FR2692148A1

FR2692148A1 - Use of lipophilic muramyl peptide MDP:DD:GPD - in vaccines against HIV and tumours

Info

Publication number: FR2692148A1
Application number: FR9207126A
Authority: FR
Inventors: Chedid Louis; Audibert Francoise; Lefrancier Pierre
Original assignee: VACSYN FRANCE SA
Current assignee: VACSYN FRANCE SA
Priority date: 1992-06-12
Filing date: 1992-06-12
Publication date: 1993-12-17
Anticipated expiration: 1998-06-12
Also published as: FR2692148B3

Abstract

Pharmaceutical compsn. contg. MDP-DD-GDP (I) are new., The compns. are pref. prepd. as vaccines contg. pathogenic agents, particularly human or mammnalian viruses or virus fractions. The prepn. of compsn. against HIV and tumours is esp. pref.. The compsns. are pref. biphasic, an aqueous phase and a hydrophobic phase. The hydrophobic phase may be a mineral oil, lipids, polyoxylene- polyoxypropylene polymers, polyoxyethylene sorbitan esters. USE - The compsns. exert a selective adjuvant action on the humoral or cellular mediation immunity response, or pref. both of these, without inducing auto-immune disorders. The action is similar to that of Freund's complete adjuvant, but without inducing the known side effects of this.

Description

COMPOSITION ADJUVANTE L'IMNUNITE HUMORALE ET A NEDIATION CELLULAIRE N'INDUISANT PAS DE REPOSE VIS
A-VIS DE DETERNINANTS AUTO-ANTIGENIQUES
L'adjuvant Complet de Freund (ACF) est le plus fort immuno-adjuvant connu capable d'augmenter les réponses immunitaires spécifiques humorales et à médiation cellulaire vis-à-vis d'un antigène. I1 se compose de mycobactéries administrées dans une émulsion eau dans l'huile minérale. l'emploi de cet adjuvant en clinique humaine ou vétérinaire est exclu, car il induit des réactions secondaires importantes, notamment induction de polyarthrites et sensibilisation à la tuberculine. I1 est déjà connu que l'on peut reproduire les effets adjuvants sans les effets secondaires des mycobactéries en les remplaçant par une petite molécule de 500 daltons, la N-acétyl muramyl-L-alanyl-D-isoglutamine, souvent abréviée comme MurNac-L-Ala-D-isoGln, encore dénommée "Muramyl-dipeptide" ou "MDP". Cette molécule consiste en un élément de structure de la paroi mycobactérienne. De nombreux analogues du MDP présentent aussi des activités adjuvantes comme le
MDP, ils peuvent être produits par synthèse chimique.COMPOSITION ADJUVANT HUMORAL IMNUNITY AND CELL NEDIATION NOT INDUCING VIS REST
WITH SELF-ANTIGENIC DETERNINANTS
Freund's Complete Adjuvant (CFA) is the strongest known immunoadjuvant capable of increasing humoral and cell-mediated immune response to an antigen. It consists of mycobacteria administered in a water-in-mineral oil emulsion. the use of this adjuvant in human or veterinary clinic is excluded because it induces significant side reactions, including induction of polyarthritis and tuberculin sensitization. It is already known that one can reproduce the adjuvant effects without the side effects of mycobacteria by replacing them with a small molecule of 500 daltons, N-acetyl muramyl-L-alanyl-D-isoglutamine, often abbreviated as MurNac-L -Ala-D-isoGln, also called "muramyl-dipeptide" or "MDP". This molecule consists of a structural element of the mycobacterial wall. Many CDM analogues also exhibit adjuvant activities such as
MDP, they can be produced by chemical synthesis.

Ces analogues, souvent dénommés "Muramyl-peptides" sont en général dérivés du MDP par l'une ou plusieurs des modifications suivantes
- remplacement du résidu du L-alanyle de la chaîne peptidique par un autre résidu L-aminoacyle ou par le résidu glycyle,
- substitutions sur l'un au moins des groupes
carboxyle du résidu D-glutamyle,
- substitutions sur les positions 1, 4 et 6 du
groupe muramyle. These analogs, often referred to as "Muramyl-peptides", are generally derived from the MDP by one or more of the following modifications:
replacing the L-alanyl residue of the peptide chain with another L-aminoacyl residue or with the glycyl residue,
- substitutions on at least one of the groups
carboxyl of the D-glutamyl residue,
- substitutions on positions 1, 4 and 6 of
muramyle group.

Ces substitutions s'accompagnent parfois d'une modulation des propriétés adjuvantes du MDP. Par exemple les dérivés lipophiles du Muramyl peptide sont souvent de plus forts adjuvants que les dérivés hydrophiles. These substitutions are sometimes accompanied by modulation of the adjuvant properties of the CDM. For example, lipophilic derivatives of muramyl peptide are often stronger adjuvants than hydrophilic derivatives.

D'autres types de modifications de la molécule de
MDP peuvent cependant altérer le spectre de ses propriétés biologiques de façon plus considérable. Par exemple --et à la notable exception de la N-acétyl muramyl-L- (méthyl) alanyl-D-isoglutamine-- des substitutions du résidu L-alanyle de la chaîne peptidique s'accompagnent le plus souvent de la perte des propriétés adjuvantes du muramyl peptide modifié correspondant. Le remplacement dans le MDP du résidu
L-alanyle par un résidu D-alanyle, pour obtenir le "NDP-DD", entraîne même l'apparition de propriétés contraires. Cette molécule est alors douée de propriétés anti-adjuvantes ou immuno-suppressives.Other types of modifications of the molecule
However, MDP can alter the spectrum of its biological properties more dramatically. For example, and with the notable exception of N-acetyl muramyl-L- (methyl) alanyl-D-isoglutamine, substitutions of the L-alanyl residue of the peptide chain are most often accompanied by loss of properties. adjuvants of the corresponding modified muramyl peptide. Replacement in the CDM of the residue
L-alanyl with a D-alanyl residue, to obtain "NDP-DD", even gives rise to the appearance of opposite properties. This molecule is then endowed with anti-adjuvant or immunosuppressive properties.

Mais pour en revenir aux muramyl peptides doués de propriétés adjuvantes, il est également connu que leur administration avec un antigène dans une émulsion eau dans l'huile minérale permet l'obtention de très fortes réponses spécifiques humorales et à médiation cellulaire. Cette activité est spécialement recherchée dans le cas de certains vaccins prophylactiques ou thérapeutiques destinés à lutter contre des maladies spécialement graves. Parmi ces maladies, on peut citer des maladies virales comme le SIDA, et différents types de cancers dont on sait déterminer les antigènes spécifiques de la tumeur. Dans tous les cas cités, il est nécessaire d'induire de hauts niveaux de réponse humorale et aussi à médiation cellulaire.Ces niveaux de réponses pourraient être obtenus en utilisant de l'Adjuvant Complet de Freund ou plutôt des dérivés lipophiles du NDP, en émulsion eau dans l'huile afin d'éviter les effets secondaires dûs à l'adjuvant complet de Freund. Mais ici s'ajoute un risque qui est lié à la composition des préparations vaccinantes. En effet, celles-ci peuvent contenir des auto-antigènes, c'est-à-dire des structures susceptibles de provoquer une maladie auto-immune. C'est ainsi que
a) le virus du SIDA utilisé dans certains vaccins a été cultivé sur des cellules humaines ou des lignées cellulaires dérivées de cellules humaines. Même après purification il y a un risque potentiel de présence d'auto-antigènes dans la préparation vaccinale.But to return to the muramyl peptides endowed with adjuvant properties, it is also known that their administration with an antigen in a water-in-mineral oil emulsion allows the obtaining of very strong specific responses humoral and cell-mediated. This activity is especially sought after in the case of certain prophylactic or therapeutic vaccines for combating especially serious diseases. These diseases include viral diseases such as AIDS, and various types of cancer whose tumor-specific antigens are known to be determined. In all the cases mentioned, it is necessary to induce high levels of humoral and also cell-mediated response. These levels of responses could be obtained by using Freund's Complete Adjuvant or rather lipophilic NDP derivatives, in emulsion. water in the oil to avoid side effects due to Freund's complete adjuvant. But here is added a risk that is related to the composition of the vaccine preparations. Indeed, these may contain self-antigens, that is to say, structures capable of causing an autoimmune disease. Thus
a) The AIDS virus used in some vaccines has been cultured on human cells or cell lines derived from human cells. Even after purification there is a potential risk of presence of autoantigens in the vaccine preparation.

b) certains "vaccins anti-cancer", qui font déjà l'objet d'essais cliniques, contiennent des structures comportant à la fois des déterminants antigéniques spécifiques de la tumeur et des déterminants antigéniques du tissu naturel de l'hôte. (b) some "cancer vaccines", which are already in clinical trials, contain structures that include both tumor-specific antigenic determinants and antigenic determinants of the host's natural tissue.

Or c'est dans le cas de ces pathologies particulièrement graves que le clinicien voudrait être à même d'induire chez l'hôte de fortes réponses humorales et à médiation cellulaire, mais à l'encontre des seuls déterminants antigéniques spécifiques des agents pathogènes qui en sont la cause (cas du SIDA) ou des déterminants antigéniques tumoraux. De telles réponses sont spécialement recherchées dans le cas de certains vaccins prophylactiques ou thérapeutiques destinés à lutter contre des maladies spécialement graves, parmi lesquelles des maladies virales comme le
SIDA, et différents types de cancers, lorsque l'on sait identifier les antigènes spécifiques de la tumeur.Mais dans ces exemples on voit que si l'on induit une très forte réponse immunitaire vis-à-vis des structures susceptibles d'évoquer une réponse protectrice, on risque d'induire également une réaction auto-immune liée à une réaction vis-à-vis des structures de l'hôte présentes dans la composition administrée contenant le vaccin. C'est ce que l'on observe effectivement dans des modèles expérimentaux où des auto-antigènes sont administrés avec un adjuvant de type "Adjuvant Complet de Freund", ou un adjuvant incomplet de Freund (AIF) contenant du
MurNac-L-Ala-D-isoGln 1, 2-dipalmitoyl-sn-glycérol ou "MDP-GDP". However, it is in the case of these particularly serious pathologies that the clinician would like to be able to induce in the host strong humoral and cell-mediated responses, but against the specific antigenic determinants of pathogens that are the cause (case of AIDS) or tumor antigenic determinants. Such responses are especially sought after in the case of certain prophylactic or therapeutic vaccines for the control of especially serious diseases, including viral diseases such as
AIDS, and different types of cancer, when it is known to identify the specific antigens of the tumor.But in these examples we see that if one induces a very strong immune response vis-à-vis the structures likely to evoke a protective response, it is also likely to induce an autoimmune reaction linked to a reaction against the host structures present in the administered composition containing the vaccine. This is actually observed in experimental models where autoantigens are administered with a Freund's Complete Adjuvant type adjuvant, or an incomplete Freund's adjuvant (AIF) containing
MurNac-L-Ala-D-isoGln 1, 2-dipalmitoyl-sn-glycerol or "MDP-GDP".

C'est pourquoi il est tout à fait inattendu qu'une molécule de la famille des Nuramyl-peptides lipophiles se soit révélée douée de propriétés uniques. En effet le N-acétyl-muramyl-D-alanyl D-(-(Sn dipalmytoyl)glycérol > isoglutamine (Mur Nac-D-Ala-DîsoGln 1,2 -dipalmitoyl-sn-glycérol ou MDP
DD-GDP) est aussi fortement adjuvant que les autres
Muramyl-peptides lipophiles, en particulier lorsqu'il est administré sous forme de dispersion eau dans l'huile et quand son action s'exerce vis-à-vis de déterminants antigéniques étrangers à l'hôte. En revanche, même lorsqu'il est administré dans une émulsion eau-dans-l'huile, il n'induit pas de maladie auto-immune liée à une réponse vis-à-vis de déterminants auto-antigéniques.This is why it is quite unexpected that a molecule of the family of Nuramyl-lipophilic peptides has been endowed with unique properties. Indeed, N-acetyl-muramyl-D-alanyl D- (- (Sn dipalmytoyl) glycerol> isoglutamine (Nac-D-Ala-DssoGln 1,2 -dipalmitoyl-sn-glycerol wall or MDP
DD-GDP) is as strongly adjuvant as the others
Muramyl-lipophilic peptides, in particular when it is administered in the form of a water-in-oil dispersion and when its action is exercised with respect to antigenic determinants which are foreign to the host. On the other hand, even when administered in a water-in-oil emulsion, it does not induce an autoimmune disease linked to a response to auto-antigenic determinants.

Le MDP-DD-GDP, de formule

est une molécule en soi connue. I1 est fait plus spécifiquement référence au brevet européen n 85.400921.4/0165123 dans lequel est décrit un procédé pour sa préparation. Ce brevet était plus particulièrement relatif à une classe de molécules, parmi lesquelles le MDP-DD-GDP, choisies en raison de leur action d'activation des macrophages.MDP-DD-GDP, of formula

is a molecule in itself known. Reference is made more specifically to European Patent No. 85.400921.4 / 0165123 in which a process for its preparation is described. This patent was more particularly related to a class of molecules, including MDP-DD-GDP, chosen because of their macrophage activation action.

L'invention concerne donc plus particulièrement une composition pharmaceutique mettant en oeuvre le
MDP-DD-GDP pour son application en tant qu'adjuvant susceptible d'induire une réponse sélective vis-à-vis d'antigènes étrangers à l'organisme de l'hôte (hétéro-antigènes) en l'absence de toute induction de maladie auto-immune liée à une réponse vis-à-vis de déterminants auto-antigéniques. Bien que cette action puisse se manifester à l'occasion d'une administration sous forme d'une solution aqueuse monophasée, il est préférable de le mettre en oeuvre sous la forme d'une dispersion biphasée, injectable, à base d'une solution aqueuse et d'un constituant hydrophobe pharmaceutiquement acceptable. Ce constituant est souvent de nature lipidique. Mais plus généralement le constituant hydrophobe pharmaceutiquement acceptable intervenant ou devant intervenir dans la constitution de la dispersion biphasée susdite est choisi de telle façon que sa présence au sein de la dispersion contenant le MDP-DD-GDP induise un renforcement de la réponse humorale ou de la réponse à médiation cellulaire, ou de préférence des deux à la fois, chez l'hôte receveur vis-à-vis de l'antigène vaccinant administré à l'hôte en présence du MDP-DD-GDP.The invention therefore relates more particularly to a pharmaceutical composition implementing the
MDP-DD-GDP for its application as an adjuvant capable of inducing a selective response towards antigens foreign to the host organism (heteroantigens) in the absence of any induction of autoimmune disease related to a response to auto-antigenic determinants. Although this action may occur during administration in the form of a single-phase aqueous solution, it is preferable to use it in the form of a two-phase, injectable dispersion based on an aqueous solution. and a pharmaceutically acceptable hydrophobic component. This constituent is often lipidic in nature. But more generally the pharmaceutically acceptable hydrophobic constituent intervening or to intervene in the constitution of the aforementioned two-phase dispersion is chosen such that its presence within the dispersion containing the MDP-DD-GDP induces a reinforcement of the humoral response or the cell-mediated response, or preferably both, in the recipient host to the vaccine antigen administered to the host in the presence of MDP-DD-GDP.

Ce constituant hydrophobe consistera le plus souvent en une huile minérale, par exemple huile de paraffine, ou végétale. Des émulsions eau dans l'huile végétale utilisables pour la constitution de compositions adjuvantes sont décrites, par exemple dans le brevet français ne7504003. Le composé hydrophobe peut aussi être à la base de lipides susceptibles de former des liposomes. Référence est de nouveau faite au brevet européen n"0165123 déjà identifié plus haut, pour ce qui concerne la constitution de tels liposomes. I1 peut encore être formé d'un détergent hydrophobe. Le composé hydrophobe peut aussi être à base de polymères polyoxylènepolyoxypropylène, tels que ceux connus sous la marque
PLURONIC et/ou d'esters polyoxyéthyléniques du sorbitane, notamment de ceux commercialisés sous la marque TWEEN 20.Le composé hydrophobe peut également être formé par des microsphères, ayant des tailles normalement inférieures à 7 microns.This hydrophobic constituent will most often consist of a mineral oil, for example paraffin oil, or vegetable oil. Water-in-vegetable oil emulsions that can be used for the constitution of adjuvant compositions are described, for example in French patent No. 7504003. The hydrophobic compound may also be the basis of lipids capable of forming liposomes. Reference is again made to European Patent No. 0165123 already identified above, with regard to the constitution of such liposomes, It may also be formed of a hydrophobic detergent The hydrophobic compound may also be based on polyoxylene polyoxypropylene polymers, such as than those known under the brand
PLURONIC and / or polyoxyethylene sorbitan esters, especially those sold under the trademark TWEEN 20. The hydrophobic compound may also be formed by microspheres, having sizes normally less than 7 microns.

L'invention présente un intérêt tout particulier, lorsqu'elle est appliquée à l'induction d'une réponse vaccinante et plus généralement immunogène à l'égard d'un antigène non dépourvu de déterminants antigéniques caractéristiques du soi ou susceptibles de croiser immunologiquement avec ces déterminants antigéniques. Ceux-ci peuvent soit appartenir à l'antigène vaccinant, soit être associés à lui dans des conditions faisant obstacle à une purification complète préalable de l'antigène vaccinant. On l'a vu, cette situation, peut se présenter chaque fois que l'antigène vaccinant a été produit, par exemple dans des cellules humaines ou animales (par exemple virus inactivés ou fractions de virus cultivés dans ces cellules). The invention is of particular interest when it is applied to the induction of a vaccinating response and more generally immunogenic with respect to an antigen which does not lack any characteristic antigenic determinants of the self or which can cross immunologically with these antigenic determinants. These can either belong to the vaccinating antigen or be associated with it under conditions which preclude complete prior purification of the vaccinating antigen. As we have seen, this situation can occur whenever the vaccinating antigen has been produced, for example in human or animal cells (for example, inactivated viruses or fractions of viruses cultivated in these cells).

L'invention trouve une application particulièrement intéressante dans la constitution -ou pour la production- de compositions pharmaceutiques vaccinantes contenant un virus HIV inactivé, ou un antigène anti-tumoral ou encore certains antigènes parasitaires susceptibles de donner lieu à des réactions croisées avec certaines structures de l'hôte. The invention finds a particularly interesting application in the constitution - or for the production - of vaccinating pharmaceutical compositions containing an inactivated HIV virus, or an anti-tumor antigen or certain parasitic antigens capable of giving rise to cross reactions with certain structures of the host.

I1 va de soi que chaque fois qu'une préparation de l'antigène vaccinant implique un risque de présence de déterminant auto-antigénique ou croisant avec les déterminants du soi à l'issue de cette préparation, il convient de le considérer comme "principe vaccinant non totalement dépourvu de constituants autoantigéniques". It goes without saying that whenever a preparation of the vaccinating antigen involves a risk of presence of self-antigenic determinant or crossing with the self determinants at the end of this preparation, it should be considered as "vaccinating principle not completely devoid of autoantigenic constituents ".

En particulier l'invention trouve une application avantageuse en combinaison avec tout virus ou fraction de virus obtenu par culture dans des cellules humaines ou de mammifères, ou encore avec tout antigène dont les conditions d'obtention introduisent un risque de contamination par des éléments de structure appartenant à des cellules humaines ou de mammifères en particulier des cellules de la lignée blanche. In particular the invention finds an advantageous application in combination with any virus or fraction of virus obtained by culturing in human or mammalian cells, or with any antigen whose conditions of introduction introduce a risk of contamination by structural elements. belonging to human or mammalian cells especially cells of the white line.

I1 est entendu que la composition pharmaceutique telle qu'elle est vient d'être définie peut être préparée de façon extemporanée. Par ailleurs, si l'antigène est souvent administré en même temps que les autres constituants de la composition pharmaceutique, l'invention ne saurait être limitée à ce cas de figure précis. L'administration du MDP-DD-
GDP sous forme de dispersion biphasée d'une part, et celle de l'antigène vaccinant, d'autre part, peuvent également être faites de façon non simultanée, la seule condition étant que les intervalles de temps qui s'écoulent entre ces administrations distinctes soient tels que l'effet d'adjuvant immunologique de la préparation contenant le MDP-DD-GDP à l'égard de l'antigène vaccinant puisse se manifester.It is understood that the pharmaceutical composition as it has just been defined can be prepared extemporaneously. Moreover, if the antigen is often administered at the same time as the other constituents of the pharmaceutical composition, the invention can not be limited to this specific case. The administration of the CDM-DD-
Two-phase dispersion on the one hand, and that of the vaccinating antigen, on the other hand, can also be made non-simultaneous, the only condition being that the time intervals that elapse between these separate administrations such that the effect of immunological adjuvant of the preparation containing the MDP-DD-GDP with respect to the vaccinating antigen can be manifested.

En d'autres termes l'expression "composition pharmaceutique" telle qu'elle est utilisée ci-dessus, couvre aussi bien des compositions formées à partir des divers constituants nommés et se trouvant dans un stade de prémélange, que l'ensemble de ces différents constituants pris isolément mais réunis au(x) moment(s) de leur (s) administrations (s) respective (s) aux patients (humains ou animaux) dans des conditions permettant l'obtention des résultats sus-indiqués. In other words, the term "pharmaceutical composition" as used above, covers both compositions formed from the various named constituents and being in a premix stage, that all of these different components taken in isolation but combined at the time (s) of their respective administration (s) to patients (humans or animals) under conditions allowing the above-mentioned results to be obtained.

Les proportions relatives dans l'émulsion de la solution aqueuse et du constituant hydrophobe sont choisies de façon telle qu'une émulsion suffisamment stable, notamment au moment de l'administration, soit susceptible d'être formée entre la solution aqueuse et le constituant hydrophobe. En particulier, lorsque le constituant hydrophobe est constitué par une huile minérale, la proportion de cette dernière sera de préférence de 50 % à 90 % (volume/volume) par rapport à la totalité du mélange. The relative proportions in the emulsion of the aqueous solution and of the hydrophobic component are chosen such that an emulsion sufficiently stable, especially at the time of administration, is capable of being formed between the aqueous solution and the hydrophobic constituent. In particular, when the hydrophobic constituent is constituted by a mineral oil, the proportion of the latter will preferably be from 50% to 90% (volume / volume) relative to the totality of the mixture.

I1 va de soi que ces intervalles ne sont indiqués qu'à titre d'exemples. Ils n'ont aucun caractère limitatif. It goes without saying that these intervals are only given as examples. They have no limiting character.

L'invention sera encore davantage illustrée par les exemples qui suivent. Comme on pourra le constater, les tests mis en oeuvre sont d'une très grande sévérité, puisque le animaux recevant la préparation capable d'induire une auto-immunisation sont frappés de paralysie et meurent. The invention will be further illustrated by the following examples. As can be seen, the tests used are of a very great severity, since animals receiving the preparation capable of inducing autoimmunization are struck with paralysis and die.

Exemple 1:
Absence d'induction d'une maladie auto-immune (l'encéphalomyélite allergique) chez le cobaye après administration de la protéine basique de myéline avec du MDP-DD-GDP en émulsion eau dans l'huile.Example 1
Absence of induction of an autoimmune disease (allergic encephalomyelitis) in the guinea pig after administration of the basic myelin protein with MDP-DD-GDP in water-in-oil emulsion.

La protéine basique de myéline est un autoantigène connu pour sa capacité à induire une réaction immunologique vis-à-vis de la myéline présente dans la moelle épinière et le cerveau. Les animaux sont des cobayes mâles Hartley. Ils reçoivent dans les coussinets des pattes arrières, 50 Sg de protéine basique. Les témoins négatifs reçoivent l'antigène dans une émulsion d'Adjuvant Incomplet de Freund (huile seule) et les témoins positifs dans une émulsion d'Adjuvant Complet (huile + mycobactéries). Myelin basic protein is an autoantigen that is known to induce an immune response to myelin in the spinal cord and brain. The animals are male Hartley guinea pigs. They receive in the pads of hind legs, 50 Sg of basic protein. Negative controls receive the antigen in a Freund Incomplete Adjuvant emulsion (oil only) and positive controls in a Complete Adjuvant emulsion (oil + mycobacteria).

Les lots expérimentaux reçoivent l'adjuvant incomplet additionné de 50 g MDP-GDP (Mur-Nac-L-Ala-D-isoGln-
GDP) ou de MDP-Thr-GDP (Mur-Nac-L-Thr-D-isoGln-GDP) ou de MDP-DD-GDP.The experimental lots receive the incomplete adjuvant supplemented with 50 g MDP-GDP (Mur-Nac-L-Ala-D-isoGln-
GDP) or MDP-Thr-GDP (Mur-Nac-L-Thr-D-isoGln-GDP) or MDP-DD-GDP.

Les animaux sont pesés toutes les semaines, les signes cliniques apparaissent après 10 jours et les animaux meurent entre le 12ème et 19ème jours. Après 3 semaines, on pratique des cuti-réactions sur les animaux sains et sur les animaux qui ont réchappé à la maladie. On prélève également du sang par ponction cardiaque afin de doser les anticorps par ELISA. The animals are weighed every week, clinical signs appear after 10 days and animals die between the 12th and 19th days. After 3 weeks, there are cuti-reactions on healthy animals and animals that have survived the disease. Blood is also collected by cardiac puncture to assay the antibodies by ELISA.

Le tableau 1 fournit des indications sur le nombre d'animaux de chaque groupe qui s'est trouvé affecté des signes cliniques caractéristiques de l'encéphalomyélite allergique : perte de poids, paralysie des pattes arrières puis généralisée, incontinence. Table 1 provides information on the number of animals in each group that have been affected by the characteristic clinical signs of allergic encephalomyelitis: weight loss, paralysis of the hind legs and generalized, incontinence.

- le nombre d'animaux morts par groupe,
- les titres en anticorps anti-protéine basique de myéline,
- enfin, la présence de cuti-réaction positive (lorsqu'elle a été testée) chez les survivants.- the number of dead animals per group,
the titres of antibodies to myelin basic protein,
- finally, the presence of a positive reaction (when it was tested) among the survivors.

NT signifie "non-testé".NT means "untested".

On voit sur le tableau 1, que seuls le lot témoin négatif et le lot ayant reçu comme adjuvant le MDP
DD-GDP échappent à la maladie. Néanmoins, les animaux ayant reçu le MDP-DD-GDP ont synthétisé des anticorps et ont eu des réactions cutanées positives, quand on a pratiqué une cuti-réaction avec la protéine basique. Table 1 shows that only the negative control lot and the batch that received the CDM adjunct
DD-GDP escape the disease. Nevertheless, the animals that received MDP-DD-GDP synthesized antibodies and had positive cutaneous reactions when a cuti-reaction was performed with the basic protein.

TABLEAU 1

TABLE 1

<tb> <SEP> Signes <SEP> Morts/ <SEP> Titre <SEP> Cuti
<tb> <SEP> Imnunisation <SEP> cliniques <SEP> Total <SEP> Anticorps <SEP> réactions
<tb> Protéine <SEP> basique <SEP> + <SEP> AIF <SEP> 0/5 <SEP> 0/5 <SEP> 5.000 <SEP> 0
<tb> Protéine <SEP> basique <SEP> + <SEP> ACF <SEP> 8/8 <SEP> 6/8 <SEP> 17.000 <SEP> NT
<tb> Protéine <SEP> basique <SEP> + <SEP> AIF <SEP> + <SEP> MDP-GDP <SEP> 10/11 <SEP> 5/11 <SEP> 22.000 <SEP>
<tb> Protéine <SEP> basique <SEP> + <SEP> AIF <SEP> + <SEP> MDP-L-Thr-GDP <SEP> 6/6 <SEP> 6/6 <SEP> NT <SEP> NT
<tb> Protéine <SEP> basique <SEP> + <SEP> AIF <SEP> + <SEP> MDP-DD-GDP <SEP> 0/11 <SEP> 0/11 <SEP> 15.000 <SEP> ++
<tb>
Sur le tableau 2, on voit l'évolution du poids. La moyenne des poids est donnée pour chaque lot.<tb><SEP> Signs <SEP> Dead / <SEP> Title <SEP> Cuti
<tb><SEP> Imnunization <SEP> Clinical <SEP> Total <SEP> Antibody <SEP> reactions
<tb> Protein <SEP> basic <SEP> + <SEP> AIF <SEP> 0/5 <SEP> 0/5 <SEP> 5.000 <SEP> 0
<tb> Protein <SEP> basic <SEP> + <SEP> ACF <SEP> 8/8 <SEP> 6/8 <SEP> 17.000 <SEP> NT
<tb> Protein <SEP> basic <SEP> + <SEP> AIF <SEP> + <SEP> MDP-GDP <SEP> 10/11 <SEP> 5/11 <SEP> 22.000 <SEP>
<tb> Protein <SEP> basic <SEP> + <SEP> AIF <SEP> + <SEP> MDP-L-Thr-GDP <SEP> 6/6 <SEP> 6/6 <SEP> NT <SEP> NT
<tb> Protein <SEP> basic <SEP> + <SEP> AIF <SEP> + <SEP> MDP-DD-GDP <SEP> 0/11 <SEP> 0/11 <SEP> 15.000 <SEP> ++
<Tb>
In Table 2, we see the evolution of the weight. The average weight is given for each lot.

TABLEAU 2

TABLE 2

<tb> <SEP> Semaine <SEP> Semaine <SEP> Semaine <SEP> Semaine
<tb> <SEP> Imnunisation <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4
<tb> Protéine <SEP> basique <SEP> + <SEP> AIF <SEP> 510 <SEP> 537 <SEP> 620 <SEP> 695
<tb> Protéine <SEP> basique <SEP> + <SEP> ACF <SEP> 500 <SEP> 560 <SEP> 425 <SEP> 450
<tb> <SEP> **
<tb> Protéine <SEP> basique <SEP> + <SEP> AIF <SEP> + <SEP> MDP-GDP <SEP> 480 <SEP> 550 <SEP> 546 <SEP> 480
<tb> <SEP> * <SEP>
<tb> Protéine <SEP> basique <SEP> + <SEP> AIF <SEP> + <SEP> MDP-L-Thr-GDP <SEP> 480 <SEP> 549 <SEP> 466 <SEP> -
<tb> Protéine <SEP> basique <SEP> + <SEP> AIF <SEP> + <SEP> MDP-DD-GDP <SEP> 490 <SEP> 568 <SEP> 638 <SEP> 685
<tb> * : 2 survivants ** : 3 survivants
On constate à l'examen de ce tableau que l'injection de la protéine basique ne s'accompagne pas d'une perte de poids, bien au contraire, des animaux traités, lorsque ceux-ci n'ont reçu en sus de la protéine basique, que 1'AIF, ou à la fois 1'AIF et le
MDP-DD-GDP, alors que l'on enregistre une perte de poids (dans la mesure où d'ailleurs les animaux survivent) chez ceux des animaux qui ont reçu en sus de la protéine basique, soit de 1'ACF, soit de 1'AIF et du MDP-GDP, soit encore de 1'AIF et du MDP-Thr-GDP.<tb><SEP> Week <SEP> Week <SEP> Week <SEP> Week
<tb><SEP> Imnunization <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4
<tb> Protein <SEP> basic <SEP> + <SEP> AIF <SEP> 510 <SEQ> 537 <SEP> 620 <SEQ> 695
<tb> Protein <SEP> basic <SEP> + <SEP> ACF <SEP> 500 <SEP> 560 <SEP> 425 <SEP> 450
<tb><SEP> **
<tb> Protein <SEP> basic <SEP> + <SEP> AIF <SEP> + <SEP> MDP-GDP <SEQ> 480 <SEQ> 550 <SEQ> 546 <SEQ> 480
<tb><SEP> * <SEP>
<tb> Protein <SEP> basic <SEP> + <SEP> AIF <SEP> + <SEP> MDP-L-Thr-GDP <SEQ> 480 <SEQ> 549 <SEQ> 466 <SEP> -
<tb> Protein <SEP> basic <SEP> + <SEP> AIF <SEP> + <SEP> MDP-DD-GDP <SEQ> 490 <SEQ> 568 <SEQ> 638 <SEQ> 685
<tb> *: 2 survivors **: 3 survivors
It can be seen from the table that the injection of the basic protein is not accompanied by a loss of weight, on the contrary, the treated animals, when they have not received the protein additionally. basic, that AIF, or both AIF and
MDP-DD-GDP, while weight loss is observed (to the extent that the animals survive) in animals that received, in addition to the basic protein, either ACF or AIF and MDP-GDP, again AIF and MDP-Thr-GDP.

Exemple 2:
Absence de synergie toxique entre le MDP-DD-GDP et les endotoxines;
Des souris Swiss femelles de 25 g reçoivent par la voie veineuse de l'eau physiologique, soit seule (témoin négatif), soit contenant des dérivés lipophiles du MDP à la dose de 300 g. Deux heures plus tard elles reçoivent toujours par voie veineuse 25 yg d'endotoxine (lipopolysaccharide de S.Example 2
Absence of toxic synergy between MDP-DD-GDP and endotoxins;
Female Swiss mice of 25 g received by the venous route of saline, either alone (negative control) or containing lipophilic derivatives of MDP at a dose of 300 g. Two hours later, they are still receiving 25 μg of endotoxin (lipopolysaccharide S.

Enderitidis). On voit sur le tableau 3 que le MDP-GDP a sensibilisé les souris à l'administration d'endotoxine contrairement au MDP-DD-GDP et au MDP
Thr-GDP.Enderitidis). Table 3 shows that MDP-GDP sensitized mice to endotoxin administration in contrast to MDP-DD-GDP and CDM.
Thr-PDM.

TABLEAU 3

TABLE 3

<tb> Molécule <SEP> testée <SEP> (300gag) <SEP> LPS <SEP> Norts/Total <SEP> après <SEP> 24h
<tb> <SEP> 25 <SEP> Ag <SEP> 0/12
<tb> MDP-GDP <SEP> 25 <SEP> Ag <SEP> 12/12
<tb> NDP-Thr-GDP <SEP> 25 <SEP> gg <SEP> 0/12
<tb> MDP-DD-GDP <SEP> 25 <SEP> ?g <SEP> 0/12
<tb>
Exemple 3:
Les dérivés lipophiles ont été testés (selon la méthode décrite dans la Pharmacopie Européenne) pour leur activité pyrogène et le MDP-DD-GDP s'est révélé 10 fois moins pyrogène que le MDP-GDP. <tb> Molecule <SEP> tested <SEP> (300gag) <SEP> LPS <SEP> Norts / Total <SEP> after <SEP> 24h
<tb><SEP> 25 <SEP> Ag <SEP> 0/12
<tb> MDP-GDP <SEP> 25 <SEP> Ag <SEP> 12/12
<tb> NDP-Thr-GDP <SEP> 25 <SEP> gg <SEP> 0/12
<tb> MDP-DD-GDP <SEP> 25 <SEP>? g <SEP> 0/12
<Tb>
Example 3
The lipophilic derivatives were tested (according to the method described in the European Pharmacopoeia) for their pyrogenic activity and the MDP-DD-GDP was 10 times less pyrogenic than the MDP-GDP.

Claims

A process for the preparation of a pharmaceutical composition exerting a selective adjuvant action of immunity employing a humoral response or a cell-mediated response, preferably both at the same time, against specific antigens, the absence of any induction of autoimmune disease linked to a response to self-antigenic determinants, characterized in that the adjuvant principle of this pharmaceutical composition is constituted by the MDP-DD-GDP of formula

2. The method of claim 1, applied to the preparation of a vaccine composition against a pathogen to which the above antigens correspond, this composition then containing these antigens.

3. A method according to claim 1 or claim 2 for the production of vaccinating compositions against a pathogen free of self-identifying antigenic determinants or antigenic determinants capable of immunologically crossing with self structures.

4. Method according to claim 3, characterized in that the antigen is a virus or a fraction of virus obtained by culturing in human or mammalian cells.

5. Method according to claim 3, characterized in that the antigen is an antigen whose conditions of introduction introduce a risk of contamination by structural elements belonging to human or mammalian cells, in particular cells of the line white.

6. Method according to any one of claims 1 to 5, characterized in that the antigen is an attenuated HIV virus or a vaccine antigen of this virus.

7. Method according to any one of claims 1 to 5, characterized in that the antigen is an anti-tumor antigen.

8. Process according to any one of claims 1 to 5, characterized in that the antigen is a parasite antigen capable of giving rise to cross-immunological reactions with certain structures of the host.

9. Pharmaceutical composition using the MDP-DD-GDP of formula

within a biphasic dispersion, injectable, based on an aqueous solution and a pharmaceutically acceptable hydrophobic component.

10. Composition according to claim 9, characterized in that the MDP-DD-GDP is there in combination with a vaccinating antigen.

11. Composition according to Claim 9 or 10, characterized in that the hydrophobic constituent consists of a mineral oil, for example paraffin oil, or vegetable oil.

12. Composition according to claim 9 or 10, characterized in that the hydrophobic constituent is based on lipids capable of forming liposomes.

13. A composition according to claim 9 or 10, characterized in that the hydrophobic compound is based on polyoxylene-polyoxypropylene polymers, such as those known under the trademark PLURONIC and / or polyoxyethylenic esters of sorbitan, in particular those marketed under the brand TWEEN 20.

14. Composition according to any one of claims 9 to 13, characterized in that the antigen is an antigen free of self-identifying antigenic determinants or an antigen capable of crossing immunologically with these antigenic determinants of the self.

15. Composition according to any one of claims 9 to 13, characterized in that the pharmaceutically acceptable hydrophobic component is chosen such that its presence in the dispersion containing the MDP-DD-GDP induces in the recipient host a enhancing the humoral response or the cell-mediated response or, preferably, both at once.

16. Composition according to any one of claims 9 to 13, characterized in that the antigen is an attenuated HIV virus or a vaccine antigen of this virus.

17. Composition according to any one of claims 9 to 13, characterized in that the antigen is an anti-tumor antigen.

18. Composition according to any one of claims 9 to 13, characterized in that the antigen is a parasite antigen capable of giving rise to cross-immunological reactions with certain structures of the host.

19. Composition according to any one of claims 9 to 13, characterized in that the antigen is a virus or a virus fraction obtained by culturing in human or mammalian cells.

20. Composition according to any one of claims 9 to 13, characterized in that the antigen is an antigen whose conditions of introduction introduce a risk of contamination by structural elements belonging to human or mammalian cells, particular cells of the white line.