FR2823224A1 - Utilisation de genes oas impliques dans la sensibilite/resistance a l'infection par les flaviviridae pour le criblage de molecules antivirales - Google Patents
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Abstract
Molécules d'acide nucléique comprenant les gènes de la famille 2'-5'-oligoadénylate synthétase (OAS) codant pour des protéines impliquées dans la résistance à l'infection par les Flaviviridae, leurs utilisations à des fins diagnostiques ou thérapeutiques; utilisation des produits desdits gènes pour le criblage de molécules antivirales et, pour l'évaluation de la sensibilité à l'infection par les virus de la famille des Flaviviridae, chez l'homme.
Description
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MOLECULES D'ADN COMPRENANT LES GENES OAS, LEURS
APPLICATIONS ET UTILISATION DES PRODUITS DESDITS GENES
La présente invention est relative à des molécules d'acide nucléique comprenant les gènes de la famille 2'-5'-oligoadénylate synthétase (OAS) codant pour des protéines impliquées dans la résistance à l'infection par les Flaviviridae, leurs utilisations à des fins diagnostiques ou thérapeutiques ; la présente invention est éga- lement relative à l'utilisation des produits desdits gènes pour le criblage de molécules antivirales et, pour l'évaluation de la sensibilité à l'infection par les virus de la famille des Flaviviridae, chez l'homme.
APPLICATIONS ET UTILISATION DES PRODUITS DESDITS GENES
La présente invention est relative à des molécules d'acide nucléique comprenant les gènes de la famille 2'-5'-oligoadénylate synthétase (OAS) codant pour des protéines impliquées dans la résistance à l'infection par les Flaviviridae, leurs utilisations à des fins diagnostiques ou thérapeutiques ; la présente invention est éga- lement relative à l'utilisation des produits desdits gènes pour le criblage de molécules antivirales et, pour l'évaluation de la sensibilité à l'infection par les virus de la famille des Flaviviridae, chez l'homme.
La famille des Flaviviridae regroupe les virus du genre flavivirus responsables de pathologies humaines graves telles que la dengue, la fièvre jaune, les encéphalites transmises par les tiques, l'encéphalite japonaise, l'encéphalite à West Nile et les virus des hépatites C et G. Si les flavivirus sont susceptibles de provoquer une morbidité et une mortalité importantes chez l'homme, l'infection est généralement asymptomatique et seule une fraction des individus infectés développent une maladie grave.
Les flavivirus sont des petits virus enveloppés. Leur génome est une molécule d'ARN monocaténaire de polarité positive d'environ 11 000 bases. L'ARN génomique est associé à plusieurs copies de la protéine de capside C pour former la nucléocapside ; elle est entourée d'une enveloppe virale constituée d'une double couche lipidique issue des membranes du réticulum endoplasmique (RE) dans lesquelles sont ancrées la protéine d'enveloppe E et la protéine de membrane M. L'ARN génomique des flavivirus contient un unique cadre de lecture ouvert d'environ 10500 nucléotides flanqué de deux courtes régions non codantes à ses extrémités 5'et 3'. Le génome est traduit en une polyprotéine d'environ 3400 acides aminés qui est le précurseur des protéines structurales C, prM (le précurseur intracellulaire de M) et E dans sa partie Nterminale et d'au moins sept protéines non structurales (NS) de NS1 à NS5 dans sa partie C-terminale.
De nombreux facteurs semblent intervenir dans la réaction d'un sujet à une infection virale : des facteurs viraux pourraient être responsables de la sévérité de la maladie, alors que la constitution génétique de l'hôte (humain ou mammifère non-humain) contribuerait à la sensibilité ou à la résistance à l'infection.
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Des modèles murins ont permis d'établir l'existence d'une résistance génétique à l'infection par les flavivirus. Il a été montré que certaines lignées de souris récemment dérivées de l'état sauvage et appartenant aux espèces Mus musculus musculus ou Mus spretus (Det, BSVR, BRVR, PRI, CASA/Rk et CAST/Ei) sont résistantes à l'infection par les flavivirus, alors qùe les lignées consanguines de laboratoire les plus courantes qui dérivent majoritairement de l'espèce Mus musculus domesticus, n'y résistent pas (Sangster et al., J. Virol., 1993,67 : 340-347).
La résistance est contrôlée par au moins un locus autosomal dénommé Flv, localisé sur le chromosome 5, chez la souris et trois allèles Flv", Flv et Fl confèrent respectivement la sensibilité, la résistance et la résistance intermédiaire à l'infection par les flavivirus. En utilisant une souche du flavivirus de l'encéphalite de la Vallée de Murray et des souris issues du croisement retour de la lignée de souris résistante C3H/RV avec les lignées de souris sensibles C3/He ou BALB/c, le locus Flv a été localisé dans une région de 0,9 cM du chromosome 5, chez la souris, entre les marqueurs D5Mit68 et D5Mit242 (G. R. Shellam et al., Rev. Sci. Tech. Off. Epiz,
1998,17 : 231-248.).
1998,17 : 231-248.).
En dépit de l'existence de ces modèles murins de résistance génétique à l'infection par les flavivirus, aucun gène cellulaire de mammifères impliqué dans la résistance à l'infection par les Flaviviridae n'a encore été identifié, de manière certaine au niveau moléculaire. C'est pourquoi les Inventeurs se sont donnés pour but de pourvoir à des outils, aptes à permettre d'évaluer la sensibilité de l'hôte (humain ou mammifère non-humain) dans certaines infections virales particulièrement graves pour l'homme comme celles provoquées par les Flaviviridae.
En utilisant un modèle expérimental mettant en oeuvre une nouvelle souche neurovirulente et neuroinvasive du virus West Nile, particulièrement virulente et dénommée ci-après souche IS-98-ST1, et des lignées de souris résistantes dérivant de géniteurs sauvages appartenant à l'espèce Mus musculus musculus ou Mus spretus, croisées en retour avec les lignées sensibles de laboratoire BALB/c ou C57BL/6, les Inventeurs ont précisé la localisation du locus Flv dans un intervalle de 0,2 à 0,4 cM du chromosome 5 de souris, comprenant la famille des gènes 2'-5'oligoadénylate synthétase (OAS) et ils ont montré que c'est le gène OAS qui confère la résistance à l'infection par les Flaviviridae. Trois isoformes de l'OAS-L1, L2 et L3-ont été
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décrites chez la souris (Genbank Data Library n X55982 [Ll], X58077 [2] et M33863 [L3]). Leurs gènes présentent une forte homologie de séquence (plus de 80 %) (figure 1) avec celui de l'OAS p40/p46 humain (Genbank Data Library n XM-007004 et XM-007005) (figure 2). On ne dispose que de peu d'informations sur les formes LI, L2 et L3 de l'OAS murin.
Le système 2-5A qui implique la famille des gènes OAS et la RNase L participe à la défense de l'hôte contre une infection virale (Castelli et al., Biomed.
And Pharmacother., 1998,52, 386-390). Le système 2-5A est une voie de dégradation des ARNs intracellulaire (pour revue, Rutherford et al., N. A. R., 1991,9, 1917-1924).
L'expression des gènes OAS est induite par les interférons (IFN). Les IFNs appartiennent à un groupe de cytokines qui induisent un état anti-viral dans beaucoup de lignées cellulaires (Goodboum et al., J. Gene Virol., 2000,81, 2341-2364). Les deux isoformes ales composent les IFNs de type I : ils se fixent sur le même récepteur et provoquent des réponses similaires chez l'hôte. Les phagocytes mononucléés et les
fibroblastes sont respectivement les principaux producteurs d'IFN-a et d'IFN-P mais certains types cellulaires peuvent produire les deux isoformes. L'infection virale d'une cellule hôte induit la production de l'IFN alp qui par fixation sur les récepteurs kinases à tyrosine, présents à la surface cellulaire des cellules avoisinantes non infectées, va induire l'expression de plusieurs espèces protéiques qui seront déterminants dans les défenses anti-virales. Une perte de l'homéostasie calcique des cellules neuronales, notamment chez le rat, est aussi capable d'induire l'expression des gènes de la famille OAS (Paschen et al., Neuroscience Letters, 1999,263, 109-112). Il a aussi été montré que la protéine C du virus de l'hépatite C active le promoteur de l'OAS p40/p46 chez l'homme (Naganuma et al., J. Virol., 2000,74, 8744-8750).
fibroblastes sont respectivement les principaux producteurs d'IFN-a et d'IFN-P mais certains types cellulaires peuvent produire les deux isoformes. L'infection virale d'une cellule hôte induit la production de l'IFN alp qui par fixation sur les récepteurs kinases à tyrosine, présents à la surface cellulaire des cellules avoisinantes non infectées, va induire l'expression de plusieurs espèces protéiques qui seront déterminants dans les défenses anti-virales. Une perte de l'homéostasie calcique des cellules neuronales, notamment chez le rat, est aussi capable d'induire l'expression des gènes de la famille OAS (Paschen et al., Neuroscience Letters, 1999,263, 109-112). Il a aussi été montré que la protéine C du virus de l'hépatite C active le promoteur de l'OAS p40/p46 chez l'homme (Naganuma et al., J. Virol., 2000,74, 8744-8750).
La molécule OAS produite sous une forme latente devient active en interagissant avec une molécule d'ARN bicaténaire. L'OAS active va alors polymériser l'ATP en oligomères ppp [A2'p] nA [2-5A] qui vont interagir de façon allostérique avec la forme normalement latente de la RNase L (84 kda) pour l'activer. Le site catalytique de la RNase L est localisé dans sa région carboxy-terminale et des séquence répétées de type ankyrine, une région d'homologie aux protéines kinases et un domaine qui est prédit former un doigt de zinc sont aussi retrouvés. La ribonucléase active dégrade les ARN monocaténaires en les clivant au niveau des motifs riches en UA et UU.
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Au cours d'une infection virale, la RNase L clive les ARN cellulaires de types messagers et ribosomaux comme les ARN viraux monocaténaires, bloquant ainsi la progression du cycle réplicatif du virus. La RNase L joue aussi un rôle dans la régulation de l'expression des gènes des facteurs pro-apoptotiques tels que Bax et les caspases (Castelli et al, Cell Death and Differentiation, 1998,5, 313-320 ; Rush et al.,
J. Interferon Cytokine Res., 2000,20, 1091-1100).
J. Interferon Cytokine Res., 2000,20, 1091-1100).
Des facteurs capables de réguler la voie OAS ont été mis en évidence. Un inhibiteur de la RNase L murine a été identifié, RNase I. Cet inhibiteur a été montré moduler la répression du gène MyoD, un facteur de transcription spécifique aux cellules musculaires (Bisbal et al., Mol. Cell Biol., 2000,20, 4959-4969). La RNase I est aussi induite par le HIV de type 1 et participe ainsi à la diminution de la réponse antivirale de la cellule (Martinand et al., J. Virol., 1999,73, 290-296).
Trois domaines conservés ont été identifiés dans la 2'-5'-oligo- adénylate synthétase : une boucle P suivie d'une séquence riche en asparagine dénommée boîte D et une région riche en lysine et en arginine dénommée région KR.
Des mutants ponctuels de l'un de ces trois domaines de l'isoforme L1 murine (boucle P : : K67R, K67M, G62A et G63A ; boîte D : D76N et D78N ; domaine KR : K200R et K200M) ont une activité enzymatique très réduite ou complètement abolie (Yamamoto et al., J. Interferon Cytokine Res., 2000,20 : 337-344).
Les Inventeurs ont mis en évidence des mutations dans la séquence nucléotidique des gènes OAS chez les souris sensibles à l'infection par les Flaviviri- dae ; ces mutations inactivent le gène OAS.
Les mutations suivantes, liées à la sensibilité/résistance de l'hôte à l'infection par un Flaviviridae ont en particulier été mises en évidence : . délétions dans la séquence codante de l'isoforme L1 des souris sensibles C57BL6 (délétion des nucléotides 100 à 102,221-232 et 576-577 en référence à la séquence HOASI humaine ; figures 3A, 3B et 3C).
. introduction d'un codon stop prématuré (figure 3B), responsable de la production d'une protéine 2'-5'OAS tronquée inactive, délétée des résidus Cterminaux (252-364 en référence à la séquence hOAS1) (figure 4).
Au sens de la présente invention, on entend par mutation une substitution, une insertion ou une délétion d'au moins un nucléotide d'une région
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codante ou non-codante.
Ces éléments ont conduit les Inventeurs à mettre au point un modèle adapté au criblage de molécules aptes à stimuler spécifiquement l'activité des gènes OAS et/ou à la détection des sujets sensibles à une infection par les virus de la famille des Flaviviridae et de ce fait mauvais répondeurs à un traitement à l'interféron ; la mesure de l'activité 2'-5'OAS chez un individu ou un groupe d'individus représentatifs d'une population humaine permet d'évaluer le risque pour cet individu ou cette population à développer une forme grave de la maladie (forme aiguë mortelle pour les arboviroses ou forme chronique pour l'hépatite C).
En conséquence, la présente invention a pour objet un procédé de criblage de molécules aptes à stimuler un gène de la famille OAS, caractérisé en ce qu'il comprend : a) la mise en culture de cellules, issues d'un mammifère non-humain Flvr/FlvrouFlvr/Flvs b) l'induction de l'expression des gènes OAS par addition d'interféron a ou ss ou par un stress calcique, notamment par addition d'EGTA, c) la mise en contact desdites cellules avec la molécule à cribler, et d) la mesure de l'activité d'un gène OAS, par comparaison avec un échantillon témoin.
Ledit échantillon témoin est notamment constitué par des cellules de mammifères non-humain F/vTE.
Selon un mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, ledit
mammifère non humain Flv IFlv est de préférence une lignée de souris résistantes dérivant de géniteurs sauvages appartenant à l'espèce Mus musculus musculus, ou Mus spretus ; elles peuvent de manière encore plus préférée être croisées en retour avec des lignées murines sensibles de laboratoire telles que BALB/c ou C57BL/6, de façon à obtenir des lignées dites congéniques.
mammifère non humain Flv IFlv est de préférence une lignée de souris résistantes dérivant de géniteurs sauvages appartenant à l'espèce Mus musculus musculus, ou Mus spretus ; elles peuvent de manière encore plus préférée être croisées en retour avec des lignées murines sensibles de laboratoire telles que BALB/c ou C57BL/6, de façon à obtenir des lignées dites congéniques.
Ces lignées pourront être utilisées dans de multiples expériences destinées à analyser les mécanismes de défense de la souris contre les infections virales à flavivirus et notamment pour l'analyse de la physiopathogénie de l'infection au niveau cellulaire. Elles pourront aussi servir à la mise au point de thérapeutiques d'un genre nouveau, lorsque les expériences en question nécessiteront l'utilisation de
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lots homogènes d'animaux ayant tous la même constitution génétique, afin de comparer leur comportement après infection ou non. Ces animaux, qui par définition seront histocompatibles entre eux et avec l'autre congénique permettront de réaliser, si besoin est, des transferts cellulaires.
Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, ledit gène OAS est un gène autologue.
Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, ledit gène OAS est un gène hétérologue.
Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, l'activité du gène OAS peut-être mesurée par détermination :
- de la quantité de transcrits OAS par des techniques classiques qui en elles-mêmes sont connues de l'homme du métier (Northern-blot, RT-PCR...), - de la quantité de protéines 2'-5'OAS produites, par des techniques classiques qui en elles-mêmes sont connues de l'homme du métier (ELISA, RIA, radioimmunoprécipitation, Western-blot..), - du niveau d'activité 2'-5'OAS, par des techniques classiques qui en elles-mêmes sont connues de l'homme du métier, telles que celles décrites dans Witt et al., J. Interferon Res., 1993,13, 17-23 ou - des séquences des ARNm ou de l'ADN génomique, issues des gènes de la famille OAS : mise en évidence éventuelle de l'une des mutations précitées.
- de la quantité de transcrits OAS par des techniques classiques qui en elles-mêmes sont connues de l'homme du métier (Northern-blot, RT-PCR...), - de la quantité de protéines 2'-5'OAS produites, par des techniques classiques qui en elles-mêmes sont connues de l'homme du métier (ELISA, RIA, radioimmunoprécipitation, Western-blot..), - du niveau d'activité 2'-5'OAS, par des techniques classiques qui en elles-mêmes sont connues de l'homme du métier, telles que celles décrites dans Witt et al., J. Interferon Res., 1993,13, 17-23 ou - des séquences des ARNm ou de l'ADN génomique, issues des gènes de la famille OAS : mise en évidence éventuelle de l'une des mutations précitées.
La présente invention a également pour objet une molécule d'acide nucléique de mammifère (humain ou non-humain), caractérisée en ce qu'elle est constituée par une séquence d'ADN génomique de 0,2 à 0,4 cM correspondant à un locus de résistance à une infection par un Flaviviridae et en ce qu'elle inclut la famille des gènes OAS sélectionnés dans le groupe constitué par les gènes OAS sauvages et les gènes OAS mutés.
Dans le cas où les gènes OAS sont des gènes sauvages, lesdits individus sont résistants à l'infection par un Flaviviridae, dans le cas où les gènes OAS sont des gènes mutés, ils sont, de préférence, inactivés ; en conséquence, les individus porteurs desdites mutations sont sensibles à l'infection par lesdits virus.
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Selon un mode de réalisation avantageux de ladite molécule, elle comprend la séquence du marqueur D5Mit368 du chromosome 5 de souris.
La présente invention a également pour objet l'utilisation des molé- cules d'acides nucléiques sélectionnées dans le groupe constitué par les molécules d'acide nucléique telles que définies ci-dessus, les ADNc desdites molécules et les protéines codées par lesdites molécules pour le criblage de molécules antivirales destinées au traitement des infections par les virus de la famille des Flaviviridae.
Selon un mode de réalisation avantageux de ladite utilisation lesdites molécules sont, de préférence, des séquences d'ADN génomique des gènes de la famille OAS, les ADNc desdites séquences et les protéines correspondantes.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un vecteur recombinant comprenant une molécule d'acide nucléique telle que définie ci- dessus pour le criblage de molécules antivirales destinées au traitement des infections par les virus de la famille des Flaviviridae.
La présente invention a également pour objet l'utilisation de cellules contenant un vecteur recombinant comprenant une molécule d'acide nucléique telle que définie ci-dessus pour le criblage de molécules antivirales destinées au traitement des infections par les virus de la famille des Flaviviridae.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un mammifère non-humain recombinant comprenant une molécule d'acide nucléique telle que définie ci-dessus pour le criblage de molécules antivirales destinées au traitement des infections par les virus de la famille des Flaviviridae.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'une molécule apte à stimuler un gène de la famille OAS, directement obtenue par le procédé de criblage tel que défini ci-dessus, pour la préparation d'un médicament antiviral, destiné à la prévention et au traitement des infections par les Flaviviridae.
La présente invention a également pour objet une molécule d'acide nucléique constituée par un ADNc ou une séquence d'ADN génomique issue d'un gène de la famille OAS comme médicament destiné au traitement des infections par les virus de la famille des Flaviviridae.
La présente invention a également pour objet une protéine codée par un ADNc ou une séquence d'ADN génomique issue d'un gène de la famille OAS
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comme médicament destiné au traitement des infections par les virus de la famille des Flaviviridae.
La présente invention a également pour objet un procédé d'évaluation de la sensibilité d'un individu à l'infection par un virus de la famille des Flaviviridae et/ou de sa réponse à un traitement par l'interféron, caractérisé en ce qu'il comprend :
- le prélèvement d'un échantillon de cellules sur ledit individu, - la mise en culture desdites cellules, - l'induction de l'expression des gènes OAS par addition d'interféron a ou ou par un stress calcique, notamment par addition d'EGTA, et - la mesure de l'activité d'un des gènes OAS, par comparaison avec un échantillon de cellules, obtenues à partir d'un sujet témoin résistant à l'infection.
- le prélèvement d'un échantillon de cellules sur ledit individu, - la mise en culture desdites cellules, - l'induction de l'expression des gènes OAS par addition d'interféron a ou ou par un stress calcique, notamment par addition d'EGTA, et - la mesure de l'activité d'un des gènes OAS, par comparaison avec un échantillon de cellules, obtenues à partir d'un sujet témoin résistant à l'infection.
L'évaluation est notamment utile pour évaluer la réponse vaccinale, en vue de mettre au point des souches atténuées plus efficaces.
La présente invention a également pour objet des réactifs utiles pour mettre en oeuvre l'un des procédés tels que définis ci-dessus : criblage, évaluation ou détection.
Parmi ces réactifs, on peut citer : - les amorces de séquences SEQ ID NO : 5 à SEQ ID NO : 22 et - les sondes correspondant respectivement aux positions 257-707 du transcrit de l'isoforme L3 murine et aux positions 1379-1874 du transcrit de l'isoforme L2 murine (SEQ ID NO : 31-32).
L'activité du gène OAS peut-être mesurée par les techniques telles que définies ci-dessus.
La présente invention a également pour objet des cellules eucaryotes transformées, caractérisées en ce qu'elles comprennent une molécule d'acide nucléique de mammifère (humain ou non-humain), telle que définie ci-dessus.
Lesdites cellules sont, de préférence, obtenues par recombinaison homologue à l'aide d'un vecteur approprié, conformément à la technique décrite dans la demande EP 0 419 621 ou le brevet US 5,792 632.
La présente invention a, également pour objet des mammifères non-humains transgéniques, caractérisés en ce qu'ils incluent au moins une copie d'une
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molécule d'acide nucléique, telle que définie ci-dessus.
De manière préférée, lesdits mammifères, notamment des souris, sont obtenus par injection in ovo (technique classique de Brister et al. ) d'une molécule d'ADN selon l'invention contenant la région OAS provenant de souris sauvages., c'est-à-dire résistantes à l'infection.
La présente invention a également pour objet des mammifères nonhumains recombinants, caractérisés en ce qu'ils sont porteurs d'au moins un allèle du gène OAS inactivé.
On obtient par exemple des souris knock-out pour l'ensemble des gènes OAS, par délétion desdits gènes par la technique cre-LoxP (voir Demande WO 97/06271)
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre de l'objet de la présente invention, ave références aux dessins annexés dans lesquels : - la figure 1 illustre la structure de la famille des gènes OAS murins, - la figure 2 illustre la structure de la famille des gènes OAS humains - la figure 3 (A, B et C) représente l'alignement de la séquence nucléotidique de l'ADNc des gènes OAS des souris sensibles à l'infection par les Flaviviridae (C57BL/6) et du gène OAS1 humain,
- la figure 4 représente l'alignement de la séquence en acides aminés des isoformes LI, L2 et L3 de la 2'-5'OAS des souris sensibles à l'infection par les Flaviviridae (C57BL/6) et de l'isoforme p40/p46 humaine, - les figure 5A à 5E représentent la comparaison de la séquence en acides aminés des protéines virales de la souche IS-98-ST1 et de la souche New York 1999 (NY99 ; Genbank AF196835), - la figure 6 représente la cinétique de mortalité et la cinétique d'apparition des anticorps sériques spécifiques chez souris Flv7Flv' (BALB/c) infectées par la souche IS-98-ST1 du virus West Nile,
- la figure 7 représente la cinétique de propagation de la souche IS- 98-ST1 dans le système nerveux central des souris sensibles (BALB/c),
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre de l'objet de la présente invention, ave références aux dessins annexés dans lesquels : - la figure 1 illustre la structure de la famille des gènes OAS murins, - la figure 2 illustre la structure de la famille des gènes OAS humains - la figure 3 (A, B et C) représente l'alignement de la séquence nucléotidique de l'ADNc des gènes OAS des souris sensibles à l'infection par les Flaviviridae (C57BL/6) et du gène OAS1 humain,
- la figure 4 représente l'alignement de la séquence en acides aminés des isoformes LI, L2 et L3 de la 2'-5'OAS des souris sensibles à l'infection par les Flaviviridae (C57BL/6) et de l'isoforme p40/p46 humaine, - les figure 5A à 5E représentent la comparaison de la séquence en acides aminés des protéines virales de la souche IS-98-ST1 et de la souche New York 1999 (NY99 ; Genbank AF196835), - la figure 6 représente la cinétique de mortalité et la cinétique d'apparition des anticorps sériques spécifiques chez souris Flv7Flv' (BALB/c) infectées par la souche IS-98-ST1 du virus West Nile,
- la figure 7 représente la cinétique de propagation de la souche IS- 98-ST1 dans le système nerveux central des souris sensibles (BALB/c),
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- la figure 8 représente le protocole expérimental utilisé pour préciser la localisation du locus Flv sur le chromosome 5 de la souris et pour établir une lignée congénique BALB/c Flv,
- la figure 9 représente la carte génétique du locus Flv, déterminée à partir des souris sensibles, issues du premier croisement en retour entre les lignées résistantes (MAI/Pas et MBT/Pas) et les lignées sensibles (C57BL/6 ou BALB/c). Les cases blanches représentent les allèles BALB/c ou C57BI/6 et les cases noires représentent les allèles MAI/Pas ou MBT/Pas.
- la figure 9 représente la carte génétique du locus Flv, déterminée à partir des souris sensibles, issues du premier croisement en retour entre les lignées résistantes (MAI/Pas et MBT/Pas) et les lignées sensibles (C57BL/6 ou BALB/c). Les cases blanches représentent les allèles BALB/c ou C57BI/6 et les cases noires représentent les allèles MAI/Pas ou MBT/Pas.
- la figure 10 représente les haplotypes autour du locus Flv déterminant la sensibilité ou la résistance aux Flaviviridae, issus du premier croisement en retour (BC1) entre les lignées résistantes (MAI/Pas et MBT/Pas) et les lignées sensibles (C57BL/6 et BALB/c). Les lignes grisées représentent les allèles (BALB/c ou
C57B1/6) et les lignes noires représentent les allèles MAI/Pas ou MBT/Pas, - la figure 11 représente la carte génétique et la carte physique du locus Flv et la position du gène OAS dans ce locus, - la figure 12 représente la distribution des allèles Flv chez les souris résistantes et sensibles issues du premier croisement en retour (BC1) entre les lignées résistantes (MAI/Pas et MBT/Pas) et les lignées sensibles (C57BL/6 et BALB/c), - la figure 13 représente la carte physique du clone BAC RP23- 39mil8 de souris sensibles (C57BL/6) sur laquelle figure la position des marqueurs de type microsatellite et STS ainsi que la position des gènes OAS murins.
C57B1/6) et les lignes noires représentent les allèles MAI/Pas ou MBT/Pas, - la figure 11 représente la carte génétique et la carte physique du locus Flv et la position du gène OAS dans ce locus, - la figure 12 représente la distribution des allèles Flv chez les souris résistantes et sensibles issues du premier croisement en retour (BC1) entre les lignées résistantes (MAI/Pas et MBT/Pas) et les lignées sensibles (C57BL/6 et BALB/c), - la figure 13 représente la carte physique du clone BAC RP23- 39mil8 de souris sensibles (C57BL/6) sur laquelle figure la position des marqueurs de type microsatellite et STS ainsi que la position des gènes OAS murins.
- la figure 14 représente la cinétique d'apparition des antigènes viraux dans les cellules Neuro 2a et les neurones primaires de souris sensibles (BALB/c) infectées par le virus West Nile (souche IS-98-ST1).
- la figure 15 représente la mort par nécrose des cellules Neuro 2a infectées par le virus West Nile (souche IS-98-STI).
- la figure 16 représente l'activité antivirale de l'IFN-a sur les cellules Neuro 2a infectées par la souche IS-98-STI du virus West Nile.
- la figure 17 représente les amorces utilisées pour la détection des mutations dans les séquences codantes de l'isoforme L1 des gènes OAS des souris sensibles C57BL6.
Exemple 1 : Matériels et méthodes
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1) Souris mises en oeuvre - lignées de souris consanguines sensibles FlvlFlv' C57BL6 et BALB/c (Janvier).
- lignées de souris résistantes (F//F/v), dérivées de souris sauvages appartenant à l'espèce Mus musculus musculus, MAI/Pas (capturées en Autriche dans la région d'Illmitz) et MBT/Pas (capturées en Bulgarie dans la région de Général Toshevo), Mus spretus (SEG/Pas et STF/Pas) et Mus musculus domestics (WMP/Pas) (F. Bonhomme et al., 1996, The laboratory mouse and its wild relatives, Genetics variants and strains of the laboratory mouse , S. R. M. F. Lyon, S. D. M.
Brown, Oxford University Press, Oxford, 1577-1596).
2) Virus a) isolement, amplification, purification et titration
Le virus West Nile (WN) a été obtenu à partir du système nerveux central d'une cigogne manifestant des troubles neuropathologiques sévères en septembre 1998, à Eilat (Israël). L'infection de cellule VERO par cet isolat est cytolytique et l'immunofluorescence indirecte avec un ascite de souris immun spécifique du virus West Nile est positive à 100 %. Le virus produit sur cellules VERO a été récolté et amplifié sur cellules de moustiques AP61 Desprès et al., Virology, 1993, 196,209-219).
Le virus West Nile (WN) a été obtenu à partir du système nerveux central d'une cigogne manifestant des troubles neuropathologiques sévères en septembre 1998, à Eilat (Israël). L'infection de cellule VERO par cet isolat est cytolytique et l'immunofluorescence indirecte avec un ascite de souris immun spécifique du virus West Nile est positive à 100 %. Le virus produit sur cellules VERO a été récolté et amplifié sur cellules de moustiques AP61 Desprès et al., Virology, 1993, 196,209-219).
Le passage 1 (ou PI) du virus WN sur cellules AP61 a été récolté 3 jours après l'infection ; il possède un titre de 2,5 x 108 UFF/ml (Unité Formant Foyer) par la technique de titration sur cellules AP61 décrite dans Desprès et al. (Virology, 1993,196, 209-219). L'inoculum P1 du virus WN sur cellules AP61 a été identifié comme la souche IS-98-ST1.
Un P2 a été obtenu, à partir de cellules AP61 infectées par la souche IS-98-ST1, P1 (titre : 6 x 107 UFF/ml). L'inoculum P2 de IS-98-ST1 est utilisé pour les épreuves de sensibilité à l'infection virale chez les souris adultes.
Un inoculum viral P3 de la souche IS-98-ST1 avec un titre de 5 x 107 UFF/ml a été produit sur cellules AP61. Une préparation virale hautement purifiée, obtenue selon le protocole de purification des flavivirions décrit dans Desprès et al. (Virology, 1993,196, 209-219) a été obtenue à partir de 20 boites de 150 cm2 de cellules AP61 récoltées 3 jours après l'infection par l'inoculum P3 du virus WN
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souche IS-98-ST1 (multiplicité d'infection de 0,4). La souche IS-98-STI purifiée en gradient de saccharose a un titre final de 2 x 10' UFF/mI.
Les ARNs extraits de ce virus purifié sont utilisés pour amplifier les
ADNc correspondant aux protéines virales C, prM et NS 1. b) Séquençage de l'ARN viral
Le génome viral a été extrait à partir du surnageant de culture des cellules VERO infectées de l'exemple 1 à l'aide du kit"QIAamp Viral RNA" (QIAGEN), en suivant les instructions du fabricant. 6 produits RT-PCR chevauchants ont été amplifiés à partir de ces ARNs en utilisant les amorces décrites par Lanciotti et al. (Science, 199,286 : 2333-). Les extrémités 5'et 3'du génome viral ont été amplifiées à l'aide d'amorces synthétisées d'après la séquence de la souche WN-NY99 (Genbank n AF202541). Les ADNc obtenus ont été purifiés par chromatographie échangeuse d'ions et précipités dans 2 volumes d'isopropanol. Ensuite les ADNc ont été séquencés sur les deux brins en utilisant le kit"Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing" (PERKIN ELMER CORP./APPLIED BIOSYSTEM) et les amorces espacées de 400 paires de bases sur le génome viral (Lanciotti et al., précité). Le séquençage a été réalisé avec 0,2 pmoles d'ADNc purifié et 30 pmoles d'amorces, en suivant le protocole recommandé par le fabricant. L'alignement des séquences est réalisé à l'aide du logiciel CLUSTAL W.
ADNc correspondant aux protéines virales C, prM et NS 1. b) Séquençage de l'ARN viral
Le génome viral a été extrait à partir du surnageant de culture des cellules VERO infectées de l'exemple 1 à l'aide du kit"QIAamp Viral RNA" (QIAGEN), en suivant les instructions du fabricant. 6 produits RT-PCR chevauchants ont été amplifiés à partir de ces ARNs en utilisant les amorces décrites par Lanciotti et al. (Science, 199,286 : 2333-). Les extrémités 5'et 3'du génome viral ont été amplifiées à l'aide d'amorces synthétisées d'après la séquence de la souche WN-NY99 (Genbank n AF202541). Les ADNc obtenus ont été purifiés par chromatographie échangeuse d'ions et précipités dans 2 volumes d'isopropanol. Ensuite les ADNc ont été séquencés sur les deux brins en utilisant le kit"Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing" (PERKIN ELMER CORP./APPLIED BIOSYSTEM) et les amorces espacées de 400 paires de bases sur le génome viral (Lanciotti et al., précité). Le séquençage a été réalisé avec 0,2 pmoles d'ADNc purifié et 30 pmoles d'amorces, en suivant le protocole recommandé par le fabricant. L'alignement des séquences est réalisé à l'aide du logiciel CLUSTAL W.
La séquence génomique complète de la souche IS-98-ST1 du virus West Nile correspond à la séquence SEQ ID NO : 1.
L'alignement des séquences en acides aminés de la souche IS-98ST1 et de la souche NY99, présentée à la figure 5, montre que la souche IS-98-ST1 isolée en Israël en 1998 et la souche NY-99 isolée à New York en 1999 sont très proches (divergence de moins de 0,2% au niveau des séquences en acides aminés).
Cependant, les différences observées dans la souche IS-98-ST1, respectivement dans les protéines E (A51), NS1 (N17), NS2A (R, 4), NS2B (G82, E83), NS3 (P Ej) et NS5 (S54, N280, Am) sont potentiellement responsables de la neurovirulence et des propriétés neuroinvasives observées avec cette souche et peuvent servir de marqueur de virulence du virus West Nile.
3) Cellules
Des neurones primaires, des cellules endothéliales et des astrocytes
Des neurones primaires, des cellules endothéliales et des astrocytes
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du système nerveux central de souris sensibles homozygotes pour l'allèle FI" [Swiss ou BALB/c (Janvier et de souris résistantes homozygotes ou hétérozygotes pour l'allèle Fla'sont isolés d'embryons de 14 jours. Les neurones primaires sont mis en culture en milieu Neuobasal (Gibco BRL) supplémenté avec 20% de facteur de diffé- renciation B27,20 mM de glutamine et 40 mg/1 de gentamycine comme antibiotique.
Des cellules de neuroblastome murin Neuro 2a (104 cellules/cm2) sont cultivées en Labtek à 8 chambres (Nunc) en milieu MEM (GIBCO BRL) supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal (EUROBIO) et 1% d'acides aminés non essentiels (GIBCO BRL).
Des cellules d'hépatome humain HepG2 (ATCC n HB8065) sont cultivées dans les conditions classiques telles que décrites dans Marianneau et al., J
Virol., 1996,77, 2547-2554.
Virol., 1996,77, 2547-2554.
4) Produits
L'interféron a (INFaA/D) est fourni par la société Biosource (PHC4044) et l'EGTA par SIGMA.
L'interféron a (INFaA/D) est fourni par la société Biosource (PHC4044) et l'EGTA par SIGMA.
Exemple 2 : Les souris de lignées sauvages et de lignées consanguines de laboratoire se différencient par leur sensibilité à l'infection par la souche neuroinvasive IS-98-ST1 du virus West Nile.
1) Les lignées de souris sensibles.
Des souris BALB/c âgées de 6 semaines sont inoculées par la voie intrapéritonéale avec 100 UFF de la souche IS-98-ST1 virus West Nile (UFF : DL50 =
10), préparée comme décrit à l'exemple 1.
10), préparée comme décrit à l'exemple 1.
Ces souris meurent à 100% avec un temps moyen de mortalité de 9 2 jours (figure 6).
La cinétique de propagation de la souche IS-98-ST1 dans le système nerveux central de la souris sensible (BALB/c) a été analysée à partir des extraits de cerveau des souris infectés titrés sur cellules AP61, selon la technique décrite dans Després et al. (J. Virol., 1998,72, 823-829), précité. Les résultats montrent que le virus est détecté dans le système nerveux central (SNC) murin au Sème jour de l'infection et la production virale est maximale au 7ème jour (Figure 7). Au 9" jour de l'infection, le virus n'est plus détecté dans le SNC murin (Figure 7).
La réplication du virus WN dans le SNC et les organes périphériques
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des souris infectées par la souche IS-98-STI est également détectée par immuno- histologie, selon les protocoles classiques tels que décrits dans Després et al., 1998 (précité) et par hybridation in situ, selon les protocoles décrits à l'exemple 1.
Les anticorps sériques spécifiquement dirigés contre les protéines du virus WN sont titrés par ELISA selon le protocole décrit dans Després et al., 1993 (précité), en utilisant la souche IS-98-ST1 purifié sur gradient de saccharose telle que décrite à l'exemple 1, comme antigène. Les résultats montrent que les anticorps sériques apparaissent au Sème jour de l'infection et sont significativement détectés au 7 jour (figure 6).
2) Les souris de lignées résistantes.
Les souris des lignées SEG, WMP, STF et MAI qui dérivent de souris sauvages sont inoculées par la voie intrapéritonéale, avec 1000 UFF (100 DL50) de la souche IS-98-ST1 préparée selon le protocole décrit à l'exemple 1.
Contrairement aux souris de laboratoire qui sont sensibles à l'infection par la souche IS-98-ST1 et meurent en une dizaine de jours, ces souris dérivant de souris sauvages sont résistantes à l'inoculation de la souche IS-98-ST1 et néanmoins permissives à la réplication de la souche IS-98-ST1. En effet, l'infection virale des souris dérivant de souris sauvages est asymptomatique bien que le virus se multiplie in toto comme le démontre la production d'anticorps sériques anti-WN à hauts titres ; en ELISA, les titres des sérums à la dilution 1 : 100 pour 106 UFF de virion purifié IS-98-ST1 sont supérieurs à 1 unité de D. O. à 450 nm.
Les souris résistantes à l'infection virale sont utilisées pour la production de sérums immuns spécifiquement dirigés contre les protéines de la souche IS-98-ST1 du virus WN. Trois semaines après inoculation du virus WN, les sérums prélevés de souris résistantes (0,045 ml par souris) sont mélangés, décomplémentés 30 min à 56 C puis dilués au 1 : 10 dans du DPBS* (V/v) supplémenté avec 0,2% ('/,) de Sérum Albumine bovine (Life Technologies) et 0,05% (P/v) d'azide de sodium. Les sérums dilués sont répartis en 0,2 ml et conservés à-20 C. Les sérums immuns dirigés contre la souche IS-98-ST1 sont utilisés aux dilutions finales de 1 : 500 pour l'immunofluorescence indirecte et au 1 : 1000 pour l'immunoprécipitation des protéines virales radiomarquées.
Exemple 3 : Localisation du locus Flv dans une région de 0,2 à 0,4 cM du
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chromosome 5 de souris contenant le gène OAS.
1) Méthodes a) Modèle d'analyse de la résistance à l'infection par les Flaviviri- dae (figure 8)
Des souris mâles des lignées résistantes MAI/Pas et MBT/Pas sont croisées avec des souris femelles des lignées sensibles C57BL/6 et BALB/c. Les souris mâles de la génération FI sont croisées en retour avec des souris femelles des lignées résistantes C57BL/6 et BALB/c pour donner une génération de souris de premier de premier croisement en retour (BC1).
Des souris mâles des lignées résistantes MAI/Pas et MBT/Pas sont croisées avec des souris femelles des lignées sensibles C57BL/6 et BALB/c. Les souris mâles de la génération FI sont croisées en retour avec des souris femelles des lignées résistantes C57BL/6 et BALB/c pour donner une génération de souris de premier de premier croisement en retour (BC1).
Des souris BC1 âgées de 5 semaines sont inoculées par voie intrapéritonéale avec la souche IS-98-STI, préparée selon le protocole décrit à l'exemple 1, dans les conditions décrites à l'exemple 2.
Les animaux sont observés tous les jours et les taux de mortalité et de survie sont déterminés 14 jours après l'infection. b) sénotypaze des allèles Flv
Les allèles Flv des individus BC1 ont été cartographiés par PCR génomique à l'aide d'amorces spécifiques de 16 microsatellites du chromosome 5
(Catalogue Research Genetics) entourant le locus Fiv (figures 9-11), selon les techniques courantes de biologie moléculaire en utilisant les protocoles standards tels que ceux décrits dans Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M.
Les allèles Flv des individus BC1 ont été cartographiés par PCR génomique à l'aide d'amorces spécifiques de 16 microsatellites du chromosome 5
(Catalogue Research Genetics) entourant le locus Fiv (figures 9-11), selon les techniques courantes de biologie moléculaire en utilisant les protocoles standards tels que ceux décrits dans Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M.
AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA).
2) Résultats
L'analyse de la distribution des allèles Flv chez les souris BC1 sensibles et résistantes à l'infection par la souche IS-98ST1 montre qu'un allèle Flvr est suffisant pour conférer la résistance à l'infection (figure 12). Les résultats montrent également que dans ce modèle il existe une corrélation parfaite entre le phénotype
résistant et la présence de l'allèle FI) ! et une corrélation presque parfaite entre le phénotype sensible et l'absence de l'allèle Flv' (figure 12).
L'analyse de la distribution des allèles Flv chez les souris BC1 sensibles et résistantes à l'infection par la souche IS-98ST1 montre qu'un allèle Flvr est suffisant pour conférer la résistance à l'infection (figure 12). Les résultats montrent également que dans ce modèle il existe une corrélation parfaite entre le phénotype
résistant et la présence de l'allèle FI) ! et une corrélation presque parfaite entre le phénotype sensible et l'absence de l'allèle Flv' (figure 12).
Le génotypage des allèles Flv montre que le locus FLv est localisé dans une région de 0, 2 à 0, 4 cM contenant le gène OAS 1 (figures 9-11). Exemple 4 : Les souris sensibles à l'infection par les Flaviridae possèdent un gène OAS muté.
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1) Méthodes
La séquence génomique du gène OAS des souris sensibles (C57BL/6) a été déterminée à partir de la séquence du clone BAC RP23-39M18 (figure 11) selon les techniques courantes de biologie moléculaire en utilisant les protocoles standards tels que ceux décrits dans Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA).
La séquence génomique du gène OAS des souris sensibles (C57BL/6) a été déterminée à partir de la séquence du clone BAC RP23-39M18 (figure 11) selon les techniques courantes de biologie moléculaire en utilisant les protocoles standards tels que ceux décrits dans Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA).
Les ADNc de l'isoforme L1 du gène OAS murin ont été amplifiés par RT-PCR (kit Titan One Tube RT-PCR ; Roche Biochemical no 1939 823) et séquencés par la technique de séquençage automatique (Automat) à l'aide des amorces suivantes (voir figure 17) :
Exon 1
F1 (SEQ ID NO : 9) et R1 (SEQ ID NO : 10) : produit d'amplification de 258 pb
F1 (SEQ ID NO : 9) et R2 (SEQ ID NO : 11) : produit d'amplification de 396 pb
Exon 2
F2 (SEQ ID NO : 12) et R3 (SEQ ID NO : 13) : produit d'amplification de 297 pb
F2 (SEQ ID NO : 12) et R4 (SEQ ID NO : 14) : produit d'amplification de 515 pb
Exon 3
F3 (SEQ ID NO : 15) et R5 (SEQ ID NO : 16) : produit d'amplification de 288 pb
F3 (SEQ ID NO : 15) et R6 (SEQ ID NO : 17) : produit d'amplification de 501 pb
F4 (SEQ ID NO : 18) et R5 (SEQ ID NO : 16) : produit d'amplification de 112 pb
F4 (SEQ ID NO : 18) et R6 (SEQ ID NO : 17) : produit d'amplification de 325 pb
Exon 4
Exon 1
F1 (SEQ ID NO : 9) et R1 (SEQ ID NO : 10) : produit d'amplification de 258 pb
F1 (SEQ ID NO : 9) et R2 (SEQ ID NO : 11) : produit d'amplification de 396 pb
Exon 2
F2 (SEQ ID NO : 12) et R3 (SEQ ID NO : 13) : produit d'amplification de 297 pb
F2 (SEQ ID NO : 12) et R4 (SEQ ID NO : 14) : produit d'amplification de 515 pb
Exon 3
F3 (SEQ ID NO : 15) et R5 (SEQ ID NO : 16) : produit d'amplification de 288 pb
F3 (SEQ ID NO : 15) et R6 (SEQ ID NO : 17) : produit d'amplification de 501 pb
F4 (SEQ ID NO : 18) et R5 (SEQ ID NO : 16) : produit d'amplification de 112 pb
F4 (SEQ ID NO : 18) et R6 (SEQ ID NO : 17) : produit d'amplification de 325 pb
Exon 4
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F5 (SEQ ID NO : 19) et R7 (SEQ ID NO : 20) : produit d'amplification de 244 pb
F5 (SEQ ID NO : 19) et R8 (SEQ ID NO : 21) : produit d'amplification de 418 pb
F6 (SEQ ID NO : 22) et R7 (SEQ ID NO : 20) : produit d'amplification de 156 pb
F6 (SEQ ID NO : 22) et R8 (SEQ ID NO : 21) : produit d'amplification de 340 pb
2) Résultats
L'alignement de la séquence de l'ADNc des isoformes L1, L2 et L3 du gène OAS des souris sensibles (C57BL/6) avec la séquence de l'ADNc de l'isoforme L1 humaine (figure 3A, 3B et 3C) montre que l'isoforme L1 des souris sensibles possède 3 délétions (nucléotides 100 à 102,221-232 ; 576-577) et un codon stop prématuré en phase, situé en position (807-809).
F5 (SEQ ID NO : 19) et R8 (SEQ ID NO : 21) : produit d'amplification de 418 pb
F6 (SEQ ID NO : 22) et R7 (SEQ ID NO : 20) : produit d'amplification de 156 pb
F6 (SEQ ID NO : 22) et R8 (SEQ ID NO : 21) : produit d'amplification de 340 pb
2) Résultats
L'alignement de la séquence de l'ADNc des isoformes L1, L2 et L3 du gène OAS des souris sensibles (C57BL/6) avec la séquence de l'ADNc de l'isoforme L1 humaine (figure 3A, 3B et 3C) montre que l'isoforme L1 des souris sensibles possède 3 délétions (nucléotides 100 à 102,221-232 ; 576-577) et un codon stop prématuré en phase, situé en position (807-809).
L'alignement des séquences en acides aminés des isoformes des isoformes LI, L2 et L3 du gène OAS des souris sensibles (C57BL/6) avec la séquence de l'isoforme LI humaine (figure 4) montre que l'isoforme LI des souris sensibles correspond à une isoforme L1 tronquée de la région C-terminale, laquelle région Cterminale comprend la séquence conservée RPVILDPADPT qui est impliquée dans l'activité enzymatique de la 2'-5'OAS. De plus, l'isoforme LI des souris C57BL/6 ne possède pas les 4 premiers acides aminés GSSG du domaine GSSGKGTTLRGRSDADLVVF qui sont impliqués dans l'activité enzymatique de la 2'-5'OAS.
Exemple 5 : Modèle cellulaire d'étude de l'activité des gènes OAS .
1) Infection de cultures primaires et de lignées cellulaires par la souche IS-98-ST1 du virus West Nile a) Matériels et méthodes al) cultures. pnmaires Des neurones primaires et des astrocytes du SNC de souris sensibles homozygotes pour l'allèle Flv (souris Swiss, Janvier) sont préparés selon les proto- coles classiques tels que décrits à l'exemple 1. Les cellules sont infectées par la souche IS-98-ST1 à une multiplicité d'infection de 20 UFF par cellule (m. i. de 20). L'effet
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cytopathique est observé en microscopie optique, la production virale est analysée par titration sur cellules AP61 comme décrit précédemment à l'exemple 1 et l'expression des antigènes viraux est analysée par radioimmunoprécipitation à l'aide d'un sérum immun de souris anti-West Nile, selon les protocoles classiques tels que décrits dans Duarte Dos Santos et al. (Virology, 2000,274, 292-308).
Les résultats montrent que 80% des neurones en culture produisent les antigènes viraux : - leur profil en gel de polyacrylamide-SDS est présenté à la figure 14A.
- la production virale est de [3, 0 : 1, 5] x 106 UFF/ml après 20 h d'infection et de [7, 0 0, 5] x 107UFF/ml à 40 h.
- les effets cytopathiques (ECPs) de type nécrotique sont observés après 48 h d'infection virale.
En revanche, les astrocytes du SNC murin ne sont pas permissifs à la réplication du virus WN souche IS-98-ST1.
a) li. gnees. cellulaires
Des cellules de neuroblastome murin Neuro 2a et des cellules d'hépatome humain HepG2, cultivées dans les conditions classiques telles que décrites dans Duarte Dos Santos et al. (précité) sont infectées à différentes multiplicité d'infection par le virus WN souche IS-98-ST1, préparé comme décrit à l'exemple 1.
a) li. gnees. cellulaires
Des cellules de neuroblastome murin Neuro 2a et des cellules d'hépatome humain HepG2, cultivées dans les conditions classiques telles que décrites dans Duarte Dos Santos et al. (précité) sont infectées à différentes multiplicité d'infection par le virus WN souche IS-98-ST1, préparé comme décrit à l'exemple 1.
L'effet cytopathique est observé en microscopie optique, la production virale est analysée par titration sur cellules AP61 comme décrit précédemment à l'exemple 1 et l'expression des antigènes viraux est analysée par radioimmunoprécipitation à l'aide d'un sérum immun de souris anti-West Nile, selon les protocoles classiques tels que décrits dans Duarte Dos Santos et al., précité.
Les résultats montrent que les cellules de neuroblastome murin Neuro 2a sont permissives à la réplication de la souche IS-98-ST1 du virus WN. Une m. i. de 4 est nécessaire pour infecter 80% des cellules Neuro 2a en monocouche. La production virale est de 107 UFF/ml (m. i. de 4) après 40 h d'infection et la mort cellulaire par nécrose est massive (Figure 15). La cinétique de production des antigènes majeurs prM, E et NS 1 à partir de la polyprotéine virale présentée dans la figure 4B. montre que le demi-temps de formation de la glycoprotéine d'enveloppe E est
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d'environ 30 min. La protéine E de la souche IS-98-ST1 semble ne posséder qu'un seul résidu N-glycanne (figure 14C).
Les résultats montrent également que les cellules d'hépatome humain HepG2 sont permissives à la réplication de la souche IS-98-ST1 du virus WN. A une m. i. de 10, la production virale est de [2 : 1] x 10UFF/ml après 48 h d'infection et les ECPs sont observés à partir de 72 h.
2) Analyse de l'effet de l'EGTA et de L'INFRA sur la réplication du virus West Nile et détection de l'activité des gènes OAS a) Matériels et cellules :
L'interféron alpha (INFa A/D) est fourni par la société Biosource (PHC4044) et l'agent chélateur EGTA par Sigma..
L'interféron alpha (INFa A/D) est fourni par la société Biosource (PHC4044) et l'agent chélateur EGTA par Sigma..
Les cellules Neuro 2a sont cultivées en MEM supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal (SVF ; Eurobio) et 1% d'acides aminés non essentiels (Gibco BRL). Les neurones primaires isolés d'embryons de 14 jours de souris BALB/c sont mis en culture en milieu Neurobasal (Gibco BRL) supplémenté avec 20% de facteur de différenciation B27,20 mM de glutamine et de la gentamycine comme antibiotique. b) Protocoles d'infection et de traitement des cellules neuronales par l'INF-a et l'EGTA : - Infection par la souche IS-98-ST1 du virus WN :
Les cellules Neuro 2a (104 cellules/cm2) cultivées en Labtek à 8 chambres (Nunc) sont infectées avec la souche virale avec une multiplicité d'infection
de 4 (cycle unique de réplication) ou 0, 1 (cycle réplicatifbiphasique) Unités Formant Foyer (UFF ; titre viral obtenu sur cellules de moustiques AP61) par cellule dans du MEM supplémenté avec 0, 2% de sérum albumine pendant 90 min à 37Oc. Les cellules infectées sont incubées avec du MEM à 2% SVF.
Les cellules Neuro 2a (104 cellules/cm2) cultivées en Labtek à 8 chambres (Nunc) sont infectées avec la souche virale avec une multiplicité d'infection
de 4 (cycle unique de réplication) ou 0, 1 (cycle réplicatifbiphasique) Unités Formant Foyer (UFF ; titre viral obtenu sur cellules de moustiques AP61) par cellule dans du MEM supplémenté avec 0, 2% de sérum albumine pendant 90 min à 37Oc. Les cellules infectées sont incubées avec du MEM à 2% SVF.
Les neurones primaires de souris BALB/c (# 2,5 105 cellules/cm2) déposés sur Labtek à 8 chambres (Nunc) sont infectés avec la souche virale avec une multiplicité d'infection de 20 UFF par cellule dans du milieu Neuobasal avec 2% SFV pendant 90 min à 37OC. Les cellules infectées sont incubées avec du milieu Neuobasal
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avec 2% SFV et 20% B27.
- Traitement des cellules infectées par l'INF-a
Les tapis cellulaires sont lavés 3 fois avec du milieu non supplé- menté puis traités avec 20 UI/ml (cellules Neuro 2a) ou 100 UI/ml (neurones primaires) d'INF-a qui sont additionnés dans le milieu de culture.
Les tapis cellulaires sont lavés 3 fois avec du milieu non supplé- menté puis traités avec 20 UI/ml (cellules Neuro 2a) ou 100 UI/ml (neurones primaires) d'INF-a qui sont additionnés dans le milieu de culture.
- Traitement des cellules infectées par l'EGTA
Les monocouches cellulaires sont lavées 3 fois avec du PBS déplété en calcium et magnésium (Gibco BRL) puis incubées dans une solution EGTA à 1 mM dans du PBS pendant 150 min à 37Oc. Les cellules Neuro 2a sont ensuite incu- bées dans du MEM supplémenté avec 10% SVF et les neurones primaires dans du milieu Neurobasal avec 20% de B27.
Les monocouches cellulaires sont lavées 3 fois avec du PBS déplété en calcium et magnésium (Gibco BRL) puis incubées dans une solution EGTA à 1 mM dans du PBS pendant 150 min à 37Oc. Les cellules Neuro 2a sont ensuite incu- bées dans du MEM supplémenté avec 10% SVF et les neurones primaires dans du milieu Neurobasal avec 20% de B27.
- Préparation des sondes OAS murines
Les neurones primaires de souris BALB/c traités par 20 UI/ml d'INF-a pendant 12 h sont lysés par la solution de lyse du kit ATLAS Pure Total RNA Labeling System (Clontech, # PT3231-1) et l'ARN total extrait est précipité avec 3 volumes d'éthanol 95% en présence de 0,2 M LiCI pendant 18 h à-20 C. Un aliquot
de l'ARN total (0, 5 g) est utilisé comme matrice pour la synthèse par la technique RT-PCR (kit Titan One Tube RT-PCR ; Roche Biochemicals no 1939823) des sondes OAS à l'aide des amorces OAS-1 à OAS-4 suivantes : OAS-1 : GTCAGACGCTGACCTGGTG (SEQ ID NO : 5, positions 257-275 ; transcrit L3, [M33863])
OAS-2 : AGCTTCTCCTTACACAGTTGG (SEQ ID NO : 6, positions 686-707 ; transcrit L3, [M33863])
OAS-3 : ACAGTGCAGGTGTGTGAGC (SEQ ID NO : 7, positions 1379-1398 ; transcrit L2, [X58077])
OAS-4 : TCATGTCTCAGAAAGGAAAC (SEQ ID NO : 8, positions 1854-1874 ; transcrit L2, [X58077])
Le couple d'amorces OAS-1 et OAS-2 a été sélectionné afin d'amplifier une région de haute identité nucléotidique entre les 3 transcrits OAS (Ll, L2 et L3) qui ont été identifiés chez la souris. Le couple d'amorces OAS-3 et OAS-4 a
Les neurones primaires de souris BALB/c traités par 20 UI/ml d'INF-a pendant 12 h sont lysés par la solution de lyse du kit ATLAS Pure Total RNA Labeling System (Clontech, # PT3231-1) et l'ARN total extrait est précipité avec 3 volumes d'éthanol 95% en présence de 0,2 M LiCI pendant 18 h à-20 C. Un aliquot
de l'ARN total (0, 5 g) est utilisé comme matrice pour la synthèse par la technique RT-PCR (kit Titan One Tube RT-PCR ; Roche Biochemicals no 1939823) des sondes OAS à l'aide des amorces OAS-1 à OAS-4 suivantes : OAS-1 : GTCAGACGCTGACCTGGTG (SEQ ID NO : 5, positions 257-275 ; transcrit L3, [M33863])
OAS-2 : AGCTTCTCCTTACACAGTTGG (SEQ ID NO : 6, positions 686-707 ; transcrit L3, [M33863])
OAS-3 : ACAGTGCAGGTGTGTGAGC (SEQ ID NO : 7, positions 1379-1398 ; transcrit L2, [X58077])
OAS-4 : TCATGTCTCAGAAAGGAAAC (SEQ ID NO : 8, positions 1854-1874 ; transcrit L2, [X58077])
Le couple d'amorces OAS-1 et OAS-2 a été sélectionné afin d'amplifier une région de haute identité nucléotidique entre les 3 transcrits OAS (Ll, L2 et L3) qui ont été identifiés chez la souris. Le couple d'amorces OAS-3 et OAS-4 a
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été dessiné dans la région 5'non codante spécifique au transcrit L2. Les produits RTPCR sont clonés à l'aide du TOPO TA cloning (Invitrogen).
Les ARN totaux de neurones primaires de souris BALB/c, non traités, traités avec l'INF-a ou l'EGTA, ou infectés par le virus WN en présence ou non de l'INF-a ou de l'EGTA seront hybridés avec les sondes OAS en Northem blot.
- Activité and-virale de l'INF-a sur le virus West Nile
Après induction par l'IFN-a, trois transcrits des gènes OAS, LI, L2, L3 sont observés (Rutherford et al., 1991). Le transcrit L3 est détecté dès 4 h post-
induction, L2 est observé à 12 h post-induction et enfin L1 est observé après 18 h post-induction.
Après induction par l'IFN-a, trois transcrits des gènes OAS, LI, L2, L3 sont observés (Rutherford et al., 1991). Le transcrit L3 est détecté dès 4 h post-
induction, L2 est observé à 12 h post-induction et enfin L1 est observé après 18 h post-induction.
La concentration d'INF-a 20 IU/ml pour les cellules Neuro 2a n'altère pas la viabilité cellulaire sur 24 h.
Les cellules Neuro 2a infectées par le virus WN sont incubées avec l'INF-a (voir 2) d'une part dès le début de l'infection ou d'autre part après 5 h ou 10 h d'infection. Ces temps d'incubation avec l'IFN-a ont été sélectionnés en fonction d'une part des cinétiques de transcription des gènes OAS LI, L2 et L3 et d'autre part de la cinétique de réplication virale.
L'addition de l'IFN-a dès le début de l'infection virale réduit de 85% (m. i. de 4) le nombre total de cellules Neuro 2a positives en antigènes viraux par immunofluorescence indirecte à 24 h post-infection. L'addition de l'IFN-a à 5 h post- infection réduit de 65% (m. i. de 4) le nombre total de cellules Neuro 2a positives en antigènes viraux par immunofluorescence indirecte à 24 h post-infection. L'addition de l'IFN-a à 10 h post-infection réduit de 50% (m. i. de 4) le nombre total de cellules Neuro 2a positives en antigènes viraux par immunofluorescence indirecte à 24 h postinfection.
- Activité anti-virale de LEGTA sur le virus West Nile
L'incubation de neurones primaires de rat dans un milieu sans calcium supplémenté avec 1 mM de l'agent chélateur EGTA pendant 150 min provoque une augmentation de 350% du niveau transcriptionnel du (ou des) membres de la famille OAS.
L'incubation de neurones primaires de rat dans un milieu sans calcium supplémenté avec 1 mM de l'agent chélateur EGTA pendant 150 min provoque une augmentation de 350% du niveau transcriptionnel du (ou des) membres de la famille OAS.
Le pré-traitement des neurones primaires de souris BALB/c avec 1
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mM EGTA pendant 2 h 30 (voir 3) réduit de 50% le nombre total de cellules positives en antigènes viraux par immunofluorescence indirecte à 24 h post-infection.
Le traitement des neurones primaires de souris BALB/c avec 1 mM EGTA pendant 2 h 30 après 2 h d'infection réduit de 50% le nombre total de cellules positives en antigènes viraux par immunofluorescence indirecte à 24 h post-infection. Le traitement des neurones primaires de souris BALB/c avec 1 mM EGTA pendant 2 h 30 après 6 h d'infection réduit de 20% le nombre total de cellules positives en antigènes viraux par immunofluorescence indirecte à 24 h post-infection.
Claims (9)
- REVENDICATIONS 1 ) Procédé de criblage de molécules aptes à stimuler un gène de la famille OAS, caractérisé en ce qu'il comprend : a) la mise en culture de cellules, issues d'un mammifère non-humain Flvr/Flvr ou Flvr/Flvs, b) l'induction de l'expression des gènes OAS par addition d'interféron et ou ss ou par un stress calcique, notamment par addition d'EGTA, c) la mise en contact des cellules avec la molécule à cribler, et d) la mesure de l'activité d'un gène OAS, par comparaison avec un échantillon témoin.
- 2 ) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit mammifère non humain Flvr/Flvr est de préférence une lignée de souris résistantes dérivant de géniteurs sauvages appartenant à l'espèce Mus musculus musculus ou Mus spretus.
- 3 ) Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que lesdites souris résistantes sont croisées en retour avec des lignées sensibles de laboratoire.
- 4 ) Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que ledit gène OAS est sélectionné dans le groupe constitué par les gènes autologues et les gènes hétérologues.
- 5 ) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'activité du gène OAS peut-être mesurée à l'aide de l'une des méthodes suivantes : détermination de la quantité de transcrits OAS, détermination de la quantité de protéines 2'-5'OAS produites, détermination du niveau d'activité 2'- 5'OAS ou détermination de la séquence des ARNm ou de l'ADN génomique issues des gènes de la famille OAS.
- 6 ) Molécule d'acide nucléique de mammifère, caractérisée en ce qu'elle est constituée par une séquence d'ADN génomique de 0,2 à 0,4 cM correspondant à un locus de résistance à une infection par un Flaviviridae et en ce qu'elle inclut la famille des gènes OAS sélectionnés dans le groupe constitué par les gènes OAS sauvages et les gènes OAS mutés.<Desc/Clms Page number 24>
- 7 ) Molécule d'acide nucléique selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence du marqueur Damit368 du chromosome 5 de souris.
- 8 ) Utilisation des molécules d'acides nucléiques sélectionnées dans le groupe constitué par les molécules d'acide nucléique selon la revendication 6 ou la revendication 7, les ADNc desdites molécules et les protéines codées par lesdites molécules pour le criblage de molécules antivirales, destinées au traitement des infections par les virus de la famille des Flaviviridae.
- 9 ) Utilisation selon la revendication 8, caractérisée en ce que lesdites molécules sont des séquences d'ADN génomique des gènes de la famille OAS, les ADNc desdites séquences et les protéines correspondantes 10 ) Utilisation d'un vecteur recombinant comprenant une molécule d'acide nucléique selon la revendication 6 ou la revendication 7 ou une molécule d'acide nucléique telle que définie dans les revendications 8 ou 9, pour le criblage de molécules antivirales destinées au traitement des infections par les virus de la famille des Flaviviridae.11 ) Utilisation de cellules contenant un vecteur recombinant comprenant une molécule d'acide nucléique selon la revendication 6 ou la revendication 7 ou une molécule d'acide nucléique telle que définie dans les revendications 8 ou 9, pour le criblage de molécules antivirales destinées au traitement des infections par les virus de la famille des Flaviviridae.de la famille des Flaviviridae.
12 ) Utilisation d'un mammifère non-humain recombinant comprenant une molécule d'acide nucléique selon la revendication 6 ou la revendication 7 ou une molécule d'acide nucléique telle que définie dans les revendications 8 ou 9, pour le criblage de molécules antivirales destinées au traitement des infections par les virus13 ) Molécule d'acide nucléique constituée par un ADNc ou une séquence d'ADN génomique issue d'un gène de la famille OAS comme médicament destiné au traitement des infections par les virus de la famille des Flaviviridae.<Desc/Clms Page number 25>14 ) Protéine codée par un ADNc ou une séquence d'ADN génomique issue d'un gène de la famille OAS comme médicament destiné au traite- ment des infections par les virus de la famille des Flaviviridae.15 ) Procédé d'évaluation de la sensibilité d'un individu à l'infection par un virus de la famille des Flaviviridae et/ou de sa réponse à un traitement par l'interféron, caractérisé en ce qu'il comprend : - la mise en culture de cellules à partir d'un échantillon d'un individu, et - l'induction de l'expression des gènes OAS par addition d'interféron ex ou ou par un stress calcique, notamment par addition d'EGTA, et la mesure de l'activité d'un des gènes OAS, par comparaison avec un échantillon de cellules, obtenues à partir d'un sujet témoin résistant à l'infection.correspondant respectivement aux positions 257-707 du transcrit de l'isoforme L3 murine et aux positions 1379-1874 du transcrit de l'isoforme L2 murine (SEQ ID NO : 31-32).
16 ) Réactifs utiles pour mettre en oeuvre les procédés selon les revendications 1 à 5 ou 15, caractérisés en ce qu'ils sont sélectionnés dans le groupe constitué par les amorces de séquences SEQ ID NO : 5 à 22 ainsi que les sondes17 ) Cellules eucaryotes transformées, caractérisées en ce qu'elles comprennent une molécule d'acide nucléique de mammifère selon la revendication 6 ou la revendication 7 ou une molécule d'acide nucléique telle que définie dans les revendications 8 ou 9.18 ) Mammifères non-humains transgéniques, caractérisés en ce qu'ils incluent au moins une copie d'une molécule d'acide nucléique, selon la revendication 6 ou la revendication 7 ou une molécule d'acide nucléique telle que définie dans les revendications 8 ou 9.19 ) Mammifères non-humains recombinants, caractérisés en ce qu'ils sont porteurs d'au moins un allèle du gène OAS inactivé.
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