WO2002004654A2 - METHODE DE DETERMINATION D'UN MODELE CELLULAIRE IN VITRO PERMETTANT DE MIMER LE PROFIL D'EXPRESSION D'UN GENE D'INTERET DANS UNE CELLULE IN VIVO - Google Patents

METHODE DE DETERMINATION D'UN MODELE CELLULAIRE IN VITRO PERMETTANT DE MIMER LE PROFIL D'EXPRESSION D'UN GENE D'INTERET DANS UNE CELLULE IN VIVO Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a method for determining an in vitro model of cell architecture making it possible to mimic the expression profile of a gene of interest in a cell or tissue of target cells in vivo, preferably target cells having a tumor character.
  • the invention also relates to a method for identifying or confirming a gene whose expression is likely to be significantly different or identical between a normal in vivo target cell and said abnormal in vivo target cell.
  • the present invention also relates to a method for selecting a compound capable of being used as a medicament for treating and / or preventing pathologies induced by an alteration of the expression of a gene of interest.
  • the invention finally relates to the use of said in vitro models thus determined, in particular the 3-dimensional spheroid type models as a relevant model for studying the expression of at least one gene of interest.
  • the thousands of cells that make up a human organism represent more than a simple biochemical network of proteins coded by genes and obeying chemical laws. They constitute a physical entity with a three-dimensional spatial structure and are subject to physical laws (1): individual cells respond to mechanical forces which play a central role during cell life.
  • a normal mammalian cell in the same biochemical medium, can divide, differentiate or even enter apoptosis, only according to the geometric shape imposed by the external medium (2).
  • the structural and mechanical complexity of living tissue must be taken into account in the studies.
  • the expression profile of genes is most often determined on cell lines in single strata (two-dimensional) or in suspension.
  • the human organism has a three-dimensional spatial structure and is subject to physical laws.
  • each of the thousands of cells (approximately 10,000 billion) that make up a human organism responds to mechanical forces that play a central role during cell life.
  • a human cell will harden, differentiate or have cell death programmed which will be very dependent on the geometric shape imposed by the external environment.
  • Such a method would make it possible to have an in vitro model faithfully reproducing the cellular architecture of target cells in vivo, in particular of a tumor, and its influence on gene expression, a model which would thus be determined according to the nature (type cell, associated function, tissue from which they originate, genetic heritage, etc.) and the state (normal or abnormal) of the target cells chosen.
  • Such a method would not only make it possible to identify or confirm the presence of a gene of interest in the target cell whose expression is likely to be significantly different or identical between a normal target cell in vivo and said target cell in abnormal in vivo, but also the possibility of using this model, thus determined and specific to the state and nature of the target cells chosen, as a model for studying mechanisms of impairment of cellular functions, such as oncogenesis, or as a model for selecting a compound intended for the preparation of a medicament for treating and / or preventing pathologies induced by an alteration in the expression of this or these genes of interest.
  • the inventors studied the influence of the cellular architecture of tumors on the expression of key genes involved in the tumor process, characterized by permanent changes in the genome.
  • the expression of genes has been compared for different in vivo models, these genes being known to contribute to the main alterations in cell physiology and which, together, are responsible for malignant transformation (3).
  • These genes were quantified by real-time quantitative PCR in cystectomy parts of patients suffering from bladder cancer and in the tumor cell lines established from these tumors. These cell lines are studied in suspension, in a cell carpet or even in spheroids composed of 2,000 to 20,000 cells.
  • the cellular architecture of the tumor (structure in 2 or 3 dimensions and volume) has a major impact on gene expression: variations up to 675 times are observed between the tumor cells in suspension, the two-dimensional (2D) tumor cells (cell mats) and 3D (spheroids of different sizes).
  • the present invention therefore relates to a method for determining an in vitro model of cell architecture making it possible to mimic the expression profile of a gene of interest in a target cell or tissue of cells in vivo, characterized in that that said method comprises the following stages: a) the in vivo taking of a first sample of said target cells and the selection of at least a second reference in vitro sample for said target cells taken in vivo, said second in vitro sample of reference having a given cellular architecture specific to its preparation; b) producing the expression profile of said gene of interest by said target cells for said first sample and said at least second sample; c) comparing the expression profiles obtained in step b); and a) the selection as an in vitro model of cell architecture, the cell architecture of the reference in vitro sample if this makes it possible to mimic the expression profile of said gene of interest by said target cells of the first sample taken in vivo.
  • second reference in vitro sample for said target cells is meant a sample of cells whose nature and / or state is similar to said target cells taken
  • this in vitro reference sample for said target cells will be derived from culture of cell lines, these lines having been established from autologous or heterologous sampling of said target cells taken in vivo.
  • said reference in vitro sample for said target cells will be derived from culture of cell lines having the same genetic heritage as the target cells taken in vivo.
  • realization of the expression profile of gene (s) for a given gene of interest or for several given genes of interest, is meant the quantitative and / or qualitative determination of the product of this or these genes (transcript or corresponding peptide), preferably at least the quantification of their transcript (mRNA or
  • Such expression profiles can be easily produced by methods well known to those skilled in the art, methods which, when it is a question of determining a quantitative and / or qualitative profile of transcript expression, generally require the use of primers and / or probes drawn from the nucleic acid sequences known for this or these genes of interest whose said profile will be produced to determine said model. Generally, these methods use the so-called PCR technique
  • these PCR or RT-PCR techniques, or related techniques will be quantitative type PCRs making it possible to evaluate the quantity of mRNA initially present in the test sample, generally by means of an internal standard of known initial quantity. capable of being amplified in the same way.
  • Methods for quantitatively and / or qualitatively determining the peptide translation product of a selected gene are also well known to those of skill in the art. Mention may in particular be made, but not limited to, of techniques based on highly specific antipeptide / peptide antibody reactions capable of precisely evaluating the amount of peptide present in a sample, in particular by the so-called ELISA technique.
  • step c compare of the expression profiles
  • step c the comparison of the expression profiles for the gene or genes of interest tested for the target cells in vivo for which the in vitro model is to be determined. closest to the expression of these genes. Said comparison will be made for example by observation of the expression profile obtained for the gene of interest, that of said in vitro reference samples best mimicking the expression of this gene of interest in the target cells taken in vivo, being retained as a model of cellular architecture for these target cells in vivo.
  • in vitro model making it possible to mimic the expression profile of a gene of interest
  • model of cellular architecture in vitro whose expression profile for the gene of interest tested is as close as possible of the profile obtained for this same gene in the target cells taken in vivo.
  • the selected in vitro cellular architecture model will make it possible to confirm a level of expression known to be significantly different or identical between an abnormal target cell in vivo and said normal target cell in vivo, for at least said gene of interest. tested.
  • the invention relates to a method for determining an in vitro model of cell architecture according to the invention, characterized in that said at least second in vitro reference sample for said target cells taken in vivo is derived from culture of cell lines established from autologous or heterologous, preferably autologous, in vivo sampling of said target cells.
  • the invention relates to a method for determining an in vitro model of cell architecture according to the invention, characterized in that said at least second in vitro reference sample for said target cells taken in vivo comes from culture of lines cells with the same genetic heritage as said target cells taken in vivo.
  • the invention preferably relates to a method for determining an in vitro model of cell architecture according to the invention, characterized in that said in vivo sampling of the first sample of target cells is a sample of abnormal target cells, in particular a target cell sample with tumor character.
  • the invention preferably relates to a method for determining an in vitro model of cell architecture according to the invention, characterized in that said given cell architecture specific to the preparation of said reference in viti'o sample is chosen from the architectures following cell phones:
  • the 3-dimensional cellular architecture of the spheroid type possibly comprising a variable number of cells
  • 3-dimensional cellular architectures of the spheroid type mention may be made in particular of 3-dimensional cellular architectures which may comprise at least 50, 100, 200, 500, 1,000, 2,000, 5,000, 10,000 and 20,000 cells, more preferably comprising a number of cells of between 2,000 and 10,000 cells.
  • the present method according to the invention will make it possible to define an approximate value of the number of cells necessary in the 3-dimensional cellular architecture of spheroid type to obtain the in vivo model making it possible to mimic the expression profile of said gene of interest in a target cell or tissue of cells in vivo.
  • the invention preferably relates to a method for determining an in vitro model of cell architecture according to the invention, characterized in that said at least second in vitro reference sample has a 3-dimensional cell architecture of spheroid type.
  • the invention preferably relates to a method for determining an in vitro model of cell architecture according to one of claims 1 to 9, characterized in that:
  • a third reference in vitro sample is selected in step a) for said target cells, said third in vitro reference sample having a given cellular architecture specific to its preparation and different from that of said second sample;
  • step b) the expression profile of said gene of interest is produced by said target cells for said first, second and third samples;
  • step b) the expression profiles obtained in step b) are compared; and - the cell architecture of the reference in vitro sample is selected as the in vitro model of cell architecture, making it possible to best mimic the expression profile of said gene of interest by said target cells of the first sample taken in vivo. .
  • in vitro reference sample having a given cell architecture different from that of another reference in vitro sample is meant to denote a reference in vitro sample having a given cell architecture different from that of the in vitro sample of reference previously chosen.
  • the in vitro reference sample will present by a cellular architecture obtained for a cell suspension or a cellular architecture obtained for a 2-dimensional cell layer, if the in vitro reference sample previously chosen has a cellular architecture in 3 dimensions of spheroid type.
  • in vitro sample having a given cellular architecture different from that of another reference in vitro sample it will be possible to distinguish if necessary an in vitro reference sample having for example a 3-dimensional cellular architecture of spheroid type containing a given number X of cells, if the other in vitro sample refers to a 3-dimensional cellular architecture of spheroid type containing given number Y of cells, the numbers X and Y being chosen such that the gene expression profile obtained for each of these spheroids is significantly different.
  • the invention preferably relates to a method for determining an in vitro model of cell architecture according to the invention, characterized in that:
  • a fourth in vitro reference sample is selected in step a) for said target cells, said fourth in vitro reference sample having a given cellular architecture specific to its preparation and different from that of said second and third samples; - in step b) the expression profile of said gene of interest is produced by said target cells for said first, second, third and fourth samples;
  • the cell architecture of the reference in vitro sample is selected as the in vitro model of cell architecture, making it possible to best mimic the expression profile of said gene of interest by said target cells of the first sample taken in vivo.
  • the invention preferably relates to a method for determining an in vitro model of cell architecture according to the invention, characterized in that said expression profile of said gene of interest in step b) is produced for at least a gene whose expression is representative or capable of being representative of the state of said target cells taken in vivo.
  • the invention preferably relates to a method for determining an in vitro model of cell architecture, characterized in that said expression profile of said gene of interest in step b) is produced for at least one gene for interest chosen from the following group of genes:
  • - a gene whose expression is linked at least in part to a pathology induced by an alteration of this expression, in particular to cancer; and / or - a gene whose sequence is known to exhibit a polymorphism associated with a pathology, in particular cancer; and or - a gene whose expression is sought to be compared between a normal cell and an abnormal cell; and or
  • the invention preferably relates to a method for determining an in vitro model of cell architecture according to the invention, characterized in that said expression profile of said gene of interest in step b) is produced for at least a gene the expression of which is sought to modify in said target cells with a compound capable of being used for the preparation of a pharmaceutical composition intended for preventing and / or treating a pathology induced by the state of abnormality of said cells targets of the first sample taken in vivo.
  • the invention preferably relates to a method for determining an in vitro model of cell architecture according to the invention, characterized in that said expression profile of said gene of interest in step b) is produced for at least a gene whose expression is representative or capable of being representative of the tumor character of said target cells of the first sample taken in vivo.
  • the invention preferably relates to a method for determining an in vitro model of cell architecture according to the invention, characterized in that said in vitro model of cell architecture making it possible to mimic the expression profile of said gene of interest in a cell or tissue of target cells in vivo thus determined, makes it possible to confirm a level of expression known to be significantly different or identical between an abnormal target cell in vivo and said normal target cell in vivo, for at least said gene. interest.
  • the invention preferably relates to a method for determining an in vitro model of cell architecture according to the invention, characterized in that the cell architecture of the reference in vitro sample is selected as an in vitro model of architecture cell if the expression profile of said gene of interest in said selected cell architecture makes it possible to observe an amount of product of the gene of interest, preferably its mRNA, expressed by said target cells of between at most 7 times and at least at least 7 times less, more preferably between 6 times more and at least times less, between 5 times more and at least 5 times less, and between 4 times more and at least 4 times less the amount observed for the same product of said gene of interest expressed by said target cells of the sample taken in vivo.
  • the invention preferably relates to a method for determining an in vitro model of cell architecture according to the invention, characterized in that in said selected cell architecture said quantity of product of the gene of interest expressed by said target cells is included between at most 3 times more and at least 3 times less the amount observed for the same product of said gene of interest expressed by said target cells of the sample taken in vivo.
  • the invention preferably relates to a method for determining an in vitro model of cell architecture according to the invention, characterized in that said gene expression profile (s) in step b) is produced for at least a gene chosen from the group of genes comprising the following genes:
  • - genes linked to the escape from apoptosis c-myc, Fas, Fas-L, p53, Bcl2, case 8, Case 9, IGF 1, IGF 2, hCG ⁇ ; - genes linked to neoangiogenesis: VEGF, P53, ras;
  • telomerase ras, pi 6, CDK4;
  • TGFa genes linked to self-sufficiency vis-à-vis growth signals: TGFa, EGF-R, ras.
  • the invention preferably relates to a method for determining an in vitro model of cell architecture according to the invention, characterized in that said gene expression profile (s) in step b) is produced for at least a gene chosen from the group of genes comprising the CG ⁇ , c-fos, c-myc and integrin ⁇ E precursor genes, preferably human.
  • the invention preferably relates to a method for determining an in vitro model of cell architecture according to the invention making it possible to mimic the expression profile of a gene of particular interest taken from a group of at least two genes of interest in a cell or tissue of target cells in vivo, characterized in that said method comprises the following steps: a) the in vivo taking of a first sample of said target cells and the selection of at least n reference in vitro samples for said target cells taken in vivo, said n reference in vitro samples having a given cell architecture specific to their preparation and different from each other; b) producing the expression profile of said genes of interest by said target cells for said first sample and said n reference in vitro samples; c) comparing the expression profiles obtained in step b) for each of said genes of interest; and d) selection as an in vitro model of cell architecture, the cell architecture of the reference in vitro sample making it possible to best mimic the expression profile of said gene of particular interest by said target cells of the first sample taken.
  • n being an integer greater than 2, preferably less than 8, less than 7, less than 6, less than 5, more preferably equal to 3.
  • the invention preferably relates to a method for determining an in vitro cell architecture model according to the invention, characterized in that said expression profile of said gene or genes of interest in step b) is produced by a method of quantitative PCR type, preferably by a method so-called real-time PCR.
  • the invention also preferably relates to a method for determining an in vitro model of cell architecture according to the invention, characterized in that the cultures of said target cells of the sample taken in vivo, carried out in order to prepare the samples of in vitro reference and presenting a given architecture model linked to their preparation, are carried out in the same culture medium.
  • the invention preferably relates to a method of identifying a gene whose expression is capable of being, or of confirming that a gene is expressed in a significantly different or identical manner between a target cell.
  • said method comprises the following steps: A) the determination of an in vitro model of cell architecture making it possible to mimic the expression profile of said gene of interest in a cell or tissue of abnormal target cells in vivo according to the invention;
  • step B) comparison of the expression profile of said gene of interest obtained in step B) by the abnormal target cells of the determined in vitro model and of an expression profile of said gene of interest by said normal target cells in vivo;
  • the invention also relates to a method of selecting a compound capable of modifying the expression of a gene of interest in abnormal target cells, preferably of target cells having a tumor character, characterized in that said method comprises the following: following steps :
  • the present invention preferably relates to a process for selecting a compound according to the invention, capable of being used for the preparation of a pharmaceutical composition intended for preventing and / or treating a pathology induced by the state of of said target cells from the first sample taken in vivo.
  • the invention preferably also relates to a method for selecting a compound according to the invention, capable of being used for the preparation of a pharmaceutical composition intended for preventing and / or treating cancer.
  • the invention preferably also relates to a method for selecting a compound according to the invention, characterized in that said compound is chosen from the following compounds: a) compounds capable of inhibiting the expression of said gene of interest or the functional activity of the expression product of said gene of interest if said gene is overexpressed in said abnormal target cell; b) compounds capable of restoring the normal expression of said gene of interest or the normal functional activity of the expression product of said gene of interest if said gene is under-expressed in said abnormal target cell or if the functional activity of the product expression of said gene of interest for at least part is abnormal.
  • the invention preferably also relates to a process for selecting a compound according to the invention, characterized in that said compound is chosen from compounds capable of leading to a qualitative and / or quantitative modification of the normal expression product of said gene of interest.
  • the invention preferably also relates to a method for selecting a compound according to the invention, characterized in that said compound is chosen from the compounds: a) a sense or antisense nucleic sequence of the sequence of said gene of interest; b) a fragment of the sequence of said gene of interest optionally comprising a deletion, insertion or substitution of at least one nucleotide with respect to the normal sequence of said gene of interest.
  • the invention relates to the use of a method for determining an in vitro model of cell architecture according to the invention for the identification of a relevant model of in vitro study of expression of d at least one gene of interest in a target cell in vivo.
  • the invention preferably includes the use of a method for determining an in vitro model of cell architecture according to the invention, for the identification of a relevant model of in vitro study of expression of at at least one gene of interest in an abnormal in vivo target cell, preferably having a tumor character.
  • the invention preferably includes the use of a method for determining an in vitro model of cell architecture according to the invention, for the selection of chemical or biochemical compound capable of modifying the expression of said gene of interest, and / or capable of preventing or treating a pathology linked to the presence of said abnormal target cells in an individual.
  • the invention also includes the use of a method for determining an in vitro model of cell architecture according to the invention, as a relevant model for studying the prediction of an individual's response to a therapeutic treatment. .
  • the invention preferably comprises the use of an in vitro model of cellular architecture of the spheroid type determined by a determination method according to the invention as a relevant model for studying in vitro the expression of at least one gene d interest in a target cell in vivo.
  • the invention preferably also includes the use of an in vitro model of cellular architecture of the spheroid type determined by a determination method according to the invention, as a relevant model for studying in vitro the expression of at least one gene of interest in an abnormal target cell in vivo, preferably having a tumor character.
  • the invention preferably also includes the use of an in vitro model of cellular architecture of the spheroid type determined by a determination method according to the invention, as a relevant study model for the selection of chemical or biochemical compound capable of modify the expression of said gene of interest, and / or capable of preventing or treating a pathology linked to the presence of said abnormal target cells in an individual.
  • the invention preferably also includes the use of an in vitro cell architecture model of spheroid type according to the invention, characterized in that said in vitro cell architecture model of spheroid type comprises a number of cells, the value is significant of the expression of said gene of interest in said target cells in vivo.
  • Figures 1A, 1B, 1C and 2 Expression profile of genes of interest obtained from a bladder tumor fragment (Tum 07) taken from a patient: • obtained for the sample taken in vivo from the tumor ( "Tumor”); • obtained for a cell line established from a fragment of the tumor taken in vivo: - for a cell suspension derived from this line ("suspension"), - for a cell carpet from this lineage ("single layer”),
  • the results represent the quantity of transcripts (mRNA) expressed in the different samples tested, this quantity being expressed in number of times the quantity expressed for the target cell sample taken in vivo ("tumor") whose value was taken as reference (1.0000), and represented using a logarithmic scale.
  • FIGS. 1A, 1B, 1C and 2 respectively represent the values obtained for the genes of interest hCGbeta, c-fos, integrin alpha E precursor and c-myc.
  • the four tumor samples come from cystectomy of patients with bladder cancer in accordance with the ethical rules of the hospital. After surgery, a tumor fragment was frozen in liquid nitrogen. Another fragment was placed in culture medium in order to establish tumor cell lines according to the protocols already described (6). The histology and percentage of viable cells in each sample were determined by visual examination of adjacent sections stained with hematoxylin and eosin.
  • culture medium RPMI 1640 with 4x10-5 2- ⁇ mercaptoethanol, 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penicillin, 100 ⁇ g / ml streptomycin, 1% sodium pyruvate, 0.1 mM non-essential amino acids
  • the cell mats are obtained by flattening 0.5 ⁇ 10 6 cells per 75 cm 2 culture flask. RNA extraction is done on subconfluent cultures.
  • the cell suspensions, originating from the trypsination of the cell mats, are resuspended in culture medium for 1 hour at 37 ° C.
  • RNA RNA-derived neuropeptides
  • the spheroids of different sizes are prepared in 96-well conical bottom plates covered with poly (2 hydroxyethyl metacrylate) as previously described (7). After 5 days, the spheroids contain an average number of 2,000, 5,000, 10,000 or 20,000 cells and are collected for the extraction of RNA.
  • RNA is extracted from tissue samples or cells cultured in vitro with RNAble according to the supplier's instructions. The concentration of RNA is determined at 260 nm and its quality is checked on conventional electrophoresis gel. One ⁇ g of total RNA from each sample is reverse transcribed in a reaction volume of 20 ⁇ l with 50 U of RT (Reversed Transcriptase) of MMLV, 20 U of RNase inhibitor, 1 mM dA / T / G / C, 5 mM MgC12, 10 mM Tris HCl pH 8.3, 10 mM KC1 and 50 ⁇ M of random hexamers.
  • RT Reversed Transcriptase
  • the cDNAs are diluted 1/20 in water free of nucleases.
  • Real-time PCR is performed on an SDS 7700 ABI Prism based on the 5 'nuclease principle.
  • An oligonucleotide probe labeled at its 5 ′ end with a fluorochrome reporter, the Fam, and in 3 ′ with a fluorochrome quencher, Tamra is present during the PCR extension phase. This oligonucleotide hybridizes to its complementary sequence on the PCR product but cannot lead to amplification.
  • the degradation of the probe during the amplification of the PCR product releases the 2 fluorochromes and the fluorescence of the reporter can be monitored and measured, allowing quantification in real time.
  • the entire protocol follows the supplier's instructions (Perkin-Elmer Applied Biosystems Inc., Foster City, CA).
  • the sequences of the primers and probes used for each gene are as follows:
  • CCCATCAATGCCACCCTG SEQ ID No. 1
  • GCAGCACGCGGGTCAT SEQ ID No. 2
  • 6FAM-TGCCCCGTGTGCATCACCG-TAMRA SEQ ID No.
  • Real-time PCR is performed with cDNA equivalent to 20 ng of total RNA for a reaction volume of 50 ⁇ l with the TaqMan® PCR Universal Master mix.
  • the 18S ribosomal RNA is amplified as a control.
  • the Ct method according to the supplier's instructions. References are made up of the original tumor samples and all other levels of RNA are expressed in multiples of this reference.
  • Bladder cancers are divided into 2 groups: invasive cancers and superficial cancers. The characterization of the molecular genetic mechanisms involved in the progression of bladder carcinomas is important both for the identification of prognostic factors and for the development of new therapeutic strategies (4,5). We used these cancer cells as an experimental model to study the influence of tumor space architecture on gene expression.
  • Four bladder tumor fragments were obtained from patients after surgery and were used to establish four autologous Tum 06, Tum 07, Tum 25 and Tum 266 cell lines. These cell lines were used in suspension or in traditional cell mats or in the form of multicellular spheroids (7): these spheroids contained 2,000, 5,000, 10,000 or 20,000 cells.
  • the architecture of Tum 26 has been shown to be representative of the four patients (result not shown).
  • This cell line has been used in cell suspension, in 2D cell carpet or in 3D spheroids. These cellular architectures observed in vitro were compared to that of the tumor cells present in the tissue sample.
  • the Tum 26 cell line, as well as the other 3 lines, has been observed to form spheroids which are identical to the tumor aggregates found in ascites during the spread of carcinomas.
  • the histological characteristics including the compact nature, the numerous mitoses and the nuclear atypies, allow us to conclude that these microtumors of carcinomatous cells obtained in vitro are comparable to those observed in cytological analyzes of ascites during abdominal metastases, thus confirming the interest of spheroid-type architecture as an essential model to be tested in order to determine the in vitro architecture model relevant for the expression of a gene of interest in target cells in vivo having a tumor character.
  • the expression profile of the genes involved in malignant transformation has been studied in bladder cancer cells presented in vitro in different spatial conformations. These genes have been selected for their role in the six main alterations occurring in the physiology of the cell during tumor growth (3,9-14): self-sufficiency in growth signals, insensitivity to growth inhibiting signals, escape from apoptosis, unlimited replication potential, intense angiogenesis, and tissue invasion and metastases.
  • Quantitative real-time PCR was used to determine the levels of messenger RNA (mRNA). To validate the real-time PCR method, standard curves for a given gene and for 18S ribosomal RNA were constructed from PCR products.
  • the amplification points for the mRNAs of the genes of interest tested and for the endogenous 18S control were obtained (result not shown).
  • the efficiency of the standard curve, determined by its slope, makes it possible to quantify the gene expressions in each sample.
  • the reference is constituted by the tissue sample, all the other levels of RNA observed in the cell culture samples have been expressed as factors relating to this reference.
  • the gene expression profiles can be profoundly modified according to the tumor architecture in vitro: for example, the CG ⁇ transcripts coding for the ⁇ subunit of the human gonadotropic chorionic hormone (hCG ⁇ ) have a level of gene expression in Tum 07 which is 675 times higher in cells in the cell layer compared to cells cultivated in spheroids composed of 5000 cells (cf. FIG. 1A).
  • hCG ⁇ human gonadotropic chorionic hormone
  • tumor architecture leads to variations of a factor of 10 in gene expression and that these strong variations do not only affect the genes involved in tumor invasion and metastases (precursor of integrin alpha E) but also those involved in the other five essential pathways that direct the tumor growth, such as tumor invasion and metastases (CG ⁇ , c-myc) or insensitivity to anti-growth signals (c-myc, c-fos). All of these results show that the impact of architecture on gene expression varies extremely depending on both the architecture and the gene considered.
  • CG ⁇ transcripts are associated with the malignant transformation of non-trophoblastic cells and, in particular, the transformation of urothelial cells (11, 15).
  • the level of expression of the same gene can vary more than 600 times depending on the cell architecture.
  • CG ⁇ transcripts (coding for the beta subunit of the gonadotropic chorionic hormone) are 675 times more abundant in cells originating from the tumor Tum 07 and forming a single stratum than in spheroids composed of 5000 cells ( Figure 1A).

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Abstract

La présente invention concerne une méthode de détermination d'un modèle <i>in vitro</i> d'architecture cellulaire permettant de mimer le profil d'expression d'un gène d'intérêt dans une cellule ou tissu de cellules cibles <i>in vivo</i>, de préférence des cellules cibles présentant un caractère tumoral. L'invention concerne également un procédé d'identification ou de confirmation d'un gène dont l'expression est susceptible d'être significativement différente ou identique entre une cellule cible <i>in vivo</i> normale et ladite cellule cible <i>in vivo</i> anormale. La présente invention concerne également un procédé de sélection de composé susceptible d'être utilisé comme médicament pour traiter et/ou prévenir les pathologies induites par une altération de l'expression d'un gène d'intérêt. L'invention concerne enfin l'utilisation desdits modèles <i>in vitro</i> ainsi déterminés, notamment les modèles de type sphéroïde en 3 dimensions comme modèle pertinent d'étude d'expression d'au moins un gène d'intérêt.

Description

METHODE DE DETERMINATION D'UN MODELE CELLULAIRE IN VITRO PERMETTANT DE MIMER LE PROFIL D'EXPRESSION D'UN GENE D'INTERET DANS UNE CELLULE/N VIVO
La présente invention concerne une méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire permettant de mimer le profil d'expression d'un gène d'intérêt dans une cellule ou tissu de cellules cibles in vivo, de préférence des cellules cibles présentant un caractère tumoral. L'invention concerne également un procédé d'identification ou de confirmation d'un gène dont l'expression est susceptible d'être significativement différente ou identique entre une cellule cible in vivo normale et ladite cellule cible in vivo anormale. La présente invention concerne également un procédé de sélection de composé susceptible d'être utilisé comme médicament pour traiter et/ou prévenir les pathologies induites par une altération de l'expression d'un gène d'intérêt. L'invention concerne enfin l'utilisation desdits modèles in vitro ainsi déterminés, notamment les modèles de type sphéroïde en 3 dimensions comme modèle pertinent d'étude d'expression d'au moins un gène d'intérêt.
Les milliers de cellules qui composent un organisme humain représentent plus qu'un simple réseau biochimique de protéines codées par des gènes et obéissant à des lois chimiques. Elles constituent une entité physique avec une structure spatiale tridimensionnelle et sont soumises à des lois physiques (1) : les cellules individuelles répondent à des forces mécaniques qui jouent un rôle central pendant la vie cellulaire. Ainsi, par exemple, une cellule normale de Mammifère, dans un même milieu biochimique, peut se diviser, se différencier ou bien entrer en apoptose, uniquement d'après la forme géométrique imposée par le milieu externe (2). Afin de mieux comprendre les mécanismes de l'oncogénèse, la complexité structurelle et mécanique des tissus vivants doit être prise en compte dans les études.
En génomique et en pharmacogénomique, le profil d'expression de gènes est le plus souvent déterminé sur des lignées cellulaires en strate unique (deux-dimensions) ou en suspension. Or, l'organisme humain a une structure spatiale en trois-dimensions et est soumis aux lois physiques. De plus, chacune des milliers de cellules (environ 10 000 milliards) qui composent un organisme humain répond à des forces mécaniques qui jouent un rôle central durant la vie cellulaire. Par exemple, dans le même milieu biochimique, une cellule humaine se durcira, se différenciera ou aura une mort cellulaire programmée qui sera très dépendante de la forme géométrique imposée par le milieu externe.
Ainsi, il reste un grand besoin de disposer d'une méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire permettant de mimer le profil d'expression de gène(s) dans une cellule ou tissu de cellules cibles in vivo, en particulier pour des cellules cibles in vivo présentant un caractère tumoral.
Une telle méthode permettrait de disposer d'un modèle in vitro reproduisant fidèlement l' architecture cellulaire des cellules cibles in vivo, notamment de tumeur, et son influence sur l'expression des gènes, modèle qui serait ainsi déterminé en fonction de la nature (type de cellule, fonction associée, tissu dont elles sont issues, patrimoine génétique etc.) et l'état (normal ou anormal), des cellules cibles choisies.
Une telle méthode permettrait non seulement d'identifier ou de confirmer la présence d'un gène d'intérêt dans la cellule cible dont l'expression est susceptible d'être significativement différente ou identique entre une cellule cible in vivo normale et ladite cellule cible in vivo anormale, mais également la possibilité d'utiliser ce modèle ainsi déterminé et spécifique de l'état et la nature des cellules cibles choisies comme modèle d'étude des mécanismes d'altération de fonctions cellulaires, telle que l'oncogénèse, ou comme modèle de sélection de composé destiné à la préparation de médicament pour traiter et/ou prévenir les pathologies induites par une altération de l'expression de ce ou ces gènes d'intérêt.
La détermination d'un tel modèle et son utilisation pour réaliser des manipulations in vitro de type thérapeutique (essai et sélection de composé susceptible de prévenir ou traiter certaines pathologies, comme le cancer) et/ou génétique (essai de traitement par thérapie génique pour modifier ou rétablir l'expression de gènes d'intérêt cibles) et/ou pharmacogénétique (modélisation in vitro de la prédiction de réponse au traitement) permettraient sans aucun doute de valider et/ou de rendre beaucoup plus pertinents les résultats obtenus dans les études de l'expression de gènes, notamment en génomique et en pharmacogénomique.
Ceci est justement l'objet de la présente invention. Dans ce contexte, les inventeurs ont étudié l'influence de l'architecture cellulaire des tumeurs sur l'expression des gènes clés impliqués dans le processus tumoral, caractérisé par des changements permanents dans le génome. Pour cela, l'expression de gènes a été comparée pour différents modèle in vivo, ces gènes étant connus pour contribuer aux principales altérations dans la physiologie cellulaire et qui, ensemble, sont responsables de la transformation maligne (3). Ces gènes ont été quantifiés par PCR quantitative en temps réel dans des pièces de cystectomie de patients atteints de cancers vésicaux et dans les lignées de cellules tumorales établies à partir de ces tumeurs. Ces lignées cellulaires sont étudiées en suspension, en tapis cellulaire ou bien encore en sphéroïdes composées de 2 000 à 20 000 cellules. Il a été observé que l'architecture cellulaire de la tumeur (structure en 2 ou 3 dimensions et volume) a un impact majeur sur l'expression des gènes : des variations jusqu'à 675 fois sont observées entre les cellules tumorales en suspension, les cellules tumorales en deux dimensions (2D) (tapis cellulaires) et en 3D (sphéroïdes de différentes tailles). En considérant l'expression des gènes dans les échantillons tumoraux comme représentative des profils d'expression des gènes in vivo, il a été trouvé par exemple que le modèle 3D in vitro des sphéroïdes miment plus fidèlement l'expression des gènes in vivo par rapport aux modèles habituels que sont les modèles in vitro de suspensions et de tapis cellulaires. Ces observations rapportent : i) l'influence de la géométrie des cellules tumorales sur les profils d'expression des gènes impliqués dans la prolifération maligne, ii) l'importance de prise en compte de la complexité structurelle et mécanique des cellules avant d'interpréter des profils d'expression; ii) l'intérêt ici du modèle 3D in vitro des sphéroïdes pour l'étude des profils d'expression de gènes dans une tumeur.
La présente invention a donc pour objet une méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire permettant de mimer le profil d'expression d'un gène d'intérêt dans une cellule ou tissu de cellules cibles in vivo, caractérisée en ce que ladite méthode comprend les étapes suivantes : a) le prélèvement in vivo d'un premier échantillon desdites cellules cibles et la sélection d'au moins un deuxième échantillon in vitro de référence pour lesdites cellules cibles prélevées in vivo, ledit deuxième échantillon in vitro de référence ayant une architecture cellulaire donnée spécifique à sa préparation ; b) la réalisation du profil d'expression dudit gène d'intérêt par lesdites cellules cibles pour ledit premier échantillon et ledit au moins deuxième échantillon ; c) la comparaison des profils d'expression obtenus à l'étape b) ; et a) la sélection comme modèle in vitro d'architecture cellulaire, l'architecture cellulaire de l'échantillon in vitro de référence si celui-ci permet de mimer le profil d'expression dudit gène d'intérêt par lesdites cellules cibles du premier échantillon prélevé in vivo. Par « deuxième échantillon in vitro de référence pour lesdites cellules cibles », on entend désigner un échantillon de cellules dont la nature et/ou l'état s'apparente auxdites cellules cibles prélevées in vivo.
En général, cet échantillon in vitro de référence pour lesdites cellules cibles sera issu de culture de lignées cellulaires, ces lignées ayant été établies à partir de prélèvement autologue ou hétérologue desdites cellules cibles prélevées in vivo.
De préférence, ledit échantillon in vitro de référence pour lesdites cellules cibles sera issu de culture de lignées cellulaires présentant le même patrimoine génétique que les cellules cibles prélevées in vivo.
Par « réalisation du profil d'expression de gène(s) », pour un gène d'intérêt donné ou pour plusieurs gènes d'intérêt donnés, on entend désigner la détermination quantitative et/ou qualitative du produit de ce ou ces gènes (transcript ou peptide correspondant), de préférence au moins la quantification de leur transcript (ARNm ou
ADNc correspondant).
De tels profils d'expression peuvent être aisément réalisés par des méthodes bien connues de l'homme de l'art, méthodes qui, lorsqu'il s'agit de déterminer un profil quantitatif et/ou qualitatif d'expression de transcript, nécessitent généralement l'utilisation d'amorces et/ou de sondes dessinées à partir des séquences nucléiques connues pour ce ou ces gènes d'intérêt dont ledit profil sera réalisé pour déterminer ledit modèle. Généralement, ces méthodes mettent en oeuvre la technique dite de PCR
(Amplification en Chaîne à la Polymérase) ou une technique apparentée, telle que la RT-PCR, méthode comprenant au préalable la Réverse Transcription de l'ARNm en ADNc.
De préférence, ces techniques de PCR ou RT-PCR, ou apparentées, seront des PCR de type quantitatif permettant d'évaluer la quantité d'ARNm présente initialement dans l'échantillon testé, généralement au moyen d'un standard interne de quantité initiale connue capable d'être amplifié de la même manière. Les méthodes permettant de déterminer quantitativement et/ou qualitativement le produit de traduction en peptide d'un gène choisi sont également bien connues de l'homme de l'art. On peut en particulier citer, mais sans s'y limiter, les techniques basées sur les réactions anticorps antipeptide/peptide hautement spécifiques et capables d'évaluer avec précision la quantité de peptide présent dans un échantillon, notamment par la technique dite d'ELISA.
Par « comparaison des profils d'expression », à l'étape c), on entend désigner la comparaison des profils d'expression pour le ou les gènes d'intérêt testés pour les cellules cibles in vivo dont on veut déterminer le modèle in vitro le plus proche pour l'expression de ces gènes. Ladite comparaison se fera par exemple par observation du profil d'expression obtenu pour le gène d'intérêt, celui desdits échantillons in vitro de référence mimant le mieux l'expression de ce gène d'intérêt dans les cellules cibles prélevées in vivo, étant retenu comme modèle d'architecture cellulaire pour ces cellules cibles in vivo. Par « modèle in vitro permettant de mimer le profil d'expression d'un gène d'intérêt », on entend désigner le modèle d'architecture cellulaire in vitro dont le profil d'expression pour le gène d'intérêt testé se rapproche au mieux du profil obtenu pour ce même gène dans les cellules cibles prélevées in vivo.
De préférence, le modèle d'architecture cellulaire in vitro retenu permettra de confirmer un niveau d'expression connu pour être significativement différent ou identique entre une cellule cible in vivo anormale et ladite cellule cible in vivo normale, pour au moins ledit gène d'intérêt testé.
Dans un mode de réalisation préféré, l'invention est relative à une méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'invention, caractérisée en ce que ledit au moins deuxième échantillon in vitro de référence pour lesdites cellules cibles prélevées in vivo est issu de culture de lignées cellulaires établies à partir de prélèvement in vivo autologue ou hétérologue, de préférence autologue, desdites cellules cibles.
Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, l'invention est relative à une méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'invention, caractérisée en ce que ledit au moins deuxième échantillon in vitro de référence pour lesdites cellules cibles prélevées in vivo est issu de culture de lignées cellulaires présentant le même patrimoine génétique que lesdites cellules cibles prélevées in vivo.
L'invention concerne de préférence une méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'invention, caractérisée en ce que ledit prélèvement in vivo du premier échantillon de cellules cibles est un échantillon de cellules cibles anormales, en particulier un échantillon de cellules cibles présentant un caractère tumoral.
L'invention concerne de préférence une méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'invention, caractérisée en ce que ladite architecture cellulaire donnée spécifique à la préparation dudit échantillon in viti'o de référence est choisie parmi les architectures cellulaires suivantes :
- l'architecture cellulaire en 3 dimensions de type sphéroïde, ladite architecture cellulaire en 3 dimensions pouvant comprendre un nombre variable de cellules ;
- l'architecture cellulaire obtenue pour une suspension cellulaire dans laquelle chacune ou la grande majorité des cellules sont en suspension ; et
- l'architecture cellulaire obtenue pour une couche cellulaire dans laquelle les cellules forment un tapis cellulaire en 2 dimensions.
Parmi les architectures cellulaires en 3 dimensions de type sphéroïde, on peut citer en particulier les architectures cellulaires en 3 dimensions pouvant comprendre au minimum 50, 100, 200, 500, 1 000, 2 000, 5 000, 10 000 et 20 000 cellules, de manière plus préférée comprenant un nombre de cellules compris entre 2 000 et 10 000 cellules.
Bien entendu, si nécessaire, la présente méthode selon l'invention permettra de définir une valeur approximative du nombre de cellules nécessaire dans l'architecture cellulaire en 3 dimensions de type sphéroïde pour obtenir le modèle in vivo permettant de mimer le profil d'expression dudit gène d'intérêt dans une cellule ou tissu de cellules cibles in vivo.
Dans ce cas, il suffira d'établir le profil d'expression desdits gènes choisis pour des architectures cellulaires en 3 dimensions de type sphéroïde, dans lesquels sphéroïdes la quantité de cellules sera variable, et choisir comme quantité de cellules devant être approximativement contenue dans ce modèle sphéroïde celle contenue dans le sphéroïde pour lequel le profil obtenu mimera au mieux le profil d'expression dudit gène d'intérêt obtenu pour le prélèvement de cellules cibles in vivo. L'invention concerne de préférence une méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'invention, caractérisée en ce que ledit au moins deuxième échantillon in vitro de référence possède une architecture cellulaire en 3 dimensions de type sphéroïde. L'invention concerne de préférence une méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que :
- on sélectionne à l'étape a) un troisième échantillon in vitro de référence pour lesdites cellules cibles, ledit troisième échantillon in vitro de référence ayant une architecture cellulaire donnée spécifique à sa préparation et différente de celle dudit deuxième échantillon ;
- on réalise à l'étape b) le profil d'expression dudit gène d'intérêt par lesdites cellules cibles pour lesdits premier, deuxième et troisième échantillons ;
- on compare les profils d'expression obtenus à l'étape b) ; et - on sélectionne comme modèle in vitro d'architecture cellulaire, l'architecture cellulaire de l'échantillon in vitro de référence permettant de mimer le mieux le profil d'expression dudit gène d'intérêt par lesdites cellules cibles du premier échantillon prélevé in vivo.
Par « échantillon in vitro de référence ayant une architecture cellulaire donnée différente de celle d'un autre échantillon in vitro de référence », on entend désigner de un échantillon in vitro de référence ayant une architecture cellulaire donnée différente de celle de l'échantillon in vitro de référence préalablement choisi.
Par exemple et de préférence, l'échantillon in vitro de référence présentera par une architecture cellulaire obtenue pour une suspension cellulaire ou une architecture cellulaire obtenue pour une couche cellulaire en 2 dimensions, si l'échantillon in vitro de référence préalablement choisi a une architecture cellulaire en 3 dimensions de type sphéroïde.
Par « échantillon in vitro de référence ayant une architecture cellulaire donnée différente de celle d'un autre échantillon in vitro de référence », on pourra distinguer si nécessaire un échantillon in vitro de référence présentant par exemple une architecture cellulaire en 3 dimensions de type sphéroïde contenant un nombre X donné de cellules, si l'autre échantillon in vitro de référence à une architecture cellulaire en 3 dimensions de type sphéroïde contenant nombre Y donné de cellules, les nombres X et Y étant choisis de telle sorte que le profil d'expression de gènes obtenu pour chacun de ces sphéroïdes soient significativement différent.
L'invention concerne de préférence une méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'invention, caractérisée en ce que :
- on sélectionne à l'étape a) un quatrième échantillon in vitro de référence pour lesdites cellules cibles, ledit quatrième échantillon in vitro de référence ayant une architecture cellulaire donnée spécifique à sa préparation et différente de celle desdits deuxième et troisième échantillons ; - on réalise à l'étape b) le profil d'expression dudit gène d'intérêt par lesdites cellules cibles pour lesdits premier, deuxième, troisième et quatrième échantillons ;
- on compare les profils d'expression obtenus à l'étape b) ; et
- on sélectionne comme modèle in vitro d'architecture cellulaire, l'architecture cellulaire de l'échantillon in vitro de référence permettant de mimer le mieux le profil d'expression dudit gène d'intérêt par lesdites cellules cibles du premier échantillon prélevé in vivo.
L'invention concerne de préférence une méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'invention, caractérisée en ce que ledit profil d'expression dudit gène d'intérêt à l'étape b) est réalisé pour au moins un gène dont l'expression est représentative ou susceptible d'être représentative de l'état desdites cellules cibles prélevées in vivo.
L'invention concerne de préférence une méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire, caractérisée en ce que ledit profil d'expression dudit gène d'intérêt à l'étape b) est réalisé pour au moins un gène d'intérêt choisi parmi le groupe de gènes suivant :
- un gène dont l'expression est représentative ou susceptible d'être représentative de l'état d'anormalité de ladite cellule cible ; et/ou
- un gène dont l'expression est liée au moins en partie à une pathologie induite par une altération de cette expression, notamment à un cancer ; et/ou - un gène dont la séquence est connue pour présenter un polymorphisme associé à une pathologie, notamment un cancer ; et/ou - un gène dont on cherche à comparer l'expression entre une cellule normale et une cellule anormale ; et/ou
- dont on cherche à modifier l'expression dans lesdites cellules cibles du premier échantillon prélevé in vivo. L'invention concerne de préférence une méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'invention, caractérisée en ce que ledit profil d'expression dudit gène d'intérêt à l'étape b) est réalisé pour au moins un gène dont on cherche à modifier l'expression dans lesdites cellules cibles par un composé susceptible d'être utilisé pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à prévenir et/ou à traiter une pathologie induite par l'état d'anormalité desdites cellules cibles du premier échantillon prélevé in vivo.
L'invention concerne de préférence une méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'invention, caractérisée en ce que ledit profil d'expression dudit gène d'intérêt à l'étape b) est réalisé pour au moins un gène dont l'expression est représentative ou susceptible d'être représentative du caractère tumoral desdites cellules cibles du premier échantillon prélevé in vivo.
L'invention concerne de préférence une méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'invention, caractérisée en ce que ledit modèle in vitro d'architecture cellulaire permettant de mimer le profil d'expression dudit gène d'intérêt dans une cellule ou tissu de cellules cibles in vivo ainsi déterminé, permet de confirmer un niveau d'expression connu pour être significativement différent ou identique entre une cellule cible in vivo anormale et ladite cellule cible in vivo normale, pour au moins ledit gène d'intérêt.
L'invention concerne de préférence une méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'invention, caractérisée en ce que l'architecture cellulaire de l'échantillon in vitro de référence est sélectionnée comme modèle in vitro d'architecture cellulaire si le profil d'expression dudit gène d'intérêt dans ladite architecture cellulaire sélectionnée permet d'observer une quantité de produit du gène d'intérêt, de préférence son ARNm, exprimée par lesdites cellules cibles comprises entre au plus 7 fois plus et au moins 7 fois moins, de manière plus préférée comprise entre 6 fois plus et au moins fois moins, entre 5 fois plus et au moins 5 fois moins, et entre 4 fois plus et au moins 4 fois moins la quantité observée pour le même produit dudit gène d'intérêt exprimé par lesdites cellules cibles de l'échantillon prélevé in vivo.
L'invention concerne de préférence une méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'invention, caractérisée en ce que dans ladite architecture cellulaire sélectionnée ladite quantité de produit du gène d'intérêt exprimée par lesdites cellules cibles est comprise entre au plus 3 fois plus et au moins 3 fois moins la quantité observée pour le même produit dudit gène d'intérêt exprimé par lesdites cellules cibles de l'échantillon prélevé in vivo.
L'invention concerne de préférence une méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'invention, caractérisée en ce que ledit profil d'expression de gène(s) à l'étape b) est réalisé pour au moins un gène choisi parmi le groupe de gènes comprenant les gènes suivants :
- les gènes liés à l'échappement à l'apoptose : c-myc, Fas, Fas-L, p53, Bcl2, cas 8, Cas 9, IGF 1, IGF 2, hCGβ ; - les gènes liés à la néoangiogénèse : VEGF, P53, ras ;
- les gènes liés au potentiel de réplication illimité : télomérase, ras, pi 6, CDK4 ;
- les gènes liés à l'invasion et aux métastases : héparanase, E-cadhérine, UPAR, vimentine, cytokératine 8, intégrine alpha ;
- les gènes liés à l'insensibilité des signaux inhibiteurs de croissance : c-myc, c-fos, c- jun, TGBβ, pi 5, pi 6, p21, CDK4, Cycline Dl ;
- les gènes liés à l'autosuffisance vis-à-vis des signaux de croissance : TGFa, EGF-R, ras.
L'invention concerne de préférence une méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'invention, caractérisée en ce que ledit profil d'expression de gène(s) à l'étape b) est réalisé pour au moins un gène choisi parmi le groupe de gènes comprenant les gènes CGβ, c-fos, c-myc et intégrine α E précurseur, de préférence humain.
L'invention concerne de préférence une méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'invention permettant de mimer le profil d'expression d'un gène d'intérêt particulier pris parmi un groupe d'au moins deux gènes d'intérêt dans une cellule ou tissu de cellules cibles in vivo, caractérisée en ce ladite méthode comprend les étapes suivantes : a) le prélèvement in vivo d'un premier échantillon desdites cellules cibles et la sélection d'au moins n échantillons in vitro de référence pour lesdites cellules cibles prélevées in vivo, lesdits n échantillons in vitro de référence ayant une architecture cellulaire donnée spécifique à leur préparation et différente entre elles ; b) la réalisation du profil d'expression desdits gènes d'intérêt par lesdites cellules cibles pour ledit premier échantillon et lesdits n échantillons in vitro de référence ; c) la comparaison des profils d'expression obtenus à l'étape b) pour chacun desdits gènes d'intérêt ; et d) la sélection comme modèle in vitro d'architecture cellulaire, l'architecture cellulaire de l'échantillon in vitro de référence permettant de mimer le mieux le profil d'expression dudit gène d'intérêt particulier par lesdites cellules cibles du premier échantillon prélevé in vivo, n étant un nombre entier supérieur à 2, de préférence inférieur à 8, inférieur à 7, inférieur à 6, inférieur à 5, de manière plus préférée égal à 3. L'invention concerne de préférence une méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'invention, caractérisée en ce que ledit profil d'expression dudit ou desdits gènes d'intérêt à l'étape b) est réalisé par une méthode de type PCR quantitative, de préférence par une méthode dite de PCR en temps réel.
L'invention concerne également de préférence une méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'invention, caractérisée en ce que les cultures desdites cellules cibles de l'échantillon prélevé in vivo, réalisées afin de préparer les échantillons de référence in vitro et présentant un modèle d'architecture donnée lié à leur préparation, sont effectuées dans le même milieu de culture.
Les procédés de préparation de modèle cellulaire in vitro ayant une architecture cellulaire donnée sont bien connus de l'homme de l'art et ne seront pas développés dans la présente description. On pourra citer mais sans s'y limiter, ceux décrits dans les exemples ci-après.
Sous un autre aspect, l'invention concerne de préférence un procédé d'identification d'un gène dont l'expression est susceptible d'être, ou de confirmation qu'un gène est exprimé de manière, significativement différente ou identique entre une cellule cible in vivo normale et ladite cellule cible in vivo anormale, caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes : A) la détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire permettant de mimer le profil d'expression dudit gène d'intérêt dans une cellule ou tissu de cellules cibles anormales in vivo selon l'invention ;
B) la comparaison du profil d'expression dudit gène d'intérêt obtenu à l'étape B) par les cellules cibles anormales du modèle in vitro déterminé et d'un profil d'expression dudit gène d'intérêt par lesdites cellules cibles normales in vivo ; et
C) déterminer si ou confirmer que ledit gène est exprimé de manière significativement différente ou identique entre lesdites cellules cibles in vivo normales et anormales après comparaison desdits profils d'expression. L'invention concerne également un procédé de sélection d'un composé capable de modifier l'expression d'un gène d'intérêt dans des cellules cibles anormales, de préférence de cellules cibles présentant un caractère tumoral, caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes :
A) la détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire permettant de mimer le profil d'expression dudit gène d'intérêt dans lesdites cellules ou tissu desdites cellules cibles anormales in vivo selon l'invention ;
B) la mise en présence du composé à tester avec ledit modèle in vitro ainsi déterminé ;
C) la réalisation du profil d'expression dudit gène d'intérêt par lesdites cellules cibles dudit modèle in vitro obtenu à l'étape B) ; D) l'observation du profil d'expression obtenu à l'étape C) ; et
E) la sélection dudit composé si celui-ci permet de modifier l'expression dudit gène d'intérêt dans lesdites cellules cibles du modèle in vivo.
La présente invention a de préférence pour objet un procédé de sélection d'un composé selon l'invention, susceptible d'être utilisé pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à prévenir et/ou à traiter une pathologie induite par l'état d'anormalité desdites cellules cibles du premier échantillon prélevé in vivo.
L'invention concerne de préférence également un procédé de sélection d'un composé selon l'invention, susceptible d'être utilisé pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à prévenir et/ou à traiter le cancer. L'invention concerne de préférence également un procédé de sélection d'un composé selon l'invention, caractérisé en ce que ledit composé est choisi parmi les composés suivants : a) les composés susceptibles d'inhiber l'expression dudit gène d'intérêt ou l'activité fonctionnelle du produit d'expression dudit gène d'intérêt si ledit gène est surexprimé dans ladite cellule cible anormale ; b) les composés susceptibles de rétablir l'expression normale dudit gène d'intérêt ou l'activité fonctionnelle normale du produit d'expression dudit gène d'intérêt si ledit gène est sousexprimé dans ladite cellule cible anormale ou si l'activité fonctionnelle du produit d'expression dudit gène d'intérêt pour au moins une partie est anormale.
L'invention concerne de préférence également un procédé de sélection d'un composé selon l'invention, caractérisé en ce que ledit composé est choisi parmi les composés capables d'aboutir à une modification qualitative et/ou quantitative du produit d'expression normale dudit gène d'intérêt.
L'invention concerne de préférence également un procédé de sélection d'un composé selon l'invention, caractérisé en ce que ledit composé est choisi parmi les composés : a) une séquence nucléique sens ou antisens de la séquence dudit gène d'intérêt ; b) un fragment de la séquence dudit gène d'intérêt comprenant éventuellement une délétion, une insertion ou une substitution d'au moins un nucléotide par rapport à la séquence normale dudit gène d'intérêt.
Sous un dernier aspect, l'invention concerne l'utilisation d'une méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'invention pour l'identification d'un modèle pertinent d'étude in vitro d'expression d'au moins un gène d'intérêt dans une cellule cible in vivo.
L'invention comprend de préférence l'utilisation d'une méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'invention, pour l'identification d'un modèle pertinent d'étude in vitro d'expression d'au moins un gène d'intérêt dans une cellule cible in vivo anormale, de préférence présentant un caractère tumoral.
L'invention comprend de préférence l'utilisation d'une méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'invention, pour la sélection de composé chimique ou biochimique capable de modifier l'expression dudit gène d'intérêt, et/ou capable de prévenir ou de traiter une pathologie liée à la présence desdites cellules cibles anormales chez un individu. L'invention comprend aussi l'utilisation d'une méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'invention, comme modèle pertinent d'étude de la prédiction d'une réponse d'un individu à un traitement thérapeutique.
L'invention comprend de préférence l'utilisation d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire de type sphéroïde déterminé par une méthode de détermination selon l'invention comme modèle pertinent d'étude in vitro d'expression d'au moins un gène d'intérêt dans une cellule cible in vivo.
L'invention comprend de préférence également l'utilisation d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire de type sphéroïde déterminé par une méthode de détermination selon l'invention, comme modèle pertinent d'étude in vitro d'expression d'au moins un gène d'intérêt dans une cellule cible in vivo anormale, de préférence présentant un caractère tumoral.
L'invention comprend de préférence également l'utilisation d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire de type sphéroïde déterminé par une méthode de détermination selon l'invention, comme modèle pertinent d'étude pour la sélection de composé chimique ou biochimique capable de modifier l'expression dudit gène d'intérêt, et/ou capable de prévenir ou de traiter une pathologie liée à la présence desdites cellules cibles anormales chez un individu.
L'invention comprend de préférence également l'utilisation d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire de type sphéroïde selon l'invention, caractérisée en ce que ledit modèle in vitro d'architecture cellulaire de type sphéroïde comprend un nombre de cellules dont la valeur est significative de l'expression dudit gène d'intérêt dans lesdites cellules cibles in vivo.
Les légendes des figures et exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée. Légendes des figures
Figures 1A, 1B, 1C et 2 : Profil d'expression de gènes d'intérêt obtenu à partir d'un fragment de tumeur vésicale (Tum 07) prélevé chez un patient : • obtenu pour l'échantillon prélevé in vivo sur la tumeur ("Tumeur") ; • obtenu pour une lignée cellulaire établie à partir d'un fragment de la tumeur prélevée in vivo : - pour une suspension cellulaire issue de cette lignée ("suspension"), - pour un tapis cellulaire issu de cette lignée ("Strate unique"),
- pour un sphéroïde comprenant environ 2 000 cellules ("sphéroïdes 2 000 cellules") ou 5 000 cellules ("sphéroïdes 5 000 cellules") issu de cette lignée cellulaire.
Les résultats représentent la quantité de transcripts (ARNm) exprimés dans les différents échantillons testés, cette quantité étant exprimée en nombre de fois la quantité exprimée pour l'échantillon de cellules cibles prélevé in vivo ("tumeur") dont la valeur a été prise comme référence (1,0000), et représentée à l'aide d'une échelle logarithmique.
Les figures 1A, 1B, 1C et 2 représentent respectivement les valeurs obtenues pour les gènes d'intérêt hCGbêta, c-fos, intégrine alpha E précurseur et c-myc.
EXEMPLE 1 : Matériels et Méthodes
A) Echantillons tumoraux
Les quatre échantillons tumoraux proviennent de cystectomie de patients atteints de cancer de la vessie en accord avec les règles éthiques de l'hôpital. Après la chirurgie, un fragment tumoral a été congelé dans l'azote liquide. Un autre fragment a été placé dans du milieu de culture afin d'établir des lignées de cellules tumorales selon les protocoles déjà décrits (6). L'histologie et le pourcentage de cellules viables de chaque échantillon ont été déterminés par un examen visuel de sections adjacentes colorées en hématoxyline et éosine.
B) Culture cellulaire in vitro
Tous les types de cultures sont cultivés dans le même milieu, du « milieu de culture » (RPMI 1640 avec 4x10-5 2-β mercaptoethanol, 2 mM L-glutamine, 100 U/ml pénicilline, 100 μg/ml streptomycine, 1% de pyruvate de sodium, 0,1 mM d'acides aminés non essentiels) supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal décomplémenté et de 10 μg/ml d'insuline. Les tapis cellulaires sont obtenus en platant 0,5x106 cellules par flasque de culture de 75 cm2. L'extraction d'ARN est faite sur des cultures subconfluentes. Les suspensions cellulaires, provenant de la trypsination des tapis cellulaires, sont resuspendues dans du milieu de culture pendant 1 heure à 37°C avant la préparation d'ARN. Les sphéroïdes de différentes tailles sont préparées dans des plaques 96 puits fond conique recouverts de poly (2 hydroxyethyl métacrylate) comme décrit précédemment (7). Après 5 jours, les sphéroïdes contiennent un nombre moyen de 2 000, 5 000, 10 000 ou 20 000 cellules et sont collectées pour l'extraction d'ARN.
C) Détermination des niveaux d'ARNm avec la PCR en temps réel L'ARN total est extrait des échantillons tissulaires ou des cellules cultivées in vitro avec du RNAble en suivant les instructions du fournisseur. La concentration de l'ARN est déterminée à 260 nm et sa qualité est vérifiée sur gel d'électrophorèse classique. Un μg d'ARN total de chaque échantillon est réverse transcrit dans un volume réactionnel de 20 μl avec 50 U de RT (Réverse Transcriptase) de MMLV, 20 U d'inhibiteur de RNase, 1 mM dA/T/G/C, 5 mM MgC12, 10 mM Tris HCl pH 8,3, 10 mM KC1 et 50 pM de random hexamers. Les ADNc sont dilués au 1/20 dans de l'eau dépourvue de nucléases. La PCR en temps réel est faite sur un SDS 7700 ABI Prism basé sur le principe de nucléase en 5'. Une sonde d'oligonucléotide marquée à son extrémité 5' avec un fluorochrome reporter, le Fam, et en 3' avec un fluorochrome quencher, le Tamra est présent lors de la phase d'extension de PCR. Cet oligonucléotide s'hybride à sa séquence complémentaire sur le produit de PCR mais ne peut conduire à une amplification. La dégradation de la sonde lors de l'amplification du produit de PCR libèrent les 2 fluorochromes et la fluorescence du reporter peut être suivie et mesurée, permettant une quantification en temps réel. Tout le protocole suit les instructions du fournisseur (Perkin-Elmer Applied Biosystems Inc., Foster City, CA). Les séquences des amorces et des sondes utilisés pour chaque gène sont les suivantes :
- hCGβ : CCCATCAATGCCACCCTG (SEQ ID N°l), GCAGCACGCGGGTCAT (SEQ ID N° 2), et 6FAM-TGCCCCGTGTGCATCACCG-TAMRA (SEQ ID N°
3) ; - Fos : AAGAGAAAAGGAGAATCCGAAGG (SEQ ID N° 4), GCAGACTTCTCATCTTCTAGTTGGTCT (SEQ ID N° 5), et 6FAM- CCAAATGCCGCAACCGGAGGA-TAMRA (SEQ ID N° 6) ;
- Myc, ATTCTCTGCTCTCCTCGACGG (SEQ ID N° 7), AGACTGCCTCTTTTCCACAG (SEQ ID N° 8), et 6FAM- CATGAGGAGACACCGCCCACCA-TAMRA (SEQ ID N° 9) ;
- L25851 (précurseur de l'intégrine alpha E): ATGCAAAGGATGCTGGGTCT (SEQ ID N°10), AAGAAAATATCAACAACTGAACTTGGAG (SEQ ID N° 11), et 6FAM-AGCAGGTCCTAATTCTCTTCTTCGAGCAGATTC-TAMRA (SEQ ID N° 12).
La PCR en temps réel est réalisé avec de l'ADNc équivalent à 20 ng d'ARN total pour un volume réactionnel de 50 μl avec le mix TaqMan® PCR Universal Master. Pour normaliser les différences de quantités d'ARN total servant à la réaction, l'ARN ribosomal 18S est amplifié comme contrôle. Pour quantifier les profils d'expression de chaque échantillon, nous avons utilisé la méthode Ct d'après les instructions du fournisseur. Les références sont constituées par les échantillons des tumeurs d'origine et tous les autres niveaux d'ARN sont exprimés en multiples de cette référence.
EXEMPLE 2 : Résultats obtenus
Les cancers de la vessie sont divisés en 2 groupes : les cancers invasifs et les cancers superficiels. La caractérisation des mécanismes de génétique moléculaire impliqués dans la progression des carcinomes vésicaux est importante à la fois pour l'identification de facteurs pronostics et pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques (4,5). Nous avons utilisé ces cellules cancéreuses comme modèle expérimental pour étudier l'influence de l'architecture spatiale tumorale sur l'expression génique. Quatre fragments de tumeurs vésicales ont été obtenus de patients après chirurgie et ont été utilisés pour établir quatre lignées autologues de cellules Tum 06, Tum 07, Tum 25 et Tum 266. Ces lignées cellulaires ont été utilisées en suspension ou en tapis cellulaires traditionnels ou bien sous forme de sphéroïdes multicellulaires (7) : ces sphéroïdes contenaient 2000, 5000, 10000 ou 20000 cellules. Il a été montré que l'architecture de Tum 26 était représentative des quatre patients (résultat non figuré). Cette lignée cellulaire a été utilisée en suspension cellulaire, en tapis cellulaire en 2D ou sphéroïdes en 3D. Ces architectures cellulaires observées in vitro ont été comparées à celle des cellules tumorales présentes dans le prélèvement tissulaire. Il a été observé que la lignée cellulaire Tum 26, aussi bien que les 3 autres lignées, forment des sphéroïdes qui sont identiques aux agrégats tumoraux trouvés dans les ascites lors de dissémination de carcinomes. En effet, les caractéristiques histologiques, dont le caractère compact, les nombreuses mitoses et les atypies nucléaires, nous permettent de conclure que ces microtumeurs de cellules carcinomateuses obtenues in vitro sont comparables à celles observées dans les analyses cytologiques d'ascite lors de métastases abdominaux, confirmant ainsi l'intérêt de l'architecture de type sphéroïde comme modèle incontournable à tester pour déterminer le modèle d'architecture in vitro pertinent pour l'expression d'un gène d'intérêt dans des cellules cibles in vivo présentant un caractère tumoral.
Le profil d'expression des gènes impliqués dans la transformation maligne a été étudié dans les cellules de cancer de vessie présentées in vitro sous différentes conformations spatiales. Ces gènes ont été sélectionnés pour leur rôle dans les six altérations principales survenant dans la physiologie de la cellule lors de la croissance tumorale (3,9-14) : autosuffisance dans les signaux de croissance, insensibilité aux signaux inhibiteurs de croissance, échappement à l'apoptose, potentiel de réplication illimité, angiogénèse intense, et invasion tissulaire et métastases. La PCR quantitative en temps réel a été utilisée pour déterminer les niveaux d'ARN messagers (ARNm). Pour valider la méthode de PCR en temps réel, des courbes standard pour un gène donné et pour l'ARN ribosomal 18S ont été construites à partir des produits de PCR. Les points d'amplification pour les ARNm des gènes d'intérêt testés et pour le contrôle endogène 18S ont été obtenus (résultat non figuré). L'efficacité de la courbe standard, déterminée par sa pente, permet de quantifier les expressions de gènes dans chaque échantillon. Pour chaque tumeur, la référence est constituée par le prélèvement tissulaire, tous les autres niveaux d'ARN observés dans les échantillons de culture cellulaire ont été exprimés comme des facteurs relatifs à cette référence.
En utilisant cette méthode, il a été trouvé que les profils d'expression génique peuvent être profondément modifiés selon l'architecture tumorale in vitro : par exemple, les transcripts CGβ codant pour la sous-unité β de l'hormone chorionique gonadotrope humaine (hCGβ) présentent un niveau d'expression génique dans Tum 07 qui est 675 fois plus élevé dans les cellules en tapis cellulaire par rapport aux cellules cultivées en sphéroïdes composés de 5 000 cellules (cf. figure 1A). Ainsi, nous avons fréquemment observé que l'architecture tumorale conduit à des variations d'un facteur 10 dans l'expression des gènes et que ces fortes variations n'affectent pas seulement les gènes impliqués dans l'invasion tumorale et les métastases (précurseur de l'intégrine alpha E) mais aussi ceux impliqués dans les cinq autres voies essentielles qui dirigent la croissance tumorale, comme l'invasion tumorale et les métastases (CGβ, c-myc) ou l'insensibilité aux signaux anticroissance (c-myc, c-fos). L'ensemble de ces résultats montre que l'impact de l'architecture sur l'expression génique varie extrêmement selon à la fois l'architecture et le gène considérés. Il est à noter que la comparaison des profils d'expression entre les cellules normales et les cellules cancéreuses révèle que lorsque des transcripts sont exprimés à des niveaux significativement différents, ces niveaux entre les cellules saines et les cellules cancéreuses variaient (augmentation ou diminution) d'un facteur 10 à 13, du moins dans le côlon (16). Une autre étude réalisée dans le cancer du poumon non à petites cellules a montré que le niveau d'expression d'un gène dans le tissu normal était au plus 150 fois supérieur à celui de ce même gène dans la tumeur. Inversement, le niveau d'expression d'un gène dans la tumeur était au plus 57 fois supérieur au contrôle sain (17). En combinant la microdissection laser et les puces ADN pour suivre l'expression d'un gène in vivo dans des populations cellulaires purifiées normales et de cancer du sein, il a été trouvé après vérification par PCR en temps réel et immunochimie que les altérations dans l'expression génique variaient d'un facteur de 8 à 4018. Ces données antérieures et les observations ci présentes suggèrent fortement qu'il est nécessaire de tenir compte de l'architecture des cellules cultivées avant d'interpréter les profils d'expression observés in vitro.
Dans ce contexte, il a été ensuite étudié quel modèle in vitro représente le plus fidèlement les profils d'expression observés dans les prélèvements tumoraux. Pour cela, les profils d'expression observés dans les différents modèles in vitro ont été comparés à ceux des prélèvements tumoraux. Ainsi, il est certain que les profils présentés par les sphéroïdes sont souvent plus proches de ceux des échantillons tissulaires que ceux des suspensions ou des tapis cellulaires. Par exemple, il n'y a une différence que de 2,2 à 3 fois de l'expression de CGβ entre les sphéroïdes Tum 07 et la tumeur d'origine alors que les cellules Tum 07 en suspension ou en tapis présentent une augmentation d'un facteur respectif 15 et 229 de l'expression du gène CGβ comparé au prélèvement Tum 07 (cf. figure 1A). L'expression des transcripts CGβ est associée à la transformation maligne des cellules non trophoblastiques et, en particulier, à la transformation des cellules urothéliales (11, 15). Le taux d'expression d'un même gène peut varier plus de 600 fois en fonction de l'architecture cellulaire. Par exemple, les transcrits CGβ (codant pour la sous-unité bêta de l'hormone chorionique gonadotrope) sont 675 fois plus abondants dans les cellules issues de la tumeur Tum 07 et formant une strate unique que dans les sphéroïdes composés de 5 000 cellules (Figure 1A). Par comparaison, il a été décrit que l'expression de gènes différemment exprimés dans une cellule normale et dans une cellule tumorale varie en moyenne d'un facteur de 10 à 13 (référence 16 de l'article). Une autre étude montre que la différence d'expression de gènes entre tissus normal et tissus tumoral varie entre 8 à 40 fois (référence 18). Dans les cellules issues de la tumeur Tum07, cette modification est de 14 fois pour c-fos (Figure 1B), de 19 fois pour le gène codant le précurseur de l'intégrine alpha (L25851) (Figure 1C) ou de 10 fois pour le gène c-myc (Figure 2). Il est donc très surprenant de constater que la simple modification d'architecture influence fortement le niveau d'expression d'un gène.
Le modèle in vitro des sphéroïdes en 3 dimensions permet le plus souvent d'observer un profil d'expression de gènes qui mime celui observé in vivo. C'est par exemple ce qui a été observé dans les cellules issues de la tumeur Tum 07 pour les gènes codant l'hCGβ, Fos et le précurseur de l'intégrine (Figures 1A, 1B, 1C).
Ces données suggèrent que les niveaux élevés d'expression de CGβ dans les suspensions ou les tapis cellulaires pourraient être un artefact de culture cellulaire alors que les sphéroïdes reflètent mieux l'expression de CGβ des cellules de la tumeur d'origine. Des observations similaires ont été faites pour de nombreux gènes dont c-fos et le gène codant le précurseur de l'intégrine alpha E. A l'inverse, les profils d'expression d'un nombre limité de gènes, dont c-myc, sont plus près des profils in vivo dans les cellules en 2D que dans les sphéroïdes. Finalement, l'ensemble de ces observations suggèrent que : i) il est nécessaire de sélectionner pour un gène donné le modèle in vitro mimant le mieux la réalité in vivo ; ii) le modèle 3D des sphéroïdes reflète mieux l'architecture 3D des tumeurs solides ; iii) ce modèle in vitro pourrait être préférentiellement utilisé en biologie post-génomique (1).
Finalement, la grande influence de l'architecture tumorale sur l'expression des gènes impliqués dans la croissance tumorale cadre avec la récente suggestion selon laquelle le contrôle de la croissance au niveau de l'architecture tissulaire pourrait représenter une étape du processus de tumorigénèse (2). Ces observations requièrent que nous replacions dans un plus grand contexte ce que nous avons appris sur l'expression génique afin que en post-génomique, nous prenions en compte l'architecture cellulaire, la micromécanique et donc la complexité structurelle des tissus.
Bibliographie
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Claims

REVENDICATIONS
1/ Méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire permettant de mimer le profil d'expression d'un gène d'intérêt dans une cellule ou tissu de cellules cibles in vivo, caractérisée en ce que ladite méthode comprend les étapes suivantes : a) le prélèvement in vivo d'un premier échantillon desdites cellules cibles et la sélection d'au moins un deuxième échantillon in vitro de référence pour lesdites cellules cibles prélevées in vivo, ledit deuxième échantillon in vitro de référence ayant une architecture cellulaire donnée spécifique à sa préparation ; b) la réalisation du profil d'expression dudit gène d'intérêt par lesdites cellules cibles pour ledit premier échantillon et ledit au moins deuxième échantillon ; c) la comparaison des profils d'expression obtenus à l'étape b) ; et d) la sélection comme modèle in vitr-o d'architecture cellulaire, l'architecture cellulaire de l'échantillon in vitro de référence si celui-ci permet de mimer le profil d'expression dudit gène d'intérêt par lesdites cellules cibles du premier échantillon prélevé in vivo.
2/ Méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit au moins deuxième échantillon in vitro de référence pour lesdites cellules cibles prélevées in vivo est issu de culture de lignées cellulaires établies à partir de prélèvement in vivo autologue ou hétérologue desdites cellules cibles.
3/ Méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que ledit au moins deuxième échantillon in vitro de référence pour lesdites cellules cibles prélevées in vivo est issu de culture de lignées cellulaires établies à partir de prélèvement in vivo autologue desdites cellules cibles.
4/ Méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ledit au moins deuxième échantillon in vitro de référence pour lesdites cellules cibles prélevées in vivo est issu de culture de lignées cellulaires présentant le même patrimoine génétique que lesdites cellules cibles prélevées in vivo. 5/ Méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ledit prélèvement in vivo du premier échantillon de cellules cibles est un échantillon de cellules cibles anormales.
61 Méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon la revendication 5, caractérisée en ce que lesdites cellules cibles anormales présentent un caractère tumoral.
7/ Méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que ladite architecture cellulaire donnée spécifique à la préparation dudit échantillon in vitro de référence est choisie parmi les architectures cellulaires suivantes :
- l'architecture cellulaire en 3 dimensions de type sphéroïde ;
- l' architecture cellulaire obtenue pour une suspension cellulaire dans laquelle chacune ou la grande majorité des cellules sont en suspension ; et
- l'architecture cellulaire obtenue pour une couche cellulaire dans laquelle les cellules forment un tapis cellulaire en 2 dimensions.
8/ Méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon la revendication 7, caractérisée en ce que ladite architecture cellulaire en 3 dimensions comprend un nombre de cellules supérieur à 50, de préférence compris entre 2 000 et 20 000 cellules. 9/ Méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que ledit au moins deuxième échantillon in vitro de référence possède une architecture cellulaire en 3 dimensions de type sphéroïde.
10/ Méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que :
- on sélectionne à l'étape a) un troisième échantillon in vitro de référence pour lesdites cellules cibles, ledit troisième échantillon in vitro de référence ayant une architecture cellulaire donnée spécifique à sa préparation et différente de celle dudit deuxième échantillon ; - on réalise à l'étape b) le profil d'expression dudit gène d'intérêt par lesdites cellules cibles pour lesdits premier, deuxième et troisième échantillons ;
- on compare les profils d'expression obtenus à l'étape b) ; et - on sélectionne comme modèle in vitro d'architecture cellulaire, l'architecture cellulaire de l'échantillon in vitro de référence permettant de mimer le profil d'expression dudit gène d'intérêt par lesdites cellules cibles du premier échantillon prélevé in vivo. 11/ Méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon la revendication 10, caractérisée en ce que :
- on sélectionne à l'étape a) un quatrième échantillon in vitro de référence pour lesdites cellules cibles, ledit quatrième échantillon in vitro de référence ayant une architecture cellulaire donnée spécifique à sa préparation et différente de celle desdits deuxième et troisième échantillons ;
- on réalise à l'étape b) le profil d'expression dudit gène d'intérêt par lesdites cellules cibles pour lesdits premier, deuxième, troisième et quatrième échantillons ;
- on compare les profils d'expression obtenus à l'étape b) ; et
- on sélectionne comme modèle in vitro d'architecture cellulaire, l'architecture cellulaire de l'échantillon in vitro de référence permettant de mimer le profil d'expression dudit gène d'intérêt par lesdites cellules cibles du premier échantillon prélevé in vivo.
12/ Méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisée en ce que ledit profil d'expression dudit gène d'intérêt à l'étape b) est réalisé pour au moins un gène dont l'expression est représentative ou susceptible d'être représentative de l'état desdites cellules cibles prélevées in vivo.
13/ Méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisée en ce que ledit profil d'expression dudit gène d'intérêt à l'étape b) est réalisé pour au moins un gène d'intérêt choisi parmi le groupe de gènes suivant :
- un gène dont l'expression est représentative ou susceptible d'être représentative de l'état d'anormalité de ladite cellule cible ; et/ou
- un gène dont l'expression est liée au moins en partie à une pathologie induite par une altération de cette expression, notamment à un cancer ; et/ou
- un gène dont la séquence est connue pour présenter un polymorphisme associé à une pathologie, notamment un cancer ; et/ou - un gène dont on cherche à comparer l'expression entre une cellule normale et une cellule anormale ; et/ou
- dont on cherche à modifier l'expression dans lesdites cellules cibles du premier échantillon prélevé in vivo. 14/ Méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisée en ce que ledit profil d'expression dudit gène d'intérêt à l'étape b) est réalisé pour au moins un gène dont on cherche à modifier l'expression dans lesdites cellules cibles par un composé susceptible d'être utilisé pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à prévenir et/ou à traiter une pathologie induite par l'état d'anormalité desdites cellules cibles du premier échantillon prélevé in vivo.
15/ Méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisée en ce que ledit profil d'expression dudit gène d'intérêt à l'étape b) est réalisé pour au moins un gène dont l'expression est représentative ou susceptible d'être représentative du caractère tumoral desdites cellules cibles du premier échantillon prélevé in vivo.
16/ Méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisée en ce que l'architecture cellulaire de l'échantillon in vitro de référence est sélectionnée comme modèle in vitro d'architecture cellulaire si le profil d'expression dudit gène d'intérêt dans ladite architecture cellulaire sélectionnée permet d'observer une quantité de produit du gène d'intérêt, de préférence son ARNm, exprimée par lesdites cellules cibles comprises entre au plus 7 fois plus et au moins 7 fois moins la quantité observée pour le même produit dudit gène d'intérêt exprimé par lesdites cellules cibles de l'échantillon prélevé in vivo. 17/ Méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon la revendication 16, caractérisée en ce que dans ladite architecture cellulaire sélectionnée ladite quantité de produit du gène d'intérêt exprimée par lesdites cellules cibles est comprise entre au plus 3 fois plus et au moins 3 fois moins la quantité observée pour le même produit dudit gène d'intérêt exprimé par lesdites cellules cibles de l'échantillon prélevé in vivo.
18/ Méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'une des revendications 1 à 17, caractérisée en ce que ledit profil d'expression de gène(s) à l'étape b) est réalisé pour au moins un gène choisi parmi le groupe de gènes comprenant les gènes suivants :
- les gènes liés à l'échappement à l'apoptose : c-myc, Fas, Fas-L, p53, Bcl2, cas 8, Cas 9, IGF 1, IGF 2, hCGβ ; - les gènes liés à la néoangiogénèse : VEGF, P53, ras ;
- les gènes liés au potentiel de réplication illimité : télomérase, ras, pi 6, CDK4 ;
- les gènes liés à l'invasion et aux métastases : heparanase, E-cadhérine, UPAR, vimentine, cytokératine 8, intégrine alpha ;
- les gènes liés à l'insensibilité des signaux inhibiteurs de croissance : c-myc, c-fos, c- jun, TGBβ, pl5, pi 6, p21, CDK4, Cycline Dl ;
- les gènes liés à l'autosuffisance vis-à-vis des signaux de croissance : TGFa, EGF-R, ras.
19/ Méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'une des revendications 1 à 18, caractérisée en ce que ledit profil d'expression de gène(s) à l'étape b) est réalisé pour au moins un gène choisi parmi le groupe de gènes comprenant les gènes CGβ, c-fos, c-myc et intégrine α E précurseur, de préférence humain.
20/ Méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'une des revendications 1 à 19 permettant de mimer le profil d'expression d'un gène d'intérêt particulier pris parmi un groupe d'au moins deux gènes d'intérêt dans une cellule ou tissu de cellules cibles in vivo, caractérisée en ce que ladite méthode comprend les étapes suivantes : a) le prélèvement in vivo d'un premier échantillon desdites cellules cibles et la sélection d'au moins n échantillons in vitro de référence pour lesdites cellules cibles prélevées in vivo, lesdits n échantillons in vitro de référence ayant une architecture cellulaire donnée spécifique à leur préparation et différente entre elles ; b) la réalisation du profil d'expression desdits gènes d'intérêt par lesdites cellules cibles pour ledit premier échantillon et lesdits n échantillons in vitro de référence ; c) la comparaison des profils d'expression obtenus à l'étape b) pour chacun desdits gènes d'intérêt ; et d) la sélection comme modèle in vitro d'architecture cellulaire, l'architecture cellulaire de l'échantillon in vitro de référence permettant de mimer le profil d'expression dudit gène d'intérêt particulier par lesdites cellules cibles du premier échantillon prélevé in vivo, n étant un nombre entier supérieur à 2, de préférence inférieur à 8, inférieur à 7, inférieur à 6, inférieur à 5, de manière plus préférée égal à 3. 21/ Méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'une des revendications 1 à 20, caractérisée en ce que ledit profil d'expression dudit ou desdits gènes d'intérêt à l'étape b) est réalisé par une méthode de type PCR quantitative, de préférence par une méthode dite de PCR en temps réel.
22/ Procédé d'identification d'un gène dont l'expression est susceptible d'être, ou de confirmation qu'un gène est exprimé de manière, significativement différente ou identique entre une cellule cible in vivo normale et ladite cellule cible in vivo anormale, caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes :
A) la détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire permettant de mimer le profil d'expression dudit gène d'intérêt dans une cellule ou tissu de cellules cibles anormales in vivo selon l'une des revendications 1 à 21 ;
B) la comparaison du profil d'expression dudit gène d'intérêt obtenu à l'étape b) par les cellules cibles anormales du modèle in vitro déterminé et d'un profil d'expression dudit gène d'intérêt par lesdites cellules cibles normales in vivo ; et
C) déterminer si ou confirmer que ledit gène est exprimé de manière significativement différente ou identique entre lesdites cellules cibles in vivo normales et anormales après comparaison desdits profils d'expression.
23/ Procédé de sélection d'un composé capable de modifier l'expression d'un gène d'intérêt dans des cellules cibles anormales, de préférence de cellules cibles présentant un caractère tumoral, caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes :
A) la détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire permettant de mimer le profil d'expression dudit gène d'intérêt dans lesdites cellules ou tissu desdites cellules cibles anormales in vivo selon l'une des revendications 1 à 21 ;
B) la mise en présence du composé à tester avec ledit modèle in vitro ainsi déterminé ; C) la réalisation du profil d'expression dudit gène d'intérêt par lesdites cellules cibles dudit modèle in vitro obtenu à l'étape B) ;
D) l'observation du profil d'expression obtenu à l'étape C) ; et E) la sélection dudit composé si celui-ci permet de modifier l'expression dudit gène d'intérêt dans lesdites cellules cibles du modèle in vivo.
24/ Procédé de sélection d'un composé selon la revendication 23, caractérisé en ce que ledit composé est choisi parmi les composés : a) une séquence nucléique sens ou antisens de la séquence dudit gène d'intérêt ; b) un fragment de la séquence dudit gène d'intérêt comprenant éventuellement une délétion, une insertion ou une substitution d'au moins un nucléotide par rapport à la séquence normale dudit gène d'intérêt.
25/ Utilisation d'une méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon l'une des revendications 1 à 21 pour l'identification d'un modèle d'étude in vitro d'expression d'au moins un gène d'intérêt dans une cellule cible in vivo.
26/ Utilisation d'une méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon la revendication 25, pour l'identification d'un modèle d'étude in vitro d'expression d'au moins un gène d'intérêt dans une cellule cible in vivo anormale, de préférence présentant un caractère tumoral.
27/ Utilisation d'une méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon la revendication 26, pour la sélection de composé chimique ou biochimique capable de modifier l'expression dudit gène d'intérêt, et/ou capable de prévenir ou de traiter une pathologie liée à la présence desdites cellules cibles anormales chez un individu.
28/ Utilisation d'une méthode de détermination d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire selon la revendication 25 ou 26, comme modèle d'étude de la prédiction d'une réponse d'un individu à un traitement thérapeutique. 29/ Utilisation d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire de type sphéroïde déterminé par une méthode de détermination selon l'une des revendications 1 à 21 comme modèle d'étude in vitro d'expression d'au moins un gène d'intérêt dans une cellule cible in vivo.
30/ Utilisation d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire de type sphéroïde déterminé par une méthode de détermination selon l'une des revendications 1 à 21, comme modèle d'étude in vitro d'expression d'au moins un gène d'intérêt dans une cellule cible in vivo anormale, de préférence présentant un caractère tumoral. 31/ Utilisation d'un modèle in vitro d'architecture cellulaire de type sphéroïde déterminé par une méthode de détermination selon l'une des revendications 1 à 21, comme modèle d'étude pour la sélection de composé chimique ou biochimique capable de modifier l'expression dudit gène d'intérêt, et/ou capable de prévenir ou de traiter une pathologie liée à la présence desdites cellules cibles anormales chez un individu.
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