptide appât à l'exclusion du codon stop .
Avantageusement, la séquence [N4] a une longueur d'au moins 25,26, 27,28, 29,30, 35 ou 40 nucléotides.
Préférentiellement, la séquence [N3] est la séquence 5'- AGCCCGGGGGATCCACTAGT-3' (SEQ) D ? 3).
ACIDE NUCLEIQUE POUR L'OBTENTION D'UN POLYNUCLEOTIDE CODANT POUR UNE PROTEINE DE DETECTION ET D'ISOLEMENT D'UN LIGAND PROIE
Cet acide nucléique code pour un polypeptide de fusion comprenant un polypeptide marqueur de détection et au moins un polypeptide se fixant sélectivement sur un support de purification. Les modes de réalisation préférés de ces polypeptides sont détaillés cidessous.
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Figure img00190001

Polypeptide (s) se fixant sélectivement sur un support de purification. pgptide ~
De préférence, l'acide nucléique pour l'obtention d'un polynucléotide codant pour une protéine de détection et d'isolement appât selon l'invention est caractérisé en ce que ladite protéine comprend une pluralité de polypeptides distincts susceptibles de se fixer chacun sur un support de purification donnée.
Selon un mode de réalisation préférentiel, ladite protéine comprend deux polypeptides distincts susceptibles de se fixer chacun sur un support de purification donné.
Avantageusement, l'un des polypeptides susceptibles de se fixer sur un support de purification est un peptide se fixant à la Calmoduline.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, l'un des polypeptides susceptibles de se fixer sur un support de purification est un peptide poly (histidine) se fixant sur un support contenant des ions Nickel.
De préférence, le peptide poly (histidine) est constitué d'une séquence de 4 à 10 résidus d'histidine, de préférence 6 histidines.
La présence de plusieurs polypeptides susceptibles de se fixer sélectivement sur les supports de purification distincts améliore significativement les possibilités de purification de la protéine de détection, complexée ou non à des ligands proie , en augmentant considérablement l'élimination des constituants cellulaires indésirables.
Ainsi, lorsque l'on purifie une protéine contenant un peptide poly (histidine) sur une colonne contenant des ions nickel, des constituants cellulaires indésirables, tels que les protéines à doigt de zinc, sont également retenues, puis éluées simultanément à la protéine d'intérêt.
L'ajout d'au moins un second polypeptide susceptible de se fixer sur un autre support de purification, tel qu'un support de purification contenant un peptide se fixant à la Calmoduline, permet de retenir sélectivement la protéine d'intérêt sans retenir simultanément d'autres constituants cellulaires indésirables, telles que les protéines à doigt de zinc précitées.
Selon un mode de réalisation préférentiel d'un acide nucléique pour l'obtention d'un polynucléotide codant pour une protéine de détection et d'isolement d'un ligand proie selon l'invention, dans lequel la protéine
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Figure img00200001

comprend, en combinaison, un peptide se fixant à la Calmoduline et un peptide poly (histidine), le peptide se fixant à la Calmoduline et le peptide poly (histidine) sont séparés par un peptide espaceur, avantageusement un peptide espaceur ayant une longueur de 5 à 20 acides aminés de longueur, préférentiellement de 7 à 15 acides aminés de longueur et de manière tout à fait préférée ayant 8,9, 10, 11, 12 ou 13 acides aminés de longueur. La présence du peptide espaceur favorise la mobilité des deux polypeptides, l'un par rapport à l'autre, les deux polypeptides étant en conséquence plus accessibles vis-à-vis des supports de purification.
Afin d'améliorer les conditions d'élution d'une protéine de détection et d'isolement d'un ligand proie de l'invention, en évitant des conditions drastiques, par exemple de très faible ou de très haute force ionique, nécessaires à la désorption de la protéine d'intérêt du support chromatographique, il est introduit dans la séquence d'acides aminés de la protéine de détection et d'isolement une séquence d'acides aminés reconnue par une endopeptidase, ce qui permet de détacher la protéine de détection et d'isolement de l'invention, complexée ou non à un ligand proie , du support chromatographique par simple clivage peptidique, sans altérer la structure ou la conformation dans l'espace du ligand proie .
Ainsi, selon un mode de réalisation avantageux, l'acide nucléique pour l'obtention d'un polynucléotide codant pour une protéine de détection et d'isolement d'un ligand proie selon l'invention est en outre caractérisé en ce que le polypeptide, ou au moins l'un des polypeptides susceptibles de se fixer sur un support de purification, est séparé du reste de la séquence en acides aminés de la protéine de détection et d'isolement par au moins un peptide comprenant une séquence d'acides aminés reconnue par une endopeptidase rare.
De manière tout à fait préférée, on utilise une séquence d'acides aminés reconnue par l'endopeptidase Lys-C décrite par JEKEL PA, WEIJER WJ, BEINTENA ( Use of endoproteinase Lys-C from Lycobacter enzymogenes in protein sequence analysis J. J. Analytical Biochemistry, 1983, vol. 134 pp 347 à 354), ou encore la séquence d'acides aminés reconnue par la protéase du virus de la marbrure du tabac (séquence en acides aminés NH-ENLYFQG-COOH ).
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Selon un mode de réalisation préféré d'un acide nucléique pour l'obtention d'un polynucléotide codant pour une protéine de détection et d'isolement d'un ligand proie selon l'invention, la séquence d'acides aminés reconnue par une endopeptidase rare est située sur le peptide espaceur localisé entre deux polypeptides distincts susceptibles de se fixer chacun sur un support de purification donné, c'est-à-dire, dans un mode de réalisation préféré, sur le peptide espaceur reliant le peptide se fixant à la Calmoduline et le peptide poly (histidine).
Polypeptide marqueur de détection.
De préférence, le polypeptide marqueur de détection codé par l'acide nucléique selon l'invention est un polypeptide détectable par mesure de fluorescence.
Selon un mode de réalisation avantageux, le polypeptide marqueur de détection consiste en une protéine à fluorescence verte, dite GFP (pour Green Fluorescent Protein ) qui a été initialement obtenue à partir de la méduse Aequorea victoria et pour laquelle de nombreux dérivés fluorescents ont été mis au point, qui sont bien connus de l'homme du métier.
A titre illustratif, l'homme du métier peut avantageusement se référer à l'article de DELAGRAVE et al. (1995) ainsi que l'article de HEIM et al. (1995). Les ADN et les vecteurs codant pour divers dérivés de la GFP sont commercialisés, par exemple par la Société CLONTECH (PALO ALTO, Californie, USA). L'homme du métier peut aussi se référer à des ADN codant pour des protéines GFP humanisées, telles que celles décrites dans le brevet US N"6, 020,192 ainsi qu'à la protéine GFP décrite dans le brevet US N"5, 941,084.
Selon l'invention, l'homme du métier peut aussi avoir recours à d'autres protéines fluorescentes telles que la protéine YFP (pour yellow fluorescent protein ) et ses dérivés ainsi qu'à la protéine RFP ( pour red fluorescent protein ) et ses dérivés, bien connues de l'homme du métier.
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Acide nucléique préféré
Un exemple préféré d'acide nucléique pour l'obtention d'un polynucléotide codant pour une protéine de détection et d'isolement d'un ligand proie selon l'invention consiste en un acide nucléique comprenant, de son extrémité 5'à son extrémité 3', les éléments caractéristiques suivants : - un acide nucléique codant pour le variant mut3 de la GFP décrit par CORMACK et al. (1997), sans le codon stop ; - un acide nucléique codant pour le peptide de fixation à la Calmoduline ( Calmodulin Binding Peptide ) ; - un acide nucléique codant pour le site de coupure de la protéase du virus de la marbrure du tabac ; - un acide nucléique codant pour un peptide constitué de six résidus histidine ; - le codon stop (TAA) - un acide nucléique contenant une séquence terminateur fonctionnelle chez la levure.
Un tel acide nucléique répondant à la définition ci-dessus est illustré sur la figure 2. Il s'agit de l'acide nucléique de séquence SEQ ID N01 du listage de séquences, qui constitue un objet de la présente invention.
Le polypeptide codé par l'acide nucléique SEQ ID n01 est le polypeptide de séquence en acides aminés SEQ ID n 13.
Autres caractéristiques
Pour son utilisation dans des vecteurs, l'acide nucléique ci-dessus comprend avantageusement une ou plusieurs séquences nucléotidiques reconnues par des endonucléases de restriction (sites de restriction).
De préférence, un ou plusieurs sites de restriction sont présents : (i) à l'extrémité 5'de l'acide nucléique, (ii) entre la séquence codant la protéine GFP et la séquence codant pour le peptide se fixant à la Calmoduline, (iii) entre la séquence codant pour le peptide se fixant à la Calmoduline et la séquence codant pour le site de coupure de la protéase
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du virus de la marbrure du tabac, (iv) entre le codon stop et la séquence du terminateur, et enfin (v) en aval, du côté 3'de la séquence du terminateur.
VECTEURS RECOMBINANT SELON L'INVENTION
Avantageusement, l'acide nucléique pour l'obtention d'un polynucléotide codant pour une protéine de détection et d'isolement d'un ligand proie selon l'invention est inséré dans un vecteur.
Avantageusement, l'acide nucléique de fusion codant une protéine de détection et d'isolement d'un ligand proie tel que défini précédemment est aussi inséré dans un vecteur.
L'invention est donc également relative à un vecteur recombinant comprenant un acide nucléique pour l'obtention d'un polynucléotide codant pour une protéine de détection et d'isolement d'un ligand proie et à un vecteur comprenant un acide nucléique codant une protéine de détection et d'isolement d'un ligand proie .
De préférence, le vecteur recombinant est un vecteur navette bactérie-levure, le vecteur pouvant être monocopie ou multicopie.
Préférentiellement, un vecteur recombinant de l'invention comprend des moyens destinés à son maintien stable dans la cellule hôte dans laquelle il est introduit et permettant aussi son maintien dans les générations successives de cellules hôtes issues, directement ou indirectement, de la multiplication de la cellule hôte initialement transfectée par le vecteur recombinant.
Avantageusement, un vecteur recombinant tel que défini ci-dessus comprend une ou plusieurs origines de réplication fonctionnelle dans la cellule hôte dans laquelle il est transfecté en vue de l'expression d'une protéine de détection et d'isolement d'un ligand proie .
Le cas échéant, le vecteur recombinant comprend aussi une ou plusieurs origines de réplication dans une cellule hôte appartenant à un genre ou une espèce distinct.
Pour une expression de la protéine de détection et d'isolement d'un ligand proie de l'invention dans une cellule hôte de levure, l'origine de réplication fonctionnelle dans la levure est de préférence la séquence ARS et le moyen permettant la stabilité et la bonne ségrégation du vecteur
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dans les générations successives de cellules de levure issues directement ou indirectement, de la multiplication de la cellule hôte initiale est un centromère fonctionnel chez la levure.
Avantageusement, un vecteur recombinant selon l'invention comprend également au moins un acide nucléique codant un marqueur de sélection chez la levure, tel que le gène URA3.
Dans le mode de réalisation préférentiel d'un vecteur selon l'invention dans lequel il s'agit d'un vecteur recombinant selon l'invention comprend aussi un acide nucléique marqueur de sélection de la transformation dans une cellule hôte telle qu'une bactérie, par exemple le gène AmpR de résistance à l'ampiciline.
Les vecteurs préférés selon l'invention sont respectivement les vecteurs pGB6 et pGB7 dont les protocoles de construction sont décrits à l'exemple 1.
L'invention concerne aussi le vecteur pGB6 hébergé dans la
Figure img00240001

souche de E. coli DH5 a déposée à la CNCM le 19 Septembre 2001 sous le numéro d'accès 1-2718.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, l'acide nucléique codant pour le polypeptide appât est lui-même inséré dans un vecteur recombinant.
L'invention a aussi pour objet une composition comprenant : - un vecteur recombinant dans lequel a été inséré artificiellement un acide nucléique codant pour le polypeptide appât ; et - un vecteur recombinant dans lequel a été inséré artificiellement un acide nucléique pour l'obtention d'un polynucléotide codant pour une protéine de détection et d'isolement d'un ligand proie .
La composition ci-dessus peut également comprendre des composés susceptibles de faciliter la transfection des vecteurs recombinants dans une cellule hôte.
CELLULES HOTES RECOMBINANTES
L'invention a aussi pour objet une cellule hôte recombinante caractérisée en ce qu'elle est transformée par un acide nucléique pour l'obtention d'un polynucléotide codant pour une protéine de détection et
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d'isolement d'un ligand proie telle que défini ci-dessus, ou encore par un vecteur recombinant dans lequel est inséré un tel acide nucléique.
Une cellule hôte recombinante préférée est la souche de E. coli
Figure img00250001

DH5a déposée à la CNCM le 19 Septembre 2001 sous le numéro d'accès 1-2718.
L'invention est aussi relative à une cellule hôte recombinante caractérisée en ce qu'elle est transformée par une composition comprenant deux acides nucléiques ou par une composition comprenant deux vecteurs recombinants, telles que définies précédemment dans la présente description.
Comme déjà exposé précédemment, après co-transfection de l'acide nucléique pour l'obtention d'une protéine de détection et d'isolement d'un ligand proie avec un second acide nucléique codant pour le polypeptide appât , au moins un événement de recombinaison homologue in vivo entraîne la fusion des deux acides nucléiques précités, résultant en un acide nucléique unique comprenant, dans le même cadre ouvert de lecture : a) un acide nucléique codant pour le polypeptide appât , fusionné avec b) l'acide nucléique pour l'obtention d'une protéine de détection et d'isolement d'un ligand proie tel que défini ci-dessus.
En conséquence, l'invention est également relative à une cellule hôte recombinante caractérisée en ce qu'elle comprend un acide nucléique codant une protéine de détection et de purification d'un ligand proie ledit acide nucléique comprenant, dans le même cadre ouvert de lecture : a) un acide nucléique codant le polypeptide appât , fusionné avec b) l'acide nucléique pour l'obtention de la protéine de détection et d'isolement d'un ligand proie .
Avantageusement, l'acide nucléique codant pour la protéine de détection et d'isolement d'un ligand proie est inséré dans le vecteur recombinant utilisé pour l'insertion de l'acide nucléique pour l'obtention de la protéine de détection et d'isolement d'un ligand proie .
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PROTEINE DE DETECTION ET D'ISOLEMENT SELON L'INVENTION
A la suite de l'événement de recombinaison homologue ci-dessus, la cellule hôte recombinante synthétise une protéine de détection et d'isolement d'un ligand proie qui constitue l'un des objets de la présente invention. Cette protéine de détection et d'isolement d'un ligand proie comprend un enchaînement d'au moins trois polypeptides liés entre eux, directement ou indirectement, caractérisé en ce que les trois polypeptides sont respectivement :
1) un polypeptide appât se fixant spécifiquement sur un ligand proie ou une pluralité de ligands proie ;
2) un polypeptide marqueur de détection ; et
3) au moins un polypeptide susceptible de se fixer sélectivement sur un support de purification.
Le polypeptide marqueur de détection et le ou les polypeptides susceptibles de se fixer sélectivement sur un support de purification sont ceux qui ont été définis précédemment dans la présente description.
Une protéine préférée est la protéine comprenant la séquence d'acides aminés SEQ ID ? 13.
La protéine ci-dessus peut être en outre caractérisée en ce qu'elle est produite par une cellule hôte recombinante telle que définie précédemment.
L'invention a également pour objet un acide nucléique codant une protéine de détection et d'isolement d'un ligand proie répondant à la structure générale ci-dessus.
Un tel acide nucléique peut être caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide régulateur permettant l'expression de la protéine de détection et d'isolement dans une cellule hôte choisie.
De préférence, le second acide nucléique codant pour le polypeptide appât comprend aussi la séquence régulatrice spécifique de la séquence codant le polypeptide appât , de telle sorte que, lors d'événement de recombinaison homologue, le polynucléotide régulateur permettant l'expression de la protéine de détection et d'isolement de
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Figure img00270001

l'invention soit inséré simultanément à la séquence codant le polypeptide appât .
L'invention a aussi pour objet un vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression comprenant un acide nucléique codant pour une protéine de détection et d'isolement d'un ligand proie selon l'invention.
Un tel vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression peut être indifféremment un vecteur d'origine virale, procaryote ou eucaryote tel que ceux décrits dans l'ouvrage de SAMBROOK et al. (1989).
De manière tout à fait préférée, il s'agit des vecteurs pGB5 et pGB7 décrits à l'exemple 1.
L'invention est également relative à une cellule hôte recombinante comprenant un acide nucléique codant une protéine de détection et d'isolement d'un ligand proie .
De manière tout à fait préférée, la cellule hôte recombinante exprime la protéine de détection et d'isolement d'un ligand proie .
L'invention concerne aussi un procédé d'obtention d'un acide nucléique codant une protéine de détection et d'isolement d'un ligand proie , ledit procédé comprenant les étapes de : a) co-transfecter une cellule hôte respectivement avec (i) un acide nucléique pour l'obtention d'un polynucléotide codant pour une protéine de détection et d'isolement d'un ligand proie tel que défini précédemment et (ii) un acide nucléique codant pour un polypeptide appât ; b) cultiver la cellule hôte co-transfectée à l'étape a) et sélectionner les cellules dans lesquelles l'acide nucléique (i) et l'acide nucléique (ii) ont été fusionnés l'un à l'autre ; c) isoler l'acide nucléique résultant de la fusion de l'acide nucléique (i) et de l'acide nucléique (ii) qui code pour une potéine de détection et d'isolement d'un ligand proie selon l'invention.
De préférence, la cellule hôte qui est co-transfectée est une levure.
De préférence, les acides nucléiques (i) et (ii) sont insérés dans des vecteurs de clonage et/ou d'expression.
De préférence, l'acide nucléique fusionné qui code pour une protéine de détection et d'isolement d'un ligand proie est lui-même inséré dans un vecteur. Il est isolé selon les techniques classiques de
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purification de vecteurs à partir d'une culture de cellules hôtes bien connues de l'homme du métier.
PROCEDES DE DETECTION ET D'ISOLEMENT D'UN LIGAND PROIE OU D'UNE PLURALITE DE LIGANDS PROIE SELON L'INVENTION.
Les acides nucléiques et les protéines dont la structure a été définie ci-avant dans la présente description sont utilisés dans des procédés de détection et d'isolement de ligands proie .
Plus spécifiquement, l'utilisation des acides nucléiques et des protéines de détection et d'isolement d'un ligand proie selon l'invention ont permis la mise au point de divers procédés permettant d'identifier et, le cas échéant, de caractériser, avec une grande rapidité, les ligands proie susceptibles d'interagir naturellement avec le polypeptide appât dans la cellule hôte.
Procédé de détection in vivo
L'invention a pour objet un procédé pour détecter et isoler un ligand proie ou une pluralité de ligands proie produit par une cellule hôte, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) transfecter ou transformer une cellule hôte avec un acide nucléique codant pour une protéine de détection et d'isolement d'un ligand proie comprenant un enchaînement d'au moins trois polypeptides liés entre eux, directement ou indirectement, caractérisé en ce que les trois polypeptides sont respectivement :
1. un polypeptide appât se fixant spécifiquement sur le ligand proie ;
2. un polypeptide marqueur de détection ; et
3. au moins un polypeptide susceptible de se fixer sélectivement sur un support de purification ; b) cultiver les cellules hôtes obtenues à l'issue de l'étape a) et exprimant la protéine de détection et d'isolement d'un ligand proie c) Iyser les cellules hôtes cultivées à l'étape b) ;
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d) détecter les complexes éventuellement formés entre la protéine de détection et d'isolement et un ligand proie ou une pluralité de ligands proie ; e) isoler le ligand proie ou la pluralité de ligands proie .
L'étape a) ci-dessus peut aussi être réalisée avec un vecteur recombinant, tel qu'exposé précédemment.
Selon le procédé, l'étape d) de détection est réalisée par mesure de la fluorescence émise par le polypeptide marqueur de détection constitutif de la protéine de détection et d'isolement selon l'invention.
De manière tout à fait préférée, l'étape c) comprend à la fois une étape de lyse des cellules hôtes cultivées et une étape d'extraction des protéines contenues dans le Iysat cellulaire, selon des techniques bien connues de l'homme du métier.
De manière tout à fait préférée, l'étape d) de détection des complexes éventuellement formés entre la protéine de détection et d'isolement et un ligand proie ou une pluralité de ligands proie est simultanée à au moins une étape de chromatographie d'exclusion de taille.
Figure img00290001

La détection de la protéine de détection et d'isolement, complexée ou non à un ligand proie , est réalisée de préférence par mesure de la fluorescence émise par le polypeptide marqueur de détection, durant la totalité de la durée d'élution de l'étape de chromatographie.
L'étape de chromatographie d'exclusion de taille est réalisée préférentiellement à l'aide d'un support de chromatographie choisi parmi le Superdex 200tu et le Superose 6TM.
Avantageusement, l'étape d) comprend deux étapes de chromatographie d'exclusion de taille successives, par exemple
Figure img00290002

TM successivement sur Superdex 200 puis sur Superose 6TM.
Le support Superdex 200tu permet une bonne résolution entre les poids moléculaires 20 kDa et 200 kDa. Le support Superose 6 permet une résolution entre les poids moléculaires 60 kDA et 800 kDA.
Selon ce mode de réalisation, on peut séparer, à l'étape d) du procédé, en fonction de leur poids moléculaire, - d'une part, les protéines de détection et d'isolement de l'invention qui ne sont pas complexées avec un ligand proie ; et
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- d'autre part, les protéines de détection et d'isolement selon l'invention qui sont complexées avec respectivement des ligands proie de poids moléculaires distincts.
La phase d'élution de l'étape de chromatographie d'exclusion de taille, qui est contrôlée par mesure de la fluorescence émise par l'éluat, permet de déterminer expérimentalement, et en continu, la masse moléculaire des protéines fluorescentes éluées.
La valeur expérimentale de masse moléculaire est ensuite comparée avec le résultat du calcul théorique de la masse moléculaire de la protéine de détection et d'isolement de l'invention sous forme libre non complexée. Lorsque les masses moléculaires sont identiques ou très similaires, le procédé est interrompu à l'étape d) et l'étape e) n'est pas réalisée.
En revanche, lorsque la comparaison entre la valeur expérimentale de la masse moléculaire d'une protéine fluorescente détectée au cours de l'élution et la valeur théorique de masse moléculaire de la protéine de détection et d'isolement selon l'invention est telle qu'elle correspond à un complexe entre un ligand proie , par exemple une protéine proie , et le polypeptide appât , alors l'étape e) du procédé ci-dessus est réalisée.
En conséquence, l'étape d) du procédé ci-dessus comprend avantageusement les étapes suivantes : d1) réaliser au moins une étape de chromatographie d'exclusion de taille pendant laquelle on détecte en continu la présence du polypeptide marqueur de détection dans l'éluat ; d2) à chaque occurrence de détection du polypeptide marqueur, calculer la valeur expérimentale de la masse moléculaire de la protéine de détection et d'isolement dans laquelle le polypeptide marqueur est inclus ; d3) comparer la valeur expérimentale de masse moléculaire calculée à l'étape d1) avec la valeur théorique de masse moléculaire de la protéine de détection sous forme libre non complexée ; et d4) poursuivre la suite des étapes du procédé uniquement dans le cas où la valeur expérimentale et la valeur théorique de masse moléculaire sont sensiblement distinctes.
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La valeur expérimentale et la valeur théorique de masse moléculaire sont sensiblement distinctes lorsqu'elles diffèrent entre elles d'au moins 5 kilodaltons.
A la suite de l'étape d), on procède à au moins une étape de purification supplémentaire visant à séparer la protéine de détection et d'isolement de l'invention complexée à un ligand proie et les nombreux contaminants cellulaires indésirables, ce qui constitue l'étape e) du procédé ci-dessus.
Ainsi, l'étape e) comprend au moins une étape de purification du complexe formé sur un support sur lequel se fixe sélectivement la protéine de détection et d'isolement selon l'invention.
De préférence, afin d'éliminer la presque totalité des contaminants cellulaires indésirables, l'étape e) du procédé comprend deux étapes successives de purification du complexe formé, respectivement sur deux supports distincts sur lesquels se fixe sélectivement la protéine de détection et d'isolement selon l'invention.
De manière tout à fait préférée, les deux supports distincts de purification sont respectivement : - un support sur lequel sont immobilisées des molécules de Calmoduline ; et - un support sur lequel ont été immobilisés des ions nickel.
Dans le mode de réalisation de la protéine de détection et d'isolement d'un ligand proie selon l'invention dans lequel ladite protéine comprend un peptide espaceur reconnu par une endopeptidase rare, l'elution du complexe formé entre la protéine de détection et d'isolement de l'invention et un ligand proie peut être réalisée en ajoutant au tampon d'élution l'endopeptidase correspondante, de manière à provoquer un clivage de la protéine de détection et d'isolement de l'invention, au niveau du site reconnu par l'enzyme, afin de libérer le complexe du support de chromatographie.
Le procédé pour détecter et isoler un ligand proie ou une pluralité de ligands proie ci-dessus comprend avantageusement aussi une étape ultérieure f) de caractérisation du ligand proie ou de la pluralité de ligands proie complexés respectivement aux protéines de détection et d'isolement de l'invention.
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Notamment, l'étape f) de caractérisation du ligand proie ou de la pluralité de ligands proie peut consister en une migration du complexe formé sur un gel d'électrophorèse, de préférence en conditions dénaturantes, puis, après digestion de chacune des bandes protéiques obtenues à l'aide d'une ou de plusieurs endopeptidases, analyse des peptides issus de la protéolyse.
De manière tout à fait préférée, l'analyse des peptides produits après digestion à l'aide de l'endopeptidase ou des endopeptidases, est réalisée par spectrométrie de masse, par exemple selon la méthodologie MALDI-TOF.
L'invention concerne aussi une trousse ou nécessaire pour détecter et isoler un ligand proie se fixant sur un polypeptide appât , comprenant : a) un acide nucléique pour l'obtention d'un polynucléotide codant une protéine de détection et d'isolement telle que définie dans la présente description ou un vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression comprenant cet acide nucléique ; b) facultativement, des réactifs nécessaires à la transfection ou la transformation d'une cellule hôte.
L'invention a aussi pour objet une trousse ou nécessaire pour détecter et isoler un ligand proie ou une pluralité de ligands proie se fixant spécifiquement sur un polypeptide appât , comprenant : a) une composition de deux acides nucléiques, respectivement : - un acide nucléique pour l'obtention d'une protéine de détection et d'isolement d'un ligand proie tel que défini dans la présente description ; et - un acide nucléique codant le polypeptide appât b) facultativement, des réactifs nécessaires à la transfection ou la transformation d'une cellule hôte.
Selon un autre mode de réalisation, la trousse ou nécessaire cidessus comprend une composition de deux vecteurs recombinants, telle que décrite précédemment.
L'invention est aussi relative à une trousse ou nécessaire pour détecter et isoler un ligand proie se fixant spécifiquement sur un polypeptide appât , comprenant :
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a) un acide nucléique codant une protéine de détection et d'isolement d'un ligand proie , tel que défini ci-dessus, ou un vecteur recombinant comprenant un tel acide nucléique ; b) facultativement, des réactifs nécessaires à la transfection ou à la transformation d'une cellule hôte.
Les réactifs nécessaires à la transfection ou à la transformation d'une cellule hôte sont bien connus de l'homme du métier.
A titre illustratif, on peut utiliser divers composants cationiques se liant aux sites anioniques des acides nucléiques à transfecter, de tels réactifs cationiques étant décrits par exemple par SCHOFIELD (1995) et ou encore par BEHR, (1994). On peut aussi utiliser des lipides cationiques tels que décrits dans le brevet US N"4, 812,449, des dérivés d'amine chargés et non chargés, des lipopolyamines telles que décrites dans le brevet US N"5, 171,678 ou encore les réactifs lipophiles décrits respectivement dans les brevets US ? 5, 208,036, 5,264, 618 et 5,334, 761. On peut aussi utiliser des liposomes, comme cela est décrit dans les brevets US 5,287, 170, 5,049, 392,4, 532,089, 4,529, 561, et 5,223, 263.
Procédé de détection et disolement in vitro d'un Il and proie ou d'une pluralité de ligands ( (proie)).
Comme déjà exposé précédemment, il est fourni selon l'invention une protéine de détection et d'isolement d'un ligand proie comprenant un enchaînement d'au moins trois polypeptides liés entre eux, directement ou indirectement, caractérisée en ce que les trois polypeptides sont respectivement :
1. un polypeptide appât se fixant spécifiquement sur le ligand proie ;
2. un polypeptide marqueur de détection ; et
3. un polypeptide susceptible de se fixer sélectivement sur un support de purification.
La protéine de détection et d'isolement d'un ligand proie selon l'invention peut être utilisée directement in vitro pour détecter et isoler un ligand proie ou une pluralité de ligands proie dans un échantillon, par exemple dans tout fluide biologique, y compris un Iysat cellulaire.
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Selon un autre aspect, la présente invention concerne un procédé pour détecter et isoler un ligand proie dans un échantillon, comprenant les étapes suivantes : a) mettre en contact une protéine de détection et d'isolement selon l'invention avec l'échantillon à tester ; b) détecter les complexes éventuellement formés entre la protéine de détection et d'isolement et le ligand proie ou la pluralité de ligands proie contenus dans l'échantillon ; et
Figure img00340001

c) isoler le ligand proie ou la pluralité de ligands proie .
Les étapes b) de détection des complexes et c) d'isolement du ou des ligands proie sont de préférence effectuées de manière identique aux étapes d) et e) du procédé de détection in vivo décrit précédemment.
Avantageusement, le procédé est en outre caractérisé en ce qu'il comprend une étape d) de caractérisation du ligand proie ou de la pluralité de ligands proie précédemment isolé.
De préférence, l'étape d) du procédé est réalisée de manière identique à l'étape f) de caractérisation du ligand proie décrit pour le procédé de détection in vivo précédemment détaillé.
L'invention a aussi pour objet une trousse ou nécessaire pour la détection et l'isolement du ligand proie ou d'une pluralité de ligands proie dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend une protéine de détection et d'isolement d'un ligand proie selon l'invention.
Procédé pour déterminer des interactions protéiques dans une cellule hôte.
L'invention a encore pour objet un procédé pour déterminer les interactions protéiques se produisant, dans une cellule hôte, entre un polypeptide appât et les protéines synthétisées par cette cellule hôte, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) réaliser le procédé de détection et d'isolement d'un ligand proie in vivo défini ci-dessus ; b) réaliser une carte des interactions entre le polypeptide appât et le ou les protéines cellulaires proie détectées, isolées, et facultativement caractérisées.
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Une carte des interactions protéiques se produisant, dans une cellule hôte, entre un polypeptide appât et les protéines synthétisées par cette cellule hôte, qui est susceptible d'être obtenue par l'un des procédés de détection et d'isolement selon l'invention, peut être de toute forme et de toute structure, dès lors qu'elle fait apparaître clairement les relations existant entre une protéine ou un polypeptide appât et une ou plusieurs protéines proie se fixant spécifiquement sur la protéine ou le polypeptide appât , pour un homme du métier.
Dans une telle carte d'interactions protéiques, chaque polypeptide ou protéine appât est relié à une ou plusieurs protéines proie , par exemple par l'intermédiaire d'une flèche.
Une telle carte d'interactions protéiques peut permettre à l'homme du métier d'identifier la totalité d'une voie métabolique et/ou physiologique de la cellule hôte considérée.
Une telle carte d'interactions protéiques constitue un autre objet de la présente invention.
L'invention est aussi relative à un support lisible par un ordinateur numérique, telle qu'une disquette, un CD ROM ou tout autre support de données numériques, par exemple magnétique ou optique, lisible par un ordinateur numérique, support sur lequel sont stockées un ensemble d'interactions protéiques constitutives d'une carte d'interactions protéiques telle que définie ci-dessus.
La présente invention est en outre illustrée, sans pour autant être limitée, par les exemples suivants : EXEMPLE 1-Construction des vecteurs
Les vecteurs de l'invention ont été développés à partir des vecteurs pRS316 et pRS426 (SIKORSKI et HIETER, 1989) illustrés respectivement dans les figures 10 et 11. Ce sont des vecteurs navettes (bactérie-levure) monocopies (le pRS316 possède une ARS et un centromère) ou multicopies (le pRS426 possède une origine de réplication du plasmide 2um). Le marqueur de sélection de la transformation bactérienne est le gène AmpR, celui de la transformation de la levure le gène URA3.
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La construction des vecteurs a consisté à insérer dans le multisite de clonage entre les sites EcoRI et Kpnl, le gène de structure de l'étiquette permettant la détection et la purification de la protéine appât des complexes protéiques. La séquence nucléotidique correspondant à cette étiquette est la séquence SEQ ID N'l, qui est présentée dans la figure 2. Ainsi, de 5'en 3', on trouve successivement : - le site BamHi (GGATCC), (SEQ ID N04) ; - le site EcoRI (GAATTC), (SEQ ID N 5) ; - le gène de structure du variant mut3 de la GFP sans le codon stop (partie grisée). Ce gène présente un biais de codon optimisé pour l'expression chez la levure (CORMACK et al., 1997), - le site Hindlll (AAGCTT) (SEQ ID N06), la partie codant pour le Calmodulin Binding Peptide (zone encadrée) - le site Clal (ATCGAT) (SEQ ID N 7) dans un environnement non sensible à la méthylase dam - une séquence codant pour le site de coupure de la protéase du virus de la marbrure du tabac, - la séquence codant pour les six histidines - le codon stop (TAA) - le site Xhol (CTCGAG) (SEQ ID N 8) - la séquence du terminateur du gène CYC1 et enfin le site Kpnl (CGTACC) (SEQ ID N09).
Ainsi, cette séquence nucléotidique code pour une protéine constituée par : - un peptide de 10 acides aminés (TSGSPGLQEF) (SEQ ID N 10) - le variant mut3 de la GFP - deux acides aminés (KL) - un peptide qui présente une forte affinité pour la Calmoduline (KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL) (SEQ ID D ? 11) - deux acides aminés (ID) - le site de coupure de la protéase du virus de la marbrure du tabac (ENLYFQG) (SEQ ID N 12), trois acides aminés (ELK) - six histidines.
La construction des vecteurs a été réalisée en plusieurs étapes.
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Figure img00370001
1 Insertion de l'élément de purification :
L'insertion entre les sites Hindlll et Xhol du plasmide pRS316 d'un fragment synthétique obtenu par annealing à 55 C de cinq oligonucléotides de synthèse et ligation par la Taq ligase. Ce fragment synthétique correspond au site de restriction Hindlil puis au gène codant pour les deux acides aminés (KL) suivis du peptide qui présente une forte affinité pour la Calmoduline, des deux acides aminés (ID), du site de coupure de la protéase du virus de la marbrure du tabac, des trois acides aminés (ELK), des six histidines, et enfin au codon stop et au site de restriction Xhol.
Le multisite de clonage du plasmide pRS316 se trouvant dans le gène lacz, la sélection de colonie bactérienne contenant le plasmide recombinant ayant inséré le fragment synthétique a été facilité (système blanc-bleu en présence d'IPTG et de Xgal). Le vecteur GENOU5 présentant les critères recherchés de taille de l'insert (147 nucléotides) a été vérifié par séquençage et conservé pour la suite des constructions.
Insertion du terminateur du gène CYCI :
Le terminateur du gène CYC1 a été récupéré comme un fragment Sall Kpnl dans le plasmide pGFP-N-FUS décrit dans la littérature (Yeast 1996, vol. 12, pp. 773-786) et inséré dans le plasmide GENOU5 ouvert par Xhol et Kpnt. Le plasmide résultant a été appelé GENOU5 + Term.
*Insertion du gène de la GFP :
Le fragment portant le gène de structure de la GFP optimisée pour l'expression dans la levure a été obtenu par PCR en utilisant deux amorces permettant d'insérer directement en amont du deuxième codon de la GFP un site EcoRI et immédiatement en aval du dernier codon de la GFP (avant le codon stop) un site Hindili. Ce fragment a été inséré dans le plasmide GENOU5 + Term digéré par EcoRI et Hindlll. Le plasmide résultant a été appelé pGB6, qui est illustré à la figure 12.
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Obtention des plasmides multicopies :
Le vecteur multicopie pGB7 a été obtenu en transférant les fragments Pvull du vecteur pGB6 dans un vecteur pRS426 préalablement ouvert par Pvull. Le vecteur pGB7 est illustré à la figure 13.
Vérification des plasmides
Tous les vecteurs ont été séquencés pour vérification.
EXEMPLE 2 : Expression d'une protéine fusionnée à l'étiquette A. MATERIE ET METHODE Transformation des cellules.
Pour chaque ORF, un couple d'oligonucléotides a été défini. La séquence de ces oligonucléotides correspond à : - pour l'oligonucléotide s'hybridant dans la région 5'de l'ORF :
5'-ACTCACTATAGGGCGAATTG (SEQ ID N02) (+ 30 nucléotides correspondant à la région située à-400 de l'ATG de l'ORF) -3'.
- pour l'oligonucléotide s'hybridant dans la région 3'de l'ORF :
5'-AGCCCGGGGGATCCACTAGT (SEQ ID N03) (+ 30 nucléotides correspondant à la fin du gène sans le codon stop)-3'.
L'amplification est réalisée selon deux protocoles en fonction de la longueur de l'ORF. Pour des longueurs inférieures à 2500 nt, un protocole classique impliquant l'AmpliTaqGolg de Perkin Elmer a été utilisé. Pour des longueurs supérieures à 2500 nt, le protocole du kit Expand 20 kbP'us PCR system de Roche a été appliqué. La taille et la quantité des amplifiants sont vérifiées par électrophorèse sur gel d'agarose.
A partir de la souche BY4742 décrite dans la littérature (Yeast (1998 vol. 14 pp 115-132) correspondant à la souche de levure totalement séquencée (S288C), une souche nommée BY4742A2 a été obtenue par
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croisement. Cette souche a le génotype suivant : Mata his3,, d200 leu2 A 0 ura3 10.
Cette souche est cotransformée par le plasmide pGB6 digéré par Sacl et Xbal et par l'amplifiat correspondant à l'ORF considérée. L'amplifiat présente la particularité suivante : les extrémités sont strictement identiques aux régions bordant les sites Sad et Xbal. Ainsi, dans la levure une recombinaison entre les régions homologues de l'amplifiat et du vecteur ouvert donne naissance non seulement à un vecteur stable exprimant le produit du gène URA3 mais aussi une protéine de fusion étiquetée en Cterminal par l'élément précédemment décrit.
Dans le but d'éviter l'obtention de transformants possédant uniquement le vecteur vide (sans l'ORF), des contrôles de la qualité des digestions du plasmide par Sacl et Xbal sont entrepris par transformation en remplaçant l'amplifiat par de l'eau. Seuls les plasmides digérés permettant d'obtenir peu de transformants (moins d'une vingtaine par boîte) sont retenus pour la co-transformation.
Culture des cellules transformées et préparation des extraits
Figure img00390001

protéiques ques
Pour chaque transformant, un extrait protéique est réalisé de la façon suivante. Plusieurs transformants sont mélangés et mis en croissance sur une boîte de collection contenant du milieu sélectif permettant de maintenir une pression de sélection pour conserver le plasmide dans la population (milieu minimum contenant de l'histidine et de la leucine). Cette boîte est ensuite utilisée pour inoculer une préculture dans 5 ml de milieu sélectif durant 6 heures sous agitation à 30 C. Cette préculture est à son tour utilisée pour inoculer 0,5 litre de milieu sélectif.
Cette culture est agitée pendant 19 heures à 30 C.
Les cellules sont récoltées par centrifugation (5000g pendant 1 min) lavées dans du tampon d'extraction (triéthanolamine 20 mM pH 7.4, NaCi 150 mM, phényl méthyl sulfonyl fluoride 1 mM) puis le culot est pesé et congelé à - 20oC.
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Les cellules sont décongelées en ajoutant autant de volume de tampon d'extraction, exprimé en millilitres que de poids, exprimé en grammes, du culot cellulaire.
Après décongélation les cellules sont broyées au One shot disrupter développé par la Société Constant Systems. La pression de travail est réglée à 2000 bars.
L'extrait broyé est clarifié par centrifugation à 100 000 g pendant
Figure img00400001

30 minutes. Il correspond à une concentration en protéine d'environ 10 mg/ml. Dans le but d'éliminer les éléments lipidiques qui se trouvent à la surface du surnageant, l'extrait est filtré sur Miracloth&commat; à l'issu de la centrifugation.
B. RESULTATS Localisation cellulaire de la protéine appât
Après avoir obtenu une souche exprimant la protéine Ade4p étiquetée avec la GFP et le fragment peptidique autorisant sa purification, nous avons observé sa localisation cellulaire au microscope à épifluorescence. Le résultat est présenté dans la figure 5. La protéine étiquetée se distribue dans la cellule en un ou deux spots distincts. Cette distribution cellulaire ne rappelle pas une structure subcellulaire déjà décrite et pourrait correspondre à un site cytoplasmique spécifique de production de l'Adenine.
EXEMPLE 4 : Détection des protéines de détection et d'isolement. non complexées. ou complexées à un ou plusieurs ligands proie .
A. MATERIE ET METHODE
Cette étape consiste d'une part à mesurer la masse moléculaire de la protéine de fusion et d'autre part à comparer cette valeur mesurée avec celle calculée sur la base de la séquence peptidique. Afin d'obtenir les mesures les plus précises possibles, nous préconisons pour cette étape
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une unité FPLCO ÂKTAO Explorer 10S distribué par la Société AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH. En effet, outre la qualité des séparations obtenues, ce matériel présente l'avantage de pouvoir analyser automatiquement huit échantillons différents. Ce matériel a été équipé de deux types de colonnes : une colonne Superdex 200 et une colonne Superose 6. Dans un premier temps, ces colonnes ont été étalonnées avec des standards moléculaires de masse moléculaire connue. Pour illustrer la précision des mesures effectuées avec ce type d'appareillage, les résultats sont présentés dans les figures 3 et 4.
Pour déterminer la taille de la protéine de fusion sur ces colonnes, l'ÂKTA a été couplé à un détecteur de fluorescence (RF-10AXL de la Société Shimadzu).
Le développement spécifique d'une carte électronique a permis de coupler les données issues de l'ÂKTA et du détecteur de fluorescence.
En pratique, lors de cette phase de diagnostic, l'extrait protéique (200 ut) est chargé sur une colonne Superdex 200. En suivant simultanément la fluorescence émise par la GFP et le volume d'élution, la masse moléculaire de la protéine de fusion peut être déterminée. Lorsque le chromatogramme indique la présence de complexe protéique de taille supérieure à 300 kDa, l'analyse est affinée sur une colonne Superose 6.
Lors d'études menées avec la souche transformée avec uniquement le plasmide ne contenant pas d'amplifiat, nous avons démontré 3 pics de fluorescence (correspondant aux volumes d'élution de 15,16 et 20 mi). Ces pics qui correspondent à des éléments fluorescents de la levure sont de faible intensité. La connaissance de ces pics spécifiques de la levure permet aujourd'hui de ne plus les considérer lors des diagnostics.
Lorsque la phase de diagnostic démontre la présence d'un complexe, nous envisageons sa purification. Pour cela de nouveaux extraits sont préparés à partir de 2 litres de culture (lorsque des protéines sont très faiblement exprimées dans la levure, des volumes de culture supérieurs sont envisagés). En règle générale, 8 à 10 ml d'extrait clarifié titrant environ 10 mg de protéine par ml sont obtenus.
Cet extrait est d'abord chargé sur une colonne de Nickel puis la fraction éluée est purifiée sur une colonne de Calmoduline Sepharose.
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B. RESULTATS DE L'EXEMPLE 4 Détermination expérimentale de la masse moléculaire de la protéine appât .
Afin de mettre en évidence la participation d'Ade4p dans un éventuel complexe protéique, un extrait protéique de la souche exprimant la protéine étiquetée est analysé sur une colonne de gel filtration selon le protocole décrit dans le chapitre Matériel et Méthodes. Le chromatogramme résultant est présenté dans la figure 6. Lorsque l'on considère l'intensité de fluorescence en fonction du volume d'exclusion, on remarque plusieurs pics. Certains de ces pics sont toujours présents avec la même intensité quelque soit l'extrait protéique analysé. Il s'agit des deux pics correspondant à des espèces moléculaires de faible taille (inférieure à 10 kDa). L'analyse d'un extrait protéique d'une souche n'exprimant pas la GFP a démontré que ces pics correspondaient à des molécules fluorescentes de la levure. Les trois autres pics ont pour origine l'expression hétérologue de la GFP. Le premier pic qui apparaît pour un volume d'élution de 8 à 9 ml devrait correspondre à des molécules emprisonnées dans des vésicules membranaires. Le second pic, spécifique de l'extrait issu de la souche exprimant la protéine Ade4p étiquetée, est exclu de la colonne avec les molécules de 320 kDa. Enfin, un troisième pic de fluorescence est observé avec les molécules ayant une masse de 27 kDa. Ce dernier pic, d'intensité variable selon les extraits analysés, correspond à la GFP qui résulte de la dégradation de la protéine de fusion.
La masse moléculaire de la protéine appât calculée à partir de sa séquence est d'environ 80 kDa. La masse moléculaire mesurée expérimentalement étant significativement supérieure (320 kDa), nous pouvons conclure que la protéine Ade4p étiquetée participe à un complexe.
Dans le but d'identifier les différents partenaires de ce complexe, la protéine appât est purifiée d'abord sur une colonne de Nickel puis sur une colonne de Calmodulin Binding Peptide.
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EXEMPLE 5 : Isolement des ligands proie .
5.1 Purification sur colonne de nickel.
A. MATERIEL ET METHODE
Cette colonne est une colonne de HITrap Cheating HP de 1 ml distribuée par la Société Amersham Pharmacia BIOTECH 5R2F. 1760408- 01). La colonne est régénérée en nickel avant chaque purification et est utilisée cinq fois maximum.
Dans le but non seulement d'automatiser cette tâche mais aussi d'éviter des variations inhérentes à la répétition, un programme de pilotage du système ÂKTA a été écrit dans le logiciel UNICORN V3.10. La liste des instructions composant ce programme est présentée dans la figure 5.
L'extrait est chargé en présence de 50 mM imidazole pour diminuer les interactions peu spécifiques. Le lavage est assuré durant 5 volumes de colonne puis la colonne est éluée avec 300 mM imidazole.
Lorsque la fraction éluée est jugée trop complexe, l'elution peut être menée en incubant la colonne de nickel avec de la protéase du TEV pendant une nuit à température ambiante.
RESULTATS DU 5.1 Purification du complexe protéique sur colonne de nickel
Un extrait protéique de la souche exprimant la protéine étiquetée est chargé sur une colonne de nickel en présence de 5 mM d'imidazole.
Après lavage, la protéine étiquetée est récupérée en éluant en présence de 300 mM d'imidazole. Le chromatogramme résultant est présenté dans la figure 9. Les fractions correspondant au pic d'élution sont d'abord réunies et la concentration en CaCI2 est ensuite amenée à 2 mM. Enfin la purification du complexe est poursuivie sur une colonne de Calmodulin Binding Peptide.
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5.2 Purification sur colonne de Calmoduline A. MATERIE ET METHODE
Les fractions correspondant au pic d'élution sont réunies, amenées à 2mM CaCI2 puis chargées sur une colonne de Calmodulin Sepharose 4B distribuée par la Société Amersham Pharmacia Biotech (réf.
17-0529-01). Le gel est coulé dans une colonne HR 5/5 sur une hauteur de 2 cm ce qui correspond à un volume de 1 ml.
Comme pour la colonne nickel, un programme de pilotage du système ÂKTA a été écrit dans le logiciel UNICORN V3.10. La liste des instructions composant ce programme est présentée figure 6.
L'extrait est chargé en présence de 2 mM CaCI2 condition indispensable pour fixer le Calmodulin Binding Peptide sur la Calmoduline. Le lavage est assuré durant 10 volumes de colonne puis la colonne est éluée avec 2 mM EGTA.
Les fractions correspondant au pic d'élution sont réunies puis précipitées avec 15% (w/v) d'acide trichloroacétique.
B. Résultats du 5.2 Purification du complexe protéique sur colonne de Calmodulin Binding Peptide Sepharose
Les fractions précédemment réunies et amenées à 2 mM CaCI2 sont chargées sur une colonne de Calmodulin Binding Peptide puis, après lavage, le complexe est récupéré en éluant avec une solution d'EGTA 2 mM. Le chromatogramme résultant est présenté sur la figure 10. Les fractions correspondant au pic d'élution sont réunies puis concentrées par précipitation au TCA 15% (w/v). Après centrifugation, les protéines sont solubilisées et séparées par électrophorèse monodimensionnelle en gel dénaturant.
EXEMPLE 6 : Caractérisation des ligands proie
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A. MATERIE ET METHODE
1. Purification par électrophorèse en gel dénaturant
Les protéines précipitées sont solubilisées puis séparées par électrophorèse en gel dénaturant. Les bandes polypeptidiques séparées sont révélées par coloration des gels au Bleu de Coomassie.
2. Identification des bandes polypeptidiques au spectromètre de masse.
Les bandes polypeptidiques du gel sont découpées, décolorées et enfin digérées par l'endoprotéinase Lys-c. Les produits de digestion sont analysés au spectromètre de masse en utilisant la méthodologie MALDITOF (Appareil Brucker Reflex 111).
L'approche méthodologique repose sur l'analyse de peptides résultant d'une protéolyse in gel par l'endoprotéinase Lys-C. Les mélanges de peptides obtenus pouvant se révéler très complexes, une étape de séparation par microchromatographie a été systématiquement introduite dans le protocole analytique, pour obtenir deux fractions d'hydrophobicité croissante.
Lors d'une première analyse de ces deux fractions chromatographiques, ce sont tout d'abord les masses des peptides intacts qui sont déterminées. Les masses monoisotopiques mesurées sont utilisées pour l'interrogation de la base de données NCBI au moyen des logiciels Protein Prospector et/ou Profound. Cette première approche peut délivrer une réponse dépourvue d'ambiguïté, mais conduit souvent à plusieurs réponses. Il faut alors procéder à une deuxième analyse pour obtenir une identification définitive. A cette fin, un signal peptidique correspondant à une protéine candidate est isolé au moyen du sélecteur d'ions du spectromètre MALDI-TOF (ion gate) et le mode d'analyse d'ions fragments (méthodologie d'analyse Post Source Decay, PSD) est activé.
Une deuxième interrogation, indépendante de la première est alors effectuée à l'aide des masses des ions fragments pour établir l'identité de la protéine de manière irréfutable (logiciel MSTag du site Protein Prospector).
<Desc/Clms Page number 46>
B. RESULTATS DE L'EXEMPLE 6 Séparation des protéines par électrophorèse et analyse au spectromètre de masse.
Les protéines purifiées par les deux chromatographies d'affinité sont séparées par électrophorèse en gel SDS. Le résultat est présenté dans la figure 11. En plus d'une bande polypeptidique migrant aux environs de 90-100 kDa, deux autres bandes polypeptidiques sont décelées sur le gel en dessous du marqueur de 66 kDa.
L'ensemble des bandes polypeptidiques sont digérées séparément par l'endoprotéinase Lys-C puis analysées au spectromètre de masse. Les résultats de l'analyse en spectrométrie de masse sont présentés dans le tableau 1. Ce type d'analyse démontre d'une part la présence d'Ade4p et de GFP dans la bande polypeptidique n01 et d'autre part identifie comme Sro9p la bande polypeptidique n 2. Cette dernière protéine correspond à une protéine contaminante. En effet, sa présence est détectée quel que soit l'ORF analysée.
Ainsi, en intégrant non seulement les résultats issus de l'analyse sur la colonne d'exclusion mais aussi les résultats de l'analyse par spectrométrie de masse, nous pouvons conclure que la protéine de fusion Ade4p-GFP (masse moléculaire de 80 kDa) s'associe en un tétramère de 320 kDa. C'est la première fois qu'un tétramère d'Ade4p est mis en évidence chez la levure. Un tel complexe a déjà été décrit chez Bacillus subtilis où cette structure quaternaire permet d'expliquer finement une régulation allostérique (SMITH et al., 1994).
CONCLUSION
L'ensemble des résultats présentés pour la protéine appât Ade4p illustre que le procédé décrit est non seulement utilisable pour mettre en évidence des complexes protéiques.
La réussite d'une purification d'une protéine implique trois pré requis : -la protéine doit être abondante
<Desc/Clms Page number 47>
- la protéine doit être stable - la mise en évidence de la protéine à l'issue de chaque étape de purification doit être aisée.
Notre procédé permet de résoudre l'ensemble de ces problèmes.
D'abord, notre élément de détection (la GFP) émet une intensité de fluorescence telle qu'une protéine peu abondante peut être purifiée.
Ensuite, la détection facilitée à l'issue de chaque étape diminue le temps du protocole et autorise la purification de protéine peu stable. Enfin, cet élément de détection permet d'optimiser le protocole de purification rapidement sans la mise en oeuvre d'un test d'activité ou d'un test indirect de présence.
TABLEAU 1
Figure img00470001
<tb>
<tb> Echantillon <SEP> Protéine <SEP> Gène <SEP> Référence <SEP> Masse <SEP> Nombre <SEP> de
<tb> identifiée <SEP> Swissprot <SEP> moleculaire <SEP> peptides
<tb> assignés
<tb> Bande <SEP> 1 <SEP> Aminophos-ADE4 <SEP> P004046 <SEP> 56719.5 <SEP> 8
<tb> phoribosyl- <SEP> YMR300C <SEP> 5510 <SEP> A. <SEP> a)
<tb> transférase <SEP> YM9952.02C
<tb> Bande <SEP> 2 <SEP> Green <SEP> GFP <SEP> P42212 <SEP> 32281.3 <SEP> 11
<tb> fluorescent <SEP> (284 <SEP> a. <SEP> a).
<tb> protein
<tb> Bande <SEP> 2 <SEP> SR09 <SEP> SR09 <SEP> P25567 <SEP> 51789.2 <SEP> 6
<tb> protéine <SEP> YCL037C <SEP> (466 <SEP> a. <SEP> a)
<tb>
<Desc/Clms Page number 48>
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Claims (45)

  1. Figure img00490001
    Revendications -------------------------- 1. Acide nucléique pour l'obtention d'un polynucléotide codant pour une protéine de détection et d'isolement d'un ligand"proie"ou d'une pluralité de ligands"proie"se fixant spécifiquement sur un polypeptide" appât If, ledit acide nucléique codant une protéine comprenant un enchaînement d'au moins deux polypeptides liés entre eux, directement ou indirectement, ladite protéine étant caractérisée en ce que les deux polypeptides sont, respectivement : i) un polypeptide marqueur de détection ; et ii) un polypeptide susceptible de se fixer sélectivement sur un support de purification.
  2. 2. Acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite protéine comprend une pluralité de polypeptides distincts susceptibles de se fixer chacun sur un support de purification donné.
  3. 3. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que ladite protéine comprend deux polypeptides distincts susceptibles de se fixer chacun sur un support de purification donné.
  4. 4. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'un polypeptide susceptible de se fixer sur un support de purification est un peptide se fixant à la Calmoduline.
  5. 5. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'un polypeptide susceptible de se fixer sur un support de purification est un peptide poly (histidine) se fixant sur un support contenant des ions
    Nickel.
  6. 6. Acide nucléique selon la revendication 3, caractérisé en ce que les deux polypeptides distincts susceptibles de se fixer chacun sur un support de purification donné sont respectivement un peptide se fixant à la
    Calmoduline et un peptide poly (histidine) se fixant sur un support contenant du Nickel
    <Desc/Clms Page number 50>
  7. 7. Acide nucléique selon la revendication 6, caractérisé en ce que le peptide se fixant à la Calmoduline et le peptide poly (histidine) sont séparés par un peptide espaceur.
  8. 8. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le polypeptide ou au moins l'un des polypeptides susceptibles de se fixer sur un support de purification sont séparés du reste de la protéine de détection et de purification par au moins un peptide comprenant une séquence d'acides aminés reconnue par une endopeptidase rare.
  9. 9. Acide nucléique selon la revendication 8, caractérisée en ce que la séquence d'acides aminés reconnue par une endopeptidase rare est la protéase du virus de la marbrure du tabac.
  10. 10. Acide nucléique selon la revendication 7, caractérisé en ce que le peptide espaceur comprend une séquence d'acides aminés reconnue par une endopeptidase rare.
  11. 11. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que le polypeptide marqueur de détection est un polypeptide détectable par mesure de fluorescence.
  12. 12. Acide nucléique selon la revendication 11, caractérisé en ce que le polypeptide marqueur est choisi par les GFP ("Greeen Fluorescent Proteins"), et les RFP ("Red Fluorescent Proteins").
  13. 13. Acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il s'agit de la séquence SEQ ID N'l.
  14. 14. Composition comprenant deux acides nucléiques, respectivement :
    1) un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 13 ;
    2) un acide nucléique codant un polypeptide appât .
  15. 15. Vecteur recombinant comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 13.
    <Desc/Clms Page number 51>
  16. 16. Vecteur recombinant selon la revendication 15, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur navette bactérie-levure monocopie ou multicopies.
  17. 17. Vecteur recombinant selon l'une des revendications 15 et 16, caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide marqueur de sélection.
  18. 18. Vecteur recombinant selon l'une des revendications 15 à 17, caractérisé en ce qu'il s'agit du vecteur pGB6 hébergé dans la souche de E. coli
    Figure img00510001
    déposée à la CNCM le 19 Septembre 2001 sous le numéro d'accès 1-2718.
  19. 19. Composition comprenant :
    1) un vecteur recombinant dans lequel a été inséré artificiellement un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 13 ;
    2) un vecteur recombinant dans lequel a été inséré artificiellement un acide nucléique codant pour un polypeptide appât .
  20. 20. Cellule hôte recombinante caractérisée en ce qu'elle est transformée par un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 13, ou par un vecteur recombinant selon l'une des revendications 15 à 18.
  21. 21. Cellule hôte recombinante selon la revendication 20, caractérisée en ce qu'il s'agit de la souche de E. coli DH5 cr. contenant le vecteur pBG6
    Figure img00510002
    déposée à la CNCM le 19 Septembre 2001 sous le numéro d'accès 1-2718.
  22. 22. Cellule hôte recombinante caractérisée en ce qu'elle est transformée par une composition comprenant deux acides nucléiques selon la revendication 14 ou par une composition comprenant deux vecteurs recombinants selon la revendication 19.
  23. 23. Cellule hôte recombinante caractérisée en ce qu'elle comprend un acide nucléique codant pour une protéine de détection et de purification d'un ligand"proie", ledit acide nucléique comprenant, dans le même cadre ouvert de lecture :
    <Desc/Clms Page number 52>
    a) un acide nucléique codant pour le polypeptide" appât ", fusionné avec b) un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 13.
  24. 24. Protéine de détection et d'isolement d'un ligand"proie"comprenant un enchaînement d'au moins trois polypeptides liés entre eux, directement ou indirectement, caractérisé en ce que les trois polypeptides sont respectivement :
    1) un polypeptide" appât" se fixant spécifiquement sur le ligand "proie" ;
    2) un polypeptide marqueur de détection ; et
    3) au moins un polypeptide susceptible de se fixer sélectivement sur un support de purification.
  25. 25. Protéine selon la revendication 24, caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence d'acides aminés SEQ ID ? 13.
  26. 26. Protéine selon l'une des revendications 24 ou 25, caractérisée en ce qu'elle est produite par une cellule hôte recombinante selon l'une des revendications 22 ou 23.
  27. 27. Acide nucléique codant une protéine selon la revendication 24.
  28. 28. Acide nucléique selon la revendication 27, caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide régulateur permettant l'expression de la protéine de détection et d'isolement dans une cellule hôte choisie.
  29. 29. Vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 27 ou 28.
  30. 30. Cellule hôte recombinante comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 27 ou 28 ou un vecteur recombinant selon la revendication 29.
    <Desc/Clms Page number 53>
  31. 31. Procédé pour détecter et isoler un igand"proie"ou une pluralité de ligands"proie"produits par une cellule hôte, comprenant les étapes suivantes : a) transfecter ou transformer une cellule hôte avec un acide nucléique selon l'une des revendications 27 ou 28 ou un vecteur recombinant selon la revendication 29 ; b) cultiver les cellules hôtes obtenues à l'issue de l'étape a) et exprimant une protéine de détection et d'isolement d'un ligand"proie" comprenant un enchaînement d'au moins trois polypeptides liés entre eux, directement ou indirectement, caractérisé en ce que les trois polypeptides sont respectivement :
    1) un polypeptide" appât" se fixant spécifiquement sur le ligand "proie" ;
    2) un polypeptide marqueur de détection ; et
    3) un polypeptide susceptible de se fixer sélectivement sur un support de purification ; c) Iyser les cellules hôtes cultivées à l'étape b) ; d) détecter les complexes éventuellement formés entre la protéine de détection et d'isolement et un ligand"proie"ou une pluralité de ligands" proie" ; e) isoler le ligand"proie". ou la pluralité de ligands" proie"
  32. 32. Procédé selon la revendication 31, caractérisé en ce que l'étape d) de détection est réalisée par mesure de la fluorescence émise par le polypeptide marqueur de détection constitutif de la protéine de détection et d'isolement.
  33. 33. Procédé selon la revendication 32, caractérisé en ce qu'à l'étape d), la détection des complexes est simultanée à au moins une étape de chromatographie d'exclusion de taille.
  34. 34. Procédé selon la revendication 33, caractérisé en ce que l'étape d) comprend deux étapes de chromatographie d'exclusion de taille successives.
    <Desc/Clms Page number 54>
  35. 35. Procédé selon l'une des revendications 31 à 34, caractérisé en ce que l'étape e) comprend au moins une étape de purification du complexe formé sur un support sur lequel se fixe sélectivement la protéine de détection et d'isolement.
  36. 36. Procédé selon la revendication 35, caractérisé en ce que l'étape e) comprend deux étapes successives de purification du complexe formé sur deux supports distincts sur lesquels se fixe sélectivement la protéine de détection et d'isolement.
  37. 37. Procédé selon la revendication 36, caractérisé en ce que les deux supports distincts de purification sont respectivement : - un support sur lequel sont immobilisées des molécules de calmoduline, et - un support sur lequel ont été immobilisés des ions de Nickel.
  38. 38. Procédé selon l'une des revendications 31 à 37, caractérisé en ce qu'il comprend une étape f) de caractérisation du ligand"proie"ou de la pluralité de ligands"proie".
  39. 39. Trousse ou nécessaire pour détecter et isoler un ligand proie se fixant spécifiquement sur un polypeptide appât , comprenant : a) un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 13 ; b) facultativement, des réactifs nécessaires à la transfection ou la transformation d'une cellule hôte.
  40. 40. Tousse ou nécessaire pour détecter et isoler un igand"proie"se fixant spécifiquement sur un polypeptide" appât", comprenant : a) une composition de deux acides nucléiques selon la revendication
    14 ou une composition de vecteurs recombinants selon la revendication 19 ; b) facultativement, des réactifs nécessaires à la transfection ou la transformation d'une cellule hôte.
    <Desc/Clms Page number 55>
  41. 41. Trousse ou nécessaire pour détecter et isoler un ligand proie se fixant spécifiquement sur un polypeptide appât , comprenant : a) un acide nucléique selon l'une des revendications 27 ou 28 ou vecteur recombinant selon la revendication 29 ; b) facultativement des réactifs nécessaires à la transfection ou à la transformation d'une cellule hôte.
  42. 42. Procédé pour détecter et isoler un ligand"proie"dans un échantillon, comprenant les étapes suivantes : a) mettre en contact une protéine de détection et d'isolement selon l'une des revendications 24 ou 25 avec l'échantillon ; b) détecter les complexes éventuellement formés entre la protéine de détection et d'isolement et le ligand" proie" ou la pluralité de ligands "proie"contenus dans l'échantillon ; c) isoler le ligand"proie".
  43. 43. Procédé selon la revendication 42, caractérisé en ce qu'il comprend une étape d) de caractérisation du ligand"proie".
  44. 44. Trousse ou nécessaire pour la détection et l'isolement d'un ligand "proie"ou d'une pluralité de ligands"proie"dans un échantillon, caractérisé en ce qu'il comprend un polypeptide selon l'une des revendications 24 ou 25.
  45. 45. Procédé pour déterminer les interactions protéiques se produisant, dans une cellule hôte, entre un polypeptide" appât" et les protéines naturellement synthétisées par cette cellule hôte, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) réaliser le procédé selon l'une des revendications 31 à 38 ; b) réaliser une carte des interactions entre le polypeptide" appât" et le ou les ligands" proie" détectés, isolés, et facultativement caractérisés.
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