FR2798288A1

FR2798288A1 - VACCINE COMPOSITIONS FOR MUCOSAL ADMINISTRATION

Info

Publication number: FR2798288A1
Application number: FR9911465A
Authority: FR
Inventors: Sophie Gaubert; Rene Laversanne
Original assignee: Capsulis SA
Current assignee: Capsulis SA
Priority date: 1999-09-14
Filing date: 1999-09-14
Publication date: 2001-03-16
Anticipated expiration: 2019-09-14
Also published as: WO2001019335A3; EP1212043A2; WO2001019335A2; FR2798288B1; JP2003509352A; CA2384876A1; AU782653B2; AU7428400A

Abstract

The invention concerns a novel use of onion-structured multilamellar vesicles having a liquid-crystal internal structure formed by stacked concentric double layers based on amphiphilic agents with layers of water, aqueous solution or solution of polar liquid and wherein is incorporated at least an antigen for making a composition, in particular a pharmaceutical composition, and more particularly a vaccine composition, to be administered through a mucous membrane to induce a mucous and/or serumal systemic response and/or for protecting the system against infection caused by said antigen. The invention also concerns a vaccine method through a mucous membrane and a method for producing antibodies, in particular, IgA. The invention is particularly applicable for intranasal administration.

Description

La présente invention concerne de nouvelles compositions vaccinales destinéesà une administration par voie muqueuse. The present invention relates to novel vaccine compositions for administration to the mucosal route.

On donne ci-après quelques définitions Administration par voie muqueuse: administration non invasive de l'antigèneà site muqueux, par exemple - aire naso-pharyngée - aire buccale - arbre bronchique - intestin - tractus uro-génital - oreille interne - conjonctive - glandes mammaires, salivaires et lacrymales. Some definitions of Mucosal Administration are given below: Non-invasively administering the antigen to the mucosal site, for example - nasopharyngeal area - mouth area - bronchial tree - bowel - urogenital tract - Internal Ear - Conjunctival - Mammary, salivary and lacrymal glands.

Parmi ces différents constituants du tissu lymphoïde associé aux muqueuses (MALT), certaines voies d'introduction sont d'un accès et d'une acceptabilité plus aisés: nasale, buccale, gastro-intestinale, rectale et vaginale. Réponse muqueuse: réponse du système immunitaire au niveau des muqueuses caractérisée par une production d'IgA (isotype en concentration importante dans les muqueuses) et d'IgG et/ou une réponse cellulaire au sein du site muqueux et des ganglions drainants. Among these various constituents of mucosal-associated lymphoid tissue (MALT), some routes of introduction are of easier access and acceptability : nasal, oral, gastrointestinal, rectal, and vaginal . Mucosal response : immune system response at mucosal level characterized by IgA (isotype at high mucosal concentration) and IgG production and / or response cell within the mucosal site and draining lymph nodes.

Réponse systémique: réponse du système immunitaire généralisée se traduisant par la présence d'anticorps circulants (IgG et aussi IgA) et/ou une réponse cellulaire (Thelper ou CTL) dans les organes lymphoïdes secondaires (rate, ganglions). Systemic Response : Response of the generalized immune system resulting in the presence of circulating antibodies (IgG and also IgA) and / or a cellular response (Thelper or CTL) in the Secondary lymphoid organs (spleen, ganglia).

Dissémination de la réponse: installation d'une réponse muqueuse dans d'autres compartiments que celui de l'induction, du fait de la circulation et de la relocalisation des lymphocytes induits au site d'administration (IgA vaginales après administration nasale par exemple). Dissemination of response : installation of a mucosal response in other compartments than that of induction, due to the circulation and relocation of lymphocytes induced by site of administration (vaginal IgA after nasal administration for example).

Adjuvant: substance ajoutéeà l'antigène de manièreà amplifier et orienter la réponse immunitaire spécifique de cet antigène. Adjuvant : substance added to the antigen so to amplify and guide the specific immune response of that antigen.

Vecteur synthétique/vectorisation : incorporation de l'antigène dans ouà la surface d'une particule ou vésicule, de manièreà protéger l'antigène et/ou à faciliter sa capture par les cellules compétentes du système immunitaire et/ou à faciliter l'apprêtement de l'antigène par lesdites cellules, et ainsià amplifier la réponse immunitaire. L'addition d'un vecteur videà l'antigène libre n'apporte pas ou d'amplification. Vector synthetic / vectorization : incorporation of the antigen into or to the surface of a particle or vesicle, so to protect the antigen and / or to facilitate its capture by the competent cells of the immune system and / or to facilitate the processing of the antigen by said cells , and thus to boost the immune response. Addition of an empty vector to the free antigen does not provide or amplify.

Jusqu'à récemment, les vaccins étaient obtenusà partir de micro organismes tues, atténués ou moins virulents. L'industrie pharmaceutique aujourd'hui chercheà éviter cette approcheà la fois pour des raisons de limitation des effets secondaires, de facilité de production, de sécurité d'administration et d'efficacité. Until recently, vaccines were obtained from microorganisms killed, attenuated or less virulent. The pharmaceutical industry today seeks to to avoid this to approach both for the sake of limiting side effects, ease of production, administrative safety and security. 'efficiency.

Les progrès de la biologie moléculaire ont permis la production industrielle de sous-unités de ces micro-organismes en particulier des protéines dites recombinantes, qu'elles soient membranaires, nucléaires ou cytoplasmiques. Malheureusement ces sous-unités ne sont pas assez immunogènes par elles-mêmes pour apporter réponse suffisante dans l'optique de la vaccination. Advances in molecular biology have allowed the industrial production of subunits of these microorganisms, particularly so-called recombinant proteins, whether membrane, nuclear or cytoplasmic. Unfortunately, these subunits are not immunogenic enough by themselves to provide a sufficient response for vaccination purposes.

Elles ont besoin d'être adjuvantées ou vectorisées pour induire une réponse suffisante. They need to be adjuvanted or vectorized to induce a sufficient response.

Aujourd'hui, les seuls adjuvants acceptés en médecine humaine sont l'hydroxyde ou le phosphate d'aluminium ainsi que le phosphate de calcium. Ces sels se présentent sous la forme d'une suspension de grains de sel d'aluminium de calcium,à surface desquels est adsorbé l'antigène. Ils présentent plusieurs inconvénients: ils induisent des réactions locales inflammatoires et la production d'IgE, ils ne sont pas efficaces pour tous les antigènes et ils sont incapables d'engendrer réactionsà médiation cellulaire de type CTL. De fait, ils ne sont pas utilisés jusqu'à présent dans le cas d'administration par voie muqueuse. Today, the only adjuvants accepted in human medicine are aluminum hydroxide or phosphate and calcium phosphate. These salts are in the form of a suspension of grains of calcium aluminum salt, on whose surface the antigen is adsorbed. They have several disadvantages: they induce inflammatory local reactions and IgE production, they are not effective for all antigens and they are incapable of generating reactions to CTL type cell mediation. In fact, they are not used until now in the case of mucosal administration.

Or, l'importance des surfaces muqueuses est considérable, d'une parce qu'elles sont présentes au niveau de tous les tractus et d'autre part parce qu'elles sont la première ligne de défense contre l'invasion des agents pathogènes. However, the importance of mucosal surfaces is considerable, because they are present in all the tracts and because they are the first line of defense against the invasion of pathogens.

La protection des surfaces muqueuses est assuréeà la fois par mécanismes de défense innés ou non adaptatifs (péristaltisme, mouvements cilies et mucus) et par la mise en place d'une réponse immune cellulaire et humorale adaptative spécifique de l'agent pathogène qui peut se généraliser aux autres organes lymphoïdes. C'est le tissu lymphoïde associé aux muqueuses (MALT) est responsable de la composante spécifique. The protection of the mucosal surfaces is ensured with both by innate or non-adaptive defense mechanisms (peristalsis, ciliate movements and mucus) and by the establishment of an adaptive cellular and humoral immune response specific to the pathogen that can be generalized to other lymphoid organs. It is the lymphoid tissue associated with the mucous membranes (MALT) is responsible for the specific component.

A égard, la vaccination par voie muqueuse représente un enjeu considérable. A therefore, mucosal vaccination is a considerable challenge.

Aujourd'hui, tous les vaccins sauf celui contre la poliomyélite sont injectables, ce implique: - Une médicalisation - Un mauvais accueil -Un inconfort (fièvre, douleur site d'injection... - Des risques de contamination hépatites) - Un coût élevé dans les pays voie de développement L'administration par voie muqueuse présenterait un avantage pour différentes raisons: - des coûts de production moins élevés liésà des conditions de préparation moins coiitraignantes que celles pour un vaccin injectable - son caractère non invasif élimine les problèmes liésà l'injection décrits ci-dessus Pour cela, elle devrait - procurer une immunité sites d'administration muqueux, permettant de renforcer par une réponse specifique la barrière muqueuse, d'où un intérêt pour les infections transmissibles par voie muqueuse (aériennes, génitales.... ) - procurer une immunité systémique et une réponse effectrice généralisée suiteà une administration aisée - ne pas entraîner d'effets secondaires (irritation locale). Today, all vaccines except the polio vaccine are injectable, this implies : - Medicalization - Unwelcome reception - Discomfort ( Fever, Pain Injection Site ... - Risks of Hepatitis Contamination) - High Cost in Developing Countries L mucosal administration would have an advantage for different reasons: - - lower production costs linked to less costly preparation conditions than those for injectable vaccine - its noninvasive nature eliminates the problems to the injection described above For this, it should - provide immunity sites of mucosal administration, making it possible to strengthen the mucosal barrier by a specific response, hence an interest for mucosally transmissible infections (aerial, genital ....) - get u Systemic immunity and a generalized effector response following to an easy administration - do not result in side effects (local irritation).

Pour une revue assez complète sur l'immunologie des muqueuses on pourra se reporter au "Handbook of mucosal immunology", édité par Pearay Ogra et al, 1994, Academic press, Inc. san Diego Californie,USA. For a fairly complete review of mucosal immunology, see Handbook of Mucosal Immunology, edited by Pearay Ogra, et al., 1994, Academic press, Inc. San Diego California, USA.

De nombreux essais et études ont été réalisés afin de développer de nouveaux adjuvants et vecteurs capables d'induire une réponse muqueuse et systémique efficace en terme de protection contre l'agent pathogène. Différents travaux portent sur l'utilisation de vecteurs vivants recombinants (bactéries ou virus atténués), de vecteurs synthétiques (complexes immunostimulants encore appelés iscoms, ce qui correspondà une abréviation de l'expression anglaise eeimmunostimulating complexes", liposomes, microsphères ... ) ou de toxines de micro-organismes (toxine cholérique-CT- ou toxine then-nolabile dE Coli -LT-). Cependant, une grande partie de ces études est encore au stade de la mise au point et la majorité des formulations présentent des inconvénients: - haute toxicité(CT et LT) et donc impossibilité d'utilisation chez l'homme, - difficultés de préparation (microsphères), - faible stabilité (liposomes), - faible efficacité (liposomes). Plusieurs brevets concernent l'administration par voie muqueuse d'antigènes, vectorisés ou adjuvantés par différents systèmes. On peut citer: - EP 0 440289 (Duphar) qui décrit l'utilisation de liposomes en mélange avec un antigène pour la vaccination contre la grippe. Il s'agitlà d'un effet adjuvant des lipides, le même résultat étant obtenu lorsque l'antigène est mélangé extemporanément avec les liposomes vides. Numerous trials and studies have been carried out to develop new adjuvants and vectors capable of inducing a mucosal and systemic response that is effective in terms of protection against the pathogen. Various works deal with the use of recombinant live vectors (bacteria or attenuated viruses), synthetic vectors (immunostimulating complexes also called iscoms, which corresponds to an abbreviation of the expression eeimmunostimulating complexes). liposomes, microspheres ...) or toxins of micro-organisms (cholera toxin -CT - or then-nolabile toxin of Coli -LT-). part of these studies is still in the development stage and the majority of the formulations have disadvantages : - high toxicity (CT and LT ) and therefore impossibility of use in humans, - preparation difficulties (microspheres), - low stability (liposomes), - weak Efficacy (liposomes) Several patents relate to the mucosal administration of antigens, vectorized or adjuvanted by different systems. - 0 440 289 (Duphar) which describes the use of liposomes mixed with an antigen for influenza vaccination. It is there an adjuvant effect of lipids, the same result being obtained when the antigen is mixed extemporaneously with the empty liposomes.

- WO 98/10748 (The School of Pharmacy) utilisant liposomes cationiques, dans le cas d'une injection ou d'une administration par voie muqueuse, - US 5,679,355 (Proteus) décrivant des vésicules ioniques, qui peuvent être administrées par voie parentérale ou muqueuse (surtout orale). D'autre part, une très abondante littérature scientifique décrit l'utilisation de microparticules polymères comme vecteur d'antigène par voie muqueuse. Une bonne revue de cette littérature peut être trouvée dans: D. T. O'HAGAN, Adv. Drug Deliv. Rev., 34(1198) 305-320. - WO 98/10748 (The School of Pharmacy) using cationic liposomes, in the case of injection or mucosal administration, - < US 5,679,355 (Proteus) describing ionic vesicles, which can be administered parenterally or mucosally (especially oral). On the other hand, a very abundant scientific literature describes the use of polymeric microparticles as a mucosal antigen vector. A good review of this literature can be found in : D. T. O'HAGAN, Adv. Drug Deliv. Rev., 34 (1198) 305-320.

Cependant, aucune de ces technologies n'a abouti aujourd'huià un produit sur marché. Les méthodes de présentation de l'antigène doivent donc encore être améliorées et le développement de nouveaux adjuvants ou vecteurs d'antigènes demeure un besoin urgent dans l'industrie du vaccin. However, none of these technologies has led today to a product on the market. The methods of presenting the antigen must therefore be further improved and the development of new adjuvants or antigenic vectors remains an urgent need in the vaccine industry.

Parmi les vésicules, objets sphériques formés d'arrangement moléculaires molécules amphiphiles, les vésicules multilamellaires à structure en oignon ont fait l'objet d'importantes recherches et ont donné lieuà plusieurs brevets (WO 93/19735; WO 95/18601 ; WO 97/00623 ; WO 98/02144; WO 99/16469). Elles se distinguent des liposomes par: - leur mode de préparation qui part d'une phase lamellaire' l'équilibre thermodynamique - leur structure inteme cristal-liquide formée d'un empilement de bicouches concentriques d'amphiphiles alternant avec des couches d'eau ou de solution aqueuse ou de solution d'un liquide polaire (glycérol, par exemple) - la nature variée des molécules amphiphiles qui peuvent etre utilisées pour les constituer, seules ou en mélange. Among the vesicles, spherical objects formed by arrangement of molecular amphiphilic molecules, multilamellar vesicles to onion structure have been the subject of important research and have given rise to several Patents (WO 93/19735; WO 95/18601; WO 97/00623; WO 98/02144 ; WO 99/16469). They are distinguished from liposomes by: - their mode of preparation which starts from a lamellar phase ' thermodynamic equilibrium - their internal structure crystal liquid formed of a stack of concentric bilayers of amphiphiles alternating with layers of water or aqueous solution or solution of a polar liquid (glycerol, for example) the varied nature of the amphiphilic molecules that can be used to form them, alone or in mixture.

La demande internationale WO 99/16468 décrit vésiculesà structure en oignon incorporant en leur sein un antigène et permettant d'amplifier la réponse immunitaire de cet antigène. Cette demande internationale qui décrit pour la première fois l'incorporation (également désignée dans document par encapsulation) d'antigènes au sein d'une vésicule multilamellaire à structure en oignon montre clairement dans ses exemples qu'une telle encapsulation permet très nettement d'amplifier la réponse immunitaire lors d'une administration parentérale d'un antigène encapsulé dans une vésicule multilamellaire à structure en oignon. International application WO 99/16468 discloses onion-like vesicles incorporating an antigen within them and allowing amplification of the immune response of this antigen. This international application which describes for the first time the incorporation (also referred to in document by encapsulation) of antigens within a multilamellar vesicle to onion structure clearly shows in its examples that such encapsulation very clearly enhances the immune response when parenteral administration of an antigen encapsulated in a multilamellar vesicle to onion structure.

Les inventeurs de la présente invention ont maintenant découvert que l'administration par vole muqueuse, en particulier nasale, des compositions du type de celles décrites dans la demande WO 99/16468, engendre une réponse immunitaire non seulement au sein de différents sites muqueux mais également dans le compartiment systémique. Cette réponse est caractérisée par l'induction d'immunoglobulineA. Un tel résultat n'était nullement évident vu de la demande WO 99/16468 puisque dans les conditions où était faite l'injection dans les exemples de cette demande, l'antigène, même sous forme encapsulée, induisait pas de réponse IgA détectable. The inventors of the present invention have now discovered that mucosal, in particular nasal, administration of compositions of the type described in application WO 99/16468, gives rise to an immune response not only to within different mucosal sites but also in the systemic compartment. This response is characterized by the induction of immunoglobulin A. Such a result was by no means obvious given the application WO 99/16468 since under the conditions in which it was made injection in the examples of this application, the antigen, even in encapsulated form, induced no detectable IgA response.

Les immunoglobulines(1g) ou anticorps (Ac), associésà des composants cellulaires, sont des acteurs essentiels dans la réponse immunitaire dirigée contre un pathogène. Les Ig sont des protéines hautement spécifiques de l'antigène. Immunoglobulins (1g) or antibodies (Ac), associated with to cellular components, are essential players in the immune response directed against a pathogen. Ig are highly specific proteins of the antigen.

Différentes classes d'anticorps ont été répertoriées, qui se distinguent leur mode d'induction, leur localisation et leur fonction (reconnaissance, neutralisation d'activité toxique ou enzymatique). Different classes of antibodies have been identified, which differ in their mode of induction, their localization and their function (recognition, neutralization of toxic or enzymatic activity).

Dans le compartiment sanguin, la majorité des Ig produites des IgG circulants (sub-divisé en différentes sous-classes), les IgA et les IgE restant très minoritaires.A l'inverse, l'isotype majeur dans les muqueuses est l'I-A qui est produite par les plasmocytes à IgA du système lymphoïde muqueux sécrétée activement par l'épithélium de la muqueuse. In the blood compartment, the majority of Ig produced circulating IgG (subdivided into different subclasses), IgA and IgE remaining very minor. A Conversely, the major isotype in the mucosa is the AI that is produced by the plasmocytes to IgA of the mucoid lymphoid system actively secreted by the mucosal epithelium.

Les IgA sont des anticorps spécialisés et adaptésà la défense des surfaces muqueuses constamment exposées aux pathogènes. Adaptés,, du fait leur structure biochimique (glycosylation, polymérisation, pièce secrétoire), ils résistent aux effets des protéases sécrétées par les micro-organismes et car, contrairement aux autres isotypes, ils limitent les réactions inflammatoires dans compartiments en état d'activation constant. Spécialisés, car agissentà plusieurs niveaux: sécrétés, ils agglutinent les pathogènes, limitent par neutralisation les effets des toxines et l'entrée des pathogènes; ils peuvent également agir au sein de l'épithélium au cours de leur transcytose ou dans la lamina propria. Ils représentent donc une barrière active essentielle qui, associéeà des mécanismes, limitent l'invasion par les pathogènes. Naturellement,à la réponse anticorps, s'associent des réponses cellulaires cytotoxiques et spécifiques qui visentà éliminer le pathogène. Si la réponse locale ne suffit pas, une réponse systémique est enclenchée. IgAs are specialized antibodies and are suitable for the defense of mucosal surfaces constantly exposed to pathogens. Adapted, , because of their biochemical structure (glycosylation, polymerization, secretory part), they resist the effects of proteases secreted by microorganisms and because, unlike other isotypes, they limit inflammatory reactions in compartments in a state of constant activation. Specialized because they act at several secreted : levels, they agglutinate pathogens, limit by neutralization the effects of toxins and the entry of pathogens ; they may also act within the epithelium during their transcytosis or in the lamina propria. They therefore represent an essential active barrier which, when associated with mechanisms, limit invasion by pathogens. Naturally, to the antibody response, associate cytotoxic and specific cellular responses that aim to to eliminate the pathogen. If the local response is not enough, a systemic response is triggered.

Une des caractéristiques très intéressantes du système immunitaire muqueux est la recirculation des lymphocytes B et T induitsà un site muqueux et leur possible domiciliation dans d'autres sites que ceux de l'induction, propageant ainsi la réponse spécifique aux autres tractus. Ce phénomène est très interessant en terme de vaccination. One of the most interesting characteristics of the mucosal immune system is the recirculation of B and T lymphocytes induced at a mucosal site and their possible domiciliation in sites other than those of induction, thus propagating the specific response. to other tracts. This phenomenon is very interesting in terms of vaccination.

Alors que les mécanismes d'induction d'une réponse immune muqueuse sont en cours d'élucidation, il reste souvent extrêmement difficile d'induire une réponse muqueuse par l'administration parentérale antigène (adjuvanté ou non) et même par administration muqueuse de l'antigène. En effet, l'administration par voie parentérale d'un antigène conduità l'induction d'anticorps spécifiques circulants, de type IgG. Ce type d'injection ne permet pas d'induire des IgA au sein des compartiments muqueux (ni systémique).Il est très clair que la vaccination parentérale ne renforcera pas les défenses naturelles locales nécessaires pour lutter contre beaucoup d'infections respiratoires ou génitales par exemple. While the mechanisms of induction of a mucosal immune response are being elucidated, it is often extremely difficult to induce a mucosal response by parenteral antigen administration (adjuvanted or not) and even by mucosal administration of the mucosa. antigen. In fact, the parenteral administration of an antigen leads to the induction of specific circulating antibodies of the IgG type. This type of injection does not allow to induce IgA within the mucosal compartments (nor systemic). It is very clear that parenteral vaccination will not strengthen the local natural defenses necessary to fight against many respiratory or genital infections for example.

Pour ces différentes raisons, il est toutà fait surprenant, même au vu de l'enseignement de WO 99/16468 que le même antigène incorpore dans les mêmes vésicules, administrées par voie muqueuse (nasale) induise non seulement réponse systémique (IgG dans les sérums) confin-nant par une autre voie les precédents résultats, mais également une réponse dans les sites muqueux. L'incorporation de l'antigène dans les vésiculesà structure en oignon engendre la production d'IgA dans le compartiment lié au site d'administration (broncho- pulmonaire) mais aussi dans les autres compartiments muqueux avec une predominance dans les sécrétions génitales. De plus, il faut noter que l'albumine de sérum humain (HSA), utiliséeà titre d'exemple, est un antigène très faiblement immunogène, qui, administré par voie nasale, seul, sans être incorpore dans des vésicules est incapable d'induire une quelconque réponse qu'elle soit muqueuse ou systémique. For these different reasons, it is all to surprisingly, even given the teaching of WO 99/16468 that the same antigen incorporates into the same vesicles, administered by Mucous (nasal) pathway induces not only systemic response (IgG in sera) conferring by another way the previous results, but also a response in mucosal sites. The incorporation of the antigen into the onion vesicles results in the production of IgA in the compartment bound to the site of administration (bronchopulary) but also in the other mucosal compartments with predominance in genital secretions. In addition, it should be noted that human serum albumin (HSA), used to as an example, is a very weakly immunogenic antigen, which, administered nasally, alone, without being incorporated in vesicles is unable to induce any response whether mucosal or systemic.

De plus, on peut remarquer que l'administration par voie muqueuse nécessite par rapportà l'administration parentérale la prise en charge l'antigène dans la muqueuse et donc la pénétration de l'antigène, ce qui implique que l'antigène doit être présenté de manière optimale afin de dépasser les mécanismes de défense non spécifiques (mouvements cillés, mucus) et de résister aux enzymes présents dans la muqueuse ouà sa surface. Il apparaît que ces paramètres sont optimisés par la structure des vésicules lors de l'administration muqueuse. Ces fonctions des vésicules dans l'administration muqueuse n'étaient pas nécessairement présentes lors l'administration parentérale, où l'injection permet d'atteindre directement des zones plus favorablesà une capture par les cellules du système immunitaire. In addition, it may be noted that the mucosal administration requires parenteral administration of the antigen in the mucosa and thus the penetration of the antigen in relation to B, which implies that the antigen must be optimally presented in order to overcome the nonspecific defense mechanisms (smooth movements, mucus) and to resist the enzymes present in the mucosa or on its surface. It appears that these parameters are optimized by the structure of the vesicles during mucosal administration. These functions of the vesicles in the mucosal administration were not necessarily present during parenteral administration, where the injection makes it possible to directly reach more favorable zones at a capture by the cells of the immune system .

Le résultat observe par administration muqueuse n'est donc pas une simple extrapolation du résultat obtenu par administration parentérale, mais la mise en évidence d'une nouvelle fonctionnalité des vésiculesà structure en oignon. The result observed by mucosal administration is therefore not a simple extrapolation of the result obtained by parenteral administration, but the demonstration of a new function of vesicles to onion structure.

Les inventeurs de présente invention ont maintenant découvert que des vésicules identiquesà celles décrites dans la demande internationale WO 99/16468 incorporant antigène provoquaient une réponse immunitaire beaucoup plus forte que l'administration de l'antigène libre. De plus, pour certains antigènes qui n'induisent aucune réponse par administration muqueuse, leur administration, incorporés sein de vésicules multilamellaires à structure en oignon, permet d'induire une réponse toutà fait remarquable. Enfin la réponse induite se retrouve non seulement au niveau local dans le compartiment muqueux (réponse muqueuse) mais aussi dans la circulation sanguine (réponse systémique sérique). The inventors of the present invention have now discovered that identical vesicles to those described in the international application WO 99/16468 incorporating antigen elicited a much stronger immune response than administration. free antigen. In addition, for certain antigens that induce no response by mucosal administration, their administration, incorporated into multilamellar vesicles to onion structure, makes it possible to induce a response to remarkable fact. Finally, the induced response is found not only locally in the mucosal compartment (mucosal response) but also in the bloodstream (serum systemic response).

D'autre part, ces vesicules multilamellaires sont préparéesà partir de constituants biocompatibles connus pour leur innocuité. De plus, le procédé de préparation est de mise en #uvre simple et ne fait appel qu'à des appareils courants de la chimie. Le fait le procédé fasse appelà une phase lamellaire initialeà l'équilibre thermodynamique lui donne une excellente reproductibilité et permet une grande stabilité des vésicules obtenues. On the other hand, these multilamellar vesicles are prepared from biocompatible constituents known for their innocuousness. In addition, the preparation process is simple to implement and uses only current devices of chemistry. Since the process uses an initial lamellar phase, the thermodynamic equilibrium gives it excellent reproducibility and allows a high stability of the vesicles obtained.

Ainsi, selon l'une de ses caractéristiques essentielles, l'invention concerne une utilisation de vésicules multilamellaires à structure en oignon présentant une structure interne cristal-liquide formée d'un empilement de bicouches concentriquesà base d'agents amphiphiles alternant avec des couches d'eau, de solution aqueuse ou de solution d'un liquide polaire et au sein desquelles se trouve incorporé au moins un antigène, pour la fabrication d'une composition vaccinale destinéeà une administration par voie muqueuse pour induire une réponse muqueuse et/ou systémique sérique. Thus, according to one of its essential characteristics, the invention relates to the use of multilamellar vesicles with onion structure having a liquid-crystal internal structure formed from a stack of concentric bilayers to Base of amphiphilic agents alternating with layers of water, aqueous solution or solution of a polar liquid and in which at least one antigen is incorporated, for the manufacture of a vaccine composition intended for B> to a mucosal administration to induce a mucosal and / or systemic serum response.

Par le ten-ne "Incorporé" dont l'utilisation nous semble préférableà celle du terrne "encapsulé", on entend que le ou les antigènes font partie intégrante de l'entité constituée par la vésicule. En effet, on peut trouver des molécules d'antigène(s) dans n'importe quelle couche comprise entre le centre la périphérie de ladite vésicule. By the term "incorporated" whose use seems to us preferable to that of the "encapsulated" terrne, it is meant that the antigen or antigens are an integral part of the entity constituted by the vesicle. Indeed, one can find antigen molecules (s) in any layer between the center of the periphery of said vesicle.

Ces vésicules ont généralement des diamètres compris entre0J et 25 #tm, de préférence entre 0,2 et15 gm. These vesicles generally have diameters between 0J and 25 #tm, preferably between 0.2 and 15 gm.

Plus précisément, les vésicules utilisées selon l'invention sont de préférence constituées de plusieurs couches d'agents amphiphiles alternant avec des couches phase aqueuse ou polaire. L'épaisseur de chacune ces couches est une épaisseur moléculaire, typiquement de l'ordre de5à 10 nanomètres. Pour un empilement d'une dizaineà quelques centaines de couches, on obtient donc un diamètre compris entre0J gm et quelques dizaines de micromètres. C'est ce qui est observé expérimentalement, les vésicules étant observables microscopie optique (en lumière polarisée afin d'avoir un meilleur contraste liéà leur biréfringence), soit comme des points non résolus pour les plus petites d'entre elles, soit comme des sphères biréfringentes pour les plus grosses. Le profil de tailles peut être étudiéà l'aide d'un granulomètre laser (utilisant la diffusion statique d'un faisceau laser, analysée sous plusieurs angles). On obtient en général un profil gaussien centré sur une valeur variant entre0J et25 montrant une faible hétérogénéité de la taille pour une formulation donnée, dans des conditions opératoires de préparation données. More specifically, the vesicles used according to the invention preferably consist of several layers of amphiphilic agents alternating with aqueous or polar layer layers. The thickness of each of these layers is a molecular thickness, typically in the range of 5 to 10 nanometers. For a stack of a few to a few hundred layers, we thus obtain a diameter between 0J gm and a few tens of micrometers. This is observed experimentally, the vesicles being observable optical microscopy (in polarized light in order to have a better contrast bound to their birefringence), or as unresolved points for the smaller ones. between them, either as birefringent spheres for larger ones. The size profile can be studied using a laser granulometer (using the static scattering of a laser beam, analyzed from several angles). In general, a Gaussian profile is obtained centered on a value varying between 0J and 25 showing a low heterogeneity of the size for a given formulation, under given operating conditions of preparation.

Les vésicules dans lesquelles se trouve incorporé l'antigène ont, comme exposé précédemment, une structure multilamellaire en oignon et sont constituées, de leur centre jusqu'à leur périphérie, d'une succession de couches lamellaires séparées par un milieu liquide. Ces vésicules peuvent être obtenues par un procédé comprenant la préparation d'une phase lamellaire cristal liquide et sa transformation par application d'un cisaillement. Un tel procédé est particulier décrit dans brevet WO 93/19735 issu du brevet français 2689 418 ou WO 95/18601 introduits ici par référence. The vesicles in which the antigen is incorporated have, as previously stated, a multilamellar structure in onion and consist, from their center to their periphery, of a succession of lamellar layers separated by a liquid medium. These vesicles may be obtained by a process comprising the preparation of a liquid crystal lamellar phase and its transformation by application of shear. Such a method is particularly described in patent WO 93/19735 resulting from the French patent 2 689 418 or WO 95/18601 introduced here by reference.

Selon le brevet français FR-2 689 418, cette transformation peut être faite lors d'une étape de cisaillement homogène de la phase cristal liquide, ce qui conduità des vésicules encore appelées microcapsules de taille contrôlée. Toutefois, en jouant sur la formulation de la phase lamellaire cristal-liquide, en particulier sur la nature des tensioactifs entrant dans sa composition, la transformation de cette phase cristal-liquide en vésicules peut être obtenue par simple sollicitation mécanique, en particulier lors du mélange des constituants. De telles vésicules présentent, entre autres, l'avantage pouvoir être preparées par un procédé de préparation particulièrement simple permettant d'utiliser une grande variété de tensioactifs. According to the French patent FR-2 689 418, this transformation can be made during a homogeneous shearing step of the liquid crystal phase, which leads to vesicles still called microcapsules of controlled size. However, by acting on the formulation of the liquid-crystalline lamellar phase, in particular on the nature of the surfactants used in its composition, the transformation of this liquid-crystal phase into vesicles can be obtained by simple mechanical stressing, in particular during mixing constituents. Among other things, such vesicles have the advantage that they can be prepared by a particularly simple preparation method making it possible to use a wide variety of surfactants.

Un autre avantage, lié lui aussi essentiellement au procedé utilisé pour preparer les vésiculesà structure en oignon utilisées selon l'invention, réside dans le fait que l'on incorpore les actifs et les additifs préalablementà la formation des vésicules, ce qui permet un excellent rendement d'encapsulation, d'où une meilleure efficacité et une économie très importante pour des molécules extrêmement coûteuses. Another advantage, also essentially related to the process used to prepare the onion structure vesicles used according to the invention, lies in the fact that the active ingredients and additives are incorporated beforehand. at vesicle formation, which allows an excellent encapsulation yield, hence a better efficiency and a very important saving for extremely expensive molecules.

De telles structures sont avantageusement obtenues par incorporation moins un antigène dans une phase lamellaire cristal-liquide comprenant au moins un agent tensioactif puis transformation de cette phase cristal-liquide lamellaire en une phase dense de vésicules multilamellaires de petite taille. Such structures are advantageously obtained by incorporating less an antigen into a liquid-crystal lamellar phase comprising at least one surfactant then transformation of this lamellar liquid crystal phase into a dense phase of small multilamellar vesicles.

Ainsi, les vésicules utilisées selon l'invention peuvent être obtenues selon un procédé selon lequel on prépare une phase cristal-liquide lamellaire incorporant au moins un antigène et on provoque le réarrangement ladite phase cristal-liquide en vésicules multilamellaires par application d'un cisaillement. Thus, the vesicles used according to the invention can be obtained according to a process according to which a lamellar liquid-crystal phase incorporating at least one antigen is prepared and the said liquid-crystal phase is rearranged into multilamellar vesicles by application of shear.

Ce cisaillement pourra être un cisaillement homogène, qui présente l'avantage de conduireà des vésicules de taille parfaitement homogène. Toutefois, une simple agitation mécanique pourra s'avérer suffisante pour conduireà la formation des vésicules multilamellaires de l'invention. This shear may be a homogeneous shear, which has the advantage of conducting to vesicles of perfectly homogeneous size. However, simple mechanical agitation may be sufficient to drive to the formation of multilamellar vesicles of the invention.

L'antigène pourra être toute molécule pour laquelle on souhaite engendrer une réponse immunitaire, qu'il ait une origine exogène tel qu'un organisme pathogène infectieux, parasites ou micro-organismes (levures, champignons, bactéries ou virus) ou une origine naturelle intrinsèque (cas des maladies auto-immunes ou de la cancérisation).Il peut être de différentes natures biochimiques. The antigen may be any molecule for which it is desired to generate an immune response, whether it has an exogenous origin such as an infectious pathogenic organism, parasites or micro-organisms (yeasts, fungi, bacteria or viruses) or an intrinsic natural origin (case of autoimmune diseases or cancerization) It can be of different biochemical natures.

Il peut, en particulier, s'agir d'un antigène choisi dans le groupe constitué : - des protéines, en particulier des protéines extraites ou recombinantes, glycosylées ou non, - des peptides, - des lipopeptides, - des polysaccharides, ou représentant un mélange de plusieurs de ces composants. Les vésicules multilamellaires à structure en oignon sont préparées selon les méthodes décrites précédemment, en particulier dans la demande internationale WO 99/16468. Les molécules amphiphiles utilisées pour leur préparation seront choisies, sans que cela soit une obligation, par-mi molécules faisant l'objet d'une description dans la pharmacopée, oudéjà utilisées dans des médicaments appliqués aux muqueuses. It may, in particular, be an antigen selected from the group consisting of proteins, in particular extracted or recombinant proteins, glycosylated or not, B> - peptides, - lipopeptides, - polysaccharides, or a mixture of several of these components. The multilamellar vesicles to onion structure are prepared according to the methods described above, in particular in the international application WO 99/16468. The amphiphilic molecules used for their preparation will be chosen, without this being an obligation, by-molecules already described in the pharmacopoeia, or already used in drugs applied to the mucous membranes.

Selon une variante avantageuse, les membranes vésicules contenues dans les compositions de l'invention contiennent au moins un agent tensioactif choisi dans le groupe constitué - des phospholipides hydrogénés ou non hydrogénés, des acides gras enC6à C30, saturés ou mono- ou polyinsaturés, linéaires ou rami iés, sous forme d'acide ou de sel d'un métal alcalin, alcalino-terreux ou d'une amine, des esters, éthoxylés ou non, de ces mêmes acides gras et de saccharose, de sorbitan, de mannitol, de glycérol ou de polyglycérol, de glycol, des mono-, di- ou triglycérides ou des mélanges de glycérides de ces mêmes acides gras, - des alcools gras enC6 à C30, saturés ou mono- ou polyinsaturés, linéaires ou rami iés, éthoxylés ou non, des éthers, éthoxylés ou non, de ces mêmes alcools gras et de saccharose, de sorbitan, de mannitol, de glycérol ou de polyglycérol, de glycol, des huiles végétales polyéthoxylées, hydrogénées ou non hydrogénées, - des polymères séquencés de polyoxyéthylène et de polyoxypropylène (poloxamères), - de Phydroxystéarate de polyéthylèneglycol, - des alcoolsà squelette stérol tel que le cholestérol, le sistostérol, - des sphyngolipides, - des polyalkyl glucosides, des copolymères de polyéthylèneglycol et d'alkylglycol (par exemple la famille ELFACOS de AKZO NOBEL), - des copolymères di- ou tribloc d'éthers de polyéthylèneglycol et polyalkylèneglycol (par exemple la famille des ARLACELL de ICI). According to an advantageous variant, the vesicle membranes contained in the compositions of the invention contain at least one surfactant chosen from the group consisting of hydrogenated or non-hydrogenated phospholipids, and C6 fatty acids. to C30, saturated or mono- or polyunsaturated, linear or branched, in the form of an acid or salt of an alkali metal, alkaline earth metal or an amine, esters, ethoxylated or otherwise, of these same fatty acids and of sucrose, of sorbitan, of mannitol, of glycerol or of polyglycerol, of glycol, mono-, di- or triglycerides or mixtures of glycerides of these same fatty acids, B> - fatty alcohols in C6 to C30, saturated or mono- or polyunsaturated, linear or branched, ethoxylated or not, ethers, ethoxylated or not, of these same fatty alcohols and sucrose, sorbitan, mannitol, glycerol or polyglycerol, glycol, polyethoxylated vegetable oils s, hydrogenated or non-hydrogenated, - polyoxyethylene and polyoxypropylene (poloxamer) block polymers, polyethylene glycol hydroxystearate, - , alcohols to sterol skeleton such as cholesterol, sistosterol, sphyngolipid, polyalkyl glucosides, polyethylene glycol and alkylglycol copolymers (B) for example the ELFACOS family of AKZO NOBEL), the di- or triblock copolymers of polyethylene glycol ethers and polyalkylene glycol ethers (for example the ARLACELL family of ICI).

A ces tensioactifs qui peuvent être utilisés seuls ou en mélange, peut éventuellement ajouter des co-tensioactifs afin d'améliorer la rigidité et l'étanchéité des membranes formant la vésicule. Parmi ces molécules, on peut citer: - le cholestérol et ses dérivés, en particulier les esters de cholestérol chargés ou neutres comme le sulfate de cholestérol - les autres dérivésà squelette stérol, en particulier ceux d'origine végétale (sitostérol, - les céramides. sigmastérol... A These surfactants, which can be used alone or in admixture, can optionally add co-surfactants to improve the rigidity and tightness of the membranes forming the vesicle. Among these molecules, mention may be made of: cholesterol and its derivatives, in particular charged or neutral cholesterol esters such as cholesterol sulphate - > other sterol skeleton derivatives, in particular those of plant origin (sitosterol, - ceramides, sigmasterol ...

La formulation fait avantageusement intervenir un mélange de molécules tensioactives.Il est généralement utilisé au moins deux tensioactifs différents ayant des balances hydrophile-lipophile différentes, ce qui permet de régler en continu les propriétés des bicouches et ainsi de contrôler l'apparition de l'instabilité qui gouverne la formation des vésicules multilamellaires. The formulation advantageously involves a mixture of surfactant molecules. It is generally used at least two different surfactants having different hydrophilic-lipophilic balance, which allows to continuously adjust the properties of bilayers and thus to control the appearance of instability governing the formation of multilamellar vesicles.

Ainsi, on choisira avantageusement parmi les tensioactifs ci-dessus, deux tensioactifs présentant des propriétés relativement différentes, en particulier une balance hydrophile-lipophile (HLB) différente. Le premier tensioactif présentera avantageusement une balance hydrophile-lipophile comprise entre1 de préférence entre1 et 4, alors que le deuxième tensioactif aura une balance hydrophile-lipophile comprise entre3 et15, de préférence comprise entre5 et15. La préparation obtenue après transformation de la phase lamellaire cnstal-liquide en vésicules multilamellaires peut ensuite être diluée, en particulier avec un solvant aqueux tel que, par exemple, une solution tampon, une solution saline ou une solution physiologique, pour obtenir ainsi une suspension aqueuse vésicules. Thus, the surfactants above will advantageously be chosen from two surfactants having relatively different properties, in particular a different hydrophilic-lipophilic balance (HLB). The first surfactant will advantageously have a hydrophilic-lipophilic balance of between 1 preferably between 1 and 4, while the second surfactant will have a hydrophilic-lipophilic balance of between 3 and 15, preferably between 5 and 15. The preparation obtained after transformation of the cnstal-liquid lamellar phase into Multilamellar vesicles may then be diluted, particularly with an aqueous solvent such as, for example, a buffer solution, saline solution or physiological solution, thereby obtaining an aqueous vesicle suspension.

La technique d'encapsulation utilisée selon la présente invention permet d'atteindre aisément des rendements d'encapsulation très élevés, voire voisins de100 %. Toutefois, de tels rendements ne sont pas toujours indispensables en fonction des applications visées. The encapsulation technique used according to the present invention makes it possible to easily reach very high encapsulation yields, even close to 100%. However, such yields are not always essential depending on the applications. referred.

Ainsi, le rendement d'encapsulation du (ou des) antigène(s) dans compositions de l'invention est avantageusement supérieurà 50 %, de préférence supérieurà 80 %. Il semble que la structure des vésicules soit responsable des résultats particulièrement avantageux obtenus, et que les vésicules multilamellaires de l'invention permettentà l'antigène d'arriver intact jusqu'aux cellules présentatrices de l'antigène (CPA) et de favoriser sa capture par ces cellules.Il semble donc bien que la fonction des vésicules de l'invention est de vectoriser, de protéger et d'améliorer la capture de l'antigène par le système immunitaire. Thus, the encapsulation efficiency of the antigen (s) in the compositions of the invention is advantageously greater than 50%, preferably greater than 80%. It seems that the structure of the vesicles is responsible for the particularly advantageous results obtained, and that the multilamellar vesicles of the invention allow to the antigen to arrive intact to the cells presenting the antigen ( CPA) and to promote its capture by these cells. It therefore seems that the function of the vesicles of the invention is to vectorize, protect and improve the capture of the antigen by the system. immune.

Un autre avantage de la technologie est que l'on peut rajouterà cette formulation des polymères naturels ou artificiels tels que les polysaccharides (alginates, chitosan, etc.) afin de renforcer la solidité de la vesicule, et lui permettre de rester plus longtemps sur le site d'administration ou dans l'organisme, délivrant ainsi l'antigène sur un temps plus long. Ces polymères peuvent être aussi bien incorporés dans la vésicule, que déposés autour sous la forme enrobage. Dans ce cas la vésicule ou la particule formée des vésicules enrobées dans la matrice polymère a un diamètre supérieurà celui des vésicules seules. Ces polymères peuvent éventuellement être réticulés pour renforcer encore leur solidité. Another advantage of the technology is that one can add to this formulation of natural or artificial polymers such as polysaccharides (alginates, chitosan, etc.) in order to reinforce the strength of the vesicle, and allow it to stay longer at the site of administration or in the body, thus delivering the antigen over a longer time. These polymers can be incorporated into the vesicle as well as deposited around in the coating form. In this case the vesicle or particle formed vesicles embedded in the polymer matrix has a greater diameter than that of the vesicles alone. These polymers may optionally be crosslinked to further enhance their strength.

De plus, et c'est un des autres avantages de la technologie, la formulation peut être complétée par l'addition de molécules immuno-modulatrices (chitosan, interleukines ... ) qui renforceront par leurs propriétés intrinsèques l'amplification et l'orientation de la réponse immunitaire. In addition, and this is one of the other advantages of the technology, the formulation can be supplemented by the addition of immunomodulatory molecules (chitosan, interleukins ...) which will strengthen by their intrinsic properties amplification and orientation of the immune response.

Les vésicules incorporant les antigènes sont avantageusement préparées dans un procédé consistantà préparer, dans un premier temps, la phase lamellaire. Celle' s'obtient par simple mélange des ingrédients, dans un ordre déten-niné par l'expérimentateur d'après les miscibilités de chacun des constituants. Il peut être nécessaire de chauffer certains constituants pâteux ou solides afin de faciliter leur incorporation. Dans ce cas on additionne l'antigène de préférence en de mélange afin de lui éviter de subir une température trop élevée. On peut aussi préparer un mélange de tous les constituants sauf de l'antigène ou solution aqueuse sous forme d'un mélange stock qu'on utilisera selon les besoins pour préparer la phase lamellaire. La solution aqueuse peut contenir différents constituants destinésà assurer sa compatibilité biologique et en particulier des mélanges tampons mais également différents antigènes. La phase lamellaire ainsi préparée est ensuite soumiseà un cisaillement modéré (de0 à 10OOs-1) pendant un temps limité (de0 à 60 minutes). The vesicles incorporating the antigens are advantageously prepared in a process consisting of initially preparing the lamellar phase. This ' is obtained by simply mixing the ingredients, in an order determined by the experimenter according to the miscibility of each of the constituents. It may be necessary to heat some pasty or solid constituents to facilitate their incorporation. In this case, the antigen is preferably added to the mixture in order to prevent it from being subjected to too high a temperature. It is also possible to prepare a mixture of all the constituents except for the antigen or aqueous solution in the form of a stock mixture which will be used as needed to prepare the phase lamellar. The aqueous solution may contain different constituents intended to ensure its biological compatibility and in particular buffer mixtures but also different antigens. The lamellar phase thus prepared is then subjected to moderate shear ( 0 to 10OOs-1) for a limited time ( 0 to 60 minutes).

Dans la plupart des cas, ce cisaillement est obtenu directement par l'action du dispositif ayant servi au mélange. Pour les très petites quantités, il peut être obtenuà la main par mélange de la préparationà l'aide d'une microspatule dans un tube de type Eppendorf La phase lamellaire cisaillée est ensuite dispersée dans milieu final, en général de l'eau ou un tampon, identique ou différent de celui ayant servi lors de la préparation de la phase lamellaire. Cette dispersion se fait avantageusementà température ambiante (20-25'C) par addition lente du milieu la phase lamellaire sous agitation constante. In most cases, this shear is obtained directly by the action of the device used for mixing. For very small quantities, it can be obtained by hand by mixing the preparation with a microspatule in an Eppendorf type tube The sheared lamellar phase is then dispersed in the final medium, usually water or buffer, the same or different from that used in the preparation of the lamellar phase. This dispersion is advantageously at room temperature (20-25 ° C) by slow addition of medium lamellar phase with constant stirring.

Un conservateur et éventuellement d'autres additifs destinésà compléter la formulation galénique peuvent être ajoutés au produit. A preservative and optionally other additives for supplementing the pharmaceutical formulation can be added to the product.

Toutes les compositions décrites précédemment comprenant au moins antigène incorporé au sein des vésiculesà structure lamellaire en oignon présentent l'avantage de pouvoir être utilisées pour une administration par voie muqueuse et tout particulièrement par voie nasale et d'induire une réponse muqueuse et/ou systémique sérique. All the compositions described above comprising at least one antigen incorporated within the vesicles to lamellar structure in the onion have the advantage of being able to be used for a mucosal and especially a nasal administration and to induce a mucosal and / or systemic serum response.

L'exemple donné ci-après met clairement en évidence un tel effet. The example given below clearly demonstrates such an effect.

Les figures1 et 2 ci-jointes rassemblent les réponses obtenues d'une dans différents prélèvements muqueux (figure1) et d'autre dans les sérums des animaux (figure 2) après une administration par voie nasale de compositions selon l'invention (groupe1) en comparaison avec ceux obtenus par administration soit des compositions dans lesquelles le même antigene est libre (groupe11), soit de compositions contenant les mêmes vésicules mais vides (groupe HI). Figures 1 and 2 attached show the responses obtained from one in different mucosal samples (Figure 1) and others in animal sera (Figure 2) after nasal administration of compositions according to the invention (group 1) in comparison with those obtained by administering either compositions in which the same antigen is free (group 11), of compositions containing the same vesicles but empty (group HI).

EXEMPLE 1 - Préparation de vésicules contenant de l'albumine de sérum humain (HSA) Formulation (en pourcentage en poids) 0 Potassium oléate (FLUKA) : 05,0% 0 Alcool laurique éthoxylé à 4 oxydes d'éthylène (SEPPIC) 02,0% 0 Cholestérol de lanoline (FLUKA) 05,0% 0 Cholestérol 3-sulfate (SIGMA) : 02,5% 0 PBS lx stérile (LIFE TECHNOLOGIES): 20,0% 0 Lécithine de soja Phospholipon 90G (NATTERMANN): 45,5% 0 Albumine humaine(SIGMA) à 30 mg/ml dans du PBS lx 20,0% Mode opératoire Les composants sont stérilisés par Irradiation UV pendant60 mil. Les contenants et accessoires (spatules, agitateurs... ) sont stérilisésà la flart-ime juste avant utilisation. EXAMPLE 1 - Preparation of Vesicles Containing Human Serum Albumin (HSA) Formulation (Percent by Weight) 0 Potassium Oleate (FLUKA ) : 05.0% 0 Ethylated Lauryl Alcohol to 4 Ethylene Oxides (SEPPIC) 02.0% 0 lanolin cholesterol (FLUKA) 05.0% 0 Cholesterol 3-sulfate (SIGMA): 02.5% 0 PBS 1x sterile (LIFE TECHNOLOGIES): 20.0% 0 Soy lecithin Phospholipon 90G (NATTERMANN): 45.5% 0 Human albumin (SIGMA) at 30 mg / ml in PBS 1x 20.0% Procedure The components are sterilized by UV Irradiation for 60 mil. Containers and accessories (spatulas, agitators ...) are sterilized to just before use.

Les constituants0 à 0 sont introduits dans un pilulier, dans un ordre indifférent, puis chauffésà 80'C pendant60 min sous très forte agitation magnetique. La solubilisation totale des constituants() et est vérifiée par observation microscopique. The constituents 0 to 0 are introduced into a pillbox, in any order, then heated to 80'C for 60 min under very strong agitation magnetic. The total solubilization of the constituents () and is verified by microscopic observation.

On introduità température ambiante dans un tube Eppendorf de1,5 ml stérile la quantité désirée du mélange0 à 0 puis on rajoute constituants0 et 0. L'ensemble est homogénéiséà l'aide d'une aiguille stérile, puis laissé au repos une nuità 4'C. Introduce to room temperature in an Eppendorf tube of 1.5 ml sterile the desired amount of the mixture 0 to 0 and then add components 0 and 0. The whole is homogenized to using a sterile needle, then left to rest one night to 4'C.

La préparation est ensuite disperséeà 33,33 % dans PBS lx stérile. H - Protocole d'immunisation Afin de tester l'effet des vésicules selon l'invention lors d'une administration muqueuse, des souris BALB/c femelles de6-8 semailles ont reçu, par voie nasale, deux fois(à JO etJ30), différentes préparations décrites ci- dessous. L'administration par voie nasale nécessite l'anesthésie animaux par une solution, mélange de Kétamine, Valium et Atropine, injectée par voie intra- péritonéale. Un mois après la dernière immunisation, les animaux sont sacrifiés, les sérums sont collectés et les prélèvements des sécrétions muqueuses effectués,à l'exception des lavages vaginaux qui sont prélevés sur la souris vivante pendant les trois jours précédents la fin de l'expérimentation. The preparation is then dispersed 33.33% in sterile 1x PBS. H - Immunization Protocol In order to test the effect of the vesicles according to the invention during mucosal administration, female BALB / c mice of 6-8 seeds received nasally twice (at OJ and J30), various preparations described below. Nasal administration requires animal anesthesia with a solution, a mixture of Ketamine, Valium and Atropine, injected intraperitoneally. One month after the last immunization, the animals are sacrificed, the sera are collected and mucous secretions taken, to with the exception of the vaginal washings that are taken from the living mouse during the previous three days. the end of the experiment.

Groupes d'immunisation Les souris ont été réparties en 4 groupes notés1 à IV, le groupeIV constituant un groupe témoin (souris non immunisées également dénommées souris naïves) et les autres groupes étant soumisà un protocole d'immunisation tel que défini précédemment au moyen des produits suivants -groupe1 : encapsulée : 20ffl par narine de vésicules selon l'invention incorporant HSA ce qui correspondà 80 gg de HSA par souris - _ roupe Il : # HSA: 20pl par narine d'une solution de HSA correspondantà 80 #tg souris groupe111 # Vésicules vides: 20ffl par narine de vésicules selon l'invention vides Prélèvements des sécrétions Tous les prélèvements sont effectués avec des solutions froides (4'C) et sont entreposés sur glace au fur età mesure afin de limiter les dégradations par les enzymes protéolytiques. Immunization Groups The mice were divided into 4 groups marked 1 to IV, the IV group constituting a control group (non-immunized mice also called naïve mice) and the other groups being subjected to an immunization protocol as defined previously using the following products - group 1 : Encapsulated : 20ffl per nostril of vesicles according to the invention incorporating HSA which corresponds to at 80 gg of HSA per mouse - _ roup IT : # HSA: 20pl per nostr of a corresponding HSA solution 80 #tg Mouse Group 111 # Empty Vesicles : 20ffl per nostril of vesicles according to the invention empty Samples of secretions All samples are taken with cold solutions (4'C) and are stored on ice as and to measure to limit degradation by enzymes proteolytic.

Lavages broncho-alvéolaires trachée des souris est canuléeà l'aide d'une sonde et 750ffl de sont injectés lentement afin de ne pas créer d'hémorragie, les poumons sont lavés ainsi3 fois avec la même solution, le prélèvement est ensuite centrifugé afin d'éliminer cellules pulmonaires et séparé en fractions aliquotes conservees a -20'C Jusqu dosage. Washes bronchoalveolar trachea mice is cannulated to using a probe and 750ffl of are injected slowly so as not to create hemorrhage, the lungs are washed thus 3 times with the same solution, the sample is then centrifuged to remove lung cells and separated into aliquots stored at -20 ° C until dosing.

Lavages vaginaux prélèvements sont réalisés sur la souris vivante non anesthésiée, par injection de 50gl de PBS dans l'orifice du vagin, le vagin est lavé3 fois avec la même solution. Ce type de prélèvement est renouvelé durant3 jours consécutifs afin de couvrir les variations dues au cycle hon-nonal de la souris. Les sécrétions sont groupées et conservéesà -20'C. Vaginal washings samples are taken from the unanesthetized live mouse, by injection of 50gl of PBS in the vaginal opening, the vagina is washed 3 times with the same solution. This type of sampling is repeated for 3 consecutive days in order to cover the variations due to the hon-nonal cycle of the mouse. Secretions are grouped and conserved at -20'C.

Lavages intestinaux L'intestin est prélevé, libéré du mésentère et rincé dans l'eau afin d'éliminer le sang extérieur.Il est ensuite découpé longitudinalement et incubé sur glace dans1 ml d'une solution de lavage enrichie en inhibiteur de protéases. L'ensemble centrifugé et le surnageant est récupéré et congeléà -20'C. Intestinal washings The intestine is removed, released from the mesentery and rinsed in water to remove the external blood. It is then cut longitudinally and incubated on ice in 1 ml of a wash solution enriched with protease inhibitor. The centrifuged assembly and the supernatant is recovered and frozen at -20 ° C.

Dosage des anticoips anticorps spécifiques de HSA présents dans les sérums et sécrétions sont dosés par technique ELISA où l'on déterrnine les IgA et IgG spécifiques de I-ISA (anti-IgA biotinyle/Streptavidine peroxydase, anti IgG peroxydase). Les résultats sont exprimés en titre moyen déterminé par rapportà un sérum de référence de souris naïve et correspondantà l'inverse de la dilution égale au seuil de référence. Assay of the HSA-specific antibody antibodies present in the sera and secretions are assayed by ELISA technique in which I-ISA-specific IgA and IgG are determined (anti-IgA biotinyl / Streptavidin peroxidase, anti-IgG peroxidase). The results are expressed as a mean titre determined in relation to a reference serum of naive mice and corresponding to the inverse of the dilution equal to the reference threshold.

111 - Résultats résultats du dosage des anticorps spécifiques sont présentés sous la forme de 2 figures (figure1 et figure 2) illustrant respectivement les réponses anticorps obtenues dans les prélèvements muqueux pour la réponse associée aux muqueuses et dans les sérums des animaux (réponse systémique). 111 - Results results of the specific antibody assay are presented in the form of 2 figures (Figure 1 and Figure 2) illustrating respectively the antibody responses obtained in the mucosal samples for the response associated with the mucous membranes and in the sera of the animals (systemic response).

Sur ces figures, on a également indiqué dans chaque cas le nombre souris ayant réagi au protocole d'immunisation par rapport au nombre de souris soumisesà ce protocole (la mention "n/m" signifiant que n souris ont réagi sur souris soumises au protocole d'immunisation). In these figures, it has also been indicated in each case the number of mice reacted to the immunization protocol in relation to the number of mice subjected to this protocol (the mention "n / m" meaning that n mice reacted on mice subjected to the immunization protocol).

Il apparaît clairement au vu de ces deux figures que l'administration par voie nasale de vésicules selon l'invention incorporant HSA entraîne production importante d'anticorps dans les poumons (Figure1). Seule l'immunisation sous la forme encapsulée engendre une réponse immune pulmonaire d'isotype IgA et IgG (l'existence au niveau pulmonaire de ces deux isotypes est rapportée dans différentes publications). Bien que cette voie d'administration ne soit pas la plus aisée chez l'animal, tous les animaux immunisés par voie nasale avec les vésicules selon l'invention sont répondeurs. It appears clearly in view of these two figures that the nasal administration of vesicles according to the invention incorporating HSA leads to a large production of antibodies in the lungs (Figure 1). Only immunization in the encapsulated form generates an IgA and IgG isotype immune pulmonary response (the existence at the pulmonary level of these two isotypes is reported in various publications). Although this route of administration is not the easiest in animals, all the animals immunized nasally with the vesicles according to the invention are responders.

L'analyse des autres prélèvements muqueux révèle la présence d'IgA spécifique de HSA dans le vagin et l'intestin des animaux immunisés par les vésicules selon l'invention incorporant HSA, muqueuses très distantes du site d'administration avec une prédilection pour la muqueuse vaginale. Ces réponses indiquent généralisation de la réponse induite dans le tissu lymphoïde muqueux pulmonaire ou nasal et la circulation et la redistribution des lymphocytes activés et différenciés près du site d'administration. The analysis of the other mucosal samples reveals the presence of HSA-specific IgA in the vagina and the intestine of the animals immunized with the vesicles according to the invention incorporating HSA, mucous membranes very distant from the site of administration with a predilection for the mucosa. vaginally. These responses indicate generalization of the response induced in pulmonary or nasal mucosal lymphoid tissue and the circulation and redistribution of activated and differentiated lymphocytes near the site of administration.

la différence de la muqueuse pulmonaire, la réponse isotype spécifique de HSA prédominante dans l'intestin et le vagin est l'IgA. Bien que le titrage des IgGHIL n'ait pu être réalisé dans les lavages vaginaux, des expériences similaires réalisées avec un autre antigène indique la prédominance des IgA dans les sécrétions vaginales. Unlike the pulmonary mucosa, the predominant HSA-specific isotype response in the intestine and vagina is IgA. Although IgGHIL titration could not be performed in vaginal washings, similar experiments with another antigen indicate the predominance of IgA in vaginal secretions.

Seule la forme vectorisée de l'antigène conduità une réponse intense et spécifique. Les quelques animaux présentant une réponse IgA détectable dans les groupes immunisés par HSA libre (titre de3 contre650 dans les sécrétions vaginales avec les vesicules selon l'invention contenant HSA ) ne sont pas différentiables du groupe vésicules selon l'invention vides. Only the vectorized form of the antigen leads to an intense and specific response. The few animals presenting a detectable IgA response in groups immunized with free HSA (titre of 3 against 650 in vaginal secretions with the vesicles according to the invention containing HSA ) are not distinguishable from the empty vesicle group according to the invention.

L'étude sérums des animaux (Figure 2) indique que les vésicules selon l'invention incorporant HSA administrées par vole nasale sont capables d'engendrer une réponse systémique caractérisée par la présence majoritaire d'IgG mais également par taux important d'IgA sérique. Seule la forme vectorisée conduità cette production (IgA HSA seule<B≥ 35 ; IgA vésicules selon l'invention HSA <B≥ 17 620). Il remarquable d'obtenir une réponse systémique de l'antigène vectorisé. Rappelons qu'il est extrêmement difficile d'induire une réponse IgA sérique par immunisation systémique avec un antigène seul ou accompagné d'un adjuvant autorisé en usage humain. The animal sera study (FIG. 2) indicates that the vesicles according to the invention incorporating HSA administered by nasal route are capable of generating a systemic response characterized by the predominant presence of IgG but also by a high level of serum IgA. Only the vectorized form leads this production (IgA HSA alone <B≥ 35; IgA vesicles according to the invention HSA <B≥ 17,620). It is remarkable to obtain a systemic response of the vectorized antigen. Recall that it is extremely difficult to induce a serum IgA response by systemic immunization with an antigen alone or accompanied by an adjuvant authorized for human use.

En conclusion de ces résultats, non seulement la forme dite encapsulée engendre une réponse immune pulmonaire mais aussi, seule cette forme permet la dissémination de la réponse induite dans le tractus respiratoire vers d'autres muqueuses indiquant que les vésicules selon l'invention sont des puissants vecteurs pour induire une immunité muqueuse, en favorisant la prise en charge et l'induction de la réponse au sein d'un site et en la redistribuantà d'autres sites. In conclusion of these results, not only the so-called encapsulated form generates a pulmonary immune response but also, only this form allows the dissemination of the response induced in the respiratory tract to other mucous membranes indicating that the vesicles according to the invention are powerful vectors to induce mucosal immunity, promoting the management and induction of response within a site and redistributing to other sites.

Les capacitésà engendrer une réponse immune muqueuse età stimuler le tissu lymphoïde muqueux commun révèlent une importance particulière lorsque l'on s'adresseà des antigènesà potentiel vaccinant, faceà des pathogènes invasifs à tropisme muqueux. The ability to induce a mucosal immune response and to stimulate common mucoid lymphoid tissue is of particular importance when addressing to antigens to vaccine potential, to pathogens invasive to mucosal tropism.

La double possibilité d'induireà la fois une réponse muqueuse et une réponse systémique présente un grand intérêt en vaccination car elle simplifie l'administration tout en offrant une immunitéà plusieurs niveaux: muqueux pour défendre les voies d'accès aux micro-organismes et systémiques pour les infections plus disséminées ou généralisées.The dual ability to induce both a mucosal response and a systemic response is of great interest in immunization because it simplifies administration while offering immunity at multiple levels. : mucosal to defend access routes to micro-organisms and systemic for more disseminated or generalized infections.

Claims

CLAIMS 1. Use of multilamellar vesicles to onion structure having an internal crystal-liquid structure formed of a stacking of concentric bilayer to bases amphiphilic agents alternating with layers of water, aqueous solution or polar liquid solution and within which is incorporated at least one antigen, for the manufacture of a vaccine composition for to mucosal administration to induce a mucosal and / or systemic serum response. 2. Use according to claim 1, characterized in that said antigen has an exogenous or intrinsic natural origin. 3. Use according to one of claims 1 or 2, characterized in that said antigen is selected from the group consisting of : Proteins, in particular extracted or recombinant proteins, glycosylated or non-glycosylated, peptides, lipopeptides, - polysaccharides, or represents a mixture of several of these components. 4. Use according to one of claims 1 to 3, characterized in that said vesicles contain at least one surfactant selected from the group consisting of : - hydrogenated or non-hydrogenated phospholipids, - linear or branched C6 to C30, saturated mono- or polyunsaturated acids, in the form of acid or salts of an alkali metal, alkaline earth metal or an amine, esters, ethoxylated or otherwise, of these same fatty acids and of sucrose, sorbitan, mannitol, glycerol or polyglycerol, glycol, - mono-, di- or triglycerides or glyceride mixtures of these same fatty acids, - fatty alcohols in C6 to C30, Saturated or mono- or polyunsaturated, linear or branched, ethoxylated or not, ethers, ethoxylated or otherwise, of these same fatty alcohols and of sucrose, sorbitan, mannitol, glycerol or polyglycerol, glycol, oils vegetal Polyethoxylated, hydrogenated or non-hydrogenated polymers, polyoxyethylene and polyoxypropylene (poloxamers), polyethylene glycol hydroxystearate, polyethylglycol hydroxymers, - alcohols to - diblock copolymers of polyethylene glycol ethers and polyalkyleneglycols. 5. Use according to one of claims 1 to 4, characterized in said vesicles additionally contain at least one co-surfactant for to improve the rigidity and / or the tightness of the membranes of said vesicles. 6. Use according to claim 5, characterized in that said cosurfactant is selected from the group consisting of cholesterol and its derivatives. , especially charged or neutral cholesterol esters such as cholesterol sulfate - sterol skeleton derivatives, in particular those of plant origin such as sitosterol or sigmasterol, - ceramides. 7. Use according to one of claims 1 to 6, characterized in that said vesicles further contain an immunomodulating substance. 8. Use according to one of claims 1 to 7, characterized in said vesicles have a diameter between 0.1 and 25 ptm, preferably between 2 and 15 gm. 9. Use according to one of claims 1 to 8, characterized in the bilayers of said vesicles comprise at least two surfactants, one of which has a hydrophilic-lipophilic balance ( HLB) between 1 and 6, preferably between 1 and 4, and the other a hydrophilic-lipophilic balance (HLB) included between 3 and 15, preferably between 5 and 15. 10. Use according to one of Claims 1 to 9, characterized in that the encapsulation efficiency of the antigen (or antigens) within said vesicles is greater than to 50 %, preferably greater than <80%. 11. Use according to any one of claims 1 to 10, characterized in that said mucosal administration is nasal administration.