FR2811335A1

FR2811335A1 - Methode de determination d'un modele cellulaire in vitro permettant de mimer le profil d'expression d'un gene d'interet dans une cellule in vivo

Info

Publication number: FR2811335A1
Application number: FR0008991A
Authority: FR
Inventors: Virginie Dangles; Vladimir Lazar; Dominique Bellet
Original assignee: EPIGENE
Current assignee: EPIGENE
Priority date: 2000-07-10
Filing date: 2000-07-10
Publication date: 2002-01-11
Also published as: WO2002004654A2; AU7757201A

Abstract

La présente invention concerne une méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire permettant de mimer le profil d'expression d'un gène d'intérêt dans une cellule ou tissu de cellules cibles in vivo, de préférence des cellules cibles présentant un caractère tumoral. L'invention concerne également un procédé d'identification ou de confirmation d'un gène dont l'expression est susceptible d'être significativement différente ou identique entre une cellule cible in vivo normale et ladite cellule cible in vivo anormale. La présente invention concerne également un procédé de sélection de composé susceptible d'être utilisé comme médicament pour traiter et/ ou prévenir les pathologies induites par une altération de l'expression d'un gène d'intérêt. L'invention concerne enfin l'utilisation desdits modèles in vitro ainsi déterminés, notamment les modèles de type sphéroïde en 3 dimensions comme modèle pertinent d'étude d'expression d'au moins un gène d'intérêt.

Description

La présente invention concerne une méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire permettant de mimer le profil d'expression d'un gène d'intérêt dans une cellule ou tissu de cellules cibles in vivo, de préférence des cellules cibles présentant un caractère tumoral. L'invention concerne également un procédé d'identification ou de confirmation d'un gène dont l'expression est susceptible d'être significativement différente ou identique entre une cellule cible in vivo normale et ladite cellule cible in vivo anormale. La présente invention concerne également un procédé de sélection de composé susceptible d'être utilisé comme médicament pour traiter et/ou prévenir les pathologies induites par une altération de l'expression d'un gène d'intérêt.

L'invention concerne enfin l'utilisation desdits modèles in vitro ainsi déterminés, notamment les modèles de type sphéroïde en 3 dimensions comme modèle pertinent d'étude d'expression d'au moins un gène d'intérêt.

Les milliers de cellules qui composent un organisme humain représentent plus qu'un simple réseau biochimique de protéines codées par des gènes et obéissant à des lois chimiques. Elles constituent une entité physique avec une structure spatiale tridimensionnelle et sont soumises à des lois physiques (1) : les cellules individuelles répondent à des forces mécaniques qui jouent un rôle central pendant la vie cellulaire.

Ainsi, par exemple, une cellule normale de Mammifère, dans un même milieu biochimique, peut se diviser, se différencier ou bien entrer en apoptose, uniquement d'après la forme géométrique imposée par le milieu externe (2). Afin de mieux comprendre les mécanismes de l'oncogénèse, la complexité structurelle et mécanique des tissus vivants doit être prise en compte dans les études.

En génomique et en pharmacogénomique, le profil d'expression de gènes est le plus souvent déterminé sur des lignées cellulaires en strate unique (deux-dimensions) ou en suspension. Or, l'organisme humain a une structure spatiale en trois-dimensions et est soumis aux lois physiques. De plus, chacune des milliers de cellules (environ 10 000 milliards) qui composent un organisme humain répond à des forces mécaniques qui jouent un rôle central durant la vie cellulaire. Par exemple, dans le même milieu biochimique, une cellule humaine se durcira, se différenciera ou aura une mort cellulaire programmée qui sera très dépendante de la forme géométrique imposée par le milieu externe.

Ainsi, il reste un grand besoin de disposer d'une méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire permettant de mimer le profil d'expression de gène (s) dans une cellule ou tissu de cellules cibles in vivo, en particulier pour des cellules cibles in vivo présentant un caractère tumoral.

Une telle méthode permettrait de disposer d'un modèle in vitro reproduisant fidèlement l'architecture cellulaire des cellules cibles in vivo, notamment de tumeur, et son influence sur l'expression des gènes, modèle qui serait ainsi déterminé en fonction de la nature (type de cellule, fonction associée, tissu dont elles sont issues, patrimoine génétique etc. ) et l'état (normal ou anormal), des cellules cibles choisies.

Une telle méthode permettrait non seulement d'identifier ou de confirmer la présence d'un gène d'intérêt dans la cellule cible dont l'expression est susceptible d'être significativement différente ou identique entre une cellule cible in vivo normale et ladite cellule cible in vivo anormale, mais également la possibilité d'utiliser ce modèle ainsi déterminé et spécifique de l'état et la nature des cellules cibles choisies comme modèle d'étude des mécanismes d'altération de fonctions cellulaires, telle que l'oncogénèse, ou comme modèle de sélection de composé destiné à la préparation de médicament pour traiter et/ou prévenir les pathologies induites par une altération de l'expression de ce ou ces gènes d'intérêt.

La détermination d'un tel modèle et son utilisation pour réaliser des manipulations in vitro de type thérapeutique (essai et sélection de composé susceptible de prévenir ou traiter certaines pathologies, comme le cancer) et/ou génétique (essai de traitement par thérapie génique pour modifier ou rétablir l'expression de gènes d'intérêt cibles) et/ou pharmacogénétique (modélisation in vitro de la prédiction de réponse au traitement) permettraient sans aucun doute de valider et/ou de rendre beaucoup plus pertinents les résultats obtenus dans les études de l'expression de gènes, notamment en génomique et en pharmacogénomique.

Ceci est justement l'objet de la présente invention.

Dans ce contexte, les inventeurs ont étudié l'influence de l'architecture cellulaire des tumeurs sur l'expression des gènes clés impliqués dans le processus tumoral, caractérisé par des changements permanents dans le génome. Pour cela, l'expression de gènes a été comparée pour différents modèle in vivo, ces gènes étant connus pour contribuer aux principales altérations dans la physiologie cellulaire et qui, ensemble,

sont responsables de la transformation maligne (3). Ces gènes ont été quantifiés par PCR quantitative en temps réel dans des pièces de cystectomie de patients atteints de cancers vésicaux et dans les lignées de cellules tumorales établies à partir de ces tumeurs. Ces lignées cellulaires sont étudiées en suspension, en tapis cellulaire ou bien encore en sphéroïdes composées de 2 000 à 20 000 cellules. Il a été observé que l'architecture cellulaire de la tumeur (structure en 2 ou 3 dimensions et volume) a un impact majeur sur l'expression des gènes : des variations jusqu'à 675 fois sont observées entre les cellules tumorales en suspension, les cellules tumorales en deux dimensions (2D) (tapis cellulaires) et en 3D (sphéroïdes de différentes tailles). En considérant l'expression des gènes dans les échantillons tumoraux comme représentative des profils d'expression des gènes in vivo, il a été trouvé par exemple que le modèle 3D in vitro des sphéroïdes miment plus fidèlement l'expression des gènes in vivo par rapport aux modèles habituels que sont les modèles in vitro de suspensions et de tapis cellulaires. Ces observations rapportent : i) l'influence de la géométrie des cellules tumorales sur les profils d'expression des gènes impliqués dans la prolifération maligne, ii) l'importance de prise en compte de la complexité structurelle et mécanique des cellules avant d'interpréter des profils d'expression; ii) l'intérêt ici du modèle 3D in vitro des sphéroïdes pour l'étude des profils d'expression de gènes dans une tumeur.

La présente invention a donc pour objet une méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire permettant de mimer le profil d'expression d'un gène d'intérêt dans une cellule ou tissu de cellules cibles in vivo, caractérisée en ce que ladite méthode comprend les étapes suivantes : a) le prélèvement in vivo d'un premier échantillon desdites cellules cibles et la sélection d'au moins un deuxième échantillon in vitro de référence pour lesdites cellules cibles prélevées in vivo, ledit deuxième échantillon in vitro de référence ayant une architecture cellulaire donnée spécifique à sa préparation ; b) la réalisation du profil d'expression dudit gène d'intérêt par lesdites cellules cibles pour ledit premier échantillon et ledit au moins deuxième échantillon ; c) la comparaison des profils d'expression obtenus à l'étape b) ; a) la sélection comme modèle in vitro d'architecture cellulaire, l'architecture cellulaire de l'échantillon in vitro de référence si celui-ci permet de mimer le profil

d'expression dudit gène d'intérêt par lesdites cellules cibles du premier échantillon prélevé in vivo.

Par deuxième échantillon in vitro de référence pour lesdites cellules cibles , on entend désigner un échantillon de cellules dont la nature et/ou l'état s'apparente auxdites cellules cibles prélevées in vivo.

En général, cet échantillon in vitro de référence pour lesdites cellules cibles sera issu de culture de lignées cellulaires, ces lignées ayant été établies à partir de prélèvement autologue ou hétérologue desdites cellules cibles prélevées in vivo.

De préférence, ledit échantillon in vitro de référence pour lesdites cellules cibles sera issu de culture de lignées cellulaires présentant le même patrimoine génétique que les cellules cibles prélevées in vivo.

Par réalisation du profil d'expression de gène(s) , pour un gène d'intérêt donné ou pour plusieurs gènes d'intérêt donnés, on entend désigner la détermination quantitative et/ou qualitative du produit de ce ou ces gènes (transcript ou peptide correspondant), de préférence au moins la quantification de leur transcript (ARNm ou ADNc correspondant).

De tels profils d'expression peuvent être aisément réalisés par des méthodes bien connues de l'homme de l'art, méthodes qui, lorsqu'il s'agit de déterminer un profil quantitatif et/ou qualitatif d'expression de transcript, nécessitent généralement l'utilisation d'amorces et/ou de sondes dessinées à partir des séquences nucléiques connues pour ce ou ces gènes d'intérêt dont ledit profil sera réalisé pour déterminer ledit modèle.

Généralement, ces méthodes mettent en #uvre la technique dite de PCR (Amplification en Chaîne à la Polymérase) ou une technique apparentée, telle que la RT-PCR, méthode comprenant au préalable la Réverse Transcription de l'ARNm en ADNc.

De préférence, ces techniques de PCR ou RT-PCR, ou apparentées, seront des PCR de type quantitatif permettant d'évaluer la quantité d'ARNm présente initialement dans l'échantillon testé, généralement au moyen d'un standard interne de quantité initiale connue capable d'être amplifié de la même manière.

Les méthodes permettant de déterminer quantitativement et/ou qualitativement le produit de traduction en peptide d'un gène choisi sont également bien connues de

l'homme de l'art. On peut en particulier citer, mais sans s'y limiter, les techniques basées sur les réactions anticorps antipeptide/peptide hautement spécifiques et capables d'évaluer avec précision la quantité de peptide présent dans un échantillon, notamment par la technique dite d'ELISA.

Par comparaison des profils d'expression , à l'étape c), on entend désigner la comparaison des profils d'expression pour le ou les gènes d'intérêt testés pour les cellules cibles in vivo dont on veut déterminer le modèle in vitro le plus proche pour l'expression de ces gènes. Ladite comparaison se fera par exemple par observation du profil d'expression obtenu pour le gène d'intérêt, celui desdits échantillons in vitro de référence mimant le mieux l'expression de ce gène d'intérêt dans les cellules cibles prélevées in vivo, étant retenu comme modèle d'architecture cellulaire pour ces cellules cibles in vivo.

Par modèle in vitro permettant de mimer le profil d'expression d'un gène d'intérêt , on entend désigner le modèle d'architecture cellulaire in vitro dont le profil d'expression pour le gène d'intérêt testé se rapproche au mieux du profil obtenu pour ce même gène dans les cellules cibles prélevées in vivo.

De préférence, le modèle d'architecture cellulaire in vitro retenu permettra de confirmer un niveau d'expression connu pour être significativement différent ou identique entre une cellule cible in vivo anormale et ladite cellule cible in vivo normale, pour au moins ledit gène d'intérêt testé.

Dans un mode de réalisation préféré, l'invention est relative à une méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'invention, caractérisée en ce que ledit au moins deuxième échantillon in vitro de référence pour lesdites cellules cibles prélevées in vivo est issu de culture de lignées cellulaires établies à partir de prélèvement in vivo autologue ou hétérologue, de préférence autologue, desdites cellules cibles.

Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, l'invention est relative à une méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'invention, caractérisée en ce que ledit au moins deuxième échantillon in vitro de référence pour lesdites cellules cibles prélevées in vivo est issu de culture de lignées cellulaires présentant le même patrimoine génétique que lesdites cellules cibles prélevées in vivo.

L'invention concerne de préférence une méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'invention, caractérisée en ce que ledit prélèvement in vivo du premier échantillon de cellules cibles est un échantillon de cellules cibles anormales, en particulier un échantillon de cellules cibles présentant un caractère tumoral.

L'invention concerne de préférence une méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'invention, caractérisée en ce que ladite architecture cellulaire donnée spécifique à la préparation dudit échantillon in vitro de référence est choisie parmi les architectures cellulaires suivantes : - l'architecture cellulaire en 3 dimensions de type sphéroïde, ladite architecture cellulaire en 3 dimensions pouvant comprendre un nombre variable de cellules ; - l'architecture cellulaire obtenue pour une suspension cellulaire dans laquelle chacune ou la grande majorité des cellules sont en suspension ; et - l'architecture cellulaire obtenue pour une couche cellulaire dans laquelle les cellules forment un tapis cellulaire en 2 dimensions.

Parmi les architectures cellulaires en 3 dimensions de type sphéroïde, on peut citer en particulier les architectures cellulaires en 3 dimensions pouvant comprendre au minimum 50, 100,200, 500,1 000,2 000,5 000,10 000 et 20 000 cellules, de manière plus préférée comprenant un nombre de cellules compris entre 2 000 et 10 000 cellules.

Bien entendu, si nécessaire, la présente méthode selon l'invention permettra de définir une valeur approximative du nombre de cellules nécessaire dans l'architecture cellulaire en 3 dimensions de type sphéroïde pour obtenir le modèle in vivo permettant de mimer le profil d'expression dudit gène d'intérêt dans une cellule ou tissu de cellules cibles in vivo.

Dans ce cas, il suffira d'établir le profil d'expression desdits gènes choisis pour des architectures cellulaires en 3 dimensions de type sphéroïde, dans lesquels sphéroïdes la quantité de cellules sera variable, et choisir comme quantité de cellules devant être approximativement contenue dans ce modèle sphéroïde celle contenue dans le sphéroïde pour lequel le profil obtenu mimera au mieux le profil d'expression dudit gène d'intérêt obtenu pour le prélèvement de cellules cibles in vivo.

L'invention concerne de préférence une méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'invention, caractérisée en ce que ledit au moins

deuxième échantillon in vitro de référence possède une architecture cellulaire en 3 dimensions de type sphéroïde.

L'invention concerne de préférence une méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que : - on sélectionne à l'étape a) un troisième échantillon in vitro de référence pour lesdites cellules cibles, ledit troisième échantillon in vitro de référence ayant une architecture cellulaire donnée spécifique à sa préparation et différente de celle dudit deuxième échantillon ; - on réalise à l'étape b) le profil d'expression dudit gène d'intérêt par lesdites cellules cibles pour lesdits premier, deuxième et troisième échantillons ; - on compare les profils d'expression obtenus à l'étape b) ; - on sélectionne comme modèle in vitro d'architecture cellulaire, l'architecture cellulaire de l'échantillon in vitro de référence permettant de mimer le mieux le profil d'expression dudit gène d'intérêt par lesdites cellules cibles du premier échantillon prélevé in vivo.

Par échantillon in vitro de référence ayant une architecture cellulaire donnée différente de celle d'un autre échantillon in vitro de référence , on entend désigner de un échantillon in vitro de référence ayant une architecture cellulaire donnée différente de celle de l'échantillon in vitro de référence préalablement choisi.

Par exemple et de préférence, l'échantillon in vitro de référence présentera par une architecture cellulaire obtenue pour une suspension cellulaire ou une architecture cellulaire obtenue pour une couche cellulaire en 2 dimensions, si l'échantillon in vitro de référence préalablement choisi a une architecture cellulaire en 3 dimensions de type sphéroïde.

Par échantillon in vitro de référence ayant une architecture cellulaire donnée différente de celle d'un autre échantillon in vitro de référence , on pourra distinguer si nécessaire un échantillon in vitro de référence présentant par exemple une architecture cellulaire en 3 dimensions de type sphéroïde contenant un nombre X donné de cellules, si l' autre échantillon in vitro de référence à une architecture cellulaire en 3 dimensions de type sphéroïde contenant nombre Y donné de cellules, les nombres X et Y étant

choisis de telle sorte que le profil d'expression de gènes obtenu pour chacun de ces sphéroïdes soient significativement différent.

L'invention concerne de préférence une méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'invention, caractérisée en ce que : - on sélectionne à l'étape a) un quatrième échantillon in vitro de référence pour lesdites cellules cibles, ledit quatrième échantillon in vitro de référence ayant une architecture cellulaire donnée spécifique à sa préparation et différente de celle desdits deuxième et troisième échantillons ; - on réalise à l'étape b) le profil d'expression dudit gène d'intérêt par lesdites cellules cibles pour lesdits premier, deuxième, troisième et quatrième échantillons ; - on compare les profils d'expression obtenus à l'étape b) ; - on sélectionne comme modèle in vitro d'architecture cellulaire, l'architecture cellulaire de l'échantillon in vitro de référence permettant de mimer le mieux le profil d'expression dudit gène d'intérêt par lesdites cellules cibles du premier échantillon prélevé in vivo.

L'invention concerne de préférence une méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'invention, caractérisée en ce que ledit profil d'expression dudit gène d'intérêt à l'étape b) est réalisé pour au moins un gène dont l'expression est représentative ou susceptible d'être représentative de l'état desdites cellules cibles prélevées in vivo.

L'invention concerne de préférence une méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire, caractérisée en ce que ledit profil d'expression dudit gène d'intérêt à l'étape b) est réalisé pour au moins un gène d'intérêt choisi parmi le groupe de gènes suivant : - un gène dont l'expression est représentative ou susceptible d'être représentative de l'état d'anormalité de ladite cellule cible ; et/ou - un gène dont l'expression est liée au moins en partie à une pathologie induite par une altération de cette expression, notamment à un cancer ; et/ou - un gène dont la séquence est connue pour présenter un polymorphisme associé à une pathologie, notamment un cancer ; et/ou - un gène dont on cherche à comparer l'expression entre une cellule normale et une cellule anormale ; et/ou

- dont on cherche à modifier l'expression dans lesdites cellules cibles du premier échantillon prélevé in vivo.

L'invention concerne de préférence une méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'invention, caractérisée en ce que ledit profil d'expression dudit gène d'intérêt à l'étape b) est réalisé pour au moins un gène dont on cherche à modifier l'expression dans lesdites cellules cibles par un composé susceptible d'être utilisé pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à prévenir et/ou à traiter une pathologie induite par l'état d'anormalité desdites cellules cibles du premier échantillon prélevé in vivo.

L'invention concerne de préférence une méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'invention, caractérisée en ce que ledit profil d'expression dudit gène d'intérêt à l'étape b) est réalisé pour au moins un gène dont l'expression est représentative ou susceptible d'être représentative du caractère tumoral desdites cellules cibles du premier échantillon prélevé in vivo.

L'invention concerne de préférence une méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'invention, caractérisée en ce que ledit modèle in vitro d'architecture cellulaire permettant de mimer le profil d'expression dudit gène d'intérêt dans une cellule ou tissu de cellules cibles in vivo ainsi déterminé, permet de confirmer un niveau d'expression connu pour être significativement différent ou identique entre une cellule cible in vivo anormale et ladite cellule cible in vivo normale, pour au moins ledit gène d'intérêt.

L'invention concerne de préférence une méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'invention, caractérisée en ce que l'architecture cellulaire de l'échantillon in vitro de référence est sélectionnée comme modèle in vitro d'architecture cellulaire si le profil d'expression dudit gène d'intérêt dans ladite architecture cellulaire sélectionnée permet d'observer une quantité de produit du gène d'intérêt, de préférence son ARNm, exprimée par lesdites cellules cibles comprises entre au plus 7 fois plus et au moins 7 fois moins, de manière plus préférée comprise entre 6 fois plus et au moins fois moins, entre 5 fois plus et au moins 5 fois moins, et entre 4 fois plus et au moins 4 fois moins la quantité observée pour le même produit dudit gène d'intérêt exprimé par lesdites cellules cibles de l'échantillon prélevé in vivo.

L'invention concerne de préférence une méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'invention, caractérisée en ce que dans ladite architecture cellulaire sélectionnée ladite quantité de produit du gène d'intérêt exprimée par lesdites cellules cibles est comprise entre au plus 3 fois plus et au moins 3 fois moins la quantité observée pour le même produit dudit gène d'intérêt exprimé par lesdites cellules cibles de l'échantillon prélevé in vivo.

L'invention concerne de préférence une méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'invention, caractérisée en ce que ledit profil d'expression de gène (s) l'étape b) est réalisé pour au moins un gène choisi parmi le groupe de gènes comprenant les gènes suivants : - les gènes liés à l'échappement à l'apoptose : c-myc, Fas, Fas-L, p53, Bcl2, cas 8,
Cas 9, IGF 1, IGF 2, hCGss; - les gènes liés à la néoangiogénèse : VEGF, P53, ras; - les gènes liés au potentiel de réplication illimité : télomérase, ras, p16, CDK4 ; - les gènes liés à l'invasion et aux métastases : héparanase, E-cadhérine, UPAR, vimentine, cytokératine 8, intégrine alpha ; - les gènes liés à l'insensibilité des signaux inhibiteurs de croissance : c-myc, c-fos, c- jun, TGBss, p15, p16, p21, CDK4, Cycline D1; - les gènes liés à l'autosuffisance vis-à-vis des signaux de croissance : TGF[alpha], EGF-R., ras.

L'invention concerne de préférence une méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'invention, caractérisée en ce que ledit profil d'expression de gène (s) l'étape b) est réalisé pour au moins un gène choisi parmi le groupe de gènes comprenant les gènes CGss, c-fos, c-myc et intégrine a E précurseur, de préférence humain.

L'invention concerne de préférence une méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'invention permettant de mimer le profil d'expression d'un gène d'intérêt particulier pris parmi un groupe d'au moins deux gènes d'intérêt dans une cellule ou tissu de cellules cibles in vivo, caractérisée en ce ladite méthode comprend les étapes suivantes : a) le prélèvement in vivo d'un premier. échantillon desdites cellules cibles et la sélection d'au moins n échantillons in vitro de référence pour lesdites cellules cibles prélevées

in vivo, lesdits n échantillons in vitro de référence ayant une architecture cellulaire donnée spécifique à leur préparation et différente entre elles ; b) la réalisation du profil d'expression desdits gènes d'intérêt par lesdites cellules cibles pour ledit premier échantillon et lesdits n échantillons in vitro de référence ; c) la comparaison des profils d'expression obtenus à l'étape b) pour chacun desdits gènes d'intérêt ; et d) la sélection comme modèle in vitro d'architecture cellulaire, l'architecture cellulaire de l'échantillon in vitro de référence permettant de mimer le mieux le profil d'expression dudit gène d'intérêt particulier par lesdites cellules cibles du premier échantillon prélevé in vivo, n étant un nombre entier supérieur à 2, de préférence inférieur à 8, inférieur à 7, inférieur à 6, inférieur à 5, de manière plus préférée égal à 3.

L'invention concerne de préférence une méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'invention, caractérisée en ce que ledit profil d'expression dudit ou desdits gènes d'intérêt à l'étape b) est réalisé par une méthode de type PCR quantitative, de préférence par une méthode dite de PCR en temps réel.

L'invention concerne également de préférence une méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'invention, caractérisée en ce que les cultures desdites cellules cibles de l'échantillon prélevé in vivo, réalisées afin de préparer les échantillons de référence in vitro et présentant un modèle d'architecture donnée lié à leur préparation, sont effectuées dans le même milieu de culture.

Les procédés de préparation de modèle cellulaire in vitro ayant une architecture cellulaire donnée sont bien connus de l'homme de l'art et ne seront pas développés dans la présente description. On pourra citer mais sans s'y limiter, ceux décrits dans les exemples ci-après.

Sous un autre aspect, l'invention concerne de préférence un procédé d'identification d'un gène dont l'expression est susceptible d'être, ou de confirmation qu'un gène est exprimé de manière, significativement différente ou identique entre une cellule cible in vivo normale et ladite cellule cible in vivo anormale, caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes :

A) la détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire permettant de mimer le profil d'expression dudit gène d'intérêt dans une cellule ou tissu de cellules cibles anormales in vivo selon l'invention ; B) la comparaison du profil d'expression dudit gène d'intérêt obtenu à l'étape B) par les cellules cibles anormales du modèle in vitro déterminé et d'un profil d'expression dudit gène d'intérêt par lesdites cellules cibles normales in vivo ; et C) déterminer si ou confirmer que ledit gène est exprimé de manière significativement différente ou identique entre lesdites cellules cibles in vivo normales et anormales après comparaison desdits profils d'expression.

L'invention concerne également un procédé de sélection d'un composé capable de modifier l'expression d'un gène d'intérêt dans des cellules cibles anormales, de préférence de cellules cibles présentant un caractère tumoral, caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes : A) la détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire permettant de mimer le profil d'expression dudit gène d'intérêt dans lesdites cellules ou tissu desdites cellules cibles anormales in vivo selon l'invention ; B) la mise en présence du composé à tester avec ledit modèle in vitro ainsi déterminé ; C) la réalisation du profil d'expression dudit gène d'intérêt par lesdites cellules cibles dudit modèle in vitro obtenu à l'étape B) ; D) l'observation du profil d'expression obtenu à l'étape C) ; E) la sélection dudit composé si celui-ci permet de modifier l'expression dudit gène d'intérêt dans lesdites cellules cibles du modèle in vivo.

La présente invention a de préférence pour objet un procédé de sélection d'un composé selon l'invention, susceptible d'être utilisé pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à prévenir et/ou à traiter une pathologie induite par l'état d'anormalité desdites cellules cibles du premier échantillon prélevé in vivo.

L'invention concerne de préférence également un procédé de sélection d'un composé selon l'invention, susceptible d'être utilisé pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à prévenir et/ou à traiter le cancer.

L'invention concerne de préférence également un procédé de sélection d'un composé selon l'invention, caractérisé en ce que ledit composé est choisi parmi les composés suivants :

a) les composés susceptibles d'inhiber l'expression dudit gène d'intérêt ou l'activité fonctionnelle du produit d'expression dudit gène d'intérêt si ledit gène est surexprimé dans ladite cellule cible anormale ; b) les composés susceptibles de rétablir l'expression normale dudit gène d'intérêt ou l'activité fonctionnelle normale du produit d'expression dudit gène d'intérêt si ledit gène est sousexprimé dans ladite cellule cible anormale ou si l'activité fonctionnelle du produit d'expression dudit gène d'intérêt pour au moins une partie est anormale.

L'invention concerne de préférence également un procédé de sélection d'un composé selon l'invention, caractérisé en ce que ledit composé est choisi parmi les composés capables d'aboutir à une modification qualitative et/ou quantitative du produit d'expression normale dudit gène d'intérêt.

L'invention concerne de préférence également un procédé de sélection d'un composé selon l'invention, caractérisé en ce que ledit composé est choisi parmi les composés : a) une séquence nucléique sens ou antisens de la séquence dudit gène d'intérêt ; b) un fragment de la séquence dudit gène d'intérêt comprenant éventuellement une délétion, une insertion ou une substitution d'au moins un nucléotide par rapport à la séquence normale dudit gène d'intérêt.

Sous un dernier aspect, l'invention concerne l'utilisation d'une méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'invention pour l'identification d'un modèle pertinent d'étude in vitro d'expression d'au moins un gène d'intérêt dans une cellule cible in vivo.

L'invention comprend de préférence l'utilisation d'une méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'invention, pour l'identification d'un modèle pertinent d'étude in vitro d'expression d'au moins un gène d'intérêt dans une cellule cible in vivo anormale, de préférence présentant un caractère tumoral.

L'invention comprend de préférence l'utilisation d'une méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'invention, pour la sélection de composé chimique ou biochimique capable de modifier l'expression dudit gène d'intérêt, et/ou capable de prévenir ou de traiter une pathologie liée à la présence desdites cellules cibles anormales chez un individu.

L'invention comprend aussi l'utilisation d'une méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'invention, comme modèle pertinent d'étude de la prédiction d'une réponse d'un individu à un traitement thérapeutique.

L'invention comprend de préférence l'utilisation d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire de type sphéroïde déterminé par une méthode de détermination selon l'invention comme modèle pertinent d'étude in vitro d'expression d'au moins un gène d'intérêt dans une cellule cible in vivo.

L'invention comprend de préférence également l'utilisation d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire de type sphéroïde déterminé par une méthode de détermination selon l'invention, comme modèle pertinent d'étude in vitro d'expression d'au moins un gène d'intérêt dans une cellule cible in vivo anormale, de préférence présentant un caractère tumoral.

L'invention comprend de préférence également l'utilisation d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire de type sphéroïde déterminé par une méthode de détermination selon l'invention, comme modèle pertinent d'étude pour la sélection de composé chimique ou biochimique capable de modifier l'expression dudit gène d'intérêt, et/ou capable de prévenir ou de traiter une pathologie liée à la présence desdites cellules cibles anormales chez un individu.

L'invention comprend de préférence également l'utilisation d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire de type sphéroïde selon l'invention, caractérisée en ce que ledit modèle in vitro d'architecture cellulaire de type sphéroïde comprend un nombre de cellules dont la valeur est significative de l'expression dudit gène d'intérêt dans lesdites cellules cibles in vivo.

Les légendes des figures et exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée.

Légendes des figures Figures lA, 1B, 1C et 2 : d'expression de gènes d'intérêt obtenu à partir d'un fragment de tumeur vésicale (Tum 07) prélevé chez un patient : # obtenu pour l'échantillon prélevé in vivo sur la tumeur ("Tumeur") ; # obtenu pour une lignée cellulaire établie à partir d'un fragment de la tumeur prélevée in vivo : - pour une suspension cellulaire issue de cette lignée ("suspension"),

- pour un tapis cellulaire issu de cette lignée ("Strate unique"), - pour un sphéroïde comprenant environ 2 000 cellules ("sphéroïdes 2 000 cellules") ou 5 000 cellules ("sphéroïdes 5 000 cellules") issu de cette lignée cellulaire.

Les résultats représentent la quantité de transcripts (ARNm) exprimés dans les différents échantillons testés, cette quantité étant exprimée en nombre de fois la quantité exprimée pour l'échantillon de cellules cibles prélevé in vivo ("tumeur") dont la valeur a été prise comme référence (1,0000), et représentée à l'aide d'une échelle logarithmique.

Les figures lA, 1B, 1C et 2 représentent respectivement les valeurs obtenues pour les gènes d'intérêt hCGbêta, c-fos, intégrine alpha Eprécurseur et c-myc.

EXEMPLE 1 : et Méthodes A) Echantillons tumoraux
Les quatre échantillons tumoraux proviennent de cystectomie de patients atteints de cancer de la vessie en accord avec les règles éthiques de l'hôpital. Après la chirurgie, un fragment tumoral a été congelé dans l'azote liquide. Un autre fragment a été placé dans du milieu de culture afin d'établir des lignées de cellules tumorales selon les protocoles déjà décrits (6). L'histologie et le pourcentage de cellules viables de chaque échantillon ont été déterminés par un examen visuel de sections adjacentes colorées en hématoxyline et éosine.

B) Culture cellulaire in vitro
Tous les types de cultures sont cultivés dans le même milieu, du milieu de culture (RPMI 1640 avec 4x10-5 2-ss mercaptoethanol, 2 mM L-glutamine, 100 U/ml pénicilline, 100 ug/ml streptomycine, 1% de pyruvate de sodium, 0,1 mM d'acides aminés non essentiels) supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal décomplémenté et de 10 g/ml d'insuline. Les tapis cellulaires sont obtenus en platant 0,5x106 cellules par flasque de culture de 75 cm2. L'extraction d'ARN est faite sur des cultures subconfluentes. Les suspensions cellulaires, provenant de la trypsination des tapis cellulaires, sont resuspendues dans du milieu de culture pendant 1 heure à 37 C avant la préparation d'ARN. Les sphéroïdes de différentes tailles sont préparées dans des plaques 96 puits fond conique recouverts de poly (2 hydroxyethyl métacrylate) comme

décrit précédemment (7). Après 5 jours, les sphéroïdes contiennent un nombre moyen de 2 000, 5 000,10 000 ou 20 000 cellules et sont collectées pour l'extraction d'ARN C) Détermination des niveaux d'ARNm avec la PCR en temps réel
L'ARN total est extrait des échantillons tissulaires ou des cellules cultivées in vitro avec du RNAble en suivant les instructions du fournisseur. La concentration de l'ARN est déterminée à 260 nm et sa qualité est vérifiée sur gel d'électrophorèse classique. Un g d'ARN total de chaque échantillon est réverse transcrit dans un volume réactionnel de 20 (il avec 50 U de RT (Réverse Transcriptase) de MMLV, 20 U d'inhibiteur de RNase, 1 mM dA/T/G/C, 5 mM MgC12, 10 mM Tris HCl pH 8,3,10 mM KCl et 50 pM de random hexamers. Les ADNc sont dilués au 1/20 dans de l'eau dépourvue de nucléases. La PCR en temps réel est faite sur un SDS 7700 ABI Prism basé sur le principe de nucléase en 5'. Une sonde d'oligonucléotide marquée à son extrémité 5' avec un fluorochrome reporter, le Fam, et en 3' avec un fluorochrome quencher, le Tamra est présent lors de la phase d'extension de PCR. Cet oligonucléotide s'hybride à sa séquence complémentaire sur le produit de PCR mais ne peut conduire à une amplification. La dégradation de la sonde lors de l'amplification du produit de PCR libèrent les 2 fluorochromes et la fluorescence du reporter peut être suivie et mesurée, permettant une quantification en temps réel. Tout le protocole suit les instructions du fournisseur (Perkin-Elmer Applied Biosystems Inc., Foster City, CA). Les séquences des amorces et des sondes utilisés pour chaque gène sont les suivantes : - hCGss: CCCATCAATGCCACCCTG (SEQ ID NI), GCAGCACGCGGGTCAT (SEQ ID N 2), et 6FAM-TGCCCCGTGTGCATCACCG-TAMRA (SEQ ID N
3) ; - Fos: AAGAGAAAAGGAGAATCCGAAGG (SEQ ID N 4),
GCAGACTTCTCATCTTCTAGTTGGTCT (SEQ ID N 5), et 6FAM-
CCAAATGCCGCAACCGGAGGA-TAMRA (SEQ ID N 6) ; - Myc, ATTCTCTGCTCTCCTCGACGG (SEQ ID N 7),
AGACTGCCTCTTTTCCACAG (SEQ ID N 8), et 6FAM-
CATGAGGAGACACCGCCCACCA-TAMRA (SEQ ID N 9) , - L25851(précurseur de l'intégrine alpha E): ATGCAAAGGATGCTGGGTCT (SEQ ID N 10), AAGAAAATATCAACAACTGAACTTGGAG (SEQ ID N 11), et

6FAM-AGCAGGTCCTAATTCTCTTCTTCGAGCAGATTC-TAMRA (SEQ ID N 12).

La PCR en temps réel est réalisé avec de l'ADNc équivalent à 20 ng d'ARN total pour un volume réactionnel de 50 l avec le mix TaqMan PCR Universal Master.

Pour normaliser les différences de quantités d'ARN total servant à la réaction, l'ARN ribosomal 18S est amplifié comme contrôle. Pour quantifier les profils d'expression de chaque échantillon, nous avons utilisé la méthode Ct d'après les instructions du fournisseur. Les références sont constituées par les échantillons des tumeurs d'origine et tous les autres niveaux d'ARN sont exprimés en multiples de cette référence.

EXEMPLE 2 : Résultats obtenus
Les cancers de la vessie sont divisés en 2 groupes : les cancers invasifs et les cancers superficiels. La caractérisation des mécanismes de génétique moléculaire impliqués dans la progression des carcinomes vésicaux est importante à la fois pour l'identification de facteurs pronostics et pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques (4,5). Nous avons utilisé ces cellules cancéreuses comme modèle expérimental pour étudier l'influence de l'architecture spatiale tumorale sur l'expression génique. Quatre fragments de tumeurs vésicales ont été obtenus de patients après chirurgie et ont été utilisés pour établir quatre lignées autologues de cellules Tum 06, Tum 07, Tum 25 et Tum 266. Ces lignées cellulaires ont été utilisées en suspension ou en tapis cellulaires traditionnels ou bien sous forme de sphéroïdes multicellulaires (7) : ces sphéroïdes contenaient 2000,5000, 10000 ou 20000 cellules. Il a été montré que l'architecture de Tum 26 était représentative des quatre patients (résultat non figuré).

Cette lignée cellulaire a été utilisée en suspension cellulaire, en tapis cellulaire en 2D ou sphéroïdes en 3D. Ces architectures cellulaires observées in vitro ont été comparées à celle des cellules tumorales présentes dans le prélèvement tissulaire. Il a été observé que la lignée cellulaire Tum 26, aussi bien que les 3 autres lignées, forment des sphéroïdes qui sont identiques aux agrégats tumoraux trouvés dans les ascites lors de dissémination de carcinomes. En effet, les caractéristiques histologiques, dont le caractère compact, les nombreuses mitoses et les atypies nucléaires, nous permettent de conclure que ces microtumeurs de cellules carcinomateuses obtenues in vitro sont comparables à celles observées dans les analyses cytologiques d'ascite lors de métastases abdominaux,

confirmant ainsi l'intérêt de l'architecture de type sphéroïde comme modèle incontournable à tester pour déterminer le modèle d'architecture in vitro pertinent pour l'expression d'un gène d'intérêt dans des cellules cibles in vivo présentant un caractère tumoral.

Le profil d'expression des gènes impliqués dans la transformation maligne a été étudié dans les cellules de cancer de vessie présentées in vitro sous différentes conformations spatiales. Ces gènes ont été sélectionnés pour leur rôle dans les six altérations principales survenant dans la physiologie de la cellule lors de la croissance tumorale (3,9-14) : autosuffisance dans les signaux de croissance, insensibilité aux signaux inhibiteurs de croissance, échappement à l'apoptose, potentiel de réplication illimité, angiogénèse intense, et invasion tissulaire et métastases. La PCR quantitative en temps réel a été utilisée pour déterminer les niveaux d'ARN messagers (ARNm). Pour valider la méthode de PCR en temps réel, des courbes standard pour un gène donné et pour l'ARN ribosomal 18S ont été construites à partir des produits de PCR.

Les points d'amplification pour les ARNm des gènes d'intérêt testés et pour le contrôle endogène 18S ont été obtenus (résultat non figuré). L'efficacité de la courbe standard, déterminée par sa pente, permet de quantifier les expressions de gènes dans chaque échantillon. Pour chaque tumeur, la référence est constituée par le prélèvement tissulaire, tous les autres niveaux d'ARN observés dans les échantillons de culture cellulaire ont été exprimés comme des facteurs relatifs à cette référence.

En utilisant cette méthode, il a été trouvé que les profils d'expression génique peuvent être profondément modifiés selon l'architecture tumorale in vitro : par exemple, les transcripts CGB codant pour la sous-unité ss de l'hormone chorionique gonadotrope humaine (hCGss) présentent un niveau d'expression génique dans Tum 07 qui est 675 fois plus élevé dans les cellules en tapis cellulaire par rapport aux cellules cultivées en sphéroïdes composés de 5 000 cellules (cf. figure 1A). Ainsi, nous avons fréquemment observé que l'architecture tumorale conduit à des variations d'un facteur 10 dans l'expression des gènes et que ces fortes variations n'affectent pas seulement les gènes impliqués dans l'invasion tumorale et les métastases (précurseur de l'intégrine alpha E) mais aussi ceux impliqués dans les cinq autres voies essentielles qui dirigent la

croissance tumorale, comme l'invasion tumorale et les métastases (CGB, c-myc) ou l'insensibilité aux signaux anticroissance (c-myc, c-fos). L'ensemble de ces résultats montre que l'impact de l'architecture sur l'expression génique varie extrêmement selon à la fois l'architecture et le gène considérés. Il est à noter que la comparaison des profils d'expression entre les cellules normales et les cellules cancéreuses révèle que lorsque des transcripts sont exprimés à des niveaux significativement différents, ces niveaux entre les cellules saines et les cellules cancéreuses variaient (augmentation ou diminution) d'un facteur 10 à 13, du moins dans le côlon (16). Une autre étude réalisée dans le cancer du poumon non à petites cellules a montré que le niveau d'expression d'un gène dans le tissu normal était au plus 150 fois supérieur à celui de ce même gène dans la tumeur. Inversement, le niveau d'expression d'un gène dans la tumeur était au plus 57 fois supérieur au contrôle sain (17). En combinant la microdissection laser et les puces ADN pour suivre l'expression d'un gène in vivo dans des populations cellulaires purifiées normales et de cancer du sein, il a été trouvé après vérification par PCR en temps réel et immunochimie que les altérations dans l'expression génique variaient d'un facteur de 8 à 4018. Ces données antérieures et les observations ci présentes suggèrent fortement qu'il est nécessaire de tenir compte de l'architecture des cellules cultivées avant d'interpréter les profils d'expression observés in vitro.

Dans ce contexte, il a été ensuite étudié quel modèle in vitro représente le plus fidèlement les profils d'expression observés dans les prélèvements tumoraux. Pour cela, les profils d'expression observés dans les différents modèles in vitro ont été comparés à ceux des prélèvements tumoraux. Ainsi, il est certain que les profils présentés par les sphéroïdes sont souvent plus proches de ceux des échantillons tissulaires que ceux des suspensions ou des tapis cellulaires. Par exemple, il n'y a une différence que de 2,2 à 3 fois de l'expression de CGB entre les sphéroïdes Tum 07 et la tumeur d'origine alors que les cellules Tum 07 en suspension ou en tapis présentent une augmentation d'un facteur respectif 15 et 229 de l'expression du gène CGB comparé au prélèvement Tum 07 (cf. figure 1A). L'expression des transcripts CGB est associée à la transformation maligne des cellules non trophoblastiques et, en particulier, à la transformation des cellules urothéliales (11, 15).

Le taux d'expression d'un même gène peut varier plus de 600 fois en fonction de l'architecture cellulaire. Par exemple, les transcrits CGss (codant pour la sous-unité bêta de l'hormone chorionique gonadotrope) sont 675 fois plus abondants dans les cellules issues de la tumeur Tum 07 et formant une strate unique que dans les sphéroïdes composés de 5 000 cellules (Figure 1A). Par comparaison, il a été décrit que l'expression de gènes différemment exprimés dans une cellule normale et dans une cellule tumorale varie en moyenne d'un facteur de 10 à 13 (référence 16 de l'article).

Une autre étude montre que la différence d'expression de gènes entre tissus normal et tissus tumoral varie entre 8 à 40 fois (référence 18). Dans les cellules issues de la tumeur Tum07, cette modification est de 14 fois pour c-fos (Figure 1B), de 19 fois pour le gène codant le précurseur de l'intégrine alpha (L25851) (Figure 1C) ou de 10 fois pour le gène c-myc (Figure 2). Il est donc très surprenant de constater que la simple modification d'architecture influence fortement le niveau d'expression d'un gène.

Le modèle in vitro des sphéroïdes en 3 dimensions permet le plus souvent d'observer un profil d'expression de gènes qui mime celui observé in vivo. C'est par exemple ce qui a été observé dans les cellules issues de la tumeur Tum 07 pour les gènes codant l'hCG, Fos et le précurseur de l'intégrine (Figures lA, 1B, 1C).

Ces données suggèrent que les niveaux élevés d'expression de CGss dans les suspensions ou les tapis cellulaires pourraient être un artefact de culture cellulaire alors que les sphéroïdes reflètent mieux l'expression de CGss des cellules de la tumeur d'origine. Des observations similaires ont été faites pour de nombreux gènes dont c-fos et le gène codant le précurseur de l'intégrine alpha E. A l'inverse, les profils d'expression d'un nombre limité de gènes, dont c-myc, sont plus près des profils in vivo dans les cellules en 2D que dans les sphéroïdes. Finalement, l'ensemble de ces observations suggèrent que : i) il est nécessaire de sélectionner pour un gène donné le modèle in vitro mimant le mieux la réalité in vivo ; ii) le modèle 3D des sphéroïdes reflète mieux l'architecture 3D des tumeurs solides , iii) ce modèle in vitro pourrait être préférentiellement utilisé en biologie post-génomique (1).

Finalement, la grande influence de l'architecture tumorale sur l'expression des gènes impliqués dans la croissance tumorale cadre avec la récente suggestion selon laquelle le contrôle de la croissance au niveau de l'architecture tissulaire pourrait représenter une étape du processus de tumorigénèse (2). Ces observations requièrent que

nous replacions dans un plus grand contexte ce que nous avons appris sur l'expression génique afin que en post-génomique, nous prenions en compte l'architecture cellulaire, la micromécanique et donc la complexité structurelle des tissus.

Bibliographie 1. Huang, S. The practical problems of post-genomic biology Nat. Biotech. 18,471-472 (2000).

2. Huang, S. & Ingber, D.E. The structural and mechanical complexity of cell-growth control. Nat. Cell Biol. 1, E131-E138 (1999).

3. Hanahan, D. & Weinberg, RA. The hallmarks ofcancer. Cell 100, 57-70 (2000).

4. Esrig, D. et al. Accumulation of nuclear p53 and tumor progression in bladder cancer.

N. Engl. J. Med., 331,1259-1264 (1994).

5. OBrien, T., Cranston, D., Fuggle, S., Bicknell, R. & Harris, A.L. Different angiogenic pathways characterise superficial and invasive bladder cancer. Cancer Res.

55, 510-513 (1995).

6. Housseau, F., et al. MHC-dependent cytolysis of autologous tumor cells by lymphocytes infiltrating urothelial carcinomas. Int. J. Cancer, 71,585-594 (1997).

7. Dangles, V. et al. Two- and three-dimensional cell structures govem epidermal growth factor survival function in human bladder carcinoma cell lines. Cancer Res.57, 3360-3364 (1997).

8. Kunz-Schughart, L., Kreutz, M. & Knuechel, R. Multicellular spheroids : three- dimensional in vitro culture system to study tumour biology. Int. J. Exp. Path., 79,1-23 (1998).

9. Vlodavsky, I. et al. Mammalian heparanase: gene cloning, expression and function in tumor progression and metastasis. Nat. Med. 5,793-802 (1999).

10. Hulett, M. D. et al. Cloning of mammalian heparanase, an important enzyme in tumor invasion and metastasis. Nat. Med., 5,803-809 (1999).

11. Bellet, D. et al. Malignant transformation of nontrophoblastic cells is associated with the expression of chorionic gonadotropin D genes normally transcribed in trophoblastic cells. Cancer Res., 57,516-523 (1997).

12. Butler, S.A., Ikram, M. S. & Iles, R. K. The increase in bladder carcinoma cell population induced by the free beta subunit of human chorionic gonadotrophin is a result of an anti-apoptosis effect and not cell prolifération. Br. J Cancer 82,1553-1556 (2000).

13..Hendrix, M.J C., Seftor, E.A., Seftor RE.B. &Trevor K.T. Experimental coexpression of vimentin and keratin intermediate filaments in human breast cancer cells results in phenotypic interconversion and increased invasive behavior. Am. J. Pathol., 150, 483-495 (1997).

14. Gilles, C. et al. Vimentin expression in cervical carcinomas : with invasive and migratory potential. J Pathol. 180, 175-180 (1996).

15. Lazar, V. et al. Expression of human chorionic gonadotropin 0 subunit genes in superficial and invasive bladder carcinomas. Cancer Res., 55,3735-3738 (1995).

16. Zhang, L. et al. Gene expression profiles in normal and cancer cells. Science 276, 1268-1272 (1997).

17. Hibi, K. et al. Sériai analysis of gene expression in non-small cell lung cancer.

Cancer Res., 58,5690-5694 (1998).

18. Sgroi, D.C. et al. In vivo gene expression profile analysis of human breast cancer progression. Cancer Res., 59,5656-5661 (1999).

Claims

REVENDICATIONS

1/ Méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire permettant de mimer le profil d'expression d'un gène d'intérêt dans une cellule ou tissu de cellules cibles in vivo, caractérisée en ce que ladite méthode comprend les étapes suivantes : a) le prélèvement in vivo d'un premier échantillon desdites cellules cibles et la sélection d'au moins un deuxième échantillon in vitro de référence pour lesdites cellules cibles prélevées in vivo, ledit deuxième échantillon in vitro de référence ayant une architecture cellulaire donnée spécifique à sa préparation ; b) la réalisation du profil d'expression dudit gène d'intérêt par lesdites cellules cibles pour ledit premier échantillon et ledit au moins deuxième échantillon ; c) la comparaison des profils d'expression obtenus à l'étape b) ; d) la sélection comme modèle in vitro d'architecture cellulaire, l'architecture cellulaire de l'échantillon in vitro de référence si celui-ci permet de mimer le profil d'expression dudit gène d'intérêt par lesdites cellules cibles du premier échantillon prélevé in vivo.

2/ Méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit au moins deuxième échantillon in vitro de référence pour lesdites cellules cibles prélevées in vivo est issu de culture de lignées cellulaires établies à partir de prélèvement in vivo autologue ou hétérologue desdites cellules cibles.

3/ Méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que ledit au moins deuxième échantillon in vitro de référence pour lesdites cellules cibles prélevées in vivo est issu de culture de lignées cellulaires établies à partir de prélèvement in vivo autologue desdites cellules cibles.

4/ Méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ledit au moins deuxième échantillon in vitro de référence pour lesdites cellules cibles prélevées in vivo est issu de culture de lignées cellulaires présentant le même patrimoine génétique que lesdites cellules cibles prélevées in vivo.

5/ Méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ledit prélèvement in vivo du premier échantillon de cellules cibles est un échantillon de cellules cibles anormales.

6/ Méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon la revendication 5, caractérisée en ce que lesdites cellules cibles anormales présentent un caractère tumoral.

7/ Méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que ladite architecture cellulaire donnée spécifique à la préparation dudit échantillon in vitro de référence est choisie parmi les architectures cellulaires suivantes : - l'architecture cellulaire en 3 dimensions de type sphéroïde ; - l'architecture cellulaire obtenue pour une suspension cellulaire dans laquelle chacune ou la grande majorité des cellules sont en suspension ; et - l'architecture cellulaire obtenue pour une couche cellulaire dans laquelle les cellules forment un tapis cellulaire en 2 dimensions.

8/ Méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon la revendication 7, caractérisée en ce que ladite architecture cellulaire en 3 dimensions comprend un nombre de cellules supérieur à 50, de préférence compris entre 2 000 et 20 000 cellules.

9/ Méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que ledit au moins deuxième échantillon in vitro de référence possède une architecture cellulaire en 3 dimensions de type sphéroïde.

10/ Méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que : - on sélectionne à l'étape a) un troisième échantillon in vitro de référence pour lesdites cellules cibles, ledit troisième échantillon in vitro de référence ayant une architecture cellulaire donnée spécifique à sa préparation et différente de celle dudit deuxième échantillon ; - on réalise à l'étape b) le profil d'expression dudit gène d'intérêt par lesdites cellules cibles pour lesdits premier, deuxième et troisième échantillons ; - on compare les profils d'expression obtenus à l'étape b) ; et

- on sélectionne comme modèle in vitro d'architecture cellulaire, l'architecture cellulaire de l'échantillon in vitro de référence permettant de mimer le profil d'expression dudit gène d'intérêt par lesdites cellules cibles du premier échantillon prélevé in vivo.

11/ Méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon la revendication 10, caractérisée en ce que : - on sélectionne à l'étape a) un quatrième échantillon in vitro de référence pour lesdites cellules cibles, ledit quatrième échantillon in vitro de référence ayant une architecture cellulaire donnée spécifique à sa préparation et différente de celle desdits deuxième et troisième échantillons ; - on réalise à l'étape b) le profil d'expression dudit gène d'intérêt par lesdites cellules cibles pour lesdits premier, deuxième, troisième et quatrième échantillons ; - on compare les profils d'expression obtenus à l'étape b) ; et - on sélectionne comme modèle in vitro d'architecture cellulaire, l'architecture cellulaire de l'échantillon in vitro de référence permettant de mimer le profil d'expression dudit gène d'intérêt par lesdites cellules cibles du premier échantillon prélevé in vivo.

12/ Méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisée en ce que ledit profil d'expression dudit gène d'intérêt à l'étape b) est réalisé pour au moins un gène dont l'expression est représentative ou susceptible d'être représentative de l'état desdites cellules cibles prélevées in vivo.

13/ Méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisée en ce que ledit profil d'expression dudit gène d'intérêt à l'étape b) est réalisé pour au moins un gène d'intérêt choisi parmi le groupe de gènes suivant : - un gène dont l'expression est représentative ou susceptible d'être représentative de l'état d'anormalité de ladite cellule cible ; et/ou - un gène dont l'expression est liée au moins en partie à une pathologie induite par une altération de cette expression, notamment à un cancer ; et/ou - un gène dont la séquence est connue pour présenter un polymorphisme associé à une pathologie, notamment un cancer ; et/ou

- un gène dont on cherche à comparer l'expression entre une cellule normale et une cellule anormale ; et/ou - dont on cherche à modifier l'expression dans lesdites cellules cibles du premier échantillon prélevé in vivo.

14/ Méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisée en ce que ledit profil d'expression dudit gène d'intérêt à l'étape b) est réalisé pour au moins un gène dont on cherche à modifier l'expression dans lesdites cellules cibles par un composé susceptible d'être utilisé pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à prévenir et/ou à traiter une pathologie induite par l'état d'anormalité desdites cellules cibles du premier échantillon prélevé in vivo.

15/ Méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisée en ce que ledit profil d'expression dudit gène d'intérêt à l'étape b) est réalisé pour au moins un gène dont l'expression est représentative ou susceptible d'être représentative du caractère tumoral desdites cellules cibles du premier échantillon prélevé in vivo.

16/ Méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisée en ce que l'architecture cellulaire de l'échantillon in vitro de référence est sélectionnée comme modèle in vitro d'architecture cellulaire si le profil d'expression dudit gène d'intérêt dans ladite architecture cellulaire sélectionnée permet d'observer une quantité de produit du gène d'intérêt, de préférence son ARNm, exprimée par lesdites cellules cibles comprises entre au plus 7 fois plus et au moins 7 fois moins la quantité observée pour le même produit dudit gène d'intérêt exprimé par lesdites cellules cibles de l'échantillon prélevé in vivo.

17/ Méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon la revendication 16, caractérisée en ce que dans ladite architecture cellulaire sélectionnée ladite quantité de produit du gène d'intérêt exprimée par lesdites cellules cibles est comprise entre au plus 3 fois plus et au moins 3 fois moins la quantité observée pour le même produit dudit gène d'intérêt exprimé par lesdites cellules cibles de l'échantillon prélevé in vivo.

18/ Méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'une des revendications 1 à 17, caractérisée en ce que ledit profil d'expression de

Cas 9, IGF 1, IGF 2, hCGss; - les gènes liés à la néoangiogénèse : VEGF, P53, ras ; - les gènes liés au potentiel de réplication illimité : télomérase, ras, p16, CDK4 ; - les gènes liés à l'invasion et aux métastases : héparanase, E-cadhérine, UPAR, vimentine, cytokératine 8, intégrine alpha ; - les gènes liés à l'insensibilité des signaux inhibiteurs de croissance : c-myc, c-fos, c- jun, TGBss, p15, p16, p21, CDK4, Cycline Dl ; - les gènes liés à l'autosuffisance vis-à-vis des signaux de croissance : TGF[alpha], EGF-R, ras.

gène (s) à l'étape b) est réalisé pour au moins un gène choisi parmi le groupe de gènes comprenant les gènes suivants : - les gènes liés à l'échappement à l'apoptose : c-myc, Fas, Fas-L, p53, Bcl2, cas 8,

19/ Méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'une des revendications 1 à 18, caractérisée en ce que ledit profil d'expression de gène (s) à l'étape b) est réalisé pour au moins un gène choisi parmi le groupe de gènes comprenant les gènes CGss, c-fos, c-myc et intégrine a E précurseur, de préférence humain.

20/ Méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'une des revendications 1 à 19 permettant de mimer le profil d'expression d'un gène d'intérêt particulier pris parmi un groupe d'au moins deux gènes d'intérêt dans une cellule ou tissu de cellules cibles in vivo, caractérisée en ce que ladite méthode comprend les étapes suivantes : a) le prélèvement in vivo d'un premier échantillon desdites cellules cibles et la sélection d'au moins n échantillons in vitro de référence pour lesdites cellules cibles prélevées in vivo, lesdits n échantillons in vitro de référence ayant une architecture cellulaire donnée spécifique à leur préparation et différente entre elles ; b) la réalisation du profil d'expression desdits gènes d'intérêt par lesdites cellules cibles pour ledit premier échantillon et lesdits n échantillons in vitro de référence ; c) la comparaison des profils d'expression obtenus à l'étape b) pour chacun desdits gènes d'intérêt ; et d) la sélection comme modèle in vitro d'architecture cellulaire, l'architecture cellulaire de l'échantillon in vitro de référence permettant de mimer le profil d'expression

dudit gène d'intérêt particulier par lesdites cellules cibles du premier échantillon prélevé in vivo, n étant un nombre entier supérieur à 2, de préférence inférieur à 8, inférieur à 7, inférieur à 6, inférieur à 5, de manière plus préférée égal à 3.

21/ Méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'une des revendications 1 à 20, caractérisée en ce que ledit profil d'expression dudit ou desdits gènes d'intérêt à l'étape b) est réalisé par une méthode de type PCR quantitative, de préférence par une méthode dite de PCR en temps réel.

22/ Procédé d'identification d'un gène dont l'expression est susceptible d'être, ou de confirmation qu'un gène est exprimé de manière, significativement différente ou identique entre une cellule cible in vivo normale et ladite cellule cible in vivo anormale, caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes : A) la détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire permettant de mimer le profil d'expression dudit gène d'intérêt dans une cellule ou tissu de cellules cibles anormales in vivo selon l'une des revendications 1 à 21 ; B) la comparaison du profil d'expression dudit gène d'intérêt obtenu à l'étape b) par les cellules cibles anormales du modèle in vitro déterminé et d'un profil d'expression dudit gène d'intérêt par lesdites cellules cibles normales in vivo ; et C) déterminer si ou confirmer que ledit gène est exprimé de manière significativement différente ou identique entre lesdites cellules cibles in vivo normales et anormales après comparaison desdits profils d'expression.

23/ Procédé de sélection d'un composé capable de modifier l'expression d'un gène d'intérêt dans des cellules cibles anormales, de préférence de cellules cibles présentant un caractère tumoral, caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes : A) la détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire permettant de mimer le profil d'expression dudit gène d'intérêt dans lesdites cellules ou tissu desdites cellules cibles anormales in vivo selon l'une des revendications 1 à 21 ; B) la mise en présence du composé à tester avec ledit modèle in vitro ainsi déterminé ; C) la réalisation du profil d'expression dudit gène d'intérêt par lesdites cellules cibles dudit modèle in vitro obtenu à l'étape B) ; D) l'observation du profil d'expression obtenu à l'étape C) ;

E) la sélection dudit composé si celui-ci permet de modifier l'expression dudit gène d'intérêt dans lesdites cellules cibles du modèle in vivo.

24/ Procédé de sélection d'un composé selon la revendication 23, caractérisé en ce que ledit composé est choisi parmi les composés : a) une séquence nucléique sens ou antisens de la séquence dudit gène d'intérêt ; b) un fragment de la séquence dudit gène d'intérêt comprenant éventuellement une délétion, une insertion ou une substitution d'au moins un nucléotide par rapport à la séquence normale dudit gène d'intérêt.

25/ Utilisation d'une méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'une des revendications 1 à 21 pour l'identification d'un modèle d'étude in vitro d'expression d'au moins un gène d'intérêt dans une cellule cible in vivo.

26/ Utilisation d'une méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon la revendication 25, pour l'identification d'un modèle d'étude in vitro d'expression d'au moins un gène d'intérêt dans une cellule cible in vivo anormale, de préférence présentant un caractère tumoral.

27/ Utilisation d'une méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon la revendication 26, pour la sélection de composé chimique ou biochimique capable de modifier l'expression dudit gène d'intérêt, et/ou capable de prévenir ou de traiter une pathologie liée à la présence desdites cellules cibles anormales chez un individu.

28/ Utilisation d'une méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon la revendication 25 ou 26, comme modèle d'étude de la prédiction d'une réponse d'un individu à un traitement thérapeutique.

29/ Utilisation d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire de type sphéroïde déterminé par une méthode de détermination selon l'une des revendications 1 à 21 comme modèle d'étude in vitro d'expression d'au moins un gène d'intérêt dans une cellule cible in vivo.

30/ Utilisation d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire de type sphéroïde déterminé par une méthode de détermination selon l'une des revendications 1 à 21, comme modèle d'étude in vitro d'expression d'au moins un gène d'intérêt dans une cellule cible in vivo anormale, de préférence présentant un caractère tumoral.

31/ Utilisation d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire de type sphéroïde déterminé par une méthode de détermination selon l'une des revendications 1 à 21, comme modèle d'étude pour la sélection de composé chimique ou biochimique capable de modifier l'expression dudit gène d'intérêt, et/ou capable de prévenir ou de traiter une pathologie liée à la présence desdites cellules cibles anormales chez un individu.