FR2813394A1

FR2813394A1 - Procede de dosage de l'antigene specifique de la prostate, procede de diagnostic in vitro du cancer de la prostate, et kits pour la mise en oeuvre de ces procedes

Info

Publication number: FR2813394A1
Application number: FR0010934A
Authority: FR
Inventors: Jean Marie Villette; Olivier Cussenot
Original assignee: Urogene SA
Current assignee: Urogene SA
Priority date: 2000-08-25
Filing date: 2000-08-25
Publication date: 2002-03-01

Abstract

Le procédé de dosage qui est applicable au dosage du PSA total (PSAt) et au dosage du PSA non complexé (PSAnc) consiste, selon la technique sandwich sur phase solide, à capturer le PSAt ou le PSAnc sur une phase solide au moyen d'une substance de capture immobilisée dans ladite phase et capable de se fixer sur un site antigénique, puis à détecter, au moyen d'une substance de détection, le PSAt ou PSAnc ainsi capturé, et il se caractérise en ce que la capture du PSAnc se fait au moyen d'une substance uniquement capable de se lier sur un site antigénique du PSA qui n'est accessible que lorsque le PSA est sous la forme non-complexée et en ce que la détection se fait au moyen d'une paire de substances de détection qui est la même pour le PSAt et le PSAnc.

Description

La présente invention concerne, d'une manière générale, le diagnostic du cancer de la prostate à partir d'un échantillon sanguin. Plus particulièrement, la présente invention a pour objet des procédés de dosage de l'antigène spécifique de la prostate (PSA, d'après la nomenclature anglaise "Prostate Spécifie Antigen"), à l'état libre et/ou lié, à partir d'un échantillon sanguin, et l'application de ces procédés de dosage audit diagnostic. Elle porte aussi sur des kits de mise en oeuvre de ces procédés.

Actuellement, le cancer de la prostate est, après le cancer broncho-pulmonaire, le cancer le plus répandu chez l'homme, et plus particulièrement chez l'homme de plus de 50 ans (1,2, 3) [les chiffres en gras, entre parenthèses, renvoient à la liste de références bibliographiques annexée]. Il est difficile non seulement de dépister ce cancer, du fait qu'il n'existe pas de marqueur spécifique du cancer de la prostate à un stade précoce, mais aussi de déterminer précisément l'extension de la tumeur avant toute opération. Or, le cancer de la prostate ne peut actuellement être efficacement traité qu'à l'état localisé, c'est-à-dire à un stade précoce.

Il existe donc un besoin en un procédé de diagnostic fiable et rapide permettant de déceler la présence d'un cancer de la prostate à un stade encore précoce.

Dans un passé récent, les seuls tests utilisés pour dépister le cancer de la prostate consistaient soit en un toucher rectal, permettant de détecter les modifications de consistance du tissu prostatique, soit en une échographie prostatique endorectale.

Toutefois, aucune de ces techniques n'était satisfaisante, car la première ne permet de détecter que les tumeurs ayant déjà atteint une grande taille et est très opérateur dépendante (outre que la plupart des tumeurs prostatiques sont situées dans des zones non accessibles au toucher) et la seconde est trop invasive, coûteuse et imprécise pour servir d'outil de dépistage (1).

Pour pallier ces inconvénients, différents tests basés sur le dosage de l'antigène spécifique de la prostate (PSA) ont aussi été développés (4, 5).

Le PSA est une protéase à sérine du groupe des kallikréines, qui se retrouve presque exclusivement dans la prostate, et dont la sécrétion est liée à l'activité prostatique. Il présente un poids moléculaire d'environ 34 kDa, et joue un rôle majeur dans la viscosité du liquide séminal. Le PSA circulant dans le sang peut se présenter sous deux formes différentes : une première forme dite "liée" ou "complexée", qui consiste en une forme complexée à des anti-protéases comme l'al-antichymotrypsine ou encore l'a2-macroglobuline ; et une seconde forme à l'état libre.

Suite à la mise en évidence d'un taux de PSA très faible chez les patients indemnes de toute pathologie, alors que des taux sériques élevés sont constatés chez les patients atteints d'un cancer de la prostate, d'une hypertrophie prostatique bénigne ou encore d'une prostatite, de nombreux efforts ont été faits pour mettre au point des tests de dosage du PSA.

Un procédé classiquement utilisé consiste à doser le taux de PSA total (PSAt), c'est-à-dire de l'ensemble PSA lié ou complexé (PSAc) et PSA libre ou non complexé (PSAnc), dans le sang d'un patient par un procédé de dosage immunologique de type "sandwich", basé sur l'utilisation d'anticorps anti-PSA. Lorsque le taux de PSAt est inférieur à environ 4,0 ng/ml, le risque de cancer de la prostate est faible ou nul alors que, lorsqu' il est supérieur à environ 10 ng/ml, le risque de cancer de la prostate est d'environ 50%. Un taux compris dans la gamme allant d'environ 4 et environ 10 ng/ml a de grandes chances de refléter un état cancéreux, mais il peut aussi résulter d'une hypertrophie prostatique bénigne ou d'une prostatite.

Pour tenter de distinguer, dans cette gamme 4-10 ng/ml, les cas positifs des cas faux-positifs, il a été suggéré d'effectuer des dosages complémentaires afin de déterminer, non plus uniquement le taux de PSAt, mais aussi

le taux de PSAnc (1). En effet, il a été mis en évidence que le taux de PSAnc est plus élevé dans les cancers de la prostate que dans les hypertrophies prostatiques bénignes ou les prostatites, de sorte que le rapport entre PSAnc et PSAt fournit une indication supplémentaire.

Pour réaliser ces dosages, de nombreuses techniques ont été développées, mais elles consistent, pour la plupart, à doser le taux de PSAt, de la manière décrite plus haut, puis à doser le taux de PSAc en utilisant cette fois des anticorps anti-PSAc, à obtenir le PSAnc par soustraction et enfin à calculer le rapport entre les taux de PSAt et de PSAnc.

A ce jour, en effet, le taux de PSAnc est déterminé indirectement, c'est-à-dire par dosage du PSAt et du PSAc, et soustraction.

La présente invention vise à pallier les manques de l'art antérieur en apportant un procédé ultra-sensible, fiable et reproductible de dosage du PSAt et de dosage direct du PSAnc, applicable au diagnostic du cancer de la prostate.

Ce but est atteint en ce sens que, selon un premier aspect, la présente invention concerne un procédé de dosage de l'antigène spécifique de la prostate total (PSAt) ou de l'antigène spécifique de la prostate non-complexé (PSAnc) dans un échantillon sanguin, qui consiste, selon la technique sandwich sur phase solide, à : a) immobiliser sur une phase solide au moins une substance de capture capable de se lier sur un site antigénique du PSAt ou du PSAnc tout en ne modifiant pas sa conformation, obtenant ainsi une phase solide piégeante pour le PSAt ou le PSAnc ; b) mettre en contact l'échantillon sanguin à tester avec la phase solide telle qu'issue de l'étape a), piégeant ainsi le PSAt ou le PSAnc présent dans ledit échantillon ; c) mettre en contact la phase solide telle qu'issue de l'étape b) avec au moins une substance de détection marquée capable de se lier au PSAt ou au PSAnc sur un site

antigénique de celui-ci, différent de celui sur lequel se lie ladite substance de capture ; et à d) évaluer la quantité de ladite au moins une substance de détection marquée qui s'est liée au PSAt ou au PSAnc ; procédé qui se caractérise en ce qu'il utilise : - comme substance de capture, pour doser le PSAnc, une substance capable uniquement de se lier sur un site antigénique du PSA qui n'est accessible que lorsque le PSA est sous la forme non-complexé, et - comme substances de détection, au moins un couple de substances capables de se lier sur au moins deux sites antigéniques du PSAt ou du PSAnc différents l'un de l'autre et différents de celui sur lequel s'est liée ladite au moins une substance de capture, ledit couple de substances de détection étant le même pour le dosage du PSAt et pour celui du PSAnc.

Dans la suite, l'expression PSA sera utilisée pour désigner indifféremment le PSAt et/ou le PSAnc lorsqu'il n'y a pas lieu de les distinguer.

Par "substance de capture", on entend toute substance capable de se fixer, d'une part, sur un support solide de quelque nature que ce soit (plastique, verre, céramique, film photographique ou toute membrane organique de type gel de silice) et, d'autre part, capable de se lier au PSA.

Par "substance de détection", on entend toute substance capable de se lier au PSA et pouvant être facilement mise en évidence et/ou quantifiée.

Par "échantillon sanguin", il faut comprendre non seulement un échantillon de sang, mais tout échantillon d'un produit d'origine sanguine, tel qu'un échantillon de sérum. Plus particulièrement, pour le dosage du PSAt, l'échantillon peut consister en une goutte de sang ou une prise d'essai de sérum et, dans le cas du dosage du PSAnc, l'échantillon est un échantillon de sérum.

Dans le cas de l'utilisation d'une goutte de sang pour doser le PSAt, les quelques microlitres de sang

nécessaires au test peuvent être obtenus par piqûre au niveau du doigt, être recueillis sur un support absorbant de type papier buvard, séchés, puis élués ou extraits par toute technique connue. Une technique classique d'élution consiste à soumettre, sous agitation, le support chargé de sang séché à un tampon d'élution. Ainsi, l'invention permet à un patient d'effectuer lui-même le prélèvement sanguin simplement en s'incisant ou en se piquant, par exemple, le bout du doigt, et en recueillant la goutte de sang sur un papier buvard. Le papier buvard, après séchage de la goutte, sera ensuite déposé, ou envoyé par la poste, au laboratoire qui le traitera comme décrit plus haut.

Le fait d'utiliser comme substance de détection, au moins deux substances capables de se lier sur au moins deux sites antigéniques différents du PSA, à la différence des procédés de l'art antérieur qui n'en utilisent qu'une, confère au procédé de l'invention une plus grande sensibilité.

En outre, le procédé selon l'invention présente l'avantage d'utiliser comme substances de détection, les mêmes substances de détection pour le dosage du PSAt et celui du PSAnc, facilitant ainsi la mise en oeuvre du procédé, tout en en réduisant les coûts.

Il apparaît ainsi clairement que le procédé de dosage du PSA objet de l'invention permet d'envisager des tests systématiques, et à grande échelle, de dépistage du cancer de la prostate.

Pour mettre au point un procédé, basé sur une réaction immunologique de type "sandwich", qui présente une grande sensibilité, la demanderesse a dû, dans une première étape, dresser une cartographie des épitopes du PSA pour lui permettre, dans un deuxième temps, de sélectionner les meilleurs candidats susceptibles d'être utilisés comme substances de capture et de détection. L'étape de cartographie a été effectuée en utilisant la technique d'analyse des interactions biospécifiques, dite "BIAcore", appliquée à la cartographie des épitopes ou épitopage (6).

Par "épitope", il faut comprendre toute partie d'une molécule d'antigène qui, de par sa conformation spatiale, a la propriété de se combiner avec la partie de l'anticorps correspondant, dite paratope. De manière générale, l'épitope est constitué par une séquence d'environ 6 à 15 acides aminés.

La technique "BIAcore" consiste, de manière générale, à tester une batterie d'anticorps (dans le cas d'un épitopage) sur le substrat (appelé antigène) désiré et ainsi à déterminer les différents anticorps qui entrent en compétition les uns avec les autres pour se fixer sur ledit antigène, et plus particulièrement, dans le cas de réaction anticorps-antigène, sur un épitope donné.

Par "anticorps qui entrent en compétition", on entend des anticorps qui présentent un homologie fonctionnelle et/ou structurelle telle qu'ils ont tendance à se fixer concurremment sur un même épitope.

Dans le cadre de l'épitopage, la demanderesse a testé sur le PSA environ 300 anticorps monoclonaux différents récupérés à partir de souris inoculées avec du PSA selon différents dosages et différents degrés de pureté et a déterminé qu'il y avait cinq classes différentes d'anticorps, au sein de chacune desquelles les anticorps entrent mutuellement en compétition pour ce qui est de se fixer sur le PSA. La demanderesse en a ainsi déduit que la molécule de PSA présente à sa surface cinq épitopes différents. Par "cinq épitopes différents", il faut en fait comprendre "cinq collections différentes d'épitopes", les épitopes d'une même collection pouvant avoir des structures légèrement différentes tout en gardant la même spécificité quant à la fixation sur le PSA.

Dans un souci de clarté, il sera par la suite attribué de manière arbitraire à chacun desdits épitopes une référence numérique de 1 à 5.

En outre, la demanderesse a identifié une sixième classe d'anticorps qui, de manière surprenante, réagissent

avec deux épitopes différents parmi les cinq précités et que l'on nommera arbitrairement "épitopes 3 et 4".

Pour chacune des six classes d'anticorps mises en évidence, la demanderesse a déterminé un anticorps type, c'est-à-dire qui présente une fixation optimale sur le (ou les) épitope(s) complémentaire(s). La demanderesse a aussi déposé, à l'Institut Pasteur, quatre anticorps qui sont les quatre anticorps types utilisés pour la mise en oeuvre du procédé de la présente invention.

Dans la suite de la présente description, ces anticorps, qui correspondent respectivement aux dépôts n I 2538 ; I 2539 ; I 2540 et I 2541, seront nommés UROGPSA01, UROG-PSA02, UROG-PSA05 et UROG-PSA06.

La présente invention concerne donc six anticorps monoclonaux anti-PSA, dont quatre ont été déposés à l'Institut Pasteur, à savoir :
UROG-PSA01 qui est un anticorps monoclonal de type IgG2b se fixant sur un épitope que l'on nommera épitope 1 ;
UROG-PSA02 qui est un anticorps monoclonal de type IgGl se fixant sur un épitope que l'on nommera épitope 2 ;
UROG-PSA03 qui est un anticorps monoclonal de type IgGl se fixant sur un épitope que l'on nommera épitope 4 ;
UROG-PSA04 qui est un anticorps monoclonal de type IgGl se fixant sur un épitope que l'on nommera épitope 3 ;
UROG-PSA05 qui est un anticorps monoclonal de type IgG2b se fixant sur les deux épitopes 3 et 4 ; etUROG-PSA06 qui est un anticorps monoclonal de type IgGl se fixant sur un épitope que l'on nommera épitope 5.

La seconde étape a consisté à déterminer quelles combinaisons de ces anticorps permettent de mettre au point un dosage "sandwich" sensible. Plus particulièrement, il a fallu déterminer quelle (s) classe (s) d'anticorps doi (ven) t être sollicitée(s) comme substance(s) de capture pour fixer, de manière spécifique, sur le support solide, la forme du PSA que l'on désire doser, et quelles classes doivent être sollicitées pour permettre une détection de forte sensibilité du PSAt et du PSAnc.

Selon une forme d'exécution préférée de l'invention, le procédé appliqué au dosage du PSAt utilise, comme substance de capture, l'anticorps monoclonal UROG-PSA01, ou toute substance capable d'entrer en compétition avec lui pour ce qui est de se fixer sur le PSAt.

Selon une autre forme d'exécution préférée de l'invention appliquée au dosage du PSAt, ladite substance capable d'entrer en compétition avec UROG-PSA01 est un anticorps monoclonal anti-PSA de type IgG2b.

Selon encore une autre forme d'exécution préférée de l'invention appliquée au dosage du PSAt, cette substance de peut être sélectionnée dans le groupe consistant en les peptides, les polysaccharides et les fragments d'anticorps recombinant.

Comme indiqué précédemment, et à la différence des procédés de l'art antérieur, le procédé objet de la présente invention permet de doser directement le taux de PSAnc, alors que les procédés utilisés jusqu'à présent opéraient indirectement par dosage du PSAt et dosage du PSAc, la détermination du taux de PSAnc nécessitant non seulement une étape supplémentaire de calcul, mais surtout étant entachée d'une plus grande incertitude quant à la précision du résultat, puisque la marge d'erreur est doublée.

La demanderesse a mis en évidence que l'épitope sur lequel se fixe UROG-PSA06 (épitope 5) se trouve masqué lorsque le PSA est complexé. Par conséquent, en utilisant comme substance de capture une substance spécifique de l'épitope 5, seul le PSAnc sera fixé sur le support solide, et sera donc la seule forme révélée lors de l'étape de détection.

Selon une forme d'exécution préférée de l'invention, le procédé appliqué au dosage du PSAnc utilise, donc, comme substance de capture, l'anticorps monoclonal UROG-PSA06, ou toute substance capable d'entrer en compétition avec lui pour ce qui est de se fixer sur le PSAnc.

Selon une forme d'exécution préférée de l'invention appliquée au dosage du PSAnc, ladite substance capable d'entrer en compétition avec UROG-PSA06 est un anticorps monoclonal anti-PSA de type IgGl.

La sensibilité du test objet de l'invention est sensiblement accrue, par rapport à l'art antérieur, par le fait que l'on utilise, à la fois comme substances de capture et de détection, uniquement des anticorps monoclonaux. Ainsi, le procédé objet de l'invention permet de réduire les bruits de fond qui pourraient se produire lorsque l'on utilise des anticorps polyclonaux.

Selon une autre forme d'exécution de l'invention appliquée au dosage du PSAnc, la substance de capture peut être sélectionnée dans le groupe consistant en les peptides, les polysaccharides et les fragments d'anticorps recombinant.

Pour ce qui est de la détection, la demanderesse a mis en évidence que les anticorps UROG-PSA02 et UROG-PSA05, utilisés simultanément comme substances de détection, permettaient d'obtenir une réponse optimale qui n'est pas simplement la somme de la réponse de chacun d'entre eux.

En effet, des expériences faites en utilisant, pour la détection, ces deux anticorps pris séparément ont montré que la réponse obtenue au moyen de la combinaison UROGPSA02 et UROG-PSA05 est, comme on pouvait s'y attendre, nettement supérieure à la réponse obtenue avec chacun d'entre eux, mais aussi, ce qui est tout à fait inattendu, à la somme de ces réponses. On est donc en présence d'un effet de synergie.

En outre, un test a été effectué en remplaçant UROGPSA05 qui se lie aux épitopes 3 et 4, par UROG-PSA03 et UROG-PSA04, qui se lient respectivement aux épitopes 4 et 3. Contrairement à ce que l'on aurait pu attendre, les résultats obtenus avec UROG-PSA03 + UROG-PSA04 sont nettement inférieurs à ceux obtenus avec UROG-PSA05.

Sans vouloir être lié par une quelconque théorie, on peut penser que les épitopes 3 et 4 sont à proximité

immédiate l'un de l'autre et que les anticorps UROG-PSA03 et UROG-PSA04, en se fixant sur leur épitope respectif se gênent mutuellement, alors que UROG-PSA05 parait se fixer simultanément sur les deux épitopes. Il s'ensuit que, dans le cas de UROG-PSA03 + UROG-PSA04, la quantité d'anticorps fixée sur les épitopes 3 et/ou 4 est faible et donc que le signal de détection est faible. A l'opposé, l'anticorps bivalent UROG-PSA05 se fixe sur les deux épitopes à la fois, ce qui lui assure une très bonne fixation, sans aucune gêne, avec pour résultat un signal de détection plus élevé.

Que cette hypothèse soit exacte ou non, l'utilisation de l'anticorps bivalent UROG-PSA05 est déterminante pour obtenir un test de grande sensibilité.

Selon une forme d'exécution préférée, le procédé de l'invention utilise donc, comme substances de détection marquées, les anticorps monoclonaux UROG-PSA02 et UROGPSA05, ou tout couple de substances capables d'entrer en compétition avec eux pour ce qui est de se fixer sur le PSAt ou le PSAnc.

Selon une autre forme d'exécution préférée, lesdites substances capables d'entrer en compétition avec UROG-PSA02 et UROG-PSA05 sont des anticorps monoclonaux anti-PSA de type IgGl et/ou IgG2b.

Selon encore une autre forme d'exécution de l'invention, ces substances pourront être sélectionnées dans le groupe consistant en les peptides, les polysaccharides et les fragments d'anticorps recombinant.

Par "anticorps recombinant", il faut comprendre tout anticorps qui a été obtenu par génie génétique.

Les substances de détection peuvent être marquées par tout procédé connu de l'homme de l'art. Cependant, dans un souci de facilité et d'économie, on préférera utiliser des substances de détection biotinylées.

Un autre aspect de l'invention a consisté à développer un kit simple et fiable pour doser l'antigène

spécifique de la prostate (PSA) dans un échantillon sanguin.

Ainsi, la présente invention concerne un kit pour mettre en oeuvre le procédé tel que décrit plus haut, qui comprend au moins les éléments suivants : a) au moins une substance de capture immobilisée sur une phase solide et capable de se lier à un site antigénique du PSAt ou du PSAnc, la substance de capture, en ce qui concerne le PSAnc, étant une substance capable uniquement de se lier sur un site antigénique du PSA qui n'est accessible que lorsque le PSA est sous sa forme non complexée ; b) au moins un couple de substances de détection marquées capables de se lier sur au moins deux sites antigéniques différents l'un de l'autre et différents de celui sur lequel se lie ladite au moins une substance de capture, ledit couple de substances étant le même pour le dosage du PSAt et pour celui du PSAnc ; et c) au moins un réactif nécessaire à la révélation des substances de détection marquées liées au PSA.

Les substance de détection utilisées sont, de préférence, les anticorps monoclonaux UROG-PSA02 et UROGPSA05, ou tout couple de substances capables d'entrer en compétition avec eux pour ce qui est de se fixer sur le PSA.

Selon une forme d'exécution préférée, les substances de détection du kit de dosage selon l'invention peuvent être marquées par tout procédé connu de l'homme de l'art, mais sont, de préférence, biotinylées.

Selon une forme de réalisation appliquée au dosage du PSAt, le kit de dosage comprend, comme substance de capture, l'anticorps monoclonal anti-PSA UROG-PSA01, ou toute substance capable d'entrer en compétition avec lui pour ce qui est de se fixer sur le PSAt.

De manière similaire, un kit appliqué au dosage du PSAnc comprend, comme substance de capture, l'anticorps monoclonal anti-PSA UROG-PSA06, ou toute substance capable

d'entrer en compétition avec lui pour ce qui est de se fixer sur le PSAnc.

La présente invention a aussi pour objet l'utilisation d'un kit tel que décrit plus haut pour la mise en oeuvre du procédé de dosage du PSA.

Il est notoire que le dosage du PSAt ne permet pas, à lui seul, de déterminer avec certitude, pour des résultats compris entre 4 et 10 ng/ml, la probabilité de risque d'un cancer de la prostate.

Comme décrit plus haut, le dosage du PSAnc donne une information supplémentaire permettant de confirmer le risque de cancer de la prostate par rapport à une hypertrophie prostatique bénigne ou encore une prostatite.

Actuellement, pour plus de fiabilité, le dosage de PSAt est combiné avec un dosage du PSAc et aussi à un toucher rectal'ou une échographie, qui sont des opérations lourdes, fastidieuses, et peu fiables, et donc inenvisageables pour des tests systématiques de dépistage.

Afin de pallier cet inconvénient, la présente invention propose un procédé de diagnostic in vitro et/ou de pronostic in vitro du cancer de la prostate qui consiste à : a) mettre en oeuvre le procédé de dosage du PSAt tel que décrit plus haut ; b) en fonction de la quantité de PSAt obtenue : # soit à déclarer le diagnostic négatif, si cette quantité est inférieure à 4 ng/ml ; * soit à déclarer le diagnostic positif, si cette quantité est supérieure à 10 ng/ml ; * soit à déclarer le diagnostic potentiellement positif, si cette quantité est comprise entre
4 et 10 ng/ml, et à compléter ce test en mettant en oeuvre le procédé de dosage du PSAnc tel que décrit plus haut, puis b) en fonction du rapport entre le PSAnc et le PSAt : # soit à déclarer le diagnostic négatif, si ce rapport est inférieur à un seuil critique ;

# soit à déclarer le diagnostic potentiellement positif, si ce rapport est supérieur audit seuil critique, et à affiner le résultat en mettant en oeuvre les étapes suivantes : i) récolter des cellules d'origine prostatique ; ii) extraire séparément les ADN et les ARN totaux des cellules récoltées à l'étape i) ; iii) caractériser les cellules récoltées à l'étape i) par l'analyse de marqueurs spécifiques des cellules prostatiques et cancéreuses à partir des ARN extraits en ii) ; iv) rechercher toute altération chromosomique détectée par perte d'hétérozygotie, à partir des
ADN extraits à l'étape ii), sur au moins quatre régions chromosomiques indépendantes.

Dans l'énoncé ci-dessus, il est fait référence, par commodité, à la gamme classique 4-10 ng/ml. Cependant, comme il ressort des informations données plus loin, la sensibilité du procédé selon l'invention est telle que l'on peut obtenir des résultats en picogrammes. Dans la pratique, cette gamme 4-10 ng/ml sera donc transposée en pg/ml et c'est ainsi qu'il faut comprendre la présente description et les revendications annexées.

Le seuil critique auquel il est fait référence dans l'étape b) est d'environ 25%. Toutefois, cette valeur peut varier notamment en fonction des pays, des conditions opératoires du dosage, et de l'âge du patient, etc. On constate même des variations physiologiques intra-

individuelles entre les taux mesurés à différents intervalles (1). La valeur de 25% est une moyenne classiquement admise par l'homme de l'art en France. Il est bien évident qu'en pratique, ce seuil est déterminé par l'homme de l'art en fonction des paramètres précités (7, 8).

Le procédé en trois étapes énoncé ci-dessus permet, non seulement de déterminer avec certitude s'il y a un risque de cancer de la prostate chez un patient, mais permet surtout d'obtenir ce résultat de manière simple et rapide, et sans manipulation ou opération fastidieuse et désagréable pour le patient. En outre, ce procédé permet de mettre en évidence l'existence d'un cancer à un état encore précoce, ce qui permet d'envisager, par la suite, un traitement efficace.

La présente invention propose aussi un kit pour le diagnostic in vitro et/ou le pronostic in vitro du cancer de la prostate qui comprend au moins les éléments suivants : a) les éléments du kit de dosage du PSA tel que décrit plus haut ; b) les amorces spécifiques permettant l'amplification des ARN correspondants des marqueurs spécifiques des cellules prostatiques et cancéreuses ; c) les amorces spécifiques permettant l'amplification PCR des marqueurs de polymorphisme ; d) les tampons et enzymes nécessaires aux réactions d'amplification, de marquage et à l'hybridation ; et e) le cas échéant, les cibles pour l'hybridation spécifique des produits amplifiés et leur quantification, lesdites cibles pouvant être fixées sur un support.

L'invention porte aussi sur l'utilisation d'un kit tel que décrit plus haut pour constituer une base de données regroupant les résultats obtenus et des données phénotypiques et génotypiques de patients atteints de cancer de la prostate ainsi que de leurs tableaux cliniques

et de leur évolution en fonction des traitements, de manière à pouvoir identifier le traitement thérapeutique optimal à proposer au patient.

L'invention envisage aussi l'utilisation de la base de données obtenue en mettant en oeuvre le kit de la manière décrite précédemment.

Dans la pratique, un programme de dépistage systématique dans une population masculine donnée, à l'aide des moyens proposés par l'invention pourrait consister à mettre à la disposition de ladite population des supports de prélèvement, conçus pour recueillir et stocker une goutte de sang, et qui seraient incorporés à, ou susceptibles d'être inclus dans, une carte postale à l'adresse d'un laboratoire participant à la campagne de dépistage.

Le laboratoire récepteur mettrait en oeuvre le procédé de dosage du PSAt' à l'aide du premier kit selon l'invention, selon le résultat convoquerait ou non le patient pour déterminer le taux de PSAnc à l'aide de deuxième kit selon l'invention puis, s'il y a lieu, rechercherait l'existence d'une LOH en mettant en oeuvre le procédé objet de la demande de brevet FR 0 008266 à l'aide du troisième kit selon l'invention.

Un tel procédé par étapes permet d'éliminer rapidement et à moindres coûts les candidats sains, en limitant le nombre des manipulations ultérieures comme les dosages du PSAnc et des LOH, aux cas suspects.

La présente invention sera mieux comprise à la lecture des exemples suivants et à l'examen de la figure qui s'y rapporte.

A) DOSAGE ULTRA SENSIBLE DU PSA TOTAL.

MATERIEL ET METHODE I. Matériel et réactifs

- Plaques NUNC à barrettes de 12 puits commercialisées par EGG-Wallac (réf. 1244-550).

- Tampon d'extraction, obtenu de la manière suivante : dans un bécher de 500 ml, introduire et mettre à dissoudre sous agitation : # Tris base : 6,05 g, # KC1 : 18,65 g, et # Eau MilliQ : 300 ml, puis ajouter 5 ml de Tween 20 et ajuster le pH à 7,4 avec du HC1 concentré. Ajouter 30 g d'albumine bovine et mettre sous agitation jusqu'à dissolution complète. Transvaser dans une fiole de 500 ml et compléter au trait de jauge avec de l'eau MilliQ (eau déionisée et filtrée par le dispositif Millipore ). Filtrer sur filtre de 0,2 m et conserver à +4 C.

- Tampon PBS : tampon phosphate 50 mM pH 7,5 additionné de NaCl (9 g/1) et d'azoture de sodium (0,5 g/1).

- Tampon BSA-10 : tampon phosphate 50 mM pH 7,5 additionné de NaCl (9 g/1), d'azoture de sodium (0,5 g/1) et d'albumine bovine (Sigma réf. A-7906,10 g/1).

- Solution de lavage : solution de NaCl (9 g/1) et de Tween 20 (1 ml/1) - Etalons : Standards CIS bio international (PSA humain, sérum humain, azoture de sodium). Diluer chaque étalon et le contrôle au 1/100ème dans le tampon d'extraction.

- Anticorps de fixation : UROG-PSA01 purifié sur Protéine A.

- Anticorps de détection : UROG-PSA02 et UROG-PSA05 biotinylés. Solutions glycérolées conservées à -20 C.

Solution de Streptavidine-Europium - Tampon Déifia - Solution de révélation

II. Préparation des plaques.

Préparer une solution d'anticorps UROG-PSA01 purifié à 10 g/ml en tampon PBS et en déposer 200 l/puits.

Sceller les plaques avec une feuille de plastique adhésif et incuber jusqu'au lendemain à température ambiante.

Faire trois lavages avec la solution de lavage.

Ajouter 300 l par puits de tampon BSA-10.

Sceller les plaques avec des feuilles de plastique adhésif et laisser en contact 1 heure à température ambiante, puis les conserver fermées à +4 C.

III. Prise d'essai.

La prise d'essai résulte de l'extraction de sang recueilli sur du papier buvard.

Découper deux pastilles d'un diamètre compris entre environ 3 et 6 mm au milieu de la tache de sang et les recueillir dans un tube à hémolyse en verre.

Ajouter 500 l de tampon d'extraction dans chaque tube et agiter pendant une heure.

IV. Dosage du PSA total.

Retirer le nombre de barrettes adéquat pour réaliser l'ensemble des dosages et la gamme d'étalonnage.

Laver les barrettes sur un laveur automatique (programme NEW ).

Distribuer, en dupliquant, 200 /il pour chaque point de gamme, contrôle et dosage.

Sceller les barrettes et incuber deux heures sous agitation à température ambiante.

Laver les barrettes sur le laveur automatique.

Préparer la solution diluée d'anticorps de détection comme suit : dans une éprouvette contenant 50 ml de tampon BSA-10, ajouter 10 (il de la solution glycérolée de UROG-

PSA02 et 50 /il de la solution de UROG-PSA05. Agiter doucement par retournements.

Ajouter 200 /il de cette solution d'anticorps dans tous les puits des barrettes lavées, et incuber deux heures sous agitation à température ambiante.

Laver les barrettes sur le laveur automatique.

Préparer la solution diluée de Streptavidine-Europium comme suit : diluer au 1/1000ème la solution stock de Streptavidine-Europium dans le tampon Delfia (pour une plaque de 96 puits : 20 /il de solution stock dans 20 ml de tampon) .

Ajouter 200 /il de cette solution diluée dans tous les puits des barrettes lavées et incuber 30 minutes sous agitation à température ambiante.

Laver trois fois les barrettes sur le laveur automatique.

Ajouter 200 /il de solution de révélation dans tous les puits.

Incuber 10 minutes sous agitation à température ambiante.

Lire sur le lecteur de fluorescence.

RESULTATS.

Les résultats obtenus ont été regroupés sur l'axe des ordonnées de la figure 1.

B) COMPARAISON ENTRE LES RESULTATS DU DOSAGE DU PSAt OBTENUS SELON LE PROCEDE DE L'INVENTION (voir ci-dessus) ET CEUX OBTENUS SELON UN PROCEDE DE DOSAGE CLASSIQUE.

A titre de comparaison, on a effectué sur 300 échantillons sanguins un dosage classique du PSAt et un dosage du PSAt selon le procédé de l'invention.

Les tests classiques ont été effectués au moyen du kit de test in vitro, disponible dans le commerce auprès de

CIS bio international, Groupe ORIS, sous la dénomination commerciale "PSA-RIACT".

Les tests effectués selon l'invention ont été mis en oeuvre comme décrit plus haut.

Les résultats ont été regroupés dans la figure 1, sur laquelle il est porté en abscisse les résultats obtenus de manière classique, en ng/ml, et en ordonnée les résultats obtenus selon l'invention, en pg/ml.

On peut voir, d'après cette figure 1, que les résultats obtenus permettent de tracer un droite de régression, ce qui confirme la corrélation entre les résultats obtenus de manière classique et ceux obtenus selon l'invention. Il apparaît donc, de manière certaine, que le procédé de dosage selon l'invention est parfaitement fiable, et présente l'avantage de permettre de détecter des quantités très faibles (de l'ordre de quelques picogrammes) de PSAt. Cette courbe sert aussi de standard pour rapporter les valeurs trouvées en pg/ml selon l'invention à des valeurs exploitables en ng/ml.

A) DOSAGE ULTRA SENSIBLE DU PSA LIBRE.

MATERIEL ETMETHODE
I. Matériel et réactifs
Le matériel et les réactifs utilisés sont les mêmes que ceux indiqués ci-dessus à propos du PSAt, à l'exception de l'anticorps de fixation qui est UROG-PSA06 purifié sur protéine A.

II. Préparation des plaques.

La préparation des plaques se fait comme indiqué cidessus à propos du PSAt.

III. Prise d'essai.

La prise d'essai est constituée d'environ 50 l de sérum issu d'un prise de sang classique.

IV. Dosage du PSA libre.

Le dosage se fait comme indiqué ci-dessus à propos du PSAt à cela près que l'anticorps de fixation UROG-PSA01 est remplacé par l'anticorps de fixation UROG-PSA06.

REFERENCES 1. Cuzin B. & Thoral JE., "Opportunité d'un dépistage systématique du cancer de la prostate par le dosage de l'antigène spécifique de la prostate", Document de l'Agence Nationale d'Accréditation et d'Evaluation en
Santé (ANAES), 121 pages (1998) 2. Grosclaude P., Menegoz F., Schaffer P., Macé Lesec'h
J., Avreux P., Lemab G. & al, "Dépistage du cancer de la prostate (II) . Le cancer de la prostate est-il un problème de santé publique ? Actualisation des chiffres d'incidence et de mortalité en France de
1982 à 1990", Progrès Urol., 7/647-54 (1997) 3. World Health Organization, International Agency for
Research on Cancer & International Association of
Cancer Registries, "Age-standardized and cumulative incidence : rates and standard errors. Prostate (ICD-
9 185)", IARC, pp 970-1 (1992) 4. Starney TA., Yang N., Hay AR. & al, "Prostate
Spécifie Antigen is the serum marker for
Adenocarcinoma of the prostate", New Engl. J Med.,
317 :909 (1987) 5. Wang MC., Valenzuela LA., Murphy GP. & Chu TM., "Purification of a human Prostate Spécifie Antigen",
Invest. Urol., 17 :159 6. Real-time BIA, "Biospecific Interaction Analysis",
Guide to methods and Applications, BIAcore Methods
Manual., chap. 10, pp 1-8.

7. Catalona WJ., Smith DS., Wolfert RL., Wang TJ.,
Rittenhouse HG., Ratliff TL. & al, "Evaluation of percentage of free serum prostate spécifie antigen to

improve specificity of prostate cancer screening",
JAMA, 274 :1214-20 (1995).

8. Bangma CH., Kranse R., Blijenberg BG., Schrôder FH., "Free and total prostate specific antigen in a screened population", Br J. Urol., 79 :756-62 (1997).

Claims

REVENDICATIONS

1. Procédé de dosage de l'antigène spécifique de la prostate total (PSAt) ou de l'antigène spécifique de la prostate non-complexé (PSAnc) dans un échantillon sanguin, qui consiste, selon la technique sandwich sur phase solide, à : a) immobiliser sur une phase solide au moins une substance de capture capable de se lier sur un site antigénique du PSAt ou du PSAnc tout en ne modifiant pas sa conformation, obtenant ainsi une phase solide piégeante pour le PSAt ou le PSAnc ; b) mettre en contact l'échantillon sanguin à tester avec la phase solide telle qu'issue de l'étape a), piégeant ainsi le PSAt ou le PSAnc présent dans ledit échantillon ; c) mettre en contact la phase solide telle qu'issue de l'étape b) avec au moins une substance de détection marquée capable de se lier au PSAt ou au PSAnc sur un site antigénique de celui-ci, différent de celui sur lequel se lie ladite substance de capture ; et à d) évaluer la quantité de ladite au moins une substance de détection marquée qui s'est liée au PSAt ou au PSAnc ; caractérisé en ce qu'il utilise : - comme substance de capture, pour doser le PSAnc, une substance capable uniquement de se lier sur un site antigénique du PSA qui n'est accessible que lorsque le PSA est sous la forme non-complexé, - comme substances de détection, au moins un couple de substances capables de se lier sur au moins deux sites antigéniques du PSAt et du PSAnc différents l'un de l'autre et différents de celui sur lequel s'est lié ladite au moins une substance de capture, ledit couple de substances de détection étant le même pour le dosage du PSAt et pour celui du PSAnc.

2. Procédé appliqué au dosage du PSAt selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite substance de capture consiste en l'anticorps monoclonal UROG-PSA01 déposé à l'Institut Pasteur sous le n I 2538, ou toute substance capable d'entrer en compétition avec lui pour ce qui est de se fixer sur le PSAt.

3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que ladite substance de capture est un anticorps monoclonal anti-PSA de type IgG2b.

4. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que ladite substance de capture est sélectionnée dans le groupe consistant en les peptides, les polysaccharides et les fragments d'anticorps recombinant.

5. Procédé appliqué au dosage du PSAnc selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite substance de capture consiste en l'anticorps monoclonal UROG-PSA06 déposé à l'Institut Pasteur sous le n I 2541, ou toute substance capable d'entrer en compétition avec lui pour ce qui est de se fixer sur le PSAnc.

6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que ladite substance de capture est un anticorps monoclonal anti-PSA de type IgGl.

7. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que ladite substance de capture est sélectionnée dans le groupe consistant en les peptides, les polysaccharides et les fragments d'anticorps recombinant.

8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que lesdites substances de détection marquées consistent en les anticorps monoclonaux UROG-PSA02 et UROG-PSA05, respectivement déposés à l'Institut Pasteur sous les n I 2539 et I 2540, ou tout couple de substances capables d'entrer en compétition avec eux pour ce qui est de se fixer sur le PSAt ou le PSAnc.

9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que lesdites substances de détection marquées sont des anticorps monoclonaux anti-PSA de type IgGl et/ou IgG2b.

10. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que lesdites substances de détection sont sélectionnées dans le groupe consistant en les peptides, les polysaccharides et les fragments d'anticorps recombinants.

11. Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que lesdites substances de détection sont biotinylées.

12. Kit pour la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les éléments suivants : a) au moins une substance de capture immobilisée sur une phase solide et capable de se lier à un site antigénique du PSAt ou du PSAnc, la substance de capture, en ce qui concerne le PSAnc, étant une substance capable uniquement de se lier sur un site antigénique du PSA qui n'est accessible que lorsque le PSA est sous la forme noncomplexée ; b) au moins un couple de substances de détection marquées capables de se lier sur au moins deux sites antigéniques différents l'un de l'autre et différents de celui sur lequel se lie ladite au moins une substance de capture ; ledit couple de substances étant le même pour le dosage du PSAt et pour celui du PSAnc ; et c) au moins un réactif nécessaire à la révélation des substances de détection marquées liées au PSAt ou au PSAnc.

13. Kit selon la revendication 12 appliqué au dosage du PSAt, caractérisé en ce que ladite substance de capture est l'anticorps monoclonal anti-PSA UROG-PSA01 déposé à l'Institut Pasteur sous le n I 2538, ou toute substance capable d'entrer en compétition avec lui pour ce qui est de se fixer sur le PSAt.

14. Kit selon la revendication 12 appliqué au dosage du PSAnc, caractérisé en ce que ladite substance de capture est l'anticorps monoclonal anti-PSA UROG-PSA06 déposé à l'Institut Pasteur sous le n I 2541, ou toute substance

capable d'entrer en compétition avec lui pour ce qui est de se fixer sur le PSAnc.

15. Kit selon l'une des revendications 12 à 14, caractérisé en ce que lesdites substances de détection marquées sont les anticorps monoclonaux UROG-PSA02 et UROGPSA05, déposés respectivement à l'Institut Pasteur sous les n I 2539 et I 2540 ou tout couple de substances capables d'entrer en compétition avec eux pour ce qui est de se fixer sur le PSAt ou le PSAnc.

16. Kit selon l'une des revendications 12 à 15, caractérisé en ce que lesdites substances de détection marquées sont biotinylées.

17. Procédé de diagnostic in vitro et/ou de pronostic in vitro du cancer de la prostate qui consiste à : a) mettre en oeuvre le procédé selon l'une quelconque des revendications 2 à 4 et 8 à 11, lorsque ces dernières sont dépendantes de l'une au moins des revendications 2 à 4 ; b) en fonction de la quantité de PSAt obtenue : # soit à déclarer le diagnostic négatif, si cette quantité est inférieure à 4 ng/ml ; # soit à déclarer le diagnostic positif, si cette quantité est supérieure à 10 ng/ml ; # soit à déclarer le diagnostic potentiellement positif, si cette quantité est comprise entre

4 et 10 ng/ml, et à compléter ce test en mettant en oeuvre le procédé de dosage du PSAnc selon l'une des revendications 5 à 7 et 8 à 11, lorsque ces dernières sont dépendantes de l'une au moins des revendications 5 à 7, puis c) en fonction du rapport entre le PSAnc et le PSAt : # soit à déclarer le diagnostic négatif, si ce rapport est inférieur à un seuil critique ; # soit à déclarer le diagnostic potentiellement positif, si ce rapport est supérieur audit seuil critique, et à affiner le résultat en mettant en

ADN extraits à l'étape ii), sur au moins quatre régions chromosomiques indépendantes.

oeuvre un procédé complémentaire qui comprend les étapes suivantes : i) récolter des cellules d'origine prostatique ; ii) extraire séparément les ADN et les ARN totaux des cellules récoltées à l'étape i) ; iii) caractériser les cellules récoltées à l'étape i) par l'analyse de marqueurs spécifiques des cellules prostatiques et cancéreuses à partir des ARN extraits en ii) ; iv) rechercher toute altération chromosomique détectée par perte d'hétérozygotie, à partir des

18. Anticorps monoclonal anti-PSA UROG-PSA01, déposé à l'Institut Pasteur sous le n I 2538.

19. Anticorps monoclonal anti-PSA UROG-PSA02, déposé à l'Institut Pasteur sous le n I 2539.

20. Anticorps monoclonal anti-PSA UROG-PSA05, déposé à l'Institut Pasteur sous le n I 2540.

21. Anticorps monoclonal anti-PSA UROG-PSA06, déposé à l'Institut Pasteur sous le n I 2541.