FR2827611A1 - Sequence d'acides nucleiques codant un nouveau recepteur couple aux proteines g et utilisations - Google Patents

Abstract

L'invention porte sur l'identification d'un nouveau récepteur couplé aux protéines liant le GTP ou protéines G. Elle porte en particulier sur l'identification d'une séquence d'acides nucléiques codant ce récepteur ainsi que sur les vecteurs recombinants comportant ces séquences et les cellules hôtes contenant les vecteurs. Les utilisations des cellules hôtes pour le criblage de molécules agonistes ou antagonistes du récepteur couplé aux protéines G font également partie de l'invention.

Description

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L'invention porte sur l'identification d'un nouveau récepteur couplé aux protéines liant le GTP ou protéines G. Elle porte en particulier sur l'identification d'une séquence d'acides nucléiques codant ce récepteur ainsi que sur les vecteurs recombinants comportant ces séquences et les cellules hôtes contenant les vecteurs. Les utilisations des cellules hôtes pour le criblage de molécules agonistes ou antagonistes du récepteur couplé aux protéines G font également partie de l'invention.

Par récepteurs couplés aux protéines G , on entend des protéines membranaires monomériques, dimériques ou multimériques exprimées à la surface des cellules, capables de recevoir un signal extracellulaire et de le transmettre à la cellule via leur interaction avec des protéines hétérotrimériques spécifiques auxquelles ils sont associés et appelées protéines G. Les protéines G hétérotrimériques sont composées d'une sous-unité a et d'un dimère ssy indissociable. La sous-unité a porte un nucléotide GDP ou GTP. Les protéines G sont des protéines sous-membranaires associées à la membrane par des lipides. Schématiquement, le mécanisme d'activation d'un récepteur couplé aux protéines G par une molécule agoniste se résume ainsi : lorsqu'un agoniste se lie à un récepteur couplé aux protéines G, ledit récepteur s'associe à la forme GDP de la protéine G hétérotrimérique.

Celle-ci perd alors son GDP qui est remplacé par un GTP, à la suite d'un état transitoire.

La fixation du GTP provoque la dissociation des trois partenaires, le récepteur, la sousunité a et le dimère ssy de la protéine G. La sous-unité a et le dimère ssy sont ensuite capables de stimuler un ou plusieurs effecteurs. L'hydrolyse du GTP, parfois stimulée par l'effecteur, marque la fin de l'activation de l'effecteur par la sous-unité a.

Parmi les différentes familles des récepteurs membranaires intervenant dans les communications cellulaires, la famille des récepteurs couplés aux protéines G est la plus nombreuse.

Elle se répartit en cinq sous-groupes distincts selon la structure moléculaire et la fonction : (i) les récepteurs aux hormones peptidiques (somatostatine, TRH, etc..) ; (ii) les récepteurs aux hormones glycoprotéiques (TSH, LH, FSH, etc..) ; (iii) les récepteurs aux hormones peptidiques de type sécrétine ; (iv) les récepteurs olfactifs et (v) les récepteurs aux bioamines (sérotonine, adrénergique). Les récepteurs couplés aux protéines G sont ainsi impliqués dans la réception des stimuli extérieurs (vision, goût, odeur), les fonctions

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endocrines (pituitaire et adrénales), les fonctions exocrines (pancreas), certaines fonctions neurologiques, la fonction cardiaque, la lipolyse et le métabolisme des carbohydrates (pour revues, Wilson S. et al., British Journal of Pharmacology 1998 125 : 1387-1392 ; Stadel JM et al., TIPS 1997 18 : 430-437).

Considérant l'importance et la diversité des systèmes de communication contrôlés par les récepteurs couplés aux protéines G, et notamment leur implication dans de nombreuses pathologies, on comprend l'intérêt de rechercher d'éventuelles séquences susceptibles de coder ces récepteurs afin de les isoler, de vérifier qu'elles correspondent à des nouveaux gènes, d'exprimer leur produit et de construire les outils pour identifier leur (s) ligand (s).

La recherche et l'identification de nouveaux récepteurs couplés aux protéines G reposent notamment sur l'analyse des séquences d'ADN génomique issues des différents projets de séquençage de génomes de mammifères actuellement en cours, et stockées dans des bases de données généralement accessibles par le réseau internet. On citera notamment les données issues du séquençage du génome à haut débit (high throughput genome sequencing) qui sont disponibles via la base de données GenBank.

En général, les séquences déposées initialement dans les bases de données sont des séquences dites brutes ou non annotées. La phase d'annotation qui consiste à repérer, à l'aide d'outils bio-informatiques, les séquences signifiantes , et notamment les séquences codantes potentielles, est réalisée ultérieurement. Sachant que dans le génome humain, seulement 1 à 2 % des séquences sont codantes, une des difficultés consiste au repérage des phases codantes parmi les séquences génomiques brutes disponibles dans les bases de données.

En outre, il faut préciser que les séquences d'ADN génomique disponibles sont susceptibles d'être la juxtaposition de séquences partielles non ordonnées issues de différents clones séquencés. Ceci peut donc constituer un obstacle supplémentaire dans l'identification des séquences codantes.

On a alors recours à l'analyse informatique des séquences à l'aide de différents logiciels disponibles et appropriés pour la recherche des phases ouvertes de lecture (ORFs)

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potentielles. Le choix et le paramétrage des logiciels utilisés sont déterminants pour l'identification de séquences potentiellement codantes. Il est cependant important de souligner que l'identification d'une ORF potentielle à l'aide de programmes bioinformatiques (in silico) n'est qu'une première étape dans l'identification d'un nouveau gène fonctionnel. L'homme du métier doit ensuite vérifier que l'ORF potentielle identifiée in silico correspond à un gène effectivement exprimé et fonctionnel dans la cellule. On sait par exemple qu'il existe des pseudo-gènes, reliquat de l'évolution, dont des portions de séquences sont homologues à certains gènes, cependant ces pseudo-gènes ne sont pas exprimés dans la cellule.

Les inventeurs ont maintenant identifié, par l'analyse informatique de la banque de données des séquences issues du séquençage du génome à haut-débit (HTGS), une phase ouverte de lecture potentielle dont la séquence protéique déduite présente une homologie avec des récepteurs couplés aux protéines G. La séquence déduite possède en effet les critères structuraux typiques des récepteurs couplés aux protéines G, incluant 7 domaines qui contiennent chacun environ 20-30 acides aminés hydrophobes et le motif DRY présent dans le troisième domaine trans-membranaire.

Par une analyse RT-PCR, les inventeurs ont révélé une expression tissulairespécifique de la séquence identifiée. Par RT-PCR, on entend une amplification PCR sur les fragments d'ADNc obtenus par rétrotranscription du transcriptome. Ils ont ainsi montré que la séquence identifiée par l'analyse bio-informatique correspondait effectivement à une séquence d'un gène exprimé. Ils ont en outre montré que le gène codant le nouveau récepteur identifié est principalement exprimé dans le coeur, le poumon, l'intestin et le cerveau et en particulier dans l'hippocampe, la substance noire et l'amygdale.

L'ADNc codant le récepteur complet a été clone après amplification par RT-PCR à partir d'ARN de cerveau total humain, puis séquencé.

La séquence nucléotidique obtenue par le séquençage de l'ADNc est présentée à la figure 1 (SEQ ID NO 1).

La séquence d'acides aminés déduite de la séquence de la figure 1 est présentée en figure 2 (SEQ ID NO 2).

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L'invention a ainsi pour objet une séquence d'acides nucléiques codant un récepteur couplé aux protéines G, caractérisée par la séquence de la figure 1.

Une séquence d'acides nucléiques selon l'invention comprend notamment : une séquence d'ADN génomique, caractérisée par la séquence de la figure 1, une séquence d'ARN messager, produit de transcription de la séquence d'ADN génomique, ou une séquence d'ADNc, produit de la transcription inverse de la séquence d'ARN messager.

Par séquence d'acides nucléiques , il doit être compris une séquence nucléotidique isolée de son contexte naturel. Il s'agit notamment de séquences isolées, amplifiées et/ou purifiées et éventuellement modifiées par génie génétique.

On entend par ADNc ou ADN complémentaire , un acide nucléique résultant de la transcription inverse d'un ARN messager.

Les inventeurs ont observé que la séquence codante d'ADN génomique du récepteur couplé aux protéines G selon l'invention était identique à la séquence d'ADNc isolée et par conséquent ne comportait pas d'introns.

Une séquence d'acides nucléiques selon l'invention peut être aisément isolée par amplification spécifique par RT-PCR à partir d'extraits d'ARN messager de cellules du cerveau humain, ou par amplification d'ADN génomique de l'homme, par exemple à l'aide du couple d'amorces ci-dessous :
5'-ATGACCAGCAATTTTTCCCAACCTG-3'
5'-TTCTAAAAATAAACTAATGGTTGATGAACTAGCC-3'
L'invention concerne aussi des variants de la séquence d'acides nucléiques de la figure 1.

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Les variants de la séquence d'acides nucléiques sont notamment : - des séquences capables de s'hybrider dans des conditions stringentes avec une séquence d'acides nucléiques de la figure 1 ou une séquence complémentaire de celle-ci, et codant un polypeptide ayant essentiellement les mêmes propriétés que le récepteur codé par la séquence de la figure 1 ; les séquences d'acides nucléiques déduites de la séquence d'acides aminés de la figure 2, selon le code génétique, - des formes alléliques pathologiques de la séquence de la figure 1 ; ou encore, des séquences d'une espèce de mammifère homologues à la séquence de la figure 1 isolée chez l'Homme.

Par conditions stringentes , on entend les conditions qui permettent l'hybridation spécifique de deux séquences d'ADN simple brin à environ 65 C par exemple dans une solution de 6 x SSC, 0,5% SDS, 5X Denhardt's solution et 100 ug d'ADN carrier non spécifique ou toute autre solution de force ionique équivalente et après un lavage à 65 C, par exemple dans une solution d'au plus 0,2 x SSC et 0, 1% SDS ou toute autre solution de force ionique équivalente. Les paramètres définissant les conditions de stringence dépendent de la température à laquelle 50% des brins appariés se séparent (Tm). Pour les séquences comprenant plus de 30 bases, Tm est définie par la relation : Tm = 81,5 + 0,41 (% G + C) + 16,6Log (concentration en cations)-0, 63 (% formamide)- (600/nombre de bases). Pour les séquences de longueur inférieure à 30 bases, Tm est définie par la relation : Tm = 4 (G+C) + 2 (A+T). Les conditions de stringence peuvent donc être adaptées par l'homme du métier selon la taille de la séquence, la teneur en GC et tout autre paramètre, selon notamment les protocoles décrits dans Sambrook et al., 2001 (Molecular Cloning : A laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor, laboratory press, Cold Spring Harbor, New York).

On entend par formes alléliques pathologiques , toute séquence isolée chez l'homme correspondant à une forme mutée de la séquence de la figure 1, et dont les mutations sont impliquées dans une pathologie spécifique. Ces mutations peuvent être un ou plusieurs changement (s) nucléotidique (s) ou une ou plusieurs délétion (s) ou insertion (s) de fragments de séquences nucléotidiques.

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On entend par séquences homologues de la séquence d'acides nucléiques de la figure 1 , une séquence de structure similaire à la séquence de la figure 1 et codant un polypeptide ayant essentiellement les mêmes propriétés chez des espèces de mammifères non-humains, notamment les primates, le rat ou la souris. Le pourcentage d'identité entre deux séquences homologues dans les régions fonctionnelles est en général supérieur à 80%, de préférence supérieur à 90%.

Les séquences homologues sont notamment utiles pour la réalisation de modèles animaux pour l'étude fonctionnelle du récepteur couplé aux protéines G et ses variants pathologiques.

L'invention porte ainsi sur un procédé d'identification de formes alléliques pathologiques d'un gène humain codant un récepteur couplé aux protéines G, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) l'isolement d'une séquence d'acides nucléiques codant un récepteur couplé aux protéines G selon l'invention à partir d'acides nucléiques totaux (ARN ou
ADN) issus de patients atteints d'une pathologie et de sujets sains ; b) le séquençage des acides nucléiques isolés en a), et, c) la détection d'une ou de plusieurs mutations communes aux acides nucléiques issus des patients atteints d'une pathologie, la ou les dite (s) mutation (s) n'étant pas présente (s) sur les acides nucléiques issus des sujets sains.

L'invention porte également sur un procédé d'identification de séquences homologues de la séquence d'acides nucléiques de la figure 1 dans une espèce non humaine comprenant les étapes suivantes : a) l'incubation dans des conditions stringentes d'une sonde d'hybridation constituée d'au moins 50 nucléotides de la séquence de la figure 1, de préférence entre 150 et 250 nucléotides, avec de l'ADN génomique ou des extraits d'ARN totaux d'espèces de mammifère non-humain ; b) la détection d'une réaction d'hybridation ; et,

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c) l'isolement de la séquence d'acides nucléiques homologue et codant un récepteur couplé aux protéines G à partir de l'ADN génomique des espèces pour lesquelles une réaction d'hybridation a été détectée.

Les sondes d'hybridation pour la reconnaissance spécifique des séquences d'acides nucléiques codant un récepteur couplé aux protéines G selon l'invention font également partie de l'invention. De telles sondes sont caractérisées en ce qu'elles correspondent à un fragment d'une longueur d'au moins 50 nucléotides, de préférence entre 150 et 250 nucléotides d'une séquence d'acides nucléiques selon l'invention. Ces sondes sont notamment utiles dans la mise en oeuvre des procédés de l'invention mentionnés ci-dessus.

Les sondes peuvent être couplées directement ou indirectement avec un marqueur radioactif ou non-radioactif, on peut citer notamment le 32p ou le 35S parmi les composés radio-actifs ou encore la biotine, l'avidine et la streptavidine ou tout type de composés fluorescents ou bioluminescents ou chimioluminescents parmi les composés non radioactifs.

L'invention fournit également des amorces utiles pour l'amplification et l'isolement des séquences d'acides nucléiques codant un récepteur couplé aux protéines G selon l'invention. Des amorces pour l'amplification d'une séquence codant un récepteur couplé aux protéines G selon l'invention comprennent notamment les séquences suivantes :
5'-ATGACCAGCAATTTTTCCCAACCTG-3'
5'-TTCTAAAAATAAACTAATGGTTGATGAACTAGCC-3'
Les amorces peuvent comprendre en outre dans leur partie 5'des séquences non spécifiques du gène, notamment des sites de restriction pour faciliter le clonage des séquences amplifiées dans un vecteur, ou encore des séquences codant des étiquettes, épitopes ou séquences signal pour faciliter l'expression et/ou la purification des polypeptides. Des amorces comprenant une séquence étiquette et des sites de restriction appropriés pour le clonage du produit d'amplification dans un plasmide sont aussi décrites dans l'exemple 1.

L'invention a trait également aux séquences d'acides nucléiques susceptibles d'être obtenues par l'amplification à l'aide des amorces définies ci-dessus.

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Les méthodes d'amplification à l'aide des amorces de l'invention sont connues de l'homme du métier et sont en particulier la méthode PCR qui comprend l'utilisation d'une polymérase thermostable ou la méthode RT-PCR qui permet l'amplification d'ADN à partir d'un échantillon d'ARN messager en effectuant préalablement à l'amplification une étape de transcription inverse. Il existe en outre de nombreuses techniques alternatives à la PCR. Citons à titre d'exemple, les méthodes d'amplification isotherme telles que la TMA (transcription mediated amplification), la NASBA (nucleic acid sequence based amplification), la 3SR (self sustained sequence replication) ou l'amplification par déplacement de brin (strand displacement amplification).

L'invention concerne aussi un vecteur recombinant comprenant une séquence d'acides nucléiques selon l'invention. Par vecteur, il faut comprendre tout type de vecteur permettant l'introduction de la séquence d'acides nucléiques dans une cellule hôte et éventuellement l'expression du polypeptide codé par la séquence d'acides nucléiques dans la cellule hôte.

Un tel vecteur est par exemple le plasmide pS7505 déposé à la CNCM le 13 juillet 2001 sous le numéro 1-2701.

Dans un mode de réalisation préféré, le vecteur recombinant selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend des séquences d'ADN nécessaires à l'expression du récepteur couplé aux protéines G dans une cellule hôte. Ces séquences sont notamment des séquences promotrices appropriées pour l'expression des gènes dans les cellules hôtes et des séquences terminatrices en aval de la séquence codante qui incluent un site de polyadénylation. Des exemples de séquences promotrices sont la séquence du promoteur du cytomégalovirus (CMV) ou encore la séquence du promoteur SV40 qui permettent une expression constitutive et forte des séquences codantes placées en aval respectivement dans les cellules de mammifères et les cellules d'insecte.

Il existe un grand nombre de vecteurs d'expression utilisables. De tels vecteurs d'expression comprennent, entre autres, des vecteurs chromosomiques, épisomiques ou dérivés de virus, en particulier, des vecteurs dérivés des plasmides bactériens, des bactériophages, des transposons, des plasmides et chromosomes de levure, des virus tels que les baculovirus, les papovirus et en particulier SV40, les adénovirus, et les rétrovirus et

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des vecteurs dérivés de leurs combinaisons, notamment les cosmides et les phagemides. Parmi les vecteurs d'expression particulièrement préférés pour l'expression hétérologue de récepteurs membranaires dans les cellules de mammifères, on citera les vecteurs pCI-neo

(promega ; N'accession U47120) et pCDNA3 comprenant le promoteur du CMV, le vecteur bicistronique pIRESneo/pIREShyg (Clontech NO cat 6061-1) ou encore le vecteur pSG5 (Stratagène) comprenant le promoteur SV40.

Pour permettre la sécrétion des protéines traduites dans la lumière du réticulum endoplasmique des cellules eucaryotes ou dans l'espace périplasmique des bactéries ou dans tout autre environnement extra-cellulaire, les vecteurs peuvent comprendre des séquences codant les signaux de sécrétion appropriés sur le polypeptide exprimé.

L'invention porte aussi sur les cellules hôtes transformées par les vecteurs recombinants. Dans un mode de réalisation particulier, les cellules hôtes sont des bactéries, telles que, par exemple, E. coli, les streptococci, les staphylococci, Streptomyces et B. subtilis, de préférence Escherichia coli. La transformation de cellules hôtes bactériennes est en particulier utile pour l'amplification et le stockage des vecteurs recombinants de l'invention.

Dans un autre mode de réalisation de l'invention, les cellules hôtes sont des cellules eucaryotes. Des cellules hôtes eucaryotes utilisables sont notamment des cellules de levures telles que S. cerevisiae ou de champignons filamenteux tels que Aspergillus, des cellules d'insectes telles que les cellules S2 de Drosphila ou Sf9 de spodoptera, ou encore des cellules de plantes.

De manière préférée, les cellules hôtes eucaryotes sont des cellules de mammifères et en particulier des lignées cellulaires de mammifères, notamment les cellules CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, HepG2, L (TK-) et de manière encore préférée, les lignées CHO-K1 ou HEK 293.

Il est ainsi possible d'exprimer le récepteur couplé aux protéines G dans une cellule hôte appropriée, de préférence une cellule hôte eucaryote, par l'introduction dans la cellule hôte du vecteur recombinant de l'invention.

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L'homme du métier sait aussi purifier ledit récepteur à partir des cellules eucaryotes l'exprimant. Différentes méthodes de purification des récepteurs couplés aux protéines G sont décrites dans l'état de la technique (Eckard CP et Beck-sickinger AG, Curr Med Chem 2000 7 : 897-910 ; Ohtaki T et al., J Biol Chem 1998 273 : 15464-15473 ; Hayashi MK, Haga TJ, Biochem (tokyo) 1996 120 : 1232-1238). Citons à titre d'exemple, les purifications par précipitation au sulfate d'ammonium ou à l'éthanol, sur colonne de chromatographie à échange d'ions, par chromatographie d'affinité, par chromatographie d'exclusion par la taille, par chromatographie en phase inverse ou encore par chromatographie liquide à haute performance. Il est aussi envisageable de purifier le récepteur de l'invention à l'aide des techniques électrophorétiques de séparation des protéines selon leur taille et/ou leur charge.

La méthode de chromatographie d'affinité consiste en particulier à exprimer dans une cellule hôte, un récepteur recombinant présentant un épitope ou une séquence étiquette (tag) spécifique en amont ou en aval de la séquence codante, à récupérer les protéines membranaires ou les protéines totales de la cellule hôte puis à purifier les récepteurs sur colonne d'affinité fixant les protéines exprimant l'épitope ou tag spécifique. Selon ce mode de purification particulier, le vecteur d'expression comprend en plus les séquences étiquette (tag) pour la purification du polypeptide exprimé dans les cellules hôtes.

L'invention concerne également un polypeptide caractérisé en ce qu'il est codé par une séquence d'acides nucléiques selon la séquence de la figure 1 (SEQ ID NO 1) ou par tout variant selon l'invention de la séquence de la figure 1.

En particulier, l'invention concerne un polypeptide comportant la séquence d'acides aminés de la figure 2 (SEQ ID NO 2).

L'invention porte aussi sur les fragments de ce polypeptide présentant une activité de récepteur couplé aux protéines G, en particulier, les fragments de ce polypeptide comprenant les sept domaines transmembranaires.

Il est en outre connu que certains fragments des récepteurs couplés aux protéines G sont capables de stimuler directement la protéine G indépendamment de la présence d'un agoniste. Par exemple, Hebert et al. ont montré que la deuxième et troisième boucle

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intracellulaire du récepteur couplé aux protéines G HTIAR permettent le couplage dudit récepteur aux protéines G et leur stimulation (Hebert TE et al., J Biol Chim 1996 271 : 16384-16392). Ainsi, l'invention porte sur les fragments du polypeptide décrit plus haut, lesdits fragments étant capables de stimuler directement les protéines G, et de mimer ainsi l'activité du récepteur couplé aux protéines G en présence d'un agoniste.

Inversement, les fragments du récepteur couplé aux protéines G délétés de tout ou partie des régions impliquées dans la dimérisation du récepteur ou dans l'interaction avec les protéines G peuvent être utilisés avantageusement afin d'inhiber l'action d'un agoniste (Varrault A. et al., J Biol Chem 1994 269 : 16720-16725). Par conséquent, l'invention porte aussi sur les fragments du polypeptide décrit plus haut, capables d'inhiber l'action d'un agoniste. Ainsi, selon les modes de réalisations de l'invention, les fragments de séquences polypeptidiques de l'invention sont compris dans un des 7 domaines transmembranaires ou dans la partie intracytoplasmique (première, deuxième et troisième

boucle intracellulaire) ou encore dans la partie extérieure à la cellule (partie N-terminale ou première, deuxième ou troisième boucle extracellulaire).

Les polypeptides ou fragments de polypeptides de l'invention sont sous la forme des protéines natives ou font partie d'une protéine de fusion de taille plus importante. En particulier, les polypeptides de l'invention sont fusionnés à des séquences d'acides aminés supplémentaires qui contiennent les signaux nécessaires à la traduction, la stabilité, la sécrétion et/ou la purification de la protéine recombinante correspondante.

Les anticorps dirigés contre les polypeptides et fragments de polypeptides décrits plus haut font également partie de l'invention. Ces anticorps trouvent leur intérêt pour détecter et/ou quantifier l'expression des récepteurs à la surface des cellules. Lorsque les anticorps sont spécifiquement dirigés contre le site de reconnaissance du ligand du récepteur couplé aux protéines G, ces anticorps peuvent aussi être utilisés en tant qu'antagonistes du récepteur.

L'invention vise à la fois les anticorps polyclonaux et monoclonaux.

Les anticorps polyclonaux peuvent être obtenus par l'immunisation d'un hôte vivant approprié avec lesdits polypeptides purifiés ou leurs fragments contenant les

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épitopes que l'on souhaite identifier et/ou quantifier. Les anticorps formés à partir d'un sérum de l'hôte immunisé sont ensuite récupérés notamment par la mise en contact des sérums avec les polypeptides purifiés et par la récupération de ces anticorps à partir des complexes antigène-anticorps formés.

Les anticorps monoclonaux sont notamment obtenus selon la méthode classique de culture d'hybridomes de Kohler et Milstein.

Les anticorps selon l'invention peuvent aussi être des anticorps chimériques, des anticorps humanisés ou des fragments Fab ou F (ab') 2. Il est en particulier possible, de cloner les gènes codant les deux chaînes des anticorps monoclonaux produits par des hybridomes, ceux-ci pouvant être manipulés in vitro et réintroduits ensuite dans des cellules secrétrices, telles des lignées lymphoïdes ou autres, après leur réinsertion dans les vecteurs d'expression appropriés aux cellules choisies. De nouveaux anticorps monoclonaux sont ainsi construits avec des régions variables de souris ou de rats et des régions constantes humaines. Différents types d'immunoglobulines peuvent être obtenus.

Leur spécificité dans tous les cas sera la même que celle des régions variables utilisées mais ils posséderont les propriétés effectrices des immunoglobulines humaines suivant l'isotype choisi dans la construction.

Les anticorps de l'invention peuvent aussi être reconstitués (Reshaped antibodies) (Riechmann et al. (1988), Nature 332 : 323-327). Schématiquement, le point de départ de cette approche est l'observation que les sites de contact des anticorps avec les épitopes des antigènes qu'ils reconnaissent sont localisés sur certaines séquences des régions variables dites hypervariables. La technique consiste à greffer les régions hypervariables d'une immunoglobuline murine appelée"région déterminant la complémentarité avec l'antigène" ou"CDR"sur les régions variables d'une immunoglobuline de classe G humaine.

Les anticorps selon l'invention sont aussi susceptibles d'être couplés à un autre composé, notamment un marqueur, afin d'obtenir un signal détectable ou quantifiable.

Les cellules hôtes exprimant le récepteur couplé aux protéines G selon l'invention peuvent être avantageusement utilisées pour le criblage de composés qui se fixent au

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récepteur et l'active (agonistes de ce récepteur) ou qui inhibent l'activation dudit récepteur (antagoniste).

L'invention porte ainsi sur un procédé de criblage pour l'identification de molécules agonistes du récepteur couplé aux protéines G, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) la culture de cellules hôtes eucaryotes transformées par un vecteur recombinant selon l'invention permettant l'expression du récepteur couplé aux protéines G ; b) la mise en contact des cellules hôte en culture avec un composé candidat ; c) la détermination d'un signal éventuel généré par le récepteur couplé aux protéines
G en présence du composé candidat.

Selon les modes de réalisation du procédé, le signal à déterminer, généré par l'activation du récepteur couplé aux protéines G par le composé candidat peut être une stimulation ou une inhibition de l'adénylate cyclase, une liaison du 35SGTPy, une activité MAP kinase ou encore une augmentation de l'inositol triphosphate intracellulaire, et plus généralement tout type de signal susceptible d'être modulé positivement ou négativement par les protéines G.

Dans un mode de réalisation préféré, le signal généré par le récepteur couplé aux protéines G en présence d'un de ses agonistes est déterminé à l'aide d'un système rapporteur comprenant l'utilisation d'une cellule recombinante exprimant la sous-unité a de la protéine G16 de manière stable ou transitoire et la quantification de la concentration en calcium intracellulaire. L'expression constitutive de la sous-unité a de la protéine G16 permet que toute réponse antagoniste se traduise essentiellement par une augmentation de la concentration en calcium intracellulaire.

Ainsi, l'invention porte sur un procédé de criblage pour l'identification de molécules agonistes comprenant les étapes suivantes : a) la culture de cellules hôtes eucaryotes transformées par un vecteur recombinant selon l'invention permettant l'expression du récepteur couplé aux protéines G,

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lesdites cellules hôtes exprimant en plus une sous-unité a de la protéine G de manière constitutive ; b) la quantification de la concentration en calcium intracellulaire dans les cellules en culture en présence et en absence des molécules à cribler ; c) la sélection des molécules en présence desquelles la concentration en calcium intracellulaire est augmentée.

Dans le procédé ci-dessus, les cellules hôtes sont modifiées de telle manière que toute activation du récepteur conduit à une élévation de la concentration en calcium intracellulaire. On utilisera par exemple des cellules COS7, CHO ou HEK293 exprimant de façon stable ou transitoire la sous-unité Gai 6. La concentration de calcium intracellulaire est déterminée à l'aide d'un marqueur, notamment un marqueur fluorescent.

L'invention porte également sur un procédé d'identification de la présence de molécules antagonistes comprenant les étapes suivantes : a) la culture de cellules hôtes eucaryotes transformées par un plasmide recombinant selon l'invention permettant l'expression du récepteur couplé aux protéines G en présence d'un agoniste ; b) la mise en contact des cellules hôtes en culture avec un composé candidat ; c) la détermination d'une diminution du signal éventuel généré par le récepteur couplé aux protéines G en présence du composé candidat et de l'agoniste par rapport au signal généré avec l'agoniste seul.

Les agonistes et antagonistes identifiés par un tel procédé sont également visés par l'invention.

L'invention porte aussi sur l'utilisation d'une séquence d'acides nucléiques codant un récepteur couplé aux protéines G selon l'invention pour le criblage de molécules agonistes et antagonistes d'un récepteur couplé aux protéines G.

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Elle concerne également l'utilisation des cellules hôtes ci-dessus mentionnées pour le criblage de molécules agonistes et antagonistes d'un récepteur couplé aux protéines G.

Les polypeptides codés par les séquences d'acides nucléiques de l'invention sont impliqués dans différentes fonctions biologiques, et éventuellement certaines pathologies. En particulier, la mise en évidence par les inventeurs de l'expression du récepteur couplé aux protéines G spécifiquement dans l'hippocampe, l'amygdale, la substance noire, le poumon, le coeur, l'intestin, suppose un rôle du récepteur dans les fonctions liées à ces structures et éventuellement dans certaines pathologies liées à une anomalie dans l'expression dudit récepteur, en particulier dans ces tissus.

Par conséquent, l'invention vise également les méthodes de diagnostic, de pronostic ou de suivi de l'évolution d'une pathologie liée à une expression anormale du récepteur dans un tissu.

Par expression anormale, il faut comprendre toute expression qualitativement ou quantitativement différente entre un individu malade et un individu sain.

Dans un premier mode de réalisation particulier, la méthode de diagnostic consiste à comparer la séquence codant le récepteur dans les cellules d'un tissu particulier chez un individu malade et un individu sain et à détecter une forme allélique particulière de la séquence chez l'individu malade par rapport au sujet sain.

Dans un second mode de réalisation particulier, la méthode consiste à comparer l'expression de l'ARN messager codant le récepteur dans les cellules d'un tissu particulier chez un individu malade et un individu sain et détecter une expression anormale dudit ARN messager chez l'individu malade par rapport au sujet sain.

Les techniques de quantification de l'expression d'un ARN messager sont bien connues de l'homme du métier. On citera en particulier la technique du Northern Blot ou de RT-PCR quantitative.

Plus particulièrement, l'invention concerne une méthode de diagnostic, de pronostic ou de suivi de l'évolution d'une pathologie liée à une expression anormale du récepteur et

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comprenant la détection de l'expression anormale de l'ARN messager du récepteur à l'aide de puces à ADN.

L'invention vise des kits de mesure quantitative et/ou qualitative de l'expression du gène codant le récepteur couplé aux protéines G dans des tissus ou des cellules d'un tissu particulier. De tels kits peuvent être utilisés pour le diagnostic, le pronostic ou le suivi thérapeutique de patients présentant, ou susceptibles de présenter une pathologie liée à une surexpression ou une sous-expression de la séquence d'acides nucléiques selon l'invention.

Un kit selon l'invention comprend :

soit des amorces selon l'invention, en particulier pour l'amplification RT-PCR du gène codant le récepteur et la quantification de l'ADNc amplifié ; soit une sonde selon l'invention, en particulier pour la quantification en
Northem Blot de l'ARN messager codant le récepteur couplé aux protéines G.

Avantageusement, l'expression du transcrit codant le récepteur couplé aux protéines G dans des cellules ou des tissus est étudié par hybridation des ADNc ou ARNm dans des kits constitués de puces à ADN , ou micro-réseaux ou macro-réseaux sur lesquels sont fixés des sondes spécifiques du gène de l'invention dont l'expression est recherchée.

Par puce à ADN , il faut comprendre tout type de support permettant la fixation stable d'une quantité d'acides nucléiques, l'hybridation des acides nucléiques fixés sur le support avec une séquence contenue dans un extrait d'ADN ou d'ARN préalablement marqué, puis la quantification de l'hybridation. Les technologies des puces à ADN sont en particulier décrites par Sambrook et al. (voir plus haut).

De même, des kits permettant la détection de formes anormales du récepteur couplé aux protéines G font également partie de l'invention. Ces tests peuvent être de nature immunologique comprenant l'utilisation d'anticorps spécifiques de régions du récepteur susceptibles de contenir des structures anormales.

Ces kits peuvent également être une puce à protéines constituée d'un support sur lequel est fixée une séquence d'acides aminés selon l'invention ou un anticorps ou

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fragment d'anticorps dirigé contre un polypeptide ou un fragment de polypeptide selon l'invention. De telles puces à protéines permettent la détection à grande échelle de structures anormales de plusieurs protéines, ou la détection des interactions particulières du récepteur avec d'autres molécules.

L'invention vise également des méthodes de traitements thérapeutiques de pathologies liées à une expression anormale, excessive ou insuffisante du récepteur couplé aux protéines G codé par les séquences de l'invention, en particulier dans le coeur, les intestins les poumons, l'hippocampe, la substance noire, l'amygdale, caractérisées en ce qu'elles comprennent l'administration d'une dose thérapeutique efficace d'un agoniste ou d'un antagoniste du récepteur couplé aux protéines G codé par les séquences de l'invention.

En particulier, l'invention porte sur une séquence nucléotidique anti-sens, capable d'inhiber l'expression des séquences d'acides nucléiques selon l'invention, et caractérisée en ce qu'elle correspond à une séquence d'acides nucléiques simple brin capable de s'hybrider dans des conditions stringentes au brin codant d'une séquence d'acides nucléiques selon l'invention. Elle porte en outre sur l'utilisation de ces séquences pour le traitement thérapeutique de pathologies liées à une expression excessive du récepteur couplé aux protéines G.

Un fonctionnement anormal de l'hippocampe, de l'amygdale, de la substance noire du coeur, de l'intestin ou des poumons peut entraîner un certain nombre de désordres ou pathologies, on citera notamment l'obésité, la boulimie, l'anorexie, la maladie de Parkinson, les désordres cardio-vasculaire, l'hypotension, l'hypertension, l'infarctus du myocarde, l'insuffisance cardiaque aiguë, l'angine de poitrine et les désordres psychotiques et neurologiques tels que l'anxiété, la schizophrénie, la maniaco-dépression, le delirium, la démence, l'épilepsie, la migraine, l'insomnie, les désordres du rythme circadien et l'atténuation des performances cognitives. On citera aussi les infections par les bactéries et les virus particulièrement le HIV-1 et HIV-2.

Par conséquent, l'invention porte aussi sur l'utilisation des séquences d'acides nucléiques et des polypeptides selon l'invention pour le criblage de molécules actives dans le traitement du diabète, de l'obésité, de la boulimie, de l'anorexie, de la maladie de

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Parkinson, de l'hypotension, de l'hypertension, de l'infarctus du myocarde, de l'insuffisance cardiaque aiguë, de l'angine de poitrine, et des désordres psychotiques et neurologiques tel que l'anxiété, la schizophrénie, la maniaco-dépression, le delirium, la démence, l'épilepsie, la migraine, l'insomnie, les désordres du rythme circadien, l'atténuation des performances cognitives et les infections bactériennes et virales en particulier par le HIV-1 et HIV-2.

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DESCRIPTION DES FIGURES Figure 1 : Séquence d'acides nucléiques codant un récepteur couplé aux protéines G (S7505).

(SEQ ID NO 1) Figure 2 : Séquence d'acides aminés du récepteur couplé aux protéines G.

(SEQ ID NO 2) Figure 3 : Profil hydrophile de la protéine codant le récepteur couplé aux protéines G.

Figure 4 : Expression tissulaire.

Exemple 1-Identification et isolement d'une séquence d'acides nucléiques codant un nouveau récepteur couplé aux protéines G
Des séquences présentant des homologies avec les séquences codant des récepteurs couplés aux protéines G ont été recherchées parmi les séquences de la banque HTGS (high throuput genome sequencing). Pour cette recherche, le logiciel de comparaison de séquence Lassap V2 (de la société Gene-IT) a été utilisé. Ce logiciel s'appuie sur un algorithme de type Blast 2.

Le criblage a permis d'identifier un fragment de séquence d'ADN génomique codant potentiellement un récepteur couplé aux protéines G. L'analyse de la séquence a permis de reconstituer une phase ouverte de lecture théorique contenant un codon d'initiation et un codon stop.

La traduction de la séquence nucléotidique théorique en acides aminés produit une séquence en protéine de 342 acides aminés. Cette séquence possède un certain nombre de critères structuraux typiques des récepteurs couplés aux protéines G : incluant 7 domaines transmembranaires contenant chacun environ 20-30 acides aminés hydrophobes et le motif DRY présent dans le troisième domaine transmembranaire.

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En outre, la comparaison de cette séquence avec les séquences accessibles dans les banques de données à l'aide de l'algorithme Clustal W révèle une d'identité de 31% avec le récepteur sérotoninergique 5HT-4.

Un ADNc a été isolé par RT-PCR à partir d'ARNm de cerveau à l'aide des amorces sens 5-CACCATGACCAGCAATTTTTCCCAACCTG-3'et anti sens 5'- TTATCACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAATCTTCTAAAAATAAACTAATGGTTGA TGAACTAGCC-3'
Ces amorces ont été définies à partir de la séquence théorique obtenue, et contiennent en plus la séquence CACC (soulignées dans la séquence d'oligonucléotides) permettant un clonage orienté dans le vecteur d'expression nommé pcDNA3.1 TOPO (Invitrogen). L'amorce anti sens contient aussi une séquence en phase avec celle codant pour le récepteur et codant pour le peptide DYKDDDDK.

La séquence amplifiée par RT-PCR a été insérée dans le vecteur d'expression pcDNA3. 1 TOPO puis la séquence nucléotidique a été déterminée à partir d'une réaction de terminaison de chaîne et en utilisant un séquenceur d'ADN automatique ABI 377 (Applied Biosystems).

La séquence nucléotidique (Seq 7505) ainsi obtenue est présentée dans la figure 1 (SEQ ID NO 1). La séquence d'acides aminés, déduite de la séquence nucléotidique est présentée dans la figure 2 (SEQ ID NO 2). L'analyse du profil hydrophile de la séquence à l'aide de la méthode de Kyte et Doolittle est présentée en figure 3. Elle confirme l'existence de sept domaines transmembranaires hydrophobes ainsi que la présence du motif DRY dans le troisième domaine transmembranaire. Ces résultats attestent que la séquence d'acides nucléiques isolée code pour un nouveau récepteur couplé aux protéines G.

Exemple 2-Etude de l'expression tissulaire de l'ARNm codant le nouveau récepteur
Afin d'une part de vérifier que la séquence identifiée correspond effectivement à une séquence transcrite dans des conditions physiologiques normales et d'autre part de connaître les tissus dans lesquels la séquence est plus particulièrement transcrite, une

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analyse de l'expression tissulaire a été réalisée par RT-PCR et hybridation des produits amplifiés spécifiques.

Quatre microgrammes d'ARN totaux sont dénaturés pendant 10 minutes à 65 C puis immédiatement placés dans la glace. La réaction de réversion des ARNm en premier brin d'ADNc s'effectue dans un volume final de 17 fil durant lhl5 à 37 C en présence de tampon First Strand cDNA kit IX (Amersham Phannacia) supplémenté de 1 mM final de DTT, de 50 ng d'oligonucléotides dT et 25 ng de random primers selon le protocole décrit par le fournisseur. Cinq minutes à 65 C sont nécessaires pour inactiver l'enzyme.

Les réactions de PCR sont effectuées en présence d'un couple d'oligonucléotides situé en 5' (5'-GATTTGCTTGGGGTTAATGACGAGG-3') et 3' (5'CACGGTGAACTTGGTAGCATAGACC-3') de la séquence théorique obtenue (S7505).

Deux microlitres de la réaction de transcription inverse sont amplifiés avec l'enzyme Ampli Taq Gold kit (Perkin Elmer) dans un volume de 100 u. I en présence de tampon lx, de 0,2 mM de dNTP, de 0,2 M de chaque oligonucléotide, 10% v/v de DMSO et de 2,5 Unités de Taq polymérase. Le programme d'amplification est le suivant : une étape de dénaturation à 94 C pendant 9 min précède 30 cycles de dénaturation (1 min. à 94 C), d'hybridation (2 min. à 58 C) et d'élongation (2 min. à 72 C). La PCR se termine par une élongation finale de 8 min. à 72 C.

Les produits de PCR sont ensuite séparés par gel d'électrophorèse d'agarose (1%, poids/volume) et transférés sur membranes de nylon Hybon N+ (Amersham). Les membranes sont hybridées avec un oligonucléotide (5'GCTGACTTCTTGGTAGGTGTGACTG-3') marqué avec du adCTP 32p (3000 Ci/mmol, NEN). L'hybridation se prolonge à 42 C toute la nuit sous agitation. La membrane est ensuite soumise à 2 lavages en tampon SSC 2X/SDS 0, 1% à température ambiante, puis à 2 lavages à 42 C pendant 30 min et enfin à un lavage à 50 C pendant 30 min. Entourée de film plastique Saran Wrap, la membrane est mise en présence d'un film autoradiographique X-Omat (Kodak) et le film est révélé dans une développeuse Hyperprocessor (Amersham).

Les résultats présentés dans la figure 4 indiquent l'expression de l'ARN messager dans les différents tissus. Le récepteur codé par la séquence Seq 7505 de la figure 1 est

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principalement exprimé dans le coeur, les poumons, les intestins, le cerveau et en particulier l'hippocampe, la substance noire et l'amygdale.

Exemple 3-Vecteur recombinant et lignées cellulaires exprimant de façon stable la séquence codant un récepteur couplé aux protéines G selon l'invention
L'ADNc tel qu'isolé dans l'exemple 1 a été cloné dans le vecteur d'expression pcDNA3. 1 TOPO. Ce vecteur, nommé pS7505, comprend une origine de réplication bactérienne permettant de multiplier le plasmide recombinant pcDNA3-S7505 flag obtenu en grand nombre de copies. Le vecteur comprend en outre un gène de résistance à l'ampicilline pour la sélection des clones bactériens, un gène de résistance à la généticine (G418) permettant la sélection de clones de cellules eucaryotes ayant incorporés l'ADNc S7505 codant pour le récepteur couplé aux protéines G. Enfin, les séquences clonées dans le vecteur sont sous le contrôle du promoteur du CMV qui permet une expression forte du gène cloné dans la cellule hôte eucaryote.

Le plasmide recombinant décrit ci-dessus est introduit dans les cellules CHO-K1 (American type culture collection, CCL61) maintenues dans un milieu Ham-F12 avec 10% de sérum de veau foetal, 2mM de glutamine, 500 lU/ml de pénicilline et 500 1g/ml de streptomycine en utilisant la méthode de transfection à la lipofectamine comme décrit par le fournisseur (Life Technologies, France). Les clones exprimant le récepteur sont sélectionnés avec 500 1g/ml de G418 et testés pour l'expression du récepteur pS7505flag, par une technique d'immunofluorescence, en utilisant un anticorps IgG reconnaissant le peptide DYKDDDDK. Ces expériences permettent de confirmer l'expression du récepteur dans la cellule CHO-K1.

Exemple 4-Procédé de criblage par l'identification de molécule agoniste d'un récepteur couplé aux protéines G Mesure du calcium intracellulaire au FLIPR Les cellules CHO-K1 exprimant le produit du gène codé par la séquence de la figure 1 et la sous-unité a de la protéine G16 sont dissociées la veille de l'expérience et ensemencées

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(45000 cellules/puits) sous un volume de 100 tl/puits dans des plaques de culture 96 puits (costar) noires à fond clair.

Le jour de l'expérience, 100full de kit calcium (Molecular Devices), 2, 5mM final de probénécide et 10 mM final de tampon Hépès sont ajoutés dans chaque puits et les cellules sont incubées pendant 1 heure à 37 C. Les plaques de cellules sont ensuite placées dans un fluorimètre de type FLIPR (Fluorometric Imaging Plate Reader). L'expérience est réalisée à température ambiante. Le temps d'exposition (0,4 sec) et l'intensité du laser (15 à 18 ampères) sont ajustés afin d'obtenir des valeurs basales de fluorescence entre 5000 et 10000 unités. La mesure de la fluorescence est effectuée sur toute la plaque toutes les secondes pendant les 60 premières secondes puis toutes les 6 secondes pendant 1 minute.

Des ligands de différentes catégories, préalablement solubilisés et répartis à une concentration définie sur des plaques 96 puits, sont mis en contact avec les cellules.

L'addition des produits à tester s'effectue en cours d'expérience à 10 secondes grâce à un dispositif de distribution comprenant 96 cônes noirs (50 fll d'une solution [x5] sont ajoutés dans chaque puits à la vitesse de 70 J. l/sec et une hauteur de 200 Fil). La réponse calcique se caractérise par une augmentation transitoire de la fluorescence immédiatement après l'addition des ligands actifs. Des solutions d'ATP 10 pM et de tampon HBSS sont incluses dans chaque plaque de ligands et servent respectivement de contrôle positif et négatif de la réponse calcique.

Claims (46)

REVENDICATIONS 1. Séquence d'acides nucléiques codant un récepteur couplé aux protéines G, caractérisée par la séquence suivante (SEQ ID NO 1) : 5-ATGACCAGCAATTTTTCCCAACCTGTTGTGCAGCTTTGCTATGAGGATGTGAATGGAT CTTGTATTGAAACTCCCTATTCTCCTGGGTCCCGGGTAATTCTGTACACGGCGTTTAGCTT TGGGTCTTTGCTGGCTGTATTTGGAAATCTCTTAGTAATGACTTCTGTTCTTCATTTTAAG CAGCTGCACTCTCCAACCAATTTTCTCATTGCCTCTCTGGCCTGTGCTGACTTCTTGGTAG GTGTGACTGTGATGCTTTTCAGCATGGTCAGGACGGTGGAGAGCTGCTGGTATTTTGGAGC CAAATTTTGTACTCTTCACAGTTGCTGTGATGTGGCATTTTGTTACTCTTCTGTCCTCCAC TTGTGCTTCATCTGCATCGACAGGTACATTGTGGTTACTGATCCCCTGGTCTATGCTACCA AGTTCACCGTGTCTGTGTCGGGAATTTGCATCAGCGTGTCCTGGATTCTGCCTCTCACGTA CAGCGGTGCTGTGTTCTACACAGGTGTCAATGATGATGGGCTGGAGGAATTAGTAAGTGCT CTCAACTGCGTAGGTGGCTGTCAAATTATTGTAAGTCAAGGCTGGGTGTTGATAGATTTTC TGTTATTCTTCATACCTACCCTTGTTATGATAATTCTTTACAGTAAGATTTTTCTTATAGC TAAACAACAAGCTATAAAAATTGAAACTACTAGTAGCAAAGTAGAATCATCCTCAGAGAGT TATAAAATCAGAGTGGCCAAGAGAGAGAGGAAAGCAGCTAAAACCCTGGGGGTCACGGTAC TAGCATTTGTTATTTCATGGTTACCGTATACAGTTGATATATTAATTGATGCCTTTATGGG CTTCCTGACCCCTGCCTATATCTATGAAATTTGCTGTTGGAGTGCTTATTATAACTCAGCC ATGAATCCTTTGATTTATGCTCTATTTTATCCTTGGTTTAGGAAAGCCATAAAACTTATTT TAAGTGGAGATGTTTTAAAGGCTAGTTCATCAACCATTAGTTTATTTTTAGAATAAG-3' 2. Séquence d'acides nucléiques capable de s'hybrider dans des conditions stringentes avec la séquence de la revendication 1 et codant un polypeptide ayant essentiellement les mêmes propriétés que le récepteur codé par la séquence de la revendication 1. <Desc/Clms Page number 25> 3. Séquence d'acides nucléiques déduite selon le code génétique de la séquence d'acides aminés suivante (SEQ ID NO 2) :
1. 5 10 15 Met Thr Ser Asn Phe Ser Gln Pro Val Val Gln Leu Cys Tyr Glu
2. 20 25 30 Asp Val Asn Gly Ser Cys Ile Glu Thr Pro Tyr Ser Pro Gly Ser
3. 35 40 45 Arg Val Ile Leu Tyr Thr Ala Phe Ser Phe Gly Ser Leu Leu Ala
4. 50 55 60 Val Phe Gly Asn Leu Leu Val Met Thr Ser Val Leu His Phe Lys
5. 65 70 75 Gln Leu His Ser Pro Thr Asn Phe Leu Ile Ala Ser Leu Ala Cys
6. 80 85 90 Ala Asp Phe Leu Val Gly Val Thr Val Met Leu Phe Ser Met Val
7. 95 100 105 Arg Thr Val Glu Ser Cys Trp Tyr Phe Gly Ala Lys Phe Cys Thr
8. 110 115 120 Leu His Ser Cys Cys Asp Val Ala Phe Cys Tyr Ser Ser Val Leu
9. 125 130 135 His Leu Cys Phe Ile Cys Ile Asp Arg Tyr Ile Val Val Thr Asp
10. 140 145 150 Pro Leu Val Tyr Ala Thr Lys Phe Thr Val Ser Val Ser Gly Ile
11. 155 160 165 Cys Ile Ser Val Ser Trp Ile Leu Pro Leu Thr Tyr Ser Gly Ala
12. 170 175 180 Val Phe Tyr Thr Gly Val Asn Asp Asp Gly Leu Glu Glu Leu Val
13. 185 190 195 Ser Ala Leu Asn Cys Val Gly Gly Cys Gln Ile Ile Val Ser Gln
14. 200 205 210 Gly Trp Val Leu Ile Asp Phe Leu Leu Phe Phe Ile Pro Thr Leu

    <Desc/Clms Page number 26>
15. 215 220 225

    

    Val Met Ile Ile Leu Tyr Ser Lys Ile Phe Leu Ile Ala Lys Gln
16. 230 235 240 Gln Ala Ile Lys Ile Glu Thr Thr Ser Ser Lys Val Glu Ser Ser
17. 245 250 255 Ser Glu Ser Tyr Lys Ile Arg Val Ala Lys Arg Glu Arg Lys Ala
18. 260 265 270 Ala Lys Thr Leu Gly Val Thr Val Leu Ala Phe Val Ile Ser Trp
19. 275 280 285 Leu Pro Tyr Thr Val Asp Ile Leu Ile Asp Ala Phe Met Gly Phe
20. 290 295 300 Leu Thr Pro Ala Tyr Ile Tyr Glu Ile Cys Cys Trp Ser Ala Tyr
21. 305 310 315 Tyr Asn Ser Ala Met Asn Pro Leu Ile Tyr Ala Leu Phe Tyr Pro
22. 320 325 330 Trp Phe Arg Lys Ala Ile Lys Leu Ile Leu Ser Gly Asp Val Leu

    335
23. 340 Lys Ala Ser Ser Ser Thr Ile Ser Leu Phe Leu Glu *** 4. Séquence d'acides nucléiques anti-sens capable d'inhiber l'expression d'une séquence d'acides nucléiques selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle correspond à une séquence d'acides nucléiques simple brin, capable de s'hybrider dans des conditions stringentes au brin codant de la séquence d'acides nucléiques selon l'une des revendications 1 à 3.

    5. Vecteur recombinant caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'acides nucléiques selon l'une des revendications 1 à 3.

    6. Vecteur recombinant selon la revendication 5, caractérisé en ce que le vecteur est un plasmide comprenant les séquences nécessaires à l'expression du récepteur couplé aux protéines G dans une cellule hôte.

    <Desc/Clms Page number 27>

    7. Vecteur recombinant selon la revendication 6, caractérisé en ce que les séquences nécessaires à l'expression du récepteur couplé aux protéines G comprennent une séquence du promoteur du cytomégalovirus (CMV) ou une séquence du promoteur

    SV40.

    8. Plasmide pS7505 déposé à la CNCM le 13 juillet 2001 sous le n I-2701.

    9. Cellule hôte caractérisée en ce qu'elle est transformée par le vecteur recombinant selon l'une des revendications 5 à 8.

    10. Cellule hôte selon la revendication 9, caractérisée en ce que ladite cellule hôte est une bactérie.

    11. Cellule hôte selon la revendication 9, caractérisée en ce que ladite cellule hôte est une cellule eucaryote.

    12. Cellule hôte selon la revendication 11, caractérisée en ce que ladite cellule hôte provient d'une lignée CRO-K1 (American type culture collection, CCL61).

    13. Cellule hôte selon la revendication 12, caractérisée en ce que ladite cellule hôte exprime en plus la sous-unité a de la protéine G de manière stable ou transitoire.

    14. Polypeptide caractérisé en ce qu'il est codé par une séquence d'acides nucléiques selon l'une des revendications 1 à 3.

    15. Polypeptide selon la revendication 14 comportant la séquence d'acides aminés suivante (SEQ ID NO 2) :
24. 5 10 15 Met Thr Ser Asn Phe Ser Gln Pro Val Val Gln Leu Cys Tyr Glu
25. 20 25 30 Asp Val Asn Gly Ser Cys Ile Glu Thr Pro Tyr Ser Pro Gly Ser
26. 35 40 45 Arg Val Ile Leu Tyr Thr Ala Phe Ser Phe Gly Ser Leu Leu Ala
27. 50 55 60 Val Phe Gly Asn Leu Leu Val Met Thr Ser Val Leu His Phe Lys

    <Desc/Clms Page number 28>
28. 65 70 75 Gln Leu His Ser Pro Thr Asn Phe Leu Ile Ala Ser Leu Ala Cys
29. 80 85 90 Ala Asp Phe Leu Val Gly Val Thr Val Met Leu Phe Ser Met Val
30. 95 100 105 Arg Thr Val Glu Ser Cys Trp Tyr Phe Gly Ala Lys Phe Cys Thr
31. 110 115 120 Leu His Ser Cys Cys Asp Val Ala Phe Cys Tyr Ser Ser Val Leu
32. 125 130 135 His Leu Cys Phe Ile Cys Ile Asp Arg Tyr Ile Val Val Thr Asp
33. 140 145 150 Pro Leu Val Tyr Ala Thr Lys Phe Thr Val Ser Val Ser Gly Ile
34. 155 160 165 Cys Ile Ser Val Ser Trp Ile Leu Pro Leu Thr Tyr Ser Gly Ala
35. 170 175 180 Val Phe Tyr Thr Gly Val Asn Asp Asp Gly Leu Glu Glu Leu Val
36. 185 190 195 Ser Ala Leu Asn Cys Val Gly Gly Cys Gln Ile Ile Val Ser Gln
37. 200 205 210 Gly Trp Val Leu Ile Asp Phe Leu Leu Phe Phe Ile Pro Thr Leu
38. 215 220 225 Val Met Ile Ile Leu Tyr Ser Lys Ile Phe Leu Ile Ala Lys Gln
39. 230 235 240 Gln Ala Ile Lys Ile Glu Thr Thr Ser Ser Lys Val Glu Ser Ser
40. 245 250 255 Ser Glu Ser Tyr Lys Ile Arg Val Ala Lys Arg Glu Arg Lys Ala
41. 260 265 270 Ala Lys Thr Leu Gly Val Thr Val Leu Ala Phe Val Ile Ser Trp
42. 275 280 285 Leu Pro Tyr Thr Val Asp Ile Leu Ile Asp Ala Phe Met Gly Phe
43. 290 295 300 Leu Thr Pro Ala Tyr Ile Tyr Glu Ile Cys Cys Trp Ser Ala Tyr

    <Desc/Clms Page number 29>
44. 305 310 315 Tyr Asn Ser Ala Met Asn Pro Leu Ile Tyr Ala Leu Phe Tyr Pro
45. 320 325 330 Trp Phe Arg Lys Ala Ile Lys Leu Ile Leu Ser Gly Asp Val Leu
46. 335 340 Lys Ala Ser Ser Ser Thr Ile Ser Leu Phe Leu Glu *** 16. Polypeptide caractérisé en ce qu'il correspond à un fragment d'un polypeptide selon l'une des revendications 14 ou 15 et en ce qu'il présente une activité de récepteur couplé aux protéines G.

    17. Polypeptide caractérisé en ce qu'il correspond à un fragment d'un polypeptide selon l'une des revendications 14 ou 15, et en ce qu'il est capable de stimuler directement les protéines G.

    18. Polypeptide caractérisé en ce qu'il correspond à un fragment d'un polypeptide selon l'une des revendications 14 ou 15, et en ce qu'il est capable d'inhiber l'action d'un agoniste.

    19. Amorces pour l'amplification d'une séquence codant un polypeptide selon l'une des revendications 14 à 16, caractérisées en ce qu'elles comprennent les séquences suivantes :

    5'-ATGACCAGCAATTTTTCCCAACCTG-3'

    5'-TTCTAAAAATAAACTAATGGTTGATGAACTAGCC-3' 20. Sonde d'hybridation pour la reconnaissance spécifique des séquences d'acides nucléiques codant un récepteur couplé aux protéines G selon l'une des revendications 1 ou 3, caractérisée en ce qu'elle correspond à un fragment d'une longueur d'au moins 50 nucléotides, de préférence entre 150 et 250 nucléotides, d'une séquence d'acides nucléiques selon l'une des revendications 1 ou 3.

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    21. Anticorps caractérisé en ce qu'il est dirigé : - soit contre un polypeptide codé par une séquence d'acides nucléiques selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 ; soit contre un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 14 à 18.

    22. Anticorps selon la revendication 21, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un anticorps monoclonal.

    23. Procédé d'identification de la présence de molécules agonistes du récepteur couplé aux protéines G, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a. la culture de cellules hôtes eucaryotes transformées par un vecteur recombinant selon l'une des revendications 6,7 ou 8 ; b. la mise en contact des cellules hôte en culture avec un composé candidat ; c. la détermination d'un signal éventuel généré par le récepteur couplé aux protéines G en présence du composé candidat.

    24. Procédé de criblage d'un agoniste d'un récepteur couplé aux protéines G, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a. la culture de cellules hôte selon la revendication 13 en présence ou en absence d'une ou de plusieurs molécules à cribler ; b. la quantification de la concentration en calcium intracellulaire dans les cellules en culture en présence et en absence des molécules à cribler ; c. la sélection des molécules en présence desquelles la concentration en calcium intracellulaire est augmentée.

    25. Procédé d'identification de la présence de molécules antagonistes comprenant les étapes suivantes : a. la culture de cellules hôtes eucaryotes transformées par un vecteur recombinant selon l'une des revendications 5 à 8 dans des conditions permettant l'expression du récepteur couplé aux protéines G en présence d'un agoniste ;

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    b. la mise en contact des cellules hôtes en culture avec un composé candidat ; c. la détermination d'une diminution du signal éventuel généré par le récepteur couplé aux protéines G en présence du composé candidat et de l'agoniste par rapport au signal généré avec l'agoniste seul.

    26. Procédé d'identification de formes alléliques pathologiques d'un gène codant un récepteur couplé aux protéines G, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a. l'isolement d'une séquence d'acides nucléiques codant un récepteur couplé aux protéines G selon l'une des revendications 1 ou 3 à partir d'acides nucléiques totaux (ARN ou ADN) issus de patients atteints d'une pathologie et de sujets sains ; b. le séquençage des acides nucléiques isolés en a) ; c. la détection d'une ou plusieurs mutation (s) commune (s) aux acides nucléiques issus des patients atteints d'une pathologie, la ou lesdite (s) mutation (s) n'étant pas présente (s) sur les acides nucléiques issus des sujets sains.

    27. Procédé d'identification de séquences homologues de la séquence d'acides nucléiques selon la revendication 1 dans une autre espèce comprenant les étapes suivantes : a. l'incubation dans des conditions stringentes d'une sonde d'hybridation selon la revendication 20 avec de l'ADN génomique ou des extraits d'ARN totaux d'espèces de mammifère non-humain ; b. la détection d'une réaction d'hybridation ; c. l'isolement de la séquence d'acides nucléiques homologue à partir de l'ADN génomique des espèces pour lesquelles une réaction d'hybridation a été détectée.

    28. Utilisation d'une séquence d'acides nucléiques selon l'une des revendications 1 à 3 pour le criblage d'un agoniste d'un récepteur couplé à la protéine G.

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    29. Utilisation des cellules hôte selon la revendication 13 pour le criblage d'un agoniste d'un récepteur couplé aux protéines G.

    30. Kit pour le diagnostic, le pronostic ou le suivi thérapeutique de patients présentant, ou susceptibles de présenter, une pathologie liée à une surexpression ou une sous- expression de la séquence d'acides nucléiques selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comprend : soit des amorces selon la revendication 19 ; soit une sonde selon la revendication 20.

    31. Puce à ADN contenant des séquences selon l'une des revendications 1 à 3.

    32. Kit pour la détection d'une structure anormale du récepteur couplé aux protéines G, caractérisé en ce qu'il comprend :

    

    soit des anticorps selon l'une des revendications 21 ou 22 ; soit des polypeptides selon l'une des revendications 14 à 18. 33. Puce à protéine contenant un anticorps selon l'une des revendications 21 ou 22 ou un polypeptide selon l'une des revendications 14 à 18.