FR2829147A1 - Procede de preparation d'une composition lyophilisee contenant des bacteries lactiques a viabilite et activite bacteriennes ameliorees lors d'un stockage a temperature ambiante et composition obtenue - Google Patents

Abstract

Institut National de la Recherche Agronomique (INRA). L'invention concerne un procédé de préparation d'une composition lyophilisée qui comprend les étapes suivantes : a) préparation d'un concentré de bactéries lactiques dans un milieu liquide, ledit milieu liquide comprenant : (i) un composé antioxydant hydrosoluble ou une association de composés antioxydants hydrosolubles; et (ii) un composé ou une association de composés augmentant la température de transition vitreuse du produit lyophilisé; b) lyophilisation du concentré de bactéries lactiques lyoprotégé préparé à l'étape a), selon les étapes suivantes : (b1) congélation du concentré de bactéries; (b2) dessiccation primaire;(b3) dessiccation secondaire jusqu'à obtenir une composition bactérienne lyophilisée ayant une activité de l'eau d'environ 0, 1 et dont la température de transition vitreuse (Tg) est supérieure d'au moins 20°C à la température de stockage (Ts) prédéterminée. Application aux industries biologiques et alimentaires.

Description

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DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention se rapporte au domaine de la production et du stockage des bactéries lactiques lyophilisées, utilisables par diverses industries pour la transformation par fermentation.

ART ANTERIEUR
Les bactéries lactiques sont très largement employées dans les industries biologiques et alimentaires. Leurs principales applications concernent l'industrie laitière (production de fromages et de laits fermentés). Elles participent également à la transformation de végétaux, de produits carnés et de certains vins. Enfin, plus récemment, leur intérêt s'élargit en raison de leur potentiel thérapeutique.

Actuellement, les bactéries lactiques sont produites, de façon commerciale, sous une forme concentrée, congelée ou lyophilisée. Cependant, au cours de leur préparation et, plus particulièrement au cours de leur stockage, les cellules perdent peu à peu leur activité et leur viabilité. Cela est préjudiciable pour les industriels producteurs et pour les utilisateurs car les ferments doivent satisfaire aux exigences de qualité et de performances technologiques, si possible pendant plusieurs mois.

L'activité biologique des bactéries lactiques commercialisées est fortement dépendante de la température de stockage : plus la température est basse, meilleure est la conservation et plus longue est la durée de vie du produit. Ainsi, sous forme congelée, elles sont conservées, à une température inférieure ou égale à -40oC alors que, sous forme lyophilisée, un maintien à une température de stockage de 4 C est couramment appliqué. La production de ferments lyophilisés constitue donc une alternative intéressante à la production de ferments congelés puisqu'elle implique une température de conservation plus élevée, donc moins coûteuse. De plus, les volumes de produit distribué sont beaucoup plus faibles, ce qui génère des économies au niveau du transport.

Pratiquement, le mode habituel de production et de conservation des bactéries lactiques concentrées lyophilisées, bien connu de l'homme de l'art, comporte trois étapes (Lejard et al. 1994) : (i) une étape de fermentation permettant la multiplication des bactéries dans un milieu de culture, (ii) la

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concentration des bactéries multipliées à l'étape (i) et (iii) l'étape de lyophilisation.

La fermentation est réalisée en culture discontinue, à température régulée. Le pH est régulé, par addition de neutralisant, à une valeur généralement comprise entre 5,5 et 7,0, selon la bactérie considérée. Dans certains cas, il est possible de coupler à la fermentation un traitement d'ultrafiltration afin d'éliminer les produits inhibiteurs (acide lactique principalement) formés par les bactéries (Amen et Cabau 1983). Lorsqu'un niveau élevé de population bactérienne est atteint (de 109 à 1010 cellules par mL), le milieu de culture est refroidi à une température comprise entre 40C et 15 C, afin de ralentir les activités métaboliques. La biomasse est ensuite concentrée par centrifugation ou par filtration tangentielle. Cette étape de la procédure permet de séparer partiellement les cellules du milieu de culture, également appelé milieu fermenté ou surnageant de fin de culture.

Les cellules concentrées sont reprises dans un milieu de conditionnement adapté servant à protéger les bactéries contre les effets dommageables des traitements de conservation ultérieurs. Ce milieu de conditionnement est appelé milieu de cryoprotection et/ou de Iyoprotection. Il est composé d'une partie du milieu fermenté, qui n'est pas totalement éliminé par l'étape de concentration, et de molécules de protection qui permettent une meilleure préservation de la viabilité cellulaire. Les molécules citées dans la littérature sont nombreuses ; il s'agit de mono-ou de disaccharides, de polymères, de polyols, d'acides organiques ou de leurs sels, d'acides aminés ou de leurs sels, de protéines, de vitamines (Porubcan and Sellars 1975 ; Amen and Cabau 1983 ; Barach et al. 1987 ; Brousse et al. 1987).

Des documents de l'état de la technique proposent d'améliorer la viabilité des bactéries au cours du stockage dans le temps, dans les concentrés bactériens. Dans la demande de brevet européen n EP 0 259 739, publiée le
16 mars 1988, il est proposé de lyophiliser le milieu de culture contenant les bactéries avec une quantité de molécules protectrices susceptible de réduire substantiellement la perte de viabilité cellulaire. Ce document suggère l'utilisation d'agents cryoprotecteurs tels que le saccharose, les peptones, la casitone, un sel d'acide glutamique, le glycérol, le diméthylsulfoxyde, le lait en poudre écrémé, ou encore un produit laitier, tel que la caséine ou le petit lait, le fructose ou le maltose, ledit agent cryoprotecteur étant présent à raison de 3,3

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à 67 pour cent en poids de matière sèche stabilisée des cellules. Selon ce document, l'acide citrique potentialise l'effet de l'agent cryoprotecteur sur la viabilité des cellules bactériennes.

Le brevet américain n US 3,897, 307, publié le 29 juillet 1975, décrit un procédé de lyophilisation de cultures de bactéries lactiques dont la stabilité dans le temps est améliorée en incorporant dans la suspension de cellules en fin de fermentation (avant la lyophilisation), une association d'ascorbate avec le glutamate ou l'aspartate. Selon ce document, les suspensions bactériennes sont aussi additionnées d'un agent cryoprotecteur, tel que l'inositol, le sorbitol, le mannitol, le glucose, le saccharose, le sirop de maïs, le diméthylsulfoxyde, des amidons, des amidons modifiés, de la polyvinylpyrrolidone, du maltose ou d'autres mono-ou di-osides (mono-ou di-saccharides). Selon ce document, l'ascorbate peut être ajouté à raison de 4 à 20 parties pour 100 parties en poids de matière sèche du milieu de culture, le glutamate ou l'aspartat est ajouté à raison de 1,5 à 20 parties pour 100 parties en poids de matière sèche et l'agent cryoprotecteur est ajouté à raison de 1 à 300 grammes par litre de milieu de culture.

Toutefois, l'ajout de ces molécules relève toujours de considérations empiriques plutôt que d'une formulation raisonnée prenant en compte les mécanismes de protection possibles. En fait, il n'existe pas, actuellement, de règles de formulation clairement établies pour ces milieux biologiques complexes. En conséquence, les différences de survie observées dans ces milieux, selon les auteurs et selon les souches, sont importantes et difficilement explicables.

Après l'étape de concentration et de protection, la suspension cellulaire est répartie en couche mince (1 à 3 cm) puis congelée. La lyophilisation est ensuite effectuée, sous gaz inerte (azote ou argon) sec, dans des conditions qui permettent d'atteindre une déshydratation poussée des échantillons (Sandine et Vedamuthu 1978). Le cycle de lyophilisation, d'une durée de 10 à 30 heures, comprend deux phases : la sublimation de la glace (dessiccation primaire), puis la désorption de la majeure partie de l'eau qui n'a pas cristallisé au cours de la congélation (dessiccation secondaire). Cependant, peu d'informations sur les conditions opératoires (température, pression) au cours du cycle de lyophilisation sont données dans les brevets relatifs à la préservation des concentrés bactériens lyophilisés (Porubcan et Sellars 1975 ;

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Sandine et Vedamuthu 1978 ; Barach et al. 1987 ; Enders et al. 1988 ; Saniez et Serpelloni 1993).

Le niveau de déshydratation, atteint en fin de lyophilisation, affecte la survie des bactéries lyophilisées au cours de leur stockage. Une teneur en eau résiduelle élevée est favorable aux réactions de dégradation cellulaire. A l'opposé, une teneur en eau résiduelle trop faible peut entraîner une dégradation des protéines membranaires et l'exposition de leurs sites hydrophiles aux gaz, notamment à l'oxygène (Brennan et al. 1986). Des phénomènes d'oxydation, auxquels les bactéries lactiques sont particulièrement sensibles, peuvent alors se produire. Des teneurs en eau de 2,5% à 3% (fraction massique) sont préconisées pour les bactéries lactiques lyophilisées (Porubcan et Sellars 1975). Cependant, en pratique, la teneur en eau, pour les faibles valeurs caractéristiques des produits lyophilisés, est difficilement mesurable. Par ailleurs, la notion d'activité de l'eau dans les produits biologiques et alimentaires a largement supplanté, depuis près de 25 ans, la teneur en eau, en tant qu'indicateur de stabilité.

A l'issue de l'étape de lyophilisation, les bactéries contenues dans les poudres lyophilisées sont éventuellement mélangées avec d'autres, en proportions adéquates, pour l'ensemencement direct ou semi-direct des cuves de fabrication. Le conditionnement final est effectué, sous vide ou sous un gaz inerte, dans des emballages étanches à la lumière et à la vapeur d'eau.

Le stockage est réalisé, en conditions isothermes, pendant plusieurs semaines, habituellement à 4 C. Or la conservation de ces produits à température ambiante constitue un enjeu industriel important : elle conduirait à une réduction des coûts de stockage et de transport, elle faciliterait la manutention et permettrait d'étendre l'utilisation des poudres de bactéries lactiques à de nombreux produits alimentaires (laits en poudre, biscuits, céréales,...) et d'intérêt pharmaceutique et/ou médical (alicaments, médicaments,...).

Il résulte de l'analyse de l'état de la technique ci-dessus que la production de ferments lactiques concentrés lyophilisés est marquée par un fort empirisme, notamment au niveau de la formulation des milieux de protection et de la conduite des procédés de lyophilisation.

Notamment, bien que le principe d'addition d'un agent protecteur soit admis, les larges gammes de concentrations possibles, qui vont de un à trois

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cents dans un même document, montrent que l'homme du métier qui voudrait reproduire l'enseignement des procédés de lyophilisation décrits dans l'état de la technique serait obligé de faire lui-même preuve d'empirisme et de réaliser, pour chaque cas d'espèce, de nombreux essais afin de retenir la meilleure combinaison de composition du milieu de culture de départ et de paramètres, notamment de temps, de température et de pression, pour l'étape de lyophilisation proprement dite.

Il existe donc un besoin, dans l'état de la technique, pour la mise au point d'un procédé de lyophilisation de bactéries lactiques qui soit simple, d'une grande reproductibilité, permettant à l'homme du métier, dans tous les cas de figures, c'est à dire notamment quelles que soient les conditions de température de stockage envisagées ou quelle que soit la souche de bactérie lactique dont la conservation est recherchée, d'obtenir une composition lyophilisée de bactéries lactiques dont l'activité ou la viabilité des cellules soit peu ou pas du tout altérée après stockage pendant plusieurs mois à température élevée.

SOMMAIRE DE L'INVENTION
L'invention fournit, pour la première fois, un procédé de préparation de bactéries lactiques lyophilisées, associant des méthodes raisonnées de formulation et de conduite du procédé de lyophilisation, afin de permettre leur stockage pendant plusieurs mois à température élevée, et des compositions de bactéries lactiques lyophilisées susceptibles d'être obtenues par ce procédé de préparation.

L'invention a pour objet un procédé de préparation reproductible d'une composition lyophilisée contenant des bactéries viables et actives après stockage pendant plusieurs mois à une température de stockage (Ts) élevée prédéterminée, caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes : a) préparation d'un concentré de bactéries lactiques dans un milieu liquide, ledit milieu liquide comprenant : (i) un composé antioxydant hydrosoluble ou une association de composés antioxydants hydrosolubles ; et (ii) un composé ou une association de composés augmentant la température de transition vitreuse du produit lyophilisé ;

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b) lyophilisation du concentré de bactéries lactiques Iyoprotégé préparé à l'étape a), selon les étapes suivantes : (b1) congélation du concentré de bactéries ; (b2) dessiccation primaire ; (b3) dessiccation secondaire jusqu'à obtenir une composition bactérienne lyophilisée ayant une activité de l'eau d'environ 0,1 et dont la température de transition vitreuse (Tg) est supérieure d'au moins 20 C à la température de stockage (Ts) prédéterminée.

L'invention est également relative à une composition contenant des bactéries lactiques viables et actives après stockage à une température élevée (Ts), caractérisée en ce que : (a) elle comprend au moins un composé antioxydant hydrosoluble ; (b) elle comprend au moins deux composés augmentant la température de transition vitreuse telle que la température de transition vitreuse (Tg) de ladite composition est supérieure d'au moins 20 C à la température de stockage (Ts) prédéterminée ; (c) ladite composition à une valeur d'activité de l'eau d'environ 0,1.

Elle concerne aussi un concentré de bactéries lactiques susceptible d'être utilisé dans l'industrie laitière, caractérisé en ce qu'il comprend une composition lyophilisée telle que définie ci-dessus.

Elle est aussi relative à l'utilisation d'une composition lyophilisée telle que définie ci-dessus pour la transformation de produits laitiers, de végétaux, de produits carnés et de produits vinicoles, par fermentation.

Elle a aussi pour objet l'utilisation d'une composition lyophilisée telle que définie ci-dessus dans un procédé de fermentation, particulièrement un procédé de fermentation impliquant la production d'acide lactique.

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Elle a encore pour objet l'utilisation d'une composition lyophilisée telle que définie ci-dessus pour la préparation d'une composition de complément alimentaire ou alicament.

Elle concerne aussi l'utilisation d'une composition lyophilisée telle que définie ci-dessus pour la préparation de produits riches en probiotiques : produits laitiers fermentés, desserts, céréales, biscuits, boissons,....

Elle a également trait à l'utilisation d'une composition lyophilisée telle que définie ci-dessus pour la fabrication d'un médicament.

Dans cette dernière utilisation, les bactéries lactiques contenues dans ladite composition lyophilisée peuvent être transformées avec un acide nucléique permettant l'expression d'un gène d'intérêt thérapeutique par ces bactéries, par exemple un facteur de croissance, une hormone ou encore une cytokine.

DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Il est montré selon l'invention que des bactéries lactiques peuvent être conservées à une température de stockage élevée (Ts) et rester viables et actives pendant plusieurs mois à la température de stockage (Ts), à condition que la composition lyophilisée finale contenant les bactéries lactiques possède une température de transition vitreuse (Tg) ayant une valeur supérieure d'au moins 20 C à la température de stockage (Ts) prédéterminé, à condition que l'activité de l'eau de cette composition lyophilisée finale soit d'environ 0,1 et à condition que cette composition lyophilisée soit protégée des phénomènes d'oxydation par l'ajout d'anti-oxydants.

L'invention fournit en conséquence un procédé de préparation d'une telle composition lyophilisée, dont la combinaison des paramètres de composition du concentré de bactéries dans le milieu liquide (antioxydant et milieu de Iyoprotection), et les paramètres de température et de pression de l'étape de lyophilisation sont adaptés en vue d'atteindre les caractéristiques de composition, de température de transition vitreuse (Tg) et d'activité de l'eau (aw) de la composition lyophilisée finale.

Grâce à une combinaison adéquate de ces paramètres, l'invention fournit un procédé de lyophilisation d'une composition contenant des bactéries lactiques permettant la fabrication d'une composition lyophilisée finale pouvant être conservée à température élevée (Ts), prédéterminée, pendant plusieurs

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mois, sans perte significative de viabilité ni d'activité métabolique des cellules bactériennes.

L'invention concerne un procédé de préparation reproductible d'une composition lyophilisée contenant des bactéries viables et actives après stockage pendant plusieurs mois à une température de stockage (Ts) élevée prédéterminée, caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes : a) préparation d'un concentré de bactéries lactiques dans un milieu liquide, ledit milieu liquide comprenant : (i) un composé antioxydant hydrosoluble ou une association de composés antioxydants hydrosolubles ; et (ii) un composé ou une association de composés augmentant la température de transition vitreuse du produit lyophilisé ; b) lyophilisation du concentré de bactéries lactiques Iyoprotégé préparé à l'étape a), selon les étapes suivantes : (b1) congélation du concentré de bactéries ; (b2) dessiccation primaire ; (b3) dessiccation secondaire jusqu'à obtenir une composition bactérienne lyophilisée ayant une activité de l'eau d'environ 0,1 et dont la température de transition vitreuse (Tg) est supérieure d'au moins 20 C à la température de stockage (Ts) prédéterminée.

Il est montré selon l'invention que l'addition, dans le milieu fermenté de départ, qui contient les bactéries lactiques à lyophiliser, d'un agent antioxydant ou d'une association de composés antioxydants hydrosolubles, et d'un composé ou d'une association de composés Iyoprotecteurs dans des quantités telles que la température de transition vitreuse (Tg) de la composition lyophilisée finale soit supérieure d'au moins 20 C, de préférence d'au moins 25 C, à la température de stockage (Ts) de la composition lyophilisée finale, associée aux autres étapes du procédé permettant l'obtention d'une composition lyophilisée finale ayant une activité de l'eau d'environ 0,1, permet de conférer à la composition lyophilisée finale des propriétés de conservation optimales de la viabilité et de l'activité biologique des bactéries lactiques lors d'un stockage à température élevée.

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Etape a) du procédé : Composition de départ contenant un ou plusieurs composés lyoprotecteurs augmentant la Tg et un ou plusieurs antioxydants.

Selon l'invention, il a été trouvé qu'une conservation optimale des caractéristiques de viabilité des bactéries est atteinte lorsque la température de transition vitreuse (Tg) de la composition lyophilisée finale est supérieure d'au moins 20 C, de préférence d'au moins 25 C, à la valeur de la température de stockage (Ts) recherchée.

La température de transition vitreuse (Tg) est mesurée par analyse enthalpique différentielle dans un calorimètre Pyris 1 Cryofill (Perkin-Elmer, USA), lors du réchauffement à une vitesse de 10 C/min. La valeur de Tg est déterminée pour une variation de 50% de l'augmentation de chaleur spécifique (ASTM, Standard Method E 1356-91). Dans les produits complexes, tels que les suspensions bactériennes concentrées, la transition vitreuse est en réalité caractérisée par un intervalle de température (de plusieurs degrés) autour de la valeur estimée de Tg (Fonseca et al. 2001).

La température de transition vitreuse (Tg) de la composition lyophilisée finale est fonction de la contribution de chacun des composés présents dans le concentré de bactéries lactiques, après addition du ou des composé (s) antioxydants et du ou des composé (s) Iyoprotecteurs destinés à augmenter la valeur de Tg du concentré de départ. Dans des milieux aussi complexes que les milieux de fermentation de bactéries lactiques concentrées, la valeur de la Tg de la composition lyophilisée finale ne peut être calculée précisément. Son évolution en fonction de la nature des solutés présents dans la composition peut cependant être prédite (Fonseca et al. 2001). La validation est obtenue par voie expérimentale, préférentiellement par la technique ci-dessus.

En conséquence, le procédé de l'invention implique que l'homme du métier qui le met en oeuvre procède tout d'abord à un essai en ajoutant des concentrations croissantes du ou des composé (s) Iyoprotecteur (s) judicieusement choisis, à l'étape a) du procédé, et détermine expérimentalement la température de transition vitreuse (Tg) de la composition lyophilisée finale, étant entendu que, pour une température de stockage (Ts) qu'il aura prédéterminée, l'homme du métier sait, grâce à l'invention, que la valeur de Tg doit être supérieure d'au moins 20 C, et mieux d'au moins 25 C, à la valeur de la température de stockage (Ts), pour atteindre les objectifs de

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conservation de la viabilité et de l'activité des bactéries lactiques lyophilisées pendant plusieurs mois, à la température de stockage (Ts).

Dans la pratique, on ajoute les quantités adéquates de composé (s) antioxydant (s) hydrosoluble (s) et de composé (s) augmentant la température de transition vitreuse avant l'étape b) de lyophilisation, c'est à dire après la phase de production des bactéries lactiques dans le milieu de culture conventionnel (ou milieu de fermentation).

Par exemple, pour obtenir une température de transition vitreuse de la composition lyophilisée finale de 52 C, l'homme du métier pourra préparer, à l'étape a) du procédé, un concentré Iyoprotégé de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus comprenant respectivement 25 g/L d'un mélange de lactose et de galactose, 12 g/L de lactate de sodium, 25 g/L de maltose, 25 g/L de maltodextrine (DE 7-10) et 10 g/L d'un antioxydant tel que l'ascorbate de sodium. Si le milieu de culture utilisé pour la multiplication des bactéries lactiques est un milieu conventionnel contenant déjà les concentrations spécifiées ci-dessus de lactose, de galactose et de lactate de sodium, la température de transition vitreuse recherchée pour la composition lyophilisée finale est atteinte en ajoutant les concentrations finales ci-dessus de maltose, de maltodextrine et d'antioxydant.

Egalement à titre illustratif, pour obtenir une température de transition vitreuse de la composition lyophilisée finale de 47 C, l'homme du métier pourra préparer, à l'étape a) du procédé, un concentré Iyoprotégé de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus comprenant respectivement 25 g/L d'un mélange de lactose et de galactose, 12 g/L de lactate de sodium, 25 g/L de glucose et 25 g/L de maltodextrine (DE 7-10) et 10 g/L d'ascorbate de sodium.

Dans les deux exemples indicatifs ci-dessus, le milieu de culture initialement utilisé pour la fermentation des bactéries lactiques est constitué de lactosérum (60 g/L), de lactose (20 g/L), d'extrait de levure (5 g/L) et d'un composé anti-mousse conventionnel (1 g/L).

Pour la mise en oeuvre de l'étape a) du procédé selon l'invention, on ajoute la quantité nécessaire d'au moins un composé Iyoprotecteur, dont la concentration finale permettra l'obtention de la valeur de Tg désirée dans la composition lyophilisée finale.

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Un composé Iyoprotecteur, au sens de l'invention, peut être tout composé, compatible avec l'alimentation humaine ou animale, capable d'augmenter la température de transition vitreuse.

De tels composés sont représentés en général par les hydrates de carbone, en particulier les mono, di et tri-saccharides (glucose, galactose, saccharose, tréhalose, lactose, maltotriose) et les polyosides (maltodextrine dont le dextrose équivalent peut varier entre 4 et 30) (Levine et Stade 1988).

Selon l'invention, on montre que les résultats de viabilité bactérienne les meilleurs sont obtenus avec respectivement le maltose et le glucose, alors qu'un composé comme le glycérol est sensiblement moins bien adapté (très faible Tg) pour le produit lyophilisé.

De préférence, le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que les composés augmentant la température de transition vitreuse sont choisis parmi le glucose ou le maltose et une maltodextrine dont le dextrose équivalent peut varier entre 4 et 10.

Ces propriétés de conservation de la viabilité et de l'activité cellulaire, qui caractérisent les compositions lyophilisées susceptibles d'être obtenues selon le procédé décrit ci-dessus, sont atteintes grâce à la présence d'un ou des composé (s) antixoydant (s) hydrosoluble (s), qui bloque (nt), ou tout au moins réduise (nt) fortement l'oxydation des lipides membranaires cellulaires qui peuvent se produire autrement au cours de la lyophilisation et surtout au cours du stockage, et qui induisent une mortalité cellulaire, spécialement dans des compositions dont l'activité de l'eau est aussi faible qu'environ 0,1.

Selon le procédé, le composé antioxydant hydrosoluble ou l'association de composés antioxydants hydrosolubles est présent dans le milieu liquide de départ à une concentration comprise entre 1 et 20 g/L, de préférence entre 5 et 15 g/L.

On peut utiliser tout type de composé antioxydant hydrosoluble connu dans l'état de la technique. Parmi les antioxydants on peut citer : l'acide ascorbique et les ascorbates, l'acide érythorbique et les érythorbates, l'acide citrique et les citrates, la cystéine, les galates, le mannitol, les tocophérols (extraits d'origine naturelle et de synthèse), la vitamine E, le Trolox, le butylhydroxyanisole (BHA) et le butylhydroxytoluène (BHT).

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Toutefois, on utilise de préférence l'acide ascorbique et/ou l'acide érythorbique, éventuellement sous la forme d'un sel, par exemple sous la forme d'un sel de sodium.

Etape b) du procédé : conduite de l'étape de lyophilisation
Il est aussi montré selon l'invention qu'un procédé de lyophilisation optimal, du point de vue des caractéristiques de maintien de la viabilité et de l'activité des bactéries lactiques à long terme à température de stockage (Ts) élevée, doit impérativement aboutir à la production d'une composition lyophilisée finale ayant une activité de l'eau suffisamment faible, d'environ 0,1.

En effet, la température de transition vitreuse diminue de manière significative lorsque l'activité de l'eau augmente, ce qui correspond à l'observation d'un effet plastifiant de l'eau.

Des activités de l'eau de la composition lyophilisée finale supérieures à 0,1 nuisent significativement à la viabilité des bactéries lyophilisées. Pour une activité de l'eau de 0,3 de la composition lyophilisée finale, par exemple après 4 semaines de conservation à 25 C, la viabilité des bactéries, estimée par la perte d'activité acidifiante, est fortement affectée, ce qui est incompatible avec les objectifs de viabilité et d'activité cellulaire recherchés, comme cela est montré dans les exemples.

A l'inverse, pour une activité d'eau significativement inférieure à 0,1 (0,05 par exemple), les temps de lyophilisation vont être fortement allongés (dessiccation secondaire plus longue de plusieurs heures et mise sous vide plus poussée). Il est de plus reconnu que les très faibles activités d'eau sont favorables aux réactions d'oxydation et peuvent nuire à la viabilité et à l'activité cellulaires de la composition lyophilisée de bactéries lactiques.

Selon l'invention, une activité de l'eau d'environ 0,1 est une activité de l'eau comprise entre 0,06 et 0,2, de préférence entre 0,08 et 0,15.

L'activité de l'eau rend compte de la pression partielle de la vapeur d'eau, à température fixée, en équilibre avec la composition lyophilisée obtenue selon le procédé ci-dessus.

Selon l'invention, la mesure de l'activité de l'eau des échantillons lyophilisés est obtenue à l'aide d'un appareil FA-st/1 (GBX Instrumentation Scientifique, Romans sur Isère), qui fonctionne selon le principe de

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l'hygromètre à miroir. L'humidité relative à l'équilibre dans un système étanche est obtenue par la mesure du point de rosée, à une température fixée de 20 C.

Selon l'étape b) de lyophilisation, l'étape (b1) de congélation et l'étape (b2) de dessiccation primaire sont réalisées de manière connue dans l'état de la technique.

Avantageusement, l'étape (b1) de congélation est réalisée en disposant une couche mince du milieu de culture contenant les bactéries lactiques sur une plaque maintenue à la température d'environ-65 C, pendant le temps nécessaire à la congélation du milieu.

A titre illustratif, l'étape (b2) de dessiccation primaire peut être réalisée à la température de 20 C à une pression de 40 Pa.

Les conditions de congélation et de dessiccation primaire peuvent être aisément adaptées par l'homme du métier, à l'aide de ses connaissances générales des procédés de lyophilisation, en fonction notamment de l'épaisseur du produit qui doit être lyophilisé, et des caractéristiques du dispositif de lyophilisation.

C'est l'étape (b3) de dessiccation secondaire qui est essentielle pour obtenir une activité de l'eau d'environ 0,1 dans la composition lyophilisée finale.

Pour définir l'étape (b3) de dessiccation secondaire, l'homme du métier pourra conduire une série d'essais afin de déterminer les conditions optimales de température, de pression et de durée nécessaires à l'obtention d'une composition finale ayant une activité de l'eau d'environ 0,1.

Par exemple, l'étape (b3) de dessiccation secondaire peut être réalisée à la température de 25 C, à une pression de 13 Pa et pendant une durée nécessaire et suffisante pour obtenir une composition lyophilisée finale ayant une activité de l'eau d'environ 0,1.

A titre illustratif, la durée de l'étape (b3) de dessiccation secondaire, aux conditions de température et de pression ci-dessus, est avantageusement de 6 heures pour un échantillon de 1 cm d'épaisseur.

Les durées des étapes (b1) à (b3) de l'étape b) du procédé peuvent aisément être adaptées par l'homme du métier au vu de ses connaissances techniques générales dans le domaine de la congélation et de la lyophilisation.

L'obtention d'une activité de l'eau d'environ 0,1 permet d'augmenter suffisamment les valeurs de température de transition vitreuse des mélanges Iyoprotecteurs de sorte que la viabilité cellulaire soit sensiblement équivalente

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lors d'un stockage de la composition lyophilisée à 4 C et à 25 C, ceci sur plusieurs mois de stockage, par exemple trois mois de stockage à ces températures respectives.

Parmi les bactéries lactiques convenant pour la présente invention, on peut citer : Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii

subsp. lactis, Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus jugurti, Lactobacillus kefir, Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactocococcus lactis subsp. cremoris, Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis, Leuconostroc mesenteroides subsp. cremoris, Leucoconostoc mesentoroides subsp. mesenteroides, Leuconostoc lactis, Oenococcus oeni, Streptococcus thermophilus, Streptococcus macedonicus.

Pour la mise en oeuvre du procédé de préparation d'une composition lyophilisée contenant des bactéries lactiques définie ci-dessus, le concentré bactérien fermenté de départ contient de préférence entre 108 et 1011 bactéries lactiques viables par millilitre.

Il est montré selon l'invention qu'une composition lyophilisée telle que définie ci-dessus présente des caractéristiques améliorées de viabilité et d'activité acidifiante des bactéries lactiques qu'elle contient, lors d'un stockage pendant plusieurs mois, notamment pendant trois mois, à une température (Ts) élevée, notamment de 25 C. La viabilité des bactéries lactiques est directement liée à leur activité acidifiante (Fonseca et ai. 2001). L'activité des bactéries lactiques est estimée de préférence par leur capacité à acidifier un milieu de culture inoculé par un échantillon de la composition lyophilisée selon l'invention.

La perte de viabilité des bactéries lactiques peut alors être exprimée comme la perte de l'activité acidifiante d'un échantillon d'un poids déterminé d'une composition lyophilisée selon l'invention, en premier lieu à l'issue de l'étape b) de lyophilisation, puis ultérieurement en fonction de la durée de stockage à une température prédéterminée, comme cela est montré dans les exemples.

On considère que la vitesse de perte d'activité acidifiante (K) lors du stockage de la composition lyophilisée doit être la plus faible possible :

- une valeur de K égale à 0 min/jour est accessible lors du stockage à 4 C comme à 25 C, si les critères définis selon l'invention sont respectés ;

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- une valeur de K comprise entre 0,5 à 2 min/jour est acceptable, en particulier dans des cas de souches sensibles. Elles sont observées tant à 40C qu'à 25 C, si les critères définis selon l'invention sont respectés ; - des valeurs de K supérieures à 2 min/jour ne sont jamais observées si les critères définis selon l'invention sont respectés, alors qu'elles sont très fréquentes dans les autres situations.

Une composition selon l'invention est aussi caractérisée en ce que la perte d'activité acidifiante K est inférieure ou égale à 2 min/jour, et préférentiellement inférieure à 2 min/jour pour les souches sensibles.

La présente invention est aussi illustrée, sans pour autant être limitée, par les figures et les exemples suivants.

DESCRIPTION DES FIGURES
La Figure 1 montre les courbes d'évolution de l'activité acidifiante, observées pour la souche Lactobacillus acidophilus, Iyoprotégée avec le milieu A décrit dans les exemples, dans différentes conditions de température. L'axe des ordonnées représente le temps nécessaire pour que le milieu de culture de référence atteigne un pH de 5,5. Ce temps correspond à l'activité acidifiante du concentré bactérien testé telle que définie par le protocole mis en oeuvre. L'axe des abscisses représente le temps de stockage de la composition lyophilisée selon l'invention, exprimé en jours.

La perte d'activité est traduite par l'augmentation du temps nécessaire pour qu'une culture, en conditions standards, atteigne un pH de 5,5.

La courbe avec les symboles en losanges pleins représente les mesures réalisées sur une composition lyophilisée selon l'invention conservée à la température de 4 C.

La courbe avec les symboles en carrés pleins représente les mesures réalisées sur une composition lyophilisée selon l'invention conservée à la température de 25 C.

La courbe avec les symboles en triangles pleins représente les mesures réalisées sur une composition lyophilisée selon l'invention conservée à la température de 37 C.

La pente des droites obtenues pour chacune des trois températures de stockage traduit la vitesse de perte d'activité acidifiante (K). Leurs valeurs respectives, dans l'exemple représenté, sont de 0 min/jour, 0,36 min/jour et 1,76 min/jour.

La Figure 2 illustre les valeurs des vitesses de perte d'activité acidifiante (K) observées lors du stockage des compositions lyophilisées décrites dans les

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exemples 1 à 4. L'axe des abscisses représente la valeur de la différence entre la température de transition vitreuse (Tg) et celle de la température de stockage (Ts), exprimée en degrés Celsius. L'axe des ordonnées représente la vitesse de perte d'activité acidifiante, exprimée en valeur normalisée pour chaque souche (K/Kmax).

EXAMPLES Méthodes générales
Des illustrations de l'invention sont présentées dans les exemples 1 à 4.

Les résultats correspondants ont été obtenus avec trois souches de bactéries lactiques différentes. Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus est une bactérie lactique thermophile très utilisée, notamment en fabrication de yaourt et bien connue pour sa résistance limitée aux traitements de conservation.

Lactobacillus acidophilus est également thermophile. Elle est utilisée dans les préparations laitières fermentées comportant des probiotiques. Enfin, Lactococcus lactis subsp. lactis est une bactérie mésophile, principalement impliquée dans l'élaboration des fromages. Par la diversité des souches étudiées dans ces 4 exemples, il est considéré que tout le champ des bactéries lactiques est couvert par l'invention.

Les bactéries sont produites par fermentation, avec régulation du pH par apport de soude 10M, dans des conditions de culture précisées pour chaque cas. Les cellules sont concentrées et conditionnées dans différents milieux de Iyoprotection dont la composition est décrite dans chaque exemple. La formule finale du produit avant lyophilisation est la suivante :
Culot de bactéries lactiques centrifugé (environ 14 à 17% de matières sèches) 'Milieu fermenté (surnageant de fin de culture) (environ 5 à 7,5 % de matières sèches) 'Milieu Iyoprotecteur (environ 5 à 6 % de matières sèches), avec ou sans antioxydant, contenant des maltodextrine et comportant du maltotriose, du maltose, du glucose ou du glycérol, en proportions variables.

Le même cycle de lyophilisation, dit de référence, est appliqué dans chaque exemple. Après une congélation sur une plaque refroidie à -65OC, la lyophilisation comprend une phase de dessiccation primaire, à une pression de 40 Pa et une température de plaque de 20 C. Cette phase est suivie d'une

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dessiccation secondaire d'une durée de 6 heures, à une température de plaque de 250C et une pression totale finale de 13 Pa. Dans ces conditions, le produit final atteint une activité de l'eau d'environ 0,1.

Les effets décrits dans les exemples se basent sur la comparaison de l'activité biologique des suspensions cellulaires. La méthode de mesure de cette activité biologique est décrite ci-dessous. Les méthodes de caractérisation physique des échantillons (mesure de la température de transition vitreuse et mesure de l'activité de l'eau) sont également présentées.

Méthode de caractérisation de l'activité biologique des bactéries lactiques La détermination de l'activité biologique des bactéries lactiques aux différentes étapes de leur production et au cours de leur stockage est importante pour caractériser leur résistance à ces traitements. Cette activité biologique est souvent associée à l'activité acidifiante, qui constitue la fonction technologique la plus importante des bactéries lactiques et qui exprime l'ensemble de leur métabolisme. Cette activité biologique est déterminée ici à l'aide de la méthode proposée par Fonseca et al. (2000). La méthode consiste à mesurer le temps nécessaire au ferment incubé dans du lait, dans des conditions standardisées, pour atteindre un pH prédéterminé, par exemple de 5,5. Cette mesure est réalisée après congélation et après lyophilisation, ce qui permet, par différence, de déterminer la perte d'activité intervenue lors de la lyophilisation (notée dtl, en min). Des mesures sont réalisées après différentes durées de stockage isotherme sous forme lyophilisée. Au cours du stockage, la méthode propose de déterminer la vitesse de perte d'activité acidifiante (K, en min/j) (Fonseca et al. 2000). A titre d'exemple, la figure 1 illustre les pertes d'activité acidifiante observées pour la souche Lactobacillus acidophilus dans différentes conditions.

Caractérisation des propriétés physiques des suspensions cellulaires
L'activité de l'eau et la température de transition vitreuse sont les deux principales propriétés physiques des suspensions cellulaires concentrées lyophilisées traduisant leur stabilité.

L'activité de l'eau des échantillons lyophilisés et la température de transition vitreuse (Tg) sont mesurées comme indiqué précédemment.

<Desc/Clms Page number 18>

Exemple 1 : Effet de l'antioxydant sur la conservation à l'état lyophilisé de Lactobacillus acidophilus A. Matériel et Méthodes Souche : Lactobacillus acidophilus CFA 1 (INRA, Grignon) Conditions de culture : température = 42 C et pH = 6, 3 Tableau 1 : Composition et caractéristiques des milieux Iyoprotecteurs finaux (en g/L) :

<tb>
<tb> Milieu <SEP> A <SEP> Milieu <SEP> B <SEP> Milieu <SEP> C
<tb> Sumageant <SEP> de <SEP> fin <SEP> de <SEP> culture
<tb> lactose <SEP> + <SEP> galactose <SEP> (g/L) <SEP> 25 <SEP> 25 <SEP> 25
<tb> lactate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> (g/L) <SEP> 12 <SEP> 12 <SEP> 12
<tb> Sucres <SEP> apportés
<tb> Maltose <SEP> (g/L) <SEP> 25 <SEP> 25 <SEP> 25
<tb> Maltodextrine <SEP> (DE <SEP> 7-10) <SEP> (g/L) <SEP> 25 <SEP> 25 <SEP> 25
<tb> Antioxydants
<tb> ascorbate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> (g/L) <SEP> 10 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> érythorbate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> (g/L) <SEP> 0 <SEP> 10 <SEP> 0
<tb> pH <SEP> 6, <SEP> 2 <SEP> 6, <SEP> 2 <SEP> 6, <SEP> 2
<tb> Aw <SEP> du <SEP> milieu <SEP> lyophilisé <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 0,1
<tb> Tg <SEP> du <SEP> milieu <SEP> lyophilisé <SEP> ( C) <SEP> 52 <SEP> 52 <SEP> 54
<tb>

<Desc/Clms Page number 19>

B. Résultats Tableau 2 Effet de l'addition d'un anti-oxydant sur la perte d'activité acidifiante intervenue lors de la lyophilisation (dtl, en min) et sur la vitesse de perte d'activité acidifiante observée lors du stockage sous forme lyophilisée (K, en min/iouh.

<tb>
<tb>

Milieu <SEP> Milieu <SEP> A <SEP> Milieu <SEP> B <SEP> Milieu <SEP> C
<tb> Ascorbate <SEP> Erythorbate <SEP> Absence <SEP> d'anti-oxydant
<tb> dtl <SEP> (Iyo) <SEP> 7 <SEP> (1,4) <SEP> 4 <SEP> (1,4) <SEP> 13 <SEP> (1,4)
<tb> K <SEP> (4 C) <SEP> 0 <SEP> (0) <SEP> 0 <SEP> (0) <SEP> 0,30 <SEP> (0,027)
<tb> K <SEP> (25 C) <SEP> 0,36 <SEP> (0,026) <SEP> 0,46 <SEP> (0,020) <SEP> 0,87 <SEP> (0,042)
<tb> K <SEP> (37 C) <SEP> 1,76 <SEP> (0,030) <SEP> 2,08 <SEP> (0,024) <SEP> 3,43 <SEP> (0,027)
<tb>

Les résultats correspondent à la moyenne de 3 mesures indépendantes (les écarts-types correspondants sont indiqués entre parenthèses) Selon le tableau 2, pour L. acidophilus, l'ajout d'un anti-oxydant limite la perte d'activité acidifiante en cours de lyophilisation (dtl) et réduit la vitesse de perte d'activité acidifiante lors du stockage sous forme lyophilisée (K).

Les deux anti-oxydants utilisés protègent les cellules de façon sensiblement équivalente.

La conservation à basse température (4 C) est toujours plus favorable.

Toutefois, les résultats montrent qu'il est possible de conserver les concentrés bactériens lyophilisés à 25 C si le milieu contient un anti-oxydant (ascorbate ou érythorbate) : la perte d'activité est alors équivalente à celle observée à 4 C en absence d'anti-oxydant. Par contre, à 37 C, la perte d'activité est trois à cinq fois plus rapide qu'à 25 C.

Exemple 2 : Effet de la température de transition vitreuse (Tg) sur la conservation à l'état lyophilisé de Lactobacillus bulaancus A. Matériel et Méthodes

Souches : Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CFL 1 (INRA, Grignon) Conditions de culture : température = 42 C et pH = 5, 5

<Desc/Clms Page number 20>

Tableau 3 : Composition et caractéristiques des milieux Iyoprotecteurs finaux (An nll)-

<tb>
<tb> Milieu <SEP> A <SEP> Milieu <SEP> D <SEP> Milieu <SEP> E
<tb> Surnageant <SEP> de <SEP> fin <SEP> de <SEP> culture
<tb> lactose <SEP> + <SEP> galactose <SEP> 25 <SEP> 25 <SEP> 25
<tb> lactate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 12 <SEP> 12 <SEP> 12
<tb> Sucres <SEP> apportés
<tb> Maltose <SEP> 25 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> Glucose <SEP> 0 <SEP> 25 <SEP> 0
<tb> Glycérol <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 50
<tb> Maltodextrine <SEP> (DE <SEP> 7-10) <SEP> 25 <SEP> 25 <SEP> 25
<tb> Antioxydant
<tb> ascorbate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 10 <SEP> 10 <SEP> 10
<tb> pH <SEP> 6, <SEP> 2 <SEP> 6,2 <SEP> 6,2
<tb> Aw <SEP> du <SEP> milieu <SEP> lyophilisé <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 1
<tb> Tg <SEP> du <SEP> milieu <SEP> lyophilisé <SEP> ( C) <SEP> 52 <SEP> 47-35
<tb>
Les températures de transition vitreuse (Tg) des 3 milieux sont différentes selon qu'ils comportent du maltose, du glucose ou du glycérol. Ces résultats sont en accord avec les valeurs de Tg de chacune de ces molécules pures : Tg maltose = 87 C, Tg glucose = 38 C et Tg glycérol =-90 C (Roos 1997 ; Bandhari and Howes 1999). Les écarts moindres, observés pour les trois milieux, sont liés à la présence des autres composés du mélange (apportés notamment par le surnageant) qui tendent à réduire les différences.

<Desc/Clms Page number 21>

B. Résultats Tableau 4. Effet de la température de transition vitreuse du milieu sur la perte d'activité acidifiante intervenue lors de la lyophilisation (dtl, en min) et sur la vitesse de perte d'activité acidifiante observée lors du stockage sous forme lyophilisée (K, en min/iour).

<tb>
<tb>

Milieu <SEP> Milieu <SEP> A <SEP> Milieu <SEP> D <SEP> Milieu <SEP> E
<tb> Maltose <SEP> Glucose <SEP> Glycérol
<tb> dtl <SEP> (Iyo) <SEP> 169 <SEP> (13,1) <SEP> 152 <SEP> (18,5) <SEP> 132 <SEP> (16)
<tb> K <SEP> (4 C) <SEP> 0 <SEP> (0) <SEP> 0 <SEP> (0) <SEP> 0,65 <SEP> (0,06)
<tb> K <SEP> (25 C) <SEP> 0 <SEP> (0) <SEP> 0 <SEP> (0) <SEP> 49,35 <SEP> (0, <SEP> 55)
<tb> K <SEP> (37 C) <SEP> 12, <SEP> 63 <SEP> (0,84) <SEP> 17,43 <SEP> (1,59) <SEP> 90,55 <SEP> (0,55)
<tb>

Les résultats correspondent à la moyenne de 3 mesures indépendantes (les écarts-types correspondants sont indiqués entre parenthèses) Tableau 5. Différence entre la température de transition vitreuse (Tg) des

milieux de Iyoprotection et la température de stockage (Ts), soit Tg-Ts ( C) i

<tb>
<tb> Tg <SEP> - <SEP> T8 <SEP> (OC)
<tb> Ts <SEP> Milieu <SEP> A <SEP> Milieu <SEP> D
<tb> Maltose <SEP> Glucose
<tb> 40C <SEP> 48 <SEP> 43
<tb> 250C <SEP> 27 <SEP> 22
<tb> 37 CJ5) <SEP> 0
<tb>

Les résultats correspondent à la moyenne de 2 mesures indépendantes.

Le tableau 4 montre, pour L. bulgaricus, que la température de transition vitreuse du milieu de Iyoprotection n'influe pas significativement sur la perte d'activité acidifiante lors de la lyophilisation (dtl). Par contre, on observe un effet de la Tg du milieu de conditionnement sur K. Lors du stockage à 4 C ou à 25 C, il n'y a pas de différence d'efficacité entre les milieux comportant du glucose et du maltose. Aucune perte d'activité n'est observée. On peut choisir indifféremment l'une des deux molécules. En revanche, quelle que soit la température de stockage considérée, le glycérol n'est pas un bon stabilisateur de produits lyophilisés, en raison de sa capacité trop importante à mobiliser l'eau (Tg faible).

<Desc/Clms Page number 22>

Pour les milieux additionnés de glucose et de maltose, le maintien de l'activité est équivalent aux températures de stockage de 40C et 25 C. D'après le tableau 5,)'écart Tg-Ts entre la Tg du mélange final et la température de stockage (Ts) est suffisamment grand (compris entre 20 C et 50 C) aux températures de 4 C et 25 C. Un tel écart paraît donc nécessaire pour assurer une bonne stabilité au stockage des bactéries pendant plusieurs mois. A une température de stockage de 37 C, les écarts (Tg-Ts) ne sont plus que de 100C à 15 C et demeurent insuffisant pour assurer la stabilité biologique du produit.

Exemple 3 : Effet de l'activité de l'eau sur la conservation à l'état lyophilisé de Lactobacillus buloaricus A. Matériel et Méthodes Souche utilisée : Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CFL1 (INRA, Grignon) Conditions de culture : température = 420C et pH = 5,5 La composition et les caractéristiques des milieux Iyoprotecteurs finaux sont identiques aux milieux A et D cités dans l'exemple 2.

Deux cycles de lyophilisation différents sont conduits afin d'obtenir deux valeurs finales distinctes d'activité de l'eau. Le cycle dit de référence permet d'atteindre une activité d'eau faible (aw de l'ordre de 0, 1) dans la composition lyophilisée finale. Avec des conditions opératoires assurant une dessiccation secondaire moins poussée (durée totale de 2 heures, température de plaque de 200C et une pression totale de 40 Pa), le produit atteint une activité de l'eau d'environ 0,3.

Tableau 6 : Propriétés physiques d'une composition lyophilisée selon deux cycles de lyophilisation

<tb>
<tb> Cycle <SEP> de <SEP> lyophilisation <SEP> Cycle <SEP> 1 <SEP> (référence) <SEP> Cycle <SEP> 2
<tb> Activité <SEP> de <SEP> l'eau <SEP> finale <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 3
<tb> Tg <SEP> ( C) <SEP> milieu <SEP> A <SEP> (maltose) <SEP> 52 <SEP> 14
<tb> Tg <SEP> ( C) <SEP> milieu <SEP> D <SEP> (glucose) <SEP> 47 <SEP> 12
<tb>
Ainsi, pour un milieu donné, la température de transition vitreuse diminue de façon significative lorsque l'aw augmente, ce qui correspond à l'effet plastifiant

<Desc/Clms Page number 23>

de l'eau. Toutefois, les deux milieux, contenant du maltose et du glucose, présentent des Tg finales jugées peu différentes, compte-tenu de l'étalement de l'épaulement observé en milieu complexe.

B. Résultats Tableau 7. Effet de l'activité de l'eau du milieu sur la perte d'activité intervenue lors de la lyophilisation (dit) et sur la vitesse de perte d'activité acidifiante observée lors du stockage sous forme lyophilisée (K, en min/jour).

<tb>
<tb>

Activité <SEP> de <SEP> l'eau <SEP> aw <SEP> = <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> aw <SEP> = <SEP> 0, <SEP> 3
<tb> Milieu <SEP> Milieu <SEP> A <SEP> Milieu <SEP> D <SEP> Milieu <SEP> A <SEP> Milieu <SEP> D
<tb> maltose <SEP> glucose <SEP> maltose <SEP> glucose
<tb> dtl <SEP> (lys) <SEP> 169 <SEP> (3,1) <SEP> 152 <SEP> (8,5) <SEP> 124 <SEP> (3) <SEP> 138 <SEP> (0,9)
<tb> K <SEP> (4 C) <SEP> 0 <SEP> (0) <SEP> 0 <SEP> (0) <SEP> 0,32 <SEP> (0,03) <SEP> 0 <SEP> (0)
<tb> K <SEP> (25 C) <SEP> 0 <SEP> (0) <SEP> 0 <SEP> (0) <SEP> 2,53 <SEP> (0,07) <SEP> 2,50 <SEP> (0,19)
<tb> K <SEP> (37 C) <SEP> 12,63 <SEP> (0,84) <SEP> 17,43 <SEP> (1,59) <SEP> 41,46 <SEP> (0, <SEP> 48) <SEP> > 50
<tb>

Les résultats correspondent à la moyenne de 3 mesures indépendantes (les écarts-types correspondants sont indiqués entre parenthèses) Tableau 8. Différence entre la température de transition vitreuse (Tg) des milieux de Iyoprotection et la température de stockage (Ts), soit Tg-Ts ( C)

<tb>
<tb> Tg <SEP> - <SEP> Ts <SEP> ( C)
<tb> aw <SEP> Ts <SEP> Milieu <SEP> A <SEP> Milieu <SEP> D
<tb> Maltose <SEP> Glucose
<tb> 4 C4843
<tb> 0, <SEP> 1 <SEP> 25 C2722
<tb> 37 C <SEP> 15 <SEP> 10
<tb> 4 CJOM
<tb> 0,3 <SEP> 25 C <SEP> -11 <SEP> -13
<tb> 370C <SEP> -23 <SEP> -25
<tb>
Les résultats correspondent à la moyenne de 2 mesures indépendantes.

D'après le tableau 7, pour L. bulgaricus, l'activité de l'eau du mélange final influe sur la perte d'activité acidifiante lors de la lyophilisation (dtl). L'activité

<Desc/Clms Page number 24>

acidifiante des cellules lyophilisées selon le cycle 2 (aw = 0,3) est meilleure que celle des bactéries traitées selon le cycle 1 (aw = 0,1) : Un gain est de 30 min, pour atteindre pH 5,5, est observé. Ainsi, la réduction de la durée et de la température de plaque lors de la dessiccation secondaire induiraient une moindre dégradation cellulaire et donc, une meilleure résistance des bactéries à la lyophilisation.

En revanche, la vitesse de perte d'activité acidifiante (K) est plus faible si l'aw du milieu est de 0,1 (cycle 1) au lieu de 0,3 (cycle 2). Cela indique qu'une faible aw est nécessaire au maintien de l'activité acidifiante au cours du stockage. Il faut préciser ici que, bien qu'une aw de 0,3 induit une meilleure activité biologique après lyophilisation, c'est l'aw de 0,1 qui est la plus favorable au maintien de l'activité lors du stockage. Par exemple, après 4 semaines d'un stockage à 25 C, les concentrés bactériens caractérisés par une aw de 0,3 présentent une activité très inférieure à l'activité initiale mesurée sur les échantillons définis par une aw de 0,1. Le maintien d'une activité de l'eau faible (aw = 0, 1) permet d'augmenter suffisamment les valeurs des températures de transition vitreuse des mélanges Iyoprotecteurs de sorte que les températures de conservation de 40C et de 25 C donnent des résultats équivalents au cours du stockage (écart Tg-Ts supérieur à 20 C, tableau 8), c'est à dire une absence quasi-totale de perte d'activité biologique pendant trois mois de stockage. En revanche, lorsque l'écart entre Tg et Ts tombe au-dessous de 20 C (aw = 0, 1 et Ts = 37 C ou aw = 0,3 et toutes les valeurs de Ts), l'activité acidifiante se dégrade de façon significative.

Exemple 4 : Effet de la différence entre la température de transition vitreuse et la température de stockage sur la conservation à l'état lyophilisé de Lactococcus lactis subsp. lactis A. Matériel et Méthodes
Souche : Lactococcus lactis CFL4 (INRA, Grignon)
Conditions de culture : température = 30 C et pH = 6,0

<Desc/Clms Page number 25>

Tableau 9 : Composition et caractéristiques des milieux Iyoprotecteurs finaux (en g/L) :

<tb>
<tb> Milieu <SEP> A <SEP> Milieu <SEP> F <SEP> Milieu <SEP> G
<tb> Sumageant <SEP> de <SEP> fin <SEP> de <SEP> culture
<tb> lactose <SEP> + <SEP> galactose <SEP> 25 <SEP> 25 <SEP> 25
<tb> lactate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 12 <SEP> 12 <SEP> 12
<tb> Sucres <SEP> apportés
<tb> Maltose <SEP> 25 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> Maltotriose <SEP> (DE <SEP> 40, <SEP> 4) <SEP> 0 <SEP> 25 <SEP> 40
<tb> Maltodextrine <SEP> (DE <SEP> 7-10) <SEP> 25 <SEP> 25 <SEP> 10
<tb> Antioxydant
<tb> ascorbate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 10 <SEP> 10 <SEP> 10
<tb> pH <SEP> 6, <SEP> 2 <SEP> 6, <SEP> 2 <SEP> 6,2
<tb> Aw <SEP> du <SEP> milieu <SEP> lyophilisé <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 1
<tb> Tg <SEP> ( C) <SEP> du <SEP> milieu <SEP> lyophilisé <SEP> 55 <SEP> 50 <SEP> 52
<tb>

B. Résultats Tableau 10. Effet de la température de transition vitreuse du milieu sur la perte d'activité intervenue lors de la lyophilisation (dtl) et sur la vitesse de perte d'activité acidifiante observée lors du stockage sous forme lyophilisée (K, en min/jour).

<tb>
<tb>

Milieu <SEP> Milieu <SEP> A <SEP> Milieu <SEP> F <SEP> Milieu <SEP> G
<tb> Maltose <SEP> MT25 <SEP> MT <SEP> 40
<tb> dtl <SEP> (Iyo) <SEP> 21 <SEP> (16,1) <SEP> 79 <SEP> (20,8) <SEP> 87 <SEP> (2,8)
<tb> K <SEP> (4 C) <SEP> 0,76 <SEP> (0,11) <SEP> 0 <SEP> (0) <SEP> 0 <SEP> (0)
<tb> K <SEP> (25 C) <SEP> 1,78 <SEP> (0,11) <SEP> 2,26 <SEP> (0,07) <SEP> 1,52 <SEP> (0,03)
<tb> K <SEP> (37 C) <SEP> 8,92 <SEP> (0, <SEP> 14) <SEP> 12,4 <SEP> (0,16) <SEP> 11,97 <SEP> (0,07)
<tb>
Les résultats correspondent à la moyenne de 3 mesures indépendantes (les écarts-types correspondants sont indiqués entre parenthèses).

<Desc/Clms Page number 26>

Tableau 11. Différence entre la température de transition vitreuse (Tg) des milieux de Iyoprotection et la température de stockage (Ts) : Tg-Ts ( C)

<tb>
<tb> Tg-Ts <SEP> ( C)
<tb> Milieu <SEP> Milieu <SEP> A <SEP> Milieu <SEP> F <SEP> Milieu <SEP> G
<tb> Maltose <SEP> MT25 <SEP> MT40
<tb> Ts <SEP> = <SEP> 40C <SEP> 51 <SEP> 46 <SEP> 48
<tb> Ts <SEP> = <SEP> 250C <SEP> 30 <SEP> 25 <SEP> 27
<tb> Ts <SEP> = <SEP> 370C <SEP> 18 <SEP> 13 <SEP> 15
<tb>

Les résultats correspondent à la moyenne de 2 mesures indépendantes.

Selon le tableau 11, pour L. lactis, les écarts importants Tg-Ts (supérieurs à 20 C) observés à 4 C et à 25 C expliquent la bonne résistance des cellules à ces deux températures de stockage (tableau 10). A 37 C, avec un écart Tg-Ts inférieur à 20 C, la perte d'activité acidifiante est rapide, quel que soit le milieu considéré.

Les valeurs des vitesses de perte d'activité acidifiante, observées lors du stockage sous forme lyophilisée dans les exemples 1 à 4, sont représentées à la figure 2 en fonction de l'écart Tg-Ts. Les vitesses sont représentées en valeur normalisée pour chaque souche (K/Kmax pour chaque souche), afin de comparer les résultats obtenus pour les trois bactéries lactiques étudiées (Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus acidophilus et Lactococcus lactis subsp. lactis), et ce pour deux activités d'eau finales différentes (aw = 0,1 ou 0,3, selon deux cycles de lyophilisation différents), et aux trois températures de stockage à l'état lyophilisé considérées (4 C, 25 C et 37 C). Il apparaît clairement que la température de transition vitreuse du mélange final (Tg), résultant de la formulation et de la conduite du procédé, permet de définir la température maximale de stockage (Ts). Pour obtenir une bonne stabilité des bactéries lactiques concentrées lyophilisées à température élevée, cette température de stockage doit être inférieure de 20 C à la température de transition vitreuse du produit lyophilisé.

Enfin, la comparaison des résultats obtenus sur le milieu A (contenant du maltose), à une activité de l'eau de 0,1 et avec les trois bactéries lactiques étudiées, confirme l'existence de différences importantes de comportement selon l'espèce considérée. Ainsi, la perte d'activité acidifiante intervenue lors de

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la lyophilisation varie de 7 min pour L. acidophilus à 21 min pour L. lacis et à 169 min pour L. bulgaricus. Lors du stockage sous forme lyophilisée, la vitesse de perte d'activité acidifiante diffère peu à 40C et à 250C (de 0 min/j à 1,78 min/j selon la bactérie considérée) mais beaucoup à 370C (de 1,76 min/j à 12,63 min/j) (tableaux 4,7 et 10). Dans tous les cas, L. bulgaricus est la bactérie la plus sensible aux traitements de conservation. Ces différences mettent en exergue la nécessité de déterminer, pour chaque espèce de microorganisme, les conditions à mettre en oeuvre lors de leur lyophilisation : formulation du milieu de Iyoprotection, conditions opératoires de la phase de dessiccation secondaire et température maximale de stockage. Cependant, les conditions préconisées par l'invention (écart Tg-Ts supérieur à 200C) permettent, dans tous les cas, de réduire les effets de la variabilité biologique.

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Claims (19)

1. REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation reproductible d'une composition lyophilisée contenant des bactéries viables et actives après stockage pendant plusieurs mois à une température de stockage (Ts) élevée prédéterminée, caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes : a) préparation d'un concentré de bactéries lactiques dans un milieu liquide, ledit milieu liquide comprenant : (i) un composé antioxydant hydrosoluble ou une association de composés antioxydants hydrosolubles ; et (ii) un composé ou une association de composés augmentant la température de transition vitreuse du produit lyophilisé ; b) lyophilisation du concentré de bactéries lactiques Iyoprotégé préparé à l'étape a), selon les étapes suivantes : (b1) congélation du concentré de bactéries ; (b2) dessiccation primaire ; (b3) dessiccation secondaire jusqu'à obtenir une composition bactérienne lyophilisée ayant une activité de l'eau d'environ 0,1 et dont la température de transition vitreuse (Tg) est supérieure d'au moins 20 C à la température de stockage (Ts) prédéterminée.
2. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape (b3) de dessiccation secondaire est réalisée à une température d'environ 250C à une pression d'environ 13 Pa.
3. 3. Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que l'étape (b1) de congélation est réalisée à une température d'environ-65 C.
4. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'étape (b2) de dessiccation primaire est réalisée à une température d'environ 200C à une pression d'environ 40 Pa.
5. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le composé antioxydant hydrosoluble, ou l'association de composés antioxydants

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   hydrosolubles, est présent dans la solution liquide de départ à une concentration comprise entre 1 et 20 g/L, de préférence entre 5 et 15 g/L.
6. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le (s) composé (s) antioxydant (s) est (sont) choisi (s) parmi l'acide ascorbique et les ascorbates, l'acide érythorbique et les érythorbates, l'acide citrique et les citrates, la cystéine, les gallates, le mannitol, les tocophérols, la vitamine E, le Trolox, le butylhydroxyanisole (BHA) et le butylhydroxytoluène (BHT).
7. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la nature et la proportion des composés augmentant la température de transition vitreuse dans la solution liquide de départ est ajustée de manière à ce que la composition lyophilisée finale ait une température de transition vitreuse (Tg) d'au moins 20 C, de préférence d'au moins 25 C, supérieure à la température de stockage (Ts) prédéterminée.
8. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le (s) composé (s) augmentant la température de transition vitreuse est (sont) choisi (s) parmi les sucres tels que le glucose, le maltose, le lactose, le saccharose, le tréhalose et le maltotriose, en association avec une maltodextrine dont le dextrose équivalent peut varier entre 4 et 30.
9. 9. Composition lyophilisée contenant des bactéries lactiques viables et actives après stockage pendant plusieurs mois à température élevée (Ts), caractérisée en ce que : (a) elle comprend au moins un composé antioxydant hydrosoluble ; (b) elle comprend au moins deux composés Iyoprotecteurs augmentant la température de transition vitreuse telle que la température de transition vitreuse (Tg) de ladite composition est supérieure d'au moins 20 C à la température de stockage (Ts) prédéterminée ; (c) ladite composition à une valeur d'activité de l'eau d'environ 0,1.

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10. 10. Composition selon la revendication 9, caractérisée en ce que la perte d'activité acidifiante des bactéries lactiques présentes dans la composition lyophilisée exprimée en vitesse de perte d'activité acidifiante lors du stockage (K, en minute (s) /jour), est égale ou inférieure à 2 min/jour pour un stockage jusqu'à 25 C.
11. 11. Composition selon la revendication 9, caractérisée en ce que la perte d'activité acidifiante des bactéries lactiques présentes dans la composition lyophilisée, exprimée en vitesse de perte d'activité acidifiante lors du stockage (K, en minute (s) /jour), est de préférence égale à 0 pour un stockage jusqu'à 25 C, et de préférence inférieure à 2 min/jour dans le cas des souches sensibles pour un stockage jusqu'à 25 C.
12. 12. Concentré de bactéries lactiques lyophilisé susceptible d'être utilisé dans l'industrie laitière, caractérisé en ce qu'il comprend une composition selon l'une des revendications 9 à 11.
13. 13. Utilisation d'une composition lyophilisée selon l'une des revendications 9 à 11 dans un procédé de fermentation.
14. 14. Utilisation d'une composition lyophilisée selon la revendication 13, caractérisée en ce que le procédé de fermentation implique la production d'acide lactique.
15. 15. Utilisation d'une composition lyophilisée selon l'une des revendications 9 à 11 pour la transformation de produits laitiers, de végétaux, de produits carnés et de produits vinicoles, par fermentation.
16. 16. Utilisation d'une composition lyophilisée selon l'une des revendications 9 à 11 pour la préparation d'une composition de complément alimentaire ou alicament.
17. 17. Utilisation d'une composition lyophilisée selon l'une des revendications 9 à

    11 pour la préparation de produits riches en probiotiques : produits laitiers fermentés, desserts, céréales, biscuits, boissons,....

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18. 18. Utilisation d'une composition lyophilisée selon l'une des revendications 9 à 11 pour la préparation d'un médicament.
19. 19. Utilisation selon la revendication 18, caractérisée en ce que les bactéries lactiques contenues dans ladite composition lyophilisée peuvent être transformées avec un acide nucléique permettant l'expression d'un gène d'intérêt thérapeutique par ces bactéries.